JP6897761B2 - タンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物を製造する方法、蛍光染色液の製造方法、タンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物、蛍光染色液およびタンパク質修飾蛍光体集積粒子精製用フィルター - Google Patents
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Description
本発明の一実施形態に係るタンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物を製造する方法は、タンパク質修飾蛍光体集積粒子と、その作製工程に由来する夾雑物とを含有する溶液を、タンパク質結合性物質を担持したフィルターと接触させることにより、前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子を前記夾雑物から分離する、精製工程を含む。
本発明の一実施形態に係るタンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物は、前記精製工程を含む方法により得られる。
前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子は、表面が生体物質結合性タンパク質で修飾された蛍光体集積粒子である。蛍光体集積粒子の生体物質結合性タンパク質による修飾方法は、蛍光染色の目的とする生体物質の蛍光標識方法に応じて適宜選択すればよい。前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子としては、第1反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第2反応性物質で修飾された生体物質結合性タンパク質とが、第1反応性物質と第2反応性物質の相互作用により連結している粒子である、蛍光プレミックス粒子が好ましい。
(ii)その第1反応性物質1つに対して、最大いくつの第2反応性物質(で修飾された生体物質結合性タンパク質)が結合するか、係数を決定する(例えば、第1反応性物質がアビジン等である場合は4であり、第1反応性物質が抗ハプテン抗体である場合は1である)
(iii)前記(i)の1粒子あたりの数に、前記(ii)の係数を乗じた値を、蛍光体集積粒子1粒子あたりに連結し得る生体物質結合性タンパク質の数の最大値とみなす
(iv)反応のために添加した第2反応性物質で修飾された生体物質結合性タンパク質の量が、(iii)の最大値よりも多いときは、前記最大値を、蛍光体集積粒子1粒子あたりの生体物質結合性タンパク質の数とみなし、(iii)の最大値よりも少ないときは、第2反応性物質で修飾された生体物質結合性タンパク質の添加総数を蛍光体集積粒子の数で除した値を、蛍光体集積粒子1粒子あたりの生体物質結合性タンパク質の数とみなす。
生体物質結合性タンパク質は、生体物質への結合性能を有するタンパク質であって、蛍光染色の対象である目的生体物質に、蛍光体集積粒子を直接的または間接的に結合させるために用いられる。このような生体物質結合性タンパク質は、目的生体物質の蛍光標識方法に応じて、また、蛍光体集積粒子の修飾の実施形態に応じて適宜選択すればよいが、抗体であることが好ましい。
前記生体物質結合性タンパク質としては、抗体(免疫グロブリン)を用いることが好ましい。該抗体は、免疫染色法において目的生体物質と直接的にまたは間接的に結合できる抗体であれば特に限定されない。該抗体としては、前記1次抗体、2次抗体および3次抗体以上の高次抗体のいずれであってもよい。
第1反応性物質および第2反応性物質は、相互作用により互いに特異的に結合する物質同士の組み合わせであって、いずれも生体物質結合性タンパク質とそれが結合する目的生体物質(目的タンパク質、または2次抗体もしくは3次抗体以上の高次抗体)との特異的な結合と交差して反応することのない物質から選択される。
前記蛍光体集積粒子(生体物質結合性タンパク質で修飾される前の粒子)としては、特に制限されないが、有機物または無機物でできた母体となる粒子の内部または表面に、蛍光体(例えば蛍光色素)を複数個固定して集積した構造を有するナノサイズの(直径が1μm以下の)粒子であることが好ましく、一粒子で十分な輝度の蛍光を発することができる粒子であることが好ましい。
有機蛍光色素集積粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に有機蛍光色素を複数個集積した、ナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。
