CN105950700A - 一种真菌荧光染色剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真菌荧光染色剂，包括荧光增白剂、背景染料以及稳定成分。本发明产品稳定性好，能够实现一滴快速染色，并且不受标本限制，对于大块、深部样本均适用，大大提高真菌检测效率。

Description

一种真菌荧光染色剂

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种真菌荧光染色剂。

背景技术

现今社会发展，生活节奏加快，免疫低下人群逐年上升，以致真菌引起的感染日渐突出。据WHO统计，能引起人类疾病的真菌约有270余种，根据感染部位又可分为浅表真菌和深部真菌。浅表真菌侵袭皮肤、毛发和指甲，而深部真菌感染心、肺、血液、胃肠等人体各个器官和系统，危及患者生命。目前治疗真菌感染的有效手段仍是抗生素类药物治疗。准确诊断感染的原因对选择适合治疗至关重要。最好的方法是从临床标本中分离出感染的病原菌，并进行形态学的鉴定。临床上常用培养法和镜检法来检测真菌，但由于各种病原菌的培养条件不一样，因此病原菌的分离非常复杂，分离周期很长，一般长达1-3周，而且形态学的鉴定也不确切。因此培养法虽然检测结果准确性高，但是耗时长，给重症病人的治疗带来了严重的危害。反观镜检法则步骤简单，速度快，有利于及时治疗。KOH法作为常用的镜检法，利用高浓度的碱溶解组织细胞，而不能溶解真菌细胞壁上的多糖的原理，通过观察真菌形态，分辨出真菌。虽然KOH真菌检测方法快速简便，但是由于KOH无法将组织完全溶解，真菌与组织细胞之间的反差不大，鉴别真菌非常困难，只有经验丰富的受过专业培训的检测人员才能将真菌和组织细胞区分开，缺乏经验者很难快速的识别真菌，从而引起很高的假阴性。通常为了更好的区分真菌与组织细胞，人们使用各种染色的方法以提高真菌和组织反差。常用的方法有：

(1)苏木素‐伊红法。苏木素-伊红法可将细胞核染成蓝色，蛋白质染成红色，通过形态分辨出真菌，但当样本过于稀疏或者真菌无法染色时就很难将组织细胞与真菌区别开来。

(2)高碘酸‐无色品红法(PAS)。PAS法可将真菌细胞壁上的多糖类物质中的乙二醇基(CHOH-CHOH)经过碘酸氧化，转变为二醛基(CHO-CHO)，与Schiff试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。通过观察真菌形态与颜色分辨真菌与组织细胞。但使用该法步骤繁琐，染色前需将无色品红液加热至室温，同时将玻片脱蜡并经高碘酸氧化，再用蒸馏水冲洗后移入无色品红液内(加盖)，于暗处作用15--20min。整个染色过程耗时长，受温度影响大。

(3)黏液胭脂红法。该法基于正负电荷结合的原理，铝与胭脂红形成一种螯合物带正电荷，可与低密度的酸基质像粘液这类物质结合。使用此法所用贮备液的配制要经过煮沸，其中所用的无水氯化铝较难保存，开瓶取用后需立即用蜡密封瓶口，否则很快吸潮失效，稳定性较差，染色时长达20-30min。

(4)阿尔辛蓝法(AB)，阿尔辛蓝作为一种阳离子染料，与酸性基团形成盐后，使胞质中的酸性粘多糖染成蓝色。AB法染液配制简单，染色步骤简易，特异性强，颜色鲜艳，性质稳定，但是染色时间长达15--20min，效率低。

(5)六胺银法(GMS)，GMS法基于碘酸氧化真菌细胞壁的多糖释放出醛基，将硝酸银还原成金属银的原理，使真菌染成棕黑色，从而与浅绿色背景形成反差。该法视觉效果好，但是步骤繁琐，使用前需将六胺银工作液，加热至60℃，玻片须脱蜡并用铬酸氧化，蒸馏水冲洗后移入已预热的六胺银工作液(加盖)。另外，该法对染色人员的技术要求极高，对染色时间掌握必须非常精准，染色时间过短则形态不清晰，染色时间过长则过染变黑，无法检测，整个过程难以控制。

(6)荧光染色法。荧光染色法是基于荧光增白剂与真菌细胞壁上的多糖结合，而不能结合组织细胞，在UV照射下激发出亮蓝光的原理，将组织细胞与真菌区分且反差巨大。现有技术下，使用荧光染色法对临床标本中分离出感染的病原菌进行形态学的鉴定时通常需要先使用含有荧光增白剂对样本染色，之后再使用背景染料对样本染色。这是由于荧光增白剂与背景染料两者互溶放置后稳定性较差，会引起引起检测灵敏度的降低，甚至无法对真菌染色，因此，染色溶液需分别配制储存，染色时需要两个步骤才能完成，操作上相对繁琐。并且，目前真菌染色液对于大块的脚皮、指甲等样本溶解速度较慢，需要更长时间才能溶解，使得真菌暴露出来，因此需要更长的染色时间，甚至需要加热来促进标本的溶解。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种单剂型的真菌荧光染色剂。本发明产品稳定性好，能够实现一滴快速染色，并且不受标本限制，对于大块、深部样本均适用，大大提高真菌检测效率。

