JP6048597B2 - 蛍光色素内包樹脂粒子の保存液 - Google Patents
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Description
粒径が40nm以上200nm以下の蛍光色素内包樹脂粒子の保存液であって、
緩衝液、蛋白質、および非イオン性界面活性剤を含み、
前記蛋白質として、
0.6% αカゼイン、0.6% βカゼイン、および3% BSAを含むか、あるいは、
10%BSAを含み、且つ、
前記蛍光色素内包樹脂粒子を該保存液に添加することにより得られる粒子含有液について、該添加直後における該粒子含有液を基準としたときの、該添加から24時間静置後における該粒子含有液の高さ中心部の後方散乱強度(透過光)の変化の割合が−1%以上であることを特徴とする保存液。
本発明に係る保存液は、
蛍光色素内包樹脂粒子の保存液であって、
蛍光色素内包樹脂粒子を該保存液に添加することにより得られる粒子含有液について、該添加直後における該粒子含有液を基準としたときの、該添加から24時間静置後における該粒子含有液の高さ中心部の後方散乱強度(透過光)の変化の割合が−1%以上である。
D=(I24−I0)/I0×100
に基づいて求められる、この粒子含有液についての高さ中心部の後方散乱強度(透過光)の変化の割合D(%)が、D≧−1の関係を満たす。ここで、この変化の割合Dは、本発明の保存液による保存を行った蛍光色素内包樹脂粒子についての凝集度合いを見るものであり、保存液による、蛍光色素内包樹脂粒子の保存性能を評価する尺度となるものである。
(1)蛍光色素内包樹脂粒子を保存液に添加して、粒子含有液を得る工程;
(2)前記粒子含有液について、添加直後に、該粒子含有液の高さ中心部の後方散乱強度(透過光)I0を測定する工程;
(3)前記粒子含有液を24時間静置後、再度該粒子含有液の高さ中心部の後方散乱強度(透過光)I24を測定する工程;
(4)前記I0およびI24をもとに、下記要件を満たすか否かを判定する工程。
ここで、本発明において、上記変化の割合Dを求める基準とする「後方散乱強度(透過光)」は、光源からの光が、試料を透過しながらあるいは、散乱を繰り替えしながら直進することにより得られる透過光あるいは後方散乱光の強度をいう。
本発明の保存液は、上述したように、上記変化の割合D(%)が本発明で規定する特定の範囲を満たすものである。ここで、そのような変化の割合D(%)を満たす本発明の保存液を、具体的にどのような構成とするかについては、保存対象とする蛍光色素内包樹脂粒子の種類および表面修飾の状態などによっても変わるものであり、あえて一律に厳密な形で特定することはしないものの、本発明の保存液は、典型的には、緩衝液、蛋白質、界面活性剤を含む。
本発明の保存液を構成しうる蛋白質は、蛍光色素内包樹脂粒子の機能を損ねず、かつ、蛍光色素内包樹脂粒子の凝集を防ぐことのできるものである限り特に限定されるわけでない。ただ、本発明の保存液が、病理染色に用いる蛍光色素内包樹脂粒子を保存するために用いられる場合、染色対象とする細胞組織への非特異吸着を防ぐことのできるものが望ましい。したがって、好適な蛋白質として、BSA、カゼインなど一般にブロッキング剤として用いられる蛋白質が挙げられる。
本発明の保存液を構成しうる界面活性剤は、蛍光色素内包樹脂粒子の機能を損ねず、かつ、蛍光色素内包樹脂粒子の凝集を防ぐことのできるものである限り特に限定されるわけでない。ただ、本発明の保存液が、病理染色に用いる蛍光色素内包樹脂粒子を保存するために用いられる場合、蛍光色素内包樹脂粒子は、本発明の保存液で稀釈された状態のまま病理染色に供されることがある。ここで、細胞組織のうち、細胞核のある部分は核酸を構成するリン酸残基により負に荷電しており、細胞核以外の部分は、正に荷電しやすい傾向にある。したがって、細胞組織への非特異吸着をできるだけ少なくする上では、界面活性剤として、非イオン性界面活性剤を用いることが望ましい。その中でも、Tween(登録商標)系界面活性剤などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを好適に用いることができ、そのうち、Tween(登録商標)20を特に好適に用いることができる。
本発明の保存液を構成しうる緩衝液は、蛍光色素内包樹脂粒子の機能を損ねない限り特に限定されるわけでなく、従来公知の種々の緩衝液を用いることができる。
本発明の保存液には、上記緩衝液、蛋白質および界面活性剤のほか、蛍光色素内包樹脂粒子の機能を損ねず、かつ、蛍光色素内包樹脂粒子の凝集を防ぐことのできる限りにおいて、防腐剤など、その他の成分を配合してもよい。ここで、防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム(NaN3)が挙げられる。
本発明の保存液は、上記蛋白質および上記界面活性剤、並びに、任意で添加される上記「その他の成分」を、常法により上記緩衝液に溶解させることによって得ることができる。
本発明の保存液による保存対象となる蛍光色素内包樹脂粒子は、複数の蛍光色素分子が化学的または物理的な作用により樹脂粒子に内包された状態で固定化された構造を有する物質をいい、その形態は特に限定されるものではない。
本発明の適用対象となる蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素には、特に限定がなく、従来公知の蛍光色素とすることができる。
本発明の適用対象となる蛍光色素内包樹脂粒子を構成する樹脂は、熱硬化性樹脂であっても、熱可塑性樹脂であってもよい。たとえば、キシレンのような有機溶媒を用いる透徹工程において蛍光色素が溶出しにくいという観点からは、緻密な架橋構造の内部に蛍光色素を固定化することができる、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を含有する樹脂が好ましい。ここで、本発明の好適な態様において、本発明の適用対象となる蛍光色素内包樹脂粒子を構成する樹脂は、熱可塑性樹脂、より具体的には、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂のみからなる樹脂である。
本発明の適用対象となる蛍光色素内包樹脂粒子は、上記蛍光色素および樹脂からなるものであり、表面修飾を施したものであってもなくても良い。
本願発明の適用対象となる蛍光色素内包樹脂粒子は、各種の樹脂について公知の重合工程に準じて製造することができる。
