CN111289336B - 一种真菌荧光染色液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学临床检验中病原菌生物学检验技术领域，尤其涉及一种真菌荧光染色液及其制备方法。本发明所述真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.5～1.5份、背景压制剂0.07～0.15份、促溶剂10～15份、抗荧光衰退剂1～2.5份、表面活性剂0.3～0.8份、氯化钠0.5～1.5份。本发明将荧光增白剂和背景染料混合配制，该染色液通过加入抗荧光衰退剂、表面活性剂、促溶剂和氯化钠，显著提高染色液的染色效果和染色持久度，而且还能保证染色溶液能够长期稳定放置，不仅简化了标本染色步骤，并且还具有染色快、效果好的优点。

Description

一种真菌荧光染色液及其制备方法

技术领域

本发明属医学临床检验中病原菌生物学检验技术技术领域，尤其涉及一种真菌荧光染色液及其制备方法。

背景技术

镜检法是临床上常用的用于检测真菌的方法，具有步骤简单，速度快的优点。KOH法作为常用的镜检法，利用高浓度的碱溶解组织细胞，而不能溶解真菌细胞壁上的多糖的原理，通过观察真菌形态，分辨出真菌。虽然KOH真菌检测方法快速简便，但是由于KOH无法将组织完全溶解，真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，只有经验丰富的受过专业培训的检测人员才能将真菌和组织细胞区分开，缺乏经验者很难快速的识别真菌，从而引起很高的假阴性。因此，为了更好的区分真菌与组织细胞，人们使用各种染色的方法以提高真菌和组织的反差。

基于荧光的微生物活性检测手段具有灵敏度高、易于操作和检测速度快等优点，随着医疗检验水平的不断推进，近年来真菌荧光染色临床检验技术逐渐推广。荧光染色法是基于荧光增白剂与真菌细胞壁上的多糖结合，而不能结合组织细胞，在UV照射下激发出荧光的原理，将组织细胞与真菌区分且反差巨大。，荧光染色法亲和力高，反应时间只需数十秒钟即可完，大大提高了临床真菌检测的灵敏度和效率。

现有技术中的真菌荧光染色剂一般包括三种主要成分：荧光增白剂、氢氧化钾或氢氧化钠等无机碱和背景压制剂。荧光素与真菌细胞壁及寄生虫多糖成分相结合，产生荧光；氢氧化钾、氢氧化钠能溶解样品组织中的角质、消除杂质，并使组织透明；而背景压制剂能降低样品组织的背景亮度，使荧光信号更加清晰。然而，现有技术中的真菌荧光染色剂具有以下缺点：(1)荧光增白剂在强碱环境中稳定性差，荧光素会发生析出沉淀现象；(2)背景压制剂会影响荧光素的稳定性，会引起检测灵敏度的降低，甚至无法对真菌染色，因此染色液成分无法稳定长期共存，需分别配制储存，染色时需要两个甚至三个步骤才能完成，操作上相对繁琐，染色时间相对较长；(3)染色后荧光效果淬灭快，样本无法保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型真菌荧光染色液，本发明将荧光增白剂和背景染料混合配制，而且通过加入抗荧光衰退剂、表面活性剂、促溶剂和氯化钠，显著提高染色液的染色效果和染色持久度，而且还能保证试剂能够长期稳定放置。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.5～1.5份、背景压制剂0.07～0.15份、促溶剂10～15份、抗荧光衰退剂1～2.5份、表面活性剂0.3～0.8份、氯化钠0.5～1.5份。

作为优选，所述荧光增白剂为荧光增白剂28。

作为优选，所述背景压制剂包括伊红和苏木素，伊红和苏木素的重量比为1～2.5:1。

作为优选，所述促溶剂为二甲基亚砜。

作为优选，所述抗荧光衰退剂包括5～10份甘油、3～6份没食子酸丙酯和2～5份抗坏血酸。

作为优选，所述表面活性剂包括司盘、吐温，聚山梨酯、泊洛沙姆中的一种或几种。

作为优选，所述荧光增白剂的化学式为C₄₂H₂₉NO₂S，其结构式如下：

作为优选，所述荧光增白剂为纳米粒子荧光增白剂，具体制备方法为：将所述荧光增白剂的四氢呋喃溶液分散在水中得到反应液，然后向反应液中通入氩气进行鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液；将含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液过滤，即得到所述纳米粒子荧光增白剂。

作为优选，所述的真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.8～1.2份、伊红0.05～0.08份、苏木素0.02～0.05份、二甲基亚砜10～15份、甘油0.5～1份、没食子酸丙酯0.3～0.6份、抗坏血酸0.2～0.5份、表面活性剂0.3～0.5份、氯化钠0.8～1.0份。

作为优选，所述的真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.5～1.5份、氢氧化钾1～3份、背景压制剂0.07～0.15份、促溶剂10～15份、抗荧光衰退剂1～2.5份、表面活性剂0.3～0.8份、氯化钠0.5～1.5份。