本发明具体技术方案如下：

一种真菌荧光染色剂，包括水、荧光增白剂、碱、背景染料和促溶剂。

本发明所述真菌荧光染色剂还可以进一步包括保护剂和/或表面活性剂。

本发明所述荧光增白剂选自选二苯乙烯类型荧光增白剂，优选双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂，更优选荧光增白剂28，。优选荧光增白剂的浓度为0.1％-5％(W/V)。

荧光增白剂28结构如下所示：

本发明所述碱为无机碱，优选氢氧化钾或氢氧化钠。优选碱的浓度为7％-20％(W/V)，更优选7％-15％(W/V)。

本发明所述背景染料为本领域常规使用的染料，优选酚蓝类染料或蓝色偶氮类染料，更优选溴酚蓝、百里酚蓝，溴甲酚蓝、溴百里酚蓝、台酚蓝、伊文思蓝中的一种或几种，优选背景染料的浓度为0.1％-3％(W/V)。

本发明所述促溶剂选自水溶性有机溶剂，优选DMSO。促溶剂的作用是加速染料的染色速度。优选促溶剂的浓度为20-40％(V/V)。

本发明所述保护剂选自甘油，丙二醇，丁二醇中的一种或几种，优选甘油。保护剂的作用是增加荧光染色剂溶液整体保湿度以及折光度，提高反差，从而使得染色更为清晰。优选保护剂的浓度为10-40％(V/V)。

本发明所述表面活性剂优选非离子型表面活性剂，优选司盘、吐温，聚山梨酯、泊洛沙姆中的一种或几种，更优选吐温20或吐温100。表面活性剂的作用是提高染色效果。优选上述表面活性剂的浓度为0.01-0.05％(W/V)。

本发明将荧光增白剂和背景染料混合配制，通过添加促溶剂、保护剂和/或表面活性剂，使得染色溶液能够长期稳定放置，不仅简化了标本染色步骤，并且还具有染色快、效果好的优点，能够实现一滴快速染色，并且不受标本限制，特别对于大块、深部样本均有很好的染色效果，大大提高真菌检测效率。

附图说明

图1为本发明试剂1和试剂3的皮屑标本的染色结果(a为试剂1的染色结果，b为试剂3的染色结果)。

图2为本发明试剂1和试剂3的脚皮标本的染色结果(a为试剂1的染色结果，b为试剂3的染色结果)。

图3为本发明试剂1和试剂3的指屑标本的染色结果(a为试剂1的染色结果，b为试剂3的染色结果)。

图4为本发明试剂1混合液和试剂3放置6个月后的皮屑标本的染色结果(a为试剂1混合液的染色结果，b为试剂3的染色结果)。

具体实施方案

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1真菌荧光染料的配制

试剂1：

A液：将荧光增白剂28溶于浓度为10％(W/V)氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂的浓度为0.1％(W/V)。

B液：1％伊文思蓝溶液。

使用前需先将A液对样本染色，之后再使用B液对样本染色。

试剂2：

将荧光增白剂28溶于浓度为10％(W/V)氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂28的浓度为0.1％(W/V)，加入伊文思蓝染料和甘油，使伊文思蓝染料的浓度为1％(W/V)，甘油浓度为30％(V/V)。

试剂3：

将荧光增白剂28溶于浓度为15％(W/V)氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂染料的浓度为0.2％(W/V)，加入甘油，伊文思蓝染料和DMSO，使甘油的浓度为20％，伊文思蓝染料的浓度为1％(W/V)，DMSO浓度为20％(V/V)。

试剂4

将荧光增白剂28溶于浓度为15％氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂染料的浓度为0.2％，加入伊文思蓝染料、DMSO和吐温20，使伊文思蓝染料的浓度为1％(W/V)，DMSO浓度为20％(V/V)，吐温20的浓度为0.01％(W/V)。

试剂5

将荧光增白剂28溶于浓度为20％氢氧化钾的溶液中，溶解充分，使荧光增白剂染料的浓度为0.2％，加入伊文思蓝染料和DMSO，使伊文思蓝染料的浓度为1％(W/V)，DMSO浓度为20％(V/V)。

实施例2皮屑标本的染色

选择大小形状重量接近的5份皮屑标本，分别放置于载玻片上，加上一滴乙醇固定组织切片，室温放置5分钟，用水洗切片，将多余的水用纸吸干，分别用试剂1,2,3,4,5进行染色染色1分钟，加上盖玻片，将多余的染料用纸吸掉，而后在荧光显微镜下观察。用340nm–400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或浅黄绿色。结果显示所有的试剂都能将皮屑标本中的真菌染色。染色效果差别不大，染色所需时间基本一样。选取试剂1和试剂3为例，两者的染色结果如图1所示，结果表明两者均能够将皮屑标本中的真菌染色，但是试剂3对真菌染色的背景反差更大，更为清晰。

