CN114459862A - 一种高识别的真菌荧光染色液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.3‑1.5％、背景染料0.05‑0.25％、渗透剂3‑13％、抗荧光衰退剂1.5‑4.5％、表面活性剂0.01‑0.05％、稳定剂14‑32％、樟脑磺酸钠0.1‑0.4％、茶多酚0.3‑0.6％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.1‑0.3％、甜菜碱0.01‑0.03％、水溶性环糊精聚合物0.01‑0.03％、N,N‑二(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸钠0.01‑0.04％，余量为去离子水。本发明还公开了一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法。本发明公开的高识别的真菌荧光染色液识别性和灵敏度高，对真菌的染色效果佳，长期存放稳定性好，使用方便，适用性足，染色结果判读的准确率和效率优异。
Description
技术领域
本发明属于生物医学诊断技术领域，尤其涉及一种高识别的真菌荧光染色液。
背景技术
近年来，随着社会的发展，人们的生活节奏逐渐加快，来自生活和工作的压力愈来愈大，免疫低下人群数量逐年上升，以致真菌引起的感染日渐突出。特别是由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌检测对临床的诊断与治疗尤为重要，随着真菌检测技术的发展，有越来越多的方法可以应用于真菌的检测和鉴定。常见的检测方法有荧光染色法、派克墨水染色法、乳酸酚棉蓝染色法、过碘酸雪夫(PAS)染色法等等。然而，派克墨水染色法、乳酸酚棉蓝染色法、过碘酸雪夫(PAS)染色法等，却也有着步骤繁杂，反应时间长等缺点。荧光染色法是基于荧光增白剂与真菌细胞壁上的多糖结合，而不能结合组织细胞，在UV照射下激发出荧光的原理，将组织细胞与真菌区分且反差巨大。荧光染色法亲和力高，反应时间只需数十秒钟即可完，大大提高了临床真菌检测的灵敏度和效率。然而目前现有的荧光染色液存在着适用性低，对真菌的染色效果差，染色后荧光效果淬灭快，染色液长期存放不稳定，使得染色后荧光强度较低等缺点。除此之外，市面上的荧光染色液还或多或少存在识别性不佳、生产成本高，使用步骤繁琐、被检样本无法长期保存留档，组织切片染色过程中容易脱片等缺陷。
为了解决上述问题，中国发明专利申请CN109297790A涉及一种检测真菌的荧光染色液的配置方法，荧光增白剂280.001-0.003％、氢氧化钾5-15％、二甲基亚砜3-6％、氯化钠2-5％、甘油5-15％、伊文思蓝0.01-0.03％，余量为纯化水的配比而成，该发明所提供的荧光染色液的菌丝和孢子结构清晰可见，易于识别真菌，灵敏度高，提高了染色结果判读的准确率和效率，检出率高，适用范围广。然而，该荧光染色液对真菌的识别性、特异性和长期存放稳定性有待进一步提高。
因此，开发一种识别性和灵敏度高，对真菌的染色效果佳，长期存放稳定性好，使用方便，适用性足，染色结果判读的准确率和效率优异的高识别的真菌荧光染色液符合市场需求，具有广泛的市场价值和应用前景，对促进生物医学诊断领域的发展具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种识别性和灵敏度高，对真菌的染色效果佳，长期存放稳定性好，使用方便，适用性足，染色结果判读的准确率和效率优异的高识别的真菌荧光染色液。同时，本发明还提供了一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，该制备方法工艺简单、操作简便、能耗低、适合工业化生产应用，经济效益显著。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.3-1.5％、背景染料0.05-0.25％、渗透剂3-13％、抗荧光衰退剂1.5-4.5％、表面活性剂0.01-0.05％、稳定剂14-32％、樟脑磺酸钠0.1-0.4％、茶多酚0.3-0.6％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.1-0.3％、甜菜碱0.01-0.03％、水溶性环糊精聚合物0.01-0.03％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.01-0.04％，余量为去离子水。
优选的，所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:(1-3):(0.8-1.2)混合形成的混合物。
优选的，所述背景染料为伊文思蓝、溴甲酚蓝、溴酚蓝中的至少一种。
优选的，所述渗透剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
优选的，所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:(0.8-1.2):(2-4)混合形成的混合物。
优选的，所述表面活性剂为吐温20。
优选的，所述促溶剂为三乙胺、乙醇钠、叔丁基醇钾中的至少一种。
优选的，所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:(3-5)混合形成的混合物。
优选的，所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
本发明的另一个目的，在于提供一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)本发明提供的高识别的真菌荧光染色液，只需将各组分混合均匀后即可，无需复杂工艺和专用设备，资金投入少，劳动强度低，劳动环境好，原材料供应广泛，操作方便，制备效率高，易于大规模生产，经济效益显著。
(2)本发明提供的高识别的真菌荧光染色液，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.3-1.5％、背景染料0.05-0.25％、渗透剂3-13％、抗荧光衰退剂1.5-4.5％、表面活性剂0.01-0.05％、稳定剂14-32％、樟脑磺酸钠0.1-0.4％、茶多酚0.3-0.6％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.1-0.3％、甜菜碱0.01-0.03％、水溶性环糊精聚合物0.01-0.03％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.01-0.04％，余量为去离子水。各组分相互配合共同作用，使得制成的真菌荧光染色液识别性和灵敏度高，对真菌的染色效果佳，长期存放稳定性好，使用方便，适用性足，染色结果判读的准确率和效率优异。