一种真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取相应重量配比的促溶剂、抗荧光衰退剂、表面活性剂和氯化钠，依次加入去离子水中，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

(2)称取相应重量的荧光增白剂加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

(3)称取相应重量的背景压制剂加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

(4)在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

(5)最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。

有益效果

本发明公开了一种真菌荧光染色液，本发明将荧光增白剂和背景染料混合配制，该染色液为保证荧光素的稳定性，创新性地去掉了现有技术中常用的氢氧化钾或氢氧化钠等强碱，而且通过加入抗荧光衰退剂、表面活性剂、促溶剂和氯化钠，显著提高染色液的染色效果和染色持久度，而且还能保证染色溶液能够长期稳定放置，不仅简化了标本染色步骤，并且还具有染色快、效果好的优点，能够实现一滴快速染色，并且不受标本限制，特别对于大块、深部样本均有很好的染色效果，大大提高真菌检测效率。本发明所述的真菌荧光染色液，使用操作简便、观察清晰度高、特异性好、结果准确，有较好的临床应用前景。本发明所用的化学式为C₄₂H₂₉NO₂S的荧光染料，发射靠近红光区，可有效避免细胞自吸收和自身荧光的干扰，在生物体内有红光信号有更强的穿透力。

本发明所述真菌荧光染色液各配料的主要作用：

荧光增白剂：与真菌细胞壁β-多糖类物质特异性的结合，从而标记荧光进行检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下(340～400nm)，菌丝或孢子发出明亮的蓝绿色荧光；

氯化钠：提高荧光增白剂与真菌细胞壁结构的结合强度，在紫外荧光激发的情况下，可以让菌体结构突显的更加清晰可见、立体，更方便识别真菌。

抗荧光衰退剂：保证荧光素与真菌核糖体核糖核酸(rRNA)基因间隔(ITS)区特异性结合后能长期保持，同时也增加了目标真菌在镜检时发出的荧光强度，使目标真菌标本与背景之间的对比度大大增强，在镜检过程中使目标真菌更加显目。

背景压制剂：弱化杂乱背景，使背景与真菌对比明显，便于识别。

促溶剂：促进荧光增白剂在水中溶解，同时帮助荧光增白剂渗透进入样本中；通过添加促溶剂，使得试剂能够长期稳定放置，使原本需要多步操作的检测方法能够实现快速一步染色，并且缩短了染色时间。临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。

表面活性剂：面活性剂的作用是提高染色效果。

具体实施方式

以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。

以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。

实施例1

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂28 0.8份、伊红0.05份、苏木素0.02份、二甲基亚砜10份、甘油0.5份、没食子酸丙酯0.3份、抗坏血酸0.2份、表面活性剂0.3份、氯化钠0.8份。

上述真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取相应重量配比的二甲基亚砜、甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸、表面活性剂和氯化钠，依次加入去离子水中，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

(3)称取相应重量的伊红和苏木素加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

(4)在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

(5)最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。

实施例2

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂28 1.2份、伊红0.08份、苏木素0.05份、二甲基亚砜15份、甘油1份、没食子酸丙酯0.6份、抗坏血酸0.5份、表面活性0.5份、氯化钠1.0份。

上述真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取相应重量配比的二甲基亚砜、甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸、表面活性剂和氯化钠，依次加入去离子水中，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

(3)称取相应重量的伊红和苏木素加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

(4)在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

(5)最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。

利用所述真菌荧光染色液进行真菌荧光染色的方法：取真菌样本于干净的载玻片上，向样本中滴加一滴本发明实施例2制备的染色液，盖上盖玻片，当样本完全溶解后，将载玻片放置在显微镜上进行观察。

实施例3

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂28 1.0份、伊红0.07份、苏木素0.03份、二甲基亚砜13份、甘油0.8份、没食子酸丙酯0.5份、抗坏血酸0.4份、表面活性剂0.4份、氯化钠0.9份。

上述真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取相应重量配比的二甲基亚砜、甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸、表面活性剂和氯化钠，依次加入去离子水中，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

(3)称取相应重量的伊红和苏木素加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

(4)在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

(5)最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。利用实施例4

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂28 0.8份、氢氧化钾3份、伊红0.05份、苏木素0.02份、二甲基亚砜10份、甘油0.5份、没食子酸丙酯0.3份、抗坏血酸0.2份、表面活性剂0.3份、氯化钠0.8份。

上述真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取相应重量的氢氧化钾加入去离子水中进行充分搅拌溶解散热，待冷却至室温后，依次加入相应重量配比的二甲基亚砜、甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸、表面活性剂和氯化钠，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

