CN111521471A - 一种用于真菌d-葡聚糖检测荧光染色液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于体外真菌(1,3)‑β‑D‑葡聚糖荧光检测的荧光染色液及其制备方法，其特征在于，以重量百分比计，包括：荧光剂0.0005～0.1％，促溶剂8～15％，渗透剂3～10％，软化剂2～10％，盐2～5％，保湿剂5～15％，背景染料0.005～0.5％，余量为纯净水。本发明通过优化配方和制备工艺方法，实现一步法快速染色，使用荧光增白剂220与真菌细胞壁中的葡聚糖产生特异性的结合，并吸收紫外光，使菌丝及孢子发出明亮的蓝绿色荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓清晰可见，操作简单，节约检测时间，灵敏度高，具有良好的应用前景。

Description

一种用于真菌D-葡聚糖检测荧光染色液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种用于真菌葡聚糖荧光检测的荧光染色液及其制备方法。

背景技术

荧光染色法是一种快速有效检测真菌的新方法，不但为临床准确快速诊断真菌感染性疾病提供了依据，也为合理用药、快速治疗创造了条件。在基础医学、检验医学与临床医学之间开展抗感染研究建立了一条链接纽带。为浅部真菌和深部真菌导致的各种真菌感染性疾病提供了快速准确的早期诊断。

荧光染色法通过使用特殊的荧光剂，与真菌细胞壁的多糖物质相结合，如纤维素、(1,3)-β-D-葡聚糖等，在荧光显微镜的紫外激发光下使其呈现荧光。使用荧光染色液进行真菌检测，是介于传统检验方法中直接镜检法和生化检测法两者之间的一种检测方法。利用直接镜检的基本操作方法，通过分析观察到的染色后的真菌，能够对真菌和寄生虫感染导致的各种疾病，做出快速、准确的实验室检测。国内外已经有很多实验证实了荧光染色法确实具有反应灵敏度高、阳性检出率高、适用范围广、方便快捷等优点。

荧光染色法必需的三种主要成分为荧光剂、促溶剂和背景染料。荧光剂与真菌细胞壁中的葡聚糖特异性的紧密结合，能够对真菌标记荧光以便检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下(340-380nm)，使菌丝及孢子发出明亮的蓝绿色荧光；促溶剂能溶解样品组织中的角质，使组织透化；而背景染料能弱化杂乱背景,使背景与荧光标记的真菌产生强烈对比，益于判读。然而，由于荧光增白剂在强碱环境中稳定性差,且背景染料也会影响荧光剂的稳定性，引起检测灵敏度的降低，甚至无法对真菌染色。因此，在现有技术下，使用荧光染色法对临床标本中分离出感染的病原菌进行形态学的鉴定时，通常先用荧光增白剂对样本染色，再使用背景染料重复染色。鉴定过程中的染色液需先分开配制储存，染色时再经过两个步骤完成，操作上相对繁琐。此外，目前市面上的真菌荧光染色液对于大块的脚皮、指甲等样本溶解速度较慢，需要更长时间才能溶解样本并使真菌暴露出来，有时还需要加热来促进样本溶解。故亟需一种灵敏度高、响应快、配制简单的体外真菌检测的荧光染色液。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明具体采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液及其制备方法；本发明产品操作简单，反应灵敏，应用范围广，大大提高了体外真菌的检测效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液，以重量百分比计，包括：荧光剂0.0005～0.1％，促溶剂8～15％，渗透剂3～10％，软化剂2～10％，盐2～5％，保湿剂5～15％，背景染料0.005～0.5％，余量为纯净水；

进一步的，所述用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液，以重量百分比计，包括：荧光剂0.001％，促溶剂10％，渗透剂4％，软化剂5％，盐3.6％，保湿剂10％，背景染料0.01％，余量为纯净水；

进一步的，所述荧光剂为双三嗪氨基二苯乙烯型荧光增白剂；进一步优选的，所述荧光剂为荧光增白剂220，即4,4′-(4-二乙醇胺基-对磺酸苯胺基-1,3,5-三嗪-2-氨基)-二苯乙烯-2,2′-二磺酸钠盐，其结构如式Ⅰ所示：

进一步的，所述促溶剂为强碱；进一步优选的，所述促溶剂为氢氧化钾；

进一步的，所述软化剂为水杨酸；

进一步的，所述渗透剂选自水溶性有机溶剂，优选二甲基亚砜；

进一步的，所述盐选自无机盐，优选氯化钠；

进一步的，所述保湿剂为极性溶剂，优选甘油；

进一步的，所述背景染料为溴甲酚绿，即3，3′，5，5′-四溴间甲酚磺酰酞。

另一方面，本发明还提供了一种上述用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液的制备方法，包括以下步骤：

S1：按上述比例称取荧光剂并加入适量纯净水混合均匀，得到透明无色溶液1，待用；

S2：按上述比例称取促溶剂并加入适量纯净水混合均匀，冷却至室温后，按上述比例加入渗透剂和盐，超声至完全溶解，然后再按上述比例加入适量保湿剂振荡混合均匀，然后再按上述比例加入软化剂振荡混合均匀，得到透明无色溶液2，待用；