無機蛍光体集積粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に半導体ナノ粒子を複数個集積した、ナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。
蛍光体集積粒子の平均粒子径は、好ましくは30〜300nm、より好ましくは40〜160nmである。一般的に、粒子径が小さくなるほど比表面積が大きくなり、検体との結合力が高まるが、平均粒子径が30nmを下回ると、蛍光体集積粒子に起因して蛍光観察で観察されるべき輝点が全く観察されないか、または観察されにくい場合がある。逆に、蛍光体集積粒子の平均粒子径が300nmを上回ると、蛍光観察において観察される輝点が多くなりすぎる等、輝点同士が分離されずに正確に輝点をカウントすることが困難となる場合がある。
後述する免疫染色法の第1および第2実施形態では、それぞれ生体物質結合性タンパク質として1次抗体および2次抗体が連結された蛍光体集積粒子を、免疫染色法の第3および第4実施形態では、ともに生体物質結合性タンパク質として第1反応性物質(例えばストレプトアビジン、抗ハプテン抗体)が連結された蛍光体集積粒子を、タンパク質修飾蛍光体集積粒子として用いる。
後述する、免疫染色法の第5および第6実施形態では、それぞれ生体物質結合性タンパク質として1次抗体または2次抗体が連結された蛍光プレミックス粒子を、タンパク質修飾蛍光体集積粒子として用いる。そのような蛍光プレミックス粒子は、第1反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第2反応性物質で修飾された抗体とを、第1反応性物質と第2反応性物質の相互作用により連結させることにより作製することができる。典型的には、蛍光プレミックス粒子は、下記第1〜第3工程により作製することができる。
前記第1工程は、第1反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子を調製するための工程である。この工程は、≪タンパク質修飾蛍光体集積粒子の作製方法≫において説明した、生体物質結合性タンパク質で修飾された蛍光体集積粒子を作製するための工程と同様の実施形態とすることができる。
前記第2工程は、第2反応性物質で修飾された抗体を調製するための工程である。典型的には、両末端に反応性官能基を有するリンカーを用いて、リンカーのそれぞれの反応性官能基を、抗体が有する反応性部位および第2反応性物質が有する反応性部位と反応させて共有結合を形成することにより、抗体と第2反応性物質とをリンカーを介して連結する。例えば、第2反応性物質としてビオチンを用いる場合、この工程は、従来のアビジン−ビオチン複合体を利用した免疫染色法(ABC法)において用いられる、ビオチンで修飾された抗体を調製するための工程と同様の実施形態とすることができる。
前記第3工程は、第1工程において調製された第1反応性物質修飾蛍光体集積粒子と、第2工程において調製された第2反応性物質修飾抗体とを反応させて、最終的に蛍光プレミックス粒子を作製するための工程である。
タンパク質修飾蛍光体集積粒子と、その作製工程に由来する夾雑物とを含有する溶液は、典型的には、タンパク質修飾蛍光体集積粒子を作製するために、蛍光体集積粒子の表面を生体物質結合性タンパク質で修飾する反応が行われた後の溶液(反応後溶液)である。タンパク質修飾蛍光体集積粒子は前述のように、蛍光体集積粒子の合成やその表面修飾など、長いプロセスを経て作製され、反応後溶液には、反応により生成したタンパク質修飾蛍光体集積粒子とともに、未反応の原料、原料や試薬に含まれる不純物などの夾雑物が含まれる。
本発明の一実施形態に係るタンパク質修飾蛍光体集積粒子精製用フィルターは、タンパク質修飾蛍光体集積粒子が通過可能なサイズの細孔を有するフィルターと、該フィルターに担持されたタンパク質結合性物質とを備える。
該フィルターは、前記製造方法に好適に用いられる。
前記タンパク質結合性物質は、タンパク質修飾蛍光体集積粒子が有する生体物質結合性タンパク質(蛍光体集積粒子に連結されている生体物質結合性タンパク質)に対する結合性能を有してタンパク質修飾蛍光体集積粒子を捕捉することができる一方、その結合を弱めることで、タンパク質修飾蛍光体集積粒子(および生体物質結合性タンパク質)を脱離させることができる(つまり可逆的な結合性能を有する)。このようなタンパク質結合性物質は、生体物質結合性タンパク質に応じて、適切な物質を選択すればよい。
本発明の一実施形態に係る蛍光染色液は、前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物を含み、通常、該精製物の分散液である。