(2)称取相应重量的荧光增白剂28加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

(3)称取相应重量的伊红和苏木素加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

(4)在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

(5)最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。

实施例5

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.8份、伊红0.05份、苏木素0.02份、二甲基亚砜10份、甘油0.5份、没食子酸丙酯0.3份、抗坏血酸0.2份、表面活性剂0.3份、氯化钠0.8份。

所述荧光增白剂的化学式为C₄₂H₂₉NO₂S，其结构式如下：

所述荧光增白剂为纳米粒子荧光增白剂，具体制备方法为：

(1)称取0.4g氢氧化钾溶于20mL的乙醇中，室温搅拌，使氢氧化钾充分溶解，将溶液冷却至0-8℃条件下，然后将4-(1,2,2-三苯乙烯基)苯乙酮(74.9mg,0.2mmol)缓慢滴加入上述氢氧化钾的乙醇溶液中，搅拌溶解后再缓慢滴加4-苯并噻唑-3-羟基苯甲(51.2mg,0.2mmol)，0-8℃条件下搅拌反应反应72h。反应结束后，向反应液中加入50mL的水，然后用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥后旋干得到粗产品，用硅胶柱层析分离(石油醚：二氯甲烷＝1：1)得到黄色纯品，即为所述荧光增白剂，收率62.6％

(2)将步骤1得到的所述荧光增白剂的四氢呋喃溶液分散在水中得到反应液，然后向反应液中通入氩气进行鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液；将含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液过滤，即得到所述纳米粒子荧光增白剂。

实施例6

一种真菌荧光染色液，包括以下重量份的组分：荧光增白剂1.0份、氢氧化钾3份、伊红0.07份、苏木素0.03份、二甲基亚砜13份、甘油0.8份、没食子酸丙酯0.5份、抗坏血酸0.4份、表面活性剂0.4份、氯化钠0.9份。

所述荧光增白剂的化学式为C₄₂H₂₉NO₂S，其结构式如下：

所述荧光增白剂为纳米粒子荧光增白剂，粒径为50<粒径≤200nm。

试验例1

利用本发明实施例1-6所得真菌荧光染色液进行真菌荧光染色与普通荧光染色液进行对比实验，结果如表1所示。

(1)对比例采用市售普通荧光染色液，具体方法为：取同一患者来源的患处皮屑于干净的载玻片上，向样本滴加市售普通荧光染色液，盖上盖玻片，当样本完全溶解后，将载玻片放置在显微镜上进行观察。

(2)使用本发明中实施例1-6所得的荧光染色液进行真菌检验的具体方法：取同一患者来源的患处于干净载玻片上，向样本滴加一滴本发明中实施例1-4所得的荧光染色液，盖上盖玻片，当样本完全溶解后，将载玻片放置在显微镜上进行观察。

表1.结果对比

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种真菌荧光染色液，其特征在于，包括以下重量份的组分：

荧光增白剂0.5～1.5份、背景压制剂0.07～0.15份、促溶剂10～15份、抗荧光衰退剂1～2.5份、表面活性剂0.3～0.8份、氯化钠0.5～1.5份；

该染色液中不包括强碱；

所述荧光增白剂为荧光增白剂28或化学式为C₄₂H₂₉NO₂S的荧光增白剂，其结构式如下：

；

所述荧光增白剂为纳米粒子荧光增白剂，具体制备方法为：将所述荧光增白剂的四氢呋喃溶液分散在水中得到反应液，然后向反应液中通入氩气进行鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液；将含有所述荧光增白剂的纳米粒子溶液过滤，即得到所述纳米粒子荧光增白剂；

所述促溶剂为二甲基亚砜；

所述背景压制剂包括伊红和苏木素，伊红和苏木素的重量比为1～2.5:1;

所述抗荧光衰退剂包括5～10份甘油、3～6份没食子酸丙酯和2～5份抗坏血酸；

所述真菌荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

（1）称取相应重量配比的促溶剂、抗荧光衰退剂、表面活性剂和氯化钠，依次加入去离子水中，搅拌均匀后得到溶液A，备用；

（2）称取相应重量的荧光增白剂加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液B，备用；

（3）称取相应重量的背景压制剂加入去离子水中进行充分搅拌溶解，得到溶液C，备用；

（4）在搅拌条件下将溶液B加入至溶液A中，充分混匀，得到溶液D；

（5）最后将溶液C与溶液D混合，即得到所述的真菌荧光染色液。

2.根据权利要求1所述的真菌荧光染色液，其特征在于，所述表面活性剂包括司盘、吐温、聚山梨酯、泊洛沙姆中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的真菌荧光染色液，其特征在于，包括以下重量份的组分：荧光增白剂0.8～1.2份、伊红0.05～0.08份、苏木素0.05份、二甲基亚砜10～15份、甘油0.5～1份、没食子酸丙酯0.3～0.6份、抗坏血酸0.2～0.5份、表面活性剂0.3～0.5份、氯化钠0.8～1.0份。