S3：按上述比例称取背景染料并加入适量纯净水混合均匀，得到墨绿色或深蓝色溶液3，待用；

S4：另取一个锥形瓶，将上述步骤S1、S3配制好的溶液1、3均加入到S2获得的溶液2中充分混合均匀，再定容各组分至配方量，过滤，即得。

有益效果

与现有技术相比，本发明用于体外真菌检测的荧光染色液具有以下优势：

1.本发明采用荧光增白剂220，荧光增白剂220是VBL(4,4′-双-(4- 羟乙胺基-苯胺基-1,3,5-三嗪-2-氨基)-二苯乙烯-2,2′-二磺酸钠盐)的改进产品，在配制过程中用量少，溶解度高，荧光增白剂220与真菌细胞壁(1,3)-β-D-葡聚糖中的结合，能够对真菌标记荧光以便检测，在荧光显微镜特定的激发光波段下，使菌丝及孢子发出明亮的蓝绿色荧光，从而与背景产生差异性对比；

2.本发明的真菌荧光染色液配方中所含的背景染料为溴甲酚绿，溴甲酚绿能弱化杂乱背景，降低杂质和非真菌细胞的干扰，在镜检过程中使目标荧光更加显目；

3.本发明配制的真菌荧光染色液主要用于定性组织学染色，可以检测各类真菌，包括皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌、曲霉及一些菌丝结构，适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液等各种标本，操作简捷，识别度高。

4.本发明配方中的促溶剂、软化剂、渗透剂等组分进行复配，采用特定用量以及制备方法本发明经过对于组分、用量、以及方法的考察，选取了特定组分、用量以及制备方法制备出真菌荧光染色液，具有灵敏度高、响应快以及操作简便的优势。

附图说明

图1：实施例3和对比例1的头皮屑样本染色效果图；其中图1A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图1B表示对比例1的头皮屑样本染色效果图

图2：实施例3和对比例2的头皮屑样本染色效果图；其中图2A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图2B表示对比例2的头皮屑样本染色效果图

图3：实施例3和对比例3的头皮屑样本染色效果图；其中图3A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图3B表示对比例3的头皮屑样本染色效果图

图4：实施例3和对比例4的头皮屑样本染色效果图；其中图4A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图4B～4D表示对比例4-1～4-3的头皮屑样本染色效果图

图5：实施例3和对比例5的头皮屑样本染色效果图；其中图5A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图5B～5D表示对比例5-1～5-3的头皮屑样本染色效果图

图6：实施例3和对比例6的头皮屑样本染色效果图；其中图6A表示实施例3的头皮屑样本染色效果图，图6B表示对比例6的头皮屑样本染色效果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

实施例1～3本发明提供的真菌荧光染色液主要配方成分见下表1 (所有数据均为质量百分含量)：

表1

	实施例1	实施例2	实施例3
				荧光剂(荧光增白剂220)	0.0005	0.1	0.001
促溶剂(氢氧化钾)	8	15	10
				渗透剂(二甲基亚砜)	3	10	4
软化剂(水杨酸)	2	10	5
				盐(氯化钠)	2	5	3.6
保湿剂(甘油)	5	15	10
				背景染料(溴甲酚绿)	0.005	0.5	0.01
纯净水	余量	余量	余量

实施例1～3的制备方法相同，制备方法包括以下步骤：

S1：使用电子天平按上述比例称取荧光剂并加入适量纯净水混合均匀，得到透明无色溶液1，待用；S2：按上述比例称取促溶剂并加入适量纯净水混合均匀，冷却至室温后，按上述比例加入渗透剂和盐，超声至完全溶解，然后再按上述比例加入甘油振荡混合均匀，然后再按上述比例加入软化剂水杨酸，振荡混合均匀，得到透明无色溶液2，待用；S3：按上述比例称取背景染料并加入适量纯净水混合均匀，得到墨绿色或深蓝色溶液3，待用；S4：另取一个锥形瓶，将上述步骤S1、S3配制好的溶液1、 3均加入到S2获得的溶液2中充分混合均匀，再定容各组分至配方量，过滤，即得。

对比例1～6(所有数据均为质量百分含量)

1.对比例1：对比例1的荧光剂替换为荧光增白剂28，荧光增白剂含量不变，其余组分不变，制备方法同实施例3，组成见下表2。

表2

当其他成分不变时，添加荧光增白剂220的染色液染色样本，显微镜下背景颜色较添加荧光增白剂28更加分明，观察的荧光显色更加清晰，荧光强度更大，更加容易观察真菌的分布。