前記蛍光染色の対象である、目的生体物質は、検体に含まれる少なくとも1種の生体物質であることが好ましく、タンパク質であることが特に好ましく、さらに主に病理診断において、タンパク質の定量ないし検出のために行われる免疫染色の対象であるタンパク質(抗原)であることが最も好ましい。典型的には、例えば、がんの病理診断に関係するタンパク質(いわゆるバイオマーカー)が好ましい。具体的には、PD−L1(Programmed cell death1 ligand 1)、CTLA4(細胞傷害性Tリンパ球抗原−4)、CD8、CD30、CD48、CD59、あるいは、EGFR(HER1)(Epidermal Growth Factor Receptor:上皮増殖因子受容体)、HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor:ヒト上皮増殖因子受容体)、HER3、HER4、VEGFR(Vasular Endothelial Growth Factor Receptor:血管内皮細胞増殖因子受容体)、IGFR(Insulin-like Growth Factor Receptor:インスリン様増殖因子受容体)、HGFR(Hepatocyte Growth Factor Receptor:肝細胞増殖因子受容体)といった増殖因子の受容体(レセプター)や、T細胞表面上にある重要な抑制性の免疫チェックポイント分子であって前記PD−L1の受容体であるPD−1(Programmed cell death 1)などの免疫系の受容体であるタンパク質が例示できる。
前記蛍光染色液は、様々な蛍光染色法に利用することができるが、典型的には、検体である組織切片から作製した組織スライドにおいて、検体に含まれる目的タンパク質を免疫染色により蛍光標識した、染色スライドを作製するために利用される。
下記製造工程1−1〜1−4により、抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子を製造した。
下記工程(1−1a)〜(1−1d)により、蛍光体として有機蛍光色素であるTAMRA(登録商標)(5−カルボキシテトラメチルローダミン)を集積化(内包)したTAMRA集積シリカ粒子を作製した。
下記工程(1−2a)〜(1−2g)により、製造工程1−1で得られたTAMRA集積シリカ粒子に対してマレイミド基を導入した。
下記工程(1−3a)〜(1−3c)により、抗HER2抗体にメルカプト基(−SH)を生成させたメルカプト基導入抗HER2抗体を調製し、該抗体中のメルカプト基の量を定量した。
下記工程(1−4a)〜(1−4c)により、マレイミド基導入TAMRA集積シリカ粒子とメルカプト基導入抗HER2抗体とを結合させることで、抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子を製造した。
比較例1と同様製造工程1−1〜1−4を行った後、下記製造工程1−5により作製したプロテインA結合樹脂カラムを用いて、下記製造工程1−6による精製処理を行った。
ゲル濾過担体「Sephacryl S-1000 SF」(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製、アリルデキストランとN,N−メチレンビスアクリルアミドが共有架橋結合した樹脂マトリックス)のデキストラン水酸基とブロモ酢酸とを16時間反応させることにより、担体表面をカルボキシメチル化した(Monchaux, E., and Vermette, P. (2008). Cell adhesion resistance mechanisms using arrays of dextran-derivative layers. J Biomed Mater Res A 85, 1052-1063参照)。なお、「Sephacryl S-1000 SF」は、粒径230nmの物体(リポソーム)が侵入し、通過できる程度の空隙を有する多孔質体と考えられる(http://lifesciencedb.jp/dbsearch/Literature/get_pne_cgpdf.php?year=1990&number=3511&file=2Qgovzb50x7RW4IcCUhKPw==参照)。
製造工程1−5により作製されたプロテインA結合樹脂カラムに、5mLの緩衝液A(0.1Mグリシン+1.2M酒石酸ナトリウム、pH9.0)を3回流すことによって平衡化した。製造工程1−4により得られた抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子の分散液1.5mLを、1.5mLの緩衝液Aで希釈して、平衡化したプロテインA結合樹脂カラムに添加し、抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子における抗HER2抗体(IgG)をプロテインA結合樹脂カラムにおけるプロテインAに結合させた。10mLの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、溶離液として3mLの0.1Mグリシン−HCl(pH2.8)を流し、抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子を脱着させ、精製物を回収した。