实施例3脚皮标本的染色

选择大小形状重量接近的5份小块脚皮标本分别放置于载玻片上，分别用试剂1,2,3,4,5进行染色，室温放置染色，如果脚皮没法染色，可适当延长染色时间，或者将染色温度提高，加速脚皮染色。加上盖玻片，而后在荧光显微镜下观察。用340nm–400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或黄绿色。结果如表1所示，结果表明，试剂3、4、5的染色速度最快，3分钟染色就能观察到真菌，试剂1染色速度最慢，染色30分钟才能看到少量的真菌。说明试剂1的灵敏度没有试剂2，3，4，5的高。选取试剂1和试剂3为例，两者的染色结果如图2所示，结果表明试剂1几乎无法对真菌染色，视野暗淡，真菌不可见，试剂3的染色效果很好视野明亮，真菌清晰可见。试剂3的染色时间和试剂5染色的时间一样，3分钟就能将脚皮中的真菌染色。

表1

	试剂1	试剂2	试剂3	试剂4	试剂5
						染色时间	30分钟	5分钟	3分钟	3分钟	3分钟
是否需要加热	是	否	否	否	否
						染色效果	差	好	好	好	好

实施例4指屑标本的染色

选择大小形状重量接近的5份小量指屑标本分别放置于载玻片上，分别用试剂1、2、3、4、5进行染色，室温放置染色，如果指屑没法溶掉，可适当延长染色时间，或者将染色温度提高，加速指屑溶解。加上盖玻片，而后在荧光显微镜下观察。用340nm–400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或浅黄绿色。结果如表2所示，结果表明，试剂3、4、5染色速度最快，能很快的将指屑染色，2分钟染色就能观察到真菌，试剂1染色速度最慢，，虽然经30分钟染色能看到真菌，但量很少。选取试剂1和试剂3为例，两者的染色结果如图3所示，结果表明试剂1几乎无法对真菌染色无法对真菌染色，视野暗淡，真菌不可见，试剂3的染色效果很好，视野明亮，真菌清晰可见。

表2

	试剂1	试剂2	试剂3	试剂4	试剂5
						染色时间	30分钟	5分钟	2分钟	2分钟	2分钟
是否需要加热	是	否	否	否	否
						染色效果	差	好	好	好	好

实施例5溶液稳定性考察

将试剂1的A液和B液的进行混合。将试剂1的混合液和试剂2，试剂3，试剂4，试剂5放置于室温6个月，然后对皮屑进行染色。从染色效果判断试剂的稳定性。结果如表3所示。

表3

	试剂1	试剂2	试剂3	试剂4	试剂5
						染色时间	/	1分钟	1分钟	1分钟	1分钟
观察到的菌数	放置1个月后没法染色	多	多	多	少
						染色效果	极差，没法染色	好	好	好	较好
沉淀	有	无	无	无	很少
						外观颜色	不变	不变	不变	不变	不变

结果表明，室温放置1个月后试剂1混合液出现沉淀，无法对样本进行染色。放置6个月后，试剂5由于碱浓度较高，出现少量沉淀，但离心后，上清仍能对真菌进行染色。试剂2，3，4的染色效果和灵敏度都没发生变化，染色时间短，效果好。选取试剂1和试剂3为例，两者的染色结果如图4所示，结果表明试剂1无法对真菌染色，视野暗淡，真菌不可见，荧光淬灭，试剂3的染色效果很好，视野明亮，真菌清晰可见。

Claims (10)

1.一种真菌荧光染色剂，其特征在于包括水、荧光增白剂、碱、背景染料和促溶剂，所述荧光增白剂为二苯乙烯类型荧光增白剂，所述碱为无机碱，所述促溶剂为水溶性有机溶剂。

2.如权利要求1所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述荧光增白剂为双三嗪氨基二苯乙烯类型荧光增白剂。

3. 如权利要求1所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述碱为氢氧化钾或氢氧化钠。

4.如权利要求1所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述背景染料选自溴酚蓝、百里酚蓝，溴甲酚蓝、溴百里酚蓝、台酚蓝、伊文思蓝中的一种或几种。

5.如权利要求1所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述促溶剂为DMSO。

6.如权利要求1所述的真菌荧光染色剂，其特征在于包括水、荧光增白剂28、氢氧化钾、伊文思蓝和DMSO。

7.如权利要求1-6任一项所述的真菌荧光染色剂，其特征在于还包括保护剂和/或表面活性剂。

8.如权利要求7所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述保护剂选自甘油，丙二醇，丁二醇中的一种或几种。

9.如权利要求7所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

10.如权利要求9所述的真菌荧光染色剂，其特征在于所述表面活性剂为吐温20或吐温100。