2.对比例2：对比例2的背景染料替换为伊文思蓝，含量不变，其余组分不变，制备方法同实施例3，组成见下表3。

表3

当其他成分不变时，添加溴甲酚绿的染色液在显微镜观察下，荧光与背景的对比度更强烈，观察到的荧光轮廓更清晰。

3.对比例3：对比例3的氢氧化钾相对于实施例3含量发生改变，其余组分不变，制备方法同实施例3，组成见下表4。

表4

当其他成分不变时，15％的氢氧化钾对样品溶解度没有明显提升，样品仍有部分荧光分布在一团，没有完全暴露出来，分解效果没有大的提高。

4.对比例4：对比例4-1～4～3的强碱组成对于实施例3发生改变，其余组分不变，制备方法同实施例3，组成见下表5。

表5

当其他成分不变时，改变强碱的成分，即氢氧化钾和氢氧化钠的含量比例，随着氢氧化钠的含量增加，荧光对比越来越弱。

5.对比例5：对比例5-1～5～3的二甲基亚砜质量相对于实施例3发生改变，其余组分不变，制备方法同实施例3，组成见下表6。

表6

当其他成分不变时，二甲基亚砜含量超过16％以后，观察到的荧光变得不清晰，因此配制荧光染色液时二甲基亚砜含量应控制在16％以下。

6.对比例6：角质软化剂——水杨酸，组成见表7

表7

实施例3和对比例6相比，增加角质软化剂——水杨酸，观察到的实验现象：背景颜色改变(绿色→蓝色)，样本软化，手指按压盖玻片后，样本均匀平铺于载玻片上，真菌荧光多但无过多堆叠，分层现象减少，易于观察。

实验例

实验例1：荧光增白剂28和荧光增白剂220的水溶性定量实验：在 1ml纯净水中加入以下质量的荧光增白剂，振荡，观察是否完全溶解。溶解情况见下表8所示：

表8

结论：荧光增白剂28的溶解度质量分数约为0.03g/ml；荧光增白剂 220的溶解度质量分数≥0.4g/ml。

实验例2：真菌荧光染色液的使用方法

取头皮屑样本于载玻片中央，滴一滴真菌荧光染色液于样本上，并使其全部淹没样本为准，盖上盖玻片，再轻压盖玻片排出样本四周多余气泡，多余的染色液用滤纸吸掉，用手指轻轻按压盖玻片，使样本平铺于载玻片上。将载玻片固定在生物显微镜的载物台上，在340-380nm的紫外光下能看到染色真菌的蓝绿色荧光。

实验例3：冷冻试验

将荧光染色液测试液放在冰箱内冷冻一段时间后取出解冻，发现在室温下保存的染色液已经从深蓝色褪色为无色，但经冷冻保存的染色液仍呈蓝色，低温延缓了溴甲酚绿的褪色速度。显微镜观察经冷冻后的染色液，发现低温对其染色效果影响不大，从侧面反映出本发明荧光染色液的稳定性。

实验例3：常温试验

将荧光染色液测试液放在25℃水浴锅中恒温加热，因为二甲基亚砜受温度影响较大，低温时易凝固，在25℃时用显微镜观察，样品的分解度没有明显改变。

由此可见，本发明经过对于组分、用量、以及方法的考察，选取了特定组分、用量以及制备方法制备出真菌荧光染色液，具有灵敏度高、响应快以及操作简便的优势。

以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液，其特征在于，以重量百分比计，包括：荧光剂0.0005～0.1％，促溶剂8～15％，渗透剂3～10％，软化剂2～10％，盐2～5％，保湿剂5～15％，背景染料0.005～0.5％，余量为纯净水。

2.根据权利要求1所述的荧光染色液，其特征在于，以重量百分比计，包括：荧光剂0.001％，促溶剂10％，渗透剂4％，软化剂5％，盐3.6％，保湿剂10％，背景染料0.01％，余量为纯净水。

3.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述荧光剂为双三嗪氨基二苯乙烯型荧光增白剂；进一步优选的，所述荧光剂为荧光增白剂220，即4,4′-(4-二乙醇胺基-对磺酸苯胺基-1,3,5-三嗪-2-氨基)-二苯乙烯-2,2′-二磺酸钠盐，其结构如式Ⅰ所示：

4.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述促溶剂为强碱；进一步优选的，所述促溶剂为氢氧化钾。

5.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述软化剂为水杨酸。

6.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述渗透剂为水溶性有机溶剂；进一步优选的，所述渗透剂为二甲基亚砜。

7.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述盐为无机盐；进一步优选的，所述盐为氯化钠。

8.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述保湿剂为极性溶剂；进一步优选的，所述保湿剂为甘油。

9.根据权利要求1或2所述的荧光染色液，其特征在于，所述背景染料为溴甲酚绿，即3，3′，5，5′-四溴间甲酚磺酰酞。

10.一种权利要求1～9任一项所述用于体外真菌(1,3)-β-D-葡聚糖荧光检测的荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：按上述比例称取荧光剂并加入适量纯净水混合均匀，得到透明无色溶液1，待用；

S2：按上述比例称取促溶剂并加入适量纯净水混合均匀，冷却至室温后，按上述比例加入渗透剂和盐，超声至完全溶解，然后再按上述比例加入适量保湿剂振荡混合均匀，然后再按上述比例加入软化剂振荡混合均匀，得到透明无色溶液2，待用；

S3：按上述比例称取背景染料并加入适量纯净水混合均匀，得到墨绿色或深蓝色溶液3，待用；

S4：另取一个锥形瓶，将上述步骤S1、S3配制好的溶液1、3均加入到S2获得的溶液2中充分混合均匀，再定容各组分至配方量，过滤，即得。

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