実施例1において、プロテインA結合樹脂カラムの代わりに、下記製造工程1−7により作製したプロテインG結合樹脂カラムを用いた以外は、実施例1と同様にして、抗HER2抗体直結TAMRA集積シリカ粒子の精製物を製造した。
プロテインAの代わりにプロテインG(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、「21193」)を用いたこと以外は製造工程1−5と同様にして、プロテインG結合樹脂カラムを作製した。
下記製造工程2−1〜2−4により、蛍光プレミックス粒子を製造した。
蛍光体として赤色の有機蛍光色素である「テキサスレッド−X」(Sulforhodamine 101−X、シグマアルドリッチ社製)3.4mgと、3−アミノプロピルトリメトキシシラン(信越シリコーン社製、KBM903)3μLとを、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
製造工程2−1で得られたテキサスレッド集積シリカ粒子を、2mMのEDTA(エチレンジアミン四酢酸)を含有するPBSを用いて3nMの濃度に調整し、得られた液体に、リンカーとしてSM(PEG)12を最終濃度が10mMとなるように添加、混合し、5℃で1時間反応させた。
目的タンパク質HER2に対する1次抗体、すなわち抗HER2抗体として、ウサギモノクローナル抗体であるAnti−Erb 2 antibody[EP1045Y](abcam社製)を用いた。この抗HER2抗体を50mMのTris溶液に溶解して1次抗体溶液を調製した。
製造工程2−2で得られた0.02nMのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液(反応液1)25μLと、製造工程2−3で得られた濃度6μg/mLのビオチン修飾1次抗体溶液(反応液2)25μLとを混合し、室温で1時間反応させることにより、抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子(蛍光プレミックス粒子)の分散液を作製した。
製造工程2−1〜2−4を行った後、前記製造工程1−5と同様にして作製したプロテインA結合樹脂カラムを用いて、下記製造工程2−5による精製処理を行った。
プロテインA結合樹脂カラムに、5mLの緩衝液A(0.1Mグリシン+1.2M酒石酸ナトリウム、pH9.0)を3回流すことによって平衡化した。製造工程2−4で得られた抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子の分散液1.5mLを、1.5mLの緩衝液Aで希釈して、平衡化したプロテインA結合樹脂カラムに添加し、抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子における抗HER2抗体(IgG)をプロテインA結合樹脂カラムにおけるプロテインAに結合させた。10mLの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、溶離液として3mLの0.1Mグリシン−HCl(pH2.8)を流し、抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を脱着させ、製造工程1−6と同様に、溶出後期の画分を取得することによって、抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子の精製物を回収した。
実施例2において、プロテインA結合樹脂カラムの代わりに、前記製造工程1−7と同様にして作製したプロテインG結合樹脂カラムを用いた以外は、実施例2と同様にして、抗HER2抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子の精製物を製造した。
実施例1および1’ならびに実施例2および2’の精製処理によるタンパク質修飾蛍光体集積粒子の回収率を測定した。回収率は、カラムに添加する前のタンパク質修飾蛍光体集積粒子分散液に含まれるタンパク質修飾蛍光体集積粒子の量と、得られた精製物に含まれるタンパク質修飾蛍光体集積粒子の量とから算出した。結果を表3に示す。回収率は、精製前後における蛍光染色液の蛍光強度の維持率と相関する。
比較例1および2、ならびに、実施例1および2で得られた分散液を、タンパク質修飾蛍光体集積粒子の濃度が0.002nMとなるよう、1%BSA含有PBSで希釈することで蛍光染色液を調製し、遮光下、冷蔵保存した。
前記分散安定性の評価と同様にして、得られた蛍光染色液を用い、下記(1)、(2)および(3)に示すような手順で、標本前処理工程(脱パラフィン処理、賦活化処理)、染色工程(免疫染色処理)および標本後処理工程(洗浄処理および封入処理)を行うことにより、免疫染色法に基づく染色スライドを作製した。その後、作製された染色スライドを用いて、下記(4)に示すような手順で観察および撮像を行った。