本発明に係る上述した保存液は、蛍光色素内包樹脂粒子、特に、病理染色に用いる蛍光色素内包樹脂粒子の保存に好適に用いることができる。別の見方をすれば、蛍光色素内包樹脂粒子の保存方法は、蛍光色素内包樹脂粒子を、上述した本発明の保存液に添加することを含む方法と見ることができる。ここで、蛍光色素内包樹脂粒子の保存は、通常冷蔵下(例えば、4〜5℃)で行うことができる。
走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて蛍光ナノ粒子を撮像し、十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めたものである。後述する合成例においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。
合成例1−1〜1−7の蛍光色素内包樹脂粒子として、従来公知の手法を用いて、40、60、80、100、150、200、250nmの平均粒径を有する蛍光色素内包樹脂粒子A1〜A7をそれぞれ用意した。
N,N'−Bis(2,6−diisopropylphenyl)−1,6,7,12−tetraphenoxyperylene−3,4:9,10−tetracarboxdiimideを濃硫酸で処理することによりスルホ基の導入を行い、対応するスルホン酸に導いた。このスルホン酸を、常法により対応する酸塩化物に変換した。
合成例1−5の蛍光色素内包樹脂粒子A5とは粒径の異なる合成例1−1〜1−4および1−6〜1−7の蛍光色素内包樹脂粒子A1〜A4およびA6〜A7についても、合成時の色素/仕込み樹脂量を一定としつつ樹脂量を適宜加減したことを除いて、それぞれ合成例1−5と同様に合成を行った。
上記マレイミド基修飾蛍光色素内包樹脂粒子A1〜A7のそれぞれについて、ストレプトアビジン修飾を以下の要領で行い、それぞれストレプトアビジン修飾蛍光色素内包樹脂粒子S1〜S7に導いた。
(保存液および蛍光色素内包樹脂粒子)
実施例1〜6および比較例1では、0.6% αカゼイン、0.6% βカゼイン、3% BSA、0.1% Tween(登録商標)20および0.015N NaN3を含むTris緩衝液(pH=6.9)を、実施例7〜12および比較例2では、10%BSA、0.1% Tween(登録商標)20および0.05N NaN3を含むPBS緩衝液(pH=7.6)を、比較例3〜9では、1%BSAを含むPBS緩衝液(pH=7.2)を、比較例10〜16では、高分子系界面活性剤(0.1% DISPERBYK−194:pH=7.0)を、保存液として採用した。
1%BSA/PBS溶液中にある各ストレプトアビジン修飾蛍光色素内包樹脂粒子について、上澄み液を除去し、上記保存液に置換した後に、フィルター処理(0.65μm:ミリポア社製)を行った。その後、ストレプトアビジン修飾蛍光色素内包樹脂粒子が目的の濃度(0.2nM)となるように上記保存液で希釈調整して、蛍光色素内包樹脂粒子含有保存液を調製した。
蛍光色素内包樹脂粒子の沈降・凝集の評価は、フォーマルアクション(Formulaction)社製のタービスキャン(商標)(タービスキャンLab)を用いて行った。
各実施例・比較例についての変化の割合D'を、表1に示した。例えば、実施例5では、測定を開始したときを基準として、測定開始から24h後に−0.9%後方散乱強度(透過光)が変化している。
保存液の性能を評価するため、上記ストレプトアビジン修飾蛍光色素内包樹脂粒子について、合成直後の蛍光色素内包樹脂粒子、および、上記保存液中で1ヶ月保存後の蛍光色素内包樹脂粒子のそれぞれを用いて、下記免疫染色、形態観察染色および観察を行った。
組織細胞スライドを常法に従い脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織細胞スライドを10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で121℃、5分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。
上記免疫染色を行った組織細胞スライドについて、さらに、形態観察染色を行った。
上記免疫染色および形態観察染色したサンプルスライド上にある組織切片に対して所定の励起光を照射して蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(BX−53,オリンパス社製)により観察および撮像を行った。ここで、観察および撮像は、サンプルスライド上の1つのコア(1つの組織スポット)につき10視野に分けて行った。このとき、対物レンズおよび接眼レンズとして、それぞれ倍率が40倍および10倍のものを用いた。また、輝点計測は、ImageJ FindMaxima法により計測した。
Claims (5)
- 粒径が40nm以上200nm以下の蛍光色素内包樹脂粒子の保存液であって、
緩衝液、蛋白質、および非イオン性界面活性剤を含み、
前記蛋白質として、
0.6% αカゼイン、0.6% βカゼイン、および3% BSAを含むか、あるいは、
10%BSAを含み、且つ、
前記蛍光色素内包樹脂粒子を該保存液に添加することにより得られる粒子含有液について、該添加直後における該粒子含有液を基準としたときの、該添加から24時間静置後における該粒子含有液の高さ中心部の後方散乱強度(透過光)の変化の割合が−1%以上であることを特徴とする保存液。 - 前記高さ中心部に照射する光の波長が前記蛍光色素内包樹脂粒子の粒径より長い、請求項1に記載の保存液。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子が病理染色に用いられる、請求項1または2に記載の保存液。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子が反応性官能基をさらに有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の保存液。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する樹脂が熱硬化性樹脂である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の保存液。
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