(1−1)脱パラフィン処理
予めパスビジョンHER−2 DNAプローブキット(アボット)を用いてFISHスコアを算出したコスモバイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)(HER2陽性染色対照標本)を用いた。該組織アレイスライドに対し、以下の(i)〜(iii)の手順で脱パラフィン処理を行った。
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを、以下の(i)〜(iv)の手順で賦活化処理した。
賦活化処理(1−2)を行った組織アレイスライドに、前記調製した蛍光染色液を滴下し、4℃で一晩反応させた。
免疫染色処理を行ったスライドに、常温でエンテランニュー(メルク社製)を滴下した後、カバーガラスを被せ、常温で10分間風乾することで、封入処理を行った。その後、シグナルの計測まで、封入処理を終えた染色スライドを遮光して保存した。
封入処理を終えた染色スライドに対して所定の励起光(蛍光色素として用いたTAMRAまたはテキサスレッドの励起波長に対応した波長を有する励起光)を照射して、蛍光を発光させた。その状態の染色スライドを、蛍光顕微鏡(オリンパス社製、「BX−53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製、「DP73」)を用いて観察および撮像した。前記励起光は、光学フィルターに通すことで、TAMRAに対しては545〜565nm、テキサスレッドに対しては575〜600nmに設定した。また、観察する蛍光についても、光学フィルターを通すことで、TAMRAに対しては570〜590nm、テキサスレッドに対しては612〜692nmに設定した。
Claims (10)
- タンパク質修飾蛍光体集積粒子と、その作製工程に由来する夾雑物とを含有する溶液を、タンパク質結合性物質を担持したフィルターに接触させることにより、前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子を前記夾雑物から分離する、精製工程を含み、
前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子が、表面が生体物質結合性タンパク質で修飾された蛍光体集積粒子であり、
前記タンパク質結合性物質が、前記生体物質結合性タンパク質への可逆的な結合性能を有する物質である、
タンパク質修飾蛍光体集積粒子の精製物を製造する方法。 - 前記生体物質結合性タンパク質が抗体であり、前記タンパク質結合性物質がプロテインA、プロテインGまたはプロテインLである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子が蛍光プレミックス粒子であり、
前記蛍光プレミックス粒子が、第1反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第2反応性物質で修飾された生体物質結合性タンパク質とが、第1反応性物質と第2反応性物質の相互作用により連結している粒子である、
請求項1または2に記載の製造方法。 - 前記第1反応性物質がストレプトアビジンであり、前記第2反応性物質がビオチンである、請求項3に記載の製造方法。
- 前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子が、蛍光体集積粒子1粒子当たり、生体物質結合性タンパク質を1000〜5000個有する粒子である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記蛍光体集積粒子の平均粒子径が30〜300nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- タンパク質修飾蛍光体集積粒子が通過可能なサイズの細孔を有するフィルターと、該フィルターに担持されたタンパク質結合性物質とを備え、
前記タンパク質修飾蛍光体集積粒子が、表面が生体物質結合性タンパク質で修飾された蛍光体集積粒子であり、
前記タンパク質結合性物質が、前記生体物質結合性タンパク質への可逆的な結合性能を有する物質である、
タンパク質修飾蛍光体集積粒子精製用フィルター。 - 前記フィルターが、デキストランまたはその誘導体と、アクリルアミドまたはその誘導体との架橋共重合体である、請求項7に記載のフィルター。
- 前記タンパク質結合性物質がプロテインA、プロテインGまたはプロテインLである、請求項7または8に記載のフィルター。
- 前記蛍光体集積粒子の平均粒子径が30〜300nmである、請求項7〜9のいずれか一項に記載のフィルター。
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