(3)本发明提供的高识别的真菌荧光染色液，水溶性环糊精聚合物和促溶剂的加入能够促进荧光增白剂在水中溶解，同时帮助荧光增白剂渗透进入样本中，使得试剂能够长期稳定放置，使原本需要多步操作的检测方法能够实现快速一步染色，并且缩短了染色时间。临床使用更加方便、快捷，大大提高真菌的检测效率。
(4)本发明提供的高识别的真菌荧光染色液，所述促溶剂为三乙胺、乙醇钠、叔丁基醇钾中的至少一种；起到溶解角质，使组织透化的作用，采用这些有机碱代替传统无机强碱，能够有效保证荧光增白剂的稳定性，提高染色效果和长期存放稳定性。
(5)本发明提供的高识别的真菌荧光染色液，樟脑磺酸钠、茶多酚和烟酰胺腺嘌呤双核苷酸组合添加，协同作用，能有效改善荧光稳定性，进而提高染色结果判读的准确率和效率；改善染色效果。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。
实施例1
一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.3％、背景染料0.05％、渗透剂3％、抗荧光衰退剂1.5％、表面活性剂0.01％、稳定剂14％、樟脑磺酸钠0.1％、茶多酚0.3％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.1％、甜菜碱0.01％、水溶性环糊精聚合物0.01％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.01％，余量为去离子水。
所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:1:0.8混合形成的混合物。
所述背景染料为伊文思蓝；所述渗透剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:0.8:2混合形成的混合物；所述表面活性剂为吐温20；所述促溶剂为三乙胺。
所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:3混合形成的混合物；所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
实施例2
一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.6％、背景染料0.1％、渗透剂5％、抗荧光衰退剂2.5％、表面活性剂0.02％、稳定剂19％、樟脑磺酸钠0.2％、茶多酚0.4％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.15％、甜菜碱0.015％、水溶性环糊精聚合物0.015％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.02％，余量为去离子水。
所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:1.5:0.9混合形成的混合物；所述背景染料为溴甲酚蓝；所述渗透剂为二甲亚砜；所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:0.9:2.5混合形成的混合物。
所述表面活性剂为吐温20；所述促溶剂为乙醇钠；所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:3.5混合形成的混合物；所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
实施例3
一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂1.2％、背景染料0.15％、渗透剂9％、抗荧光衰退剂3％、表面活性剂0.035％、稳定剂26％、樟脑磺酸钠0.25％、茶多酚0.45％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.2％、甜菜碱0.02％、水溶性环糊精聚合物0.02％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.025％，余量为去离子水。
所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:2:1混合形成的混合物；所述背景染料为溴酚蓝；所述渗透剂为N-甲基吡咯烷酮。
所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:1:3混合形成的混合物；所述表面活性剂为吐温20；所述促溶剂为叔丁基醇钾；所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:4混合形成的混合物；所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
实施例4
一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂1.3％、背景染料0.22％、渗透剂11％、抗荧光衰退剂4.1％、表面活性剂0.04％、稳定剂30％、樟脑磺酸钠0.35％、茶多酚0.55％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.22％、甜菜碱0.025％、水溶性环糊精聚合物0.025％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.035％，余量为去离子水。
所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:2.5:1.1混合形成的混合物；所述背景染料为伊文思蓝、溴甲酚蓝、溴酚蓝按质量比1:2:3混合形成的混合物。
所述渗透剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮按质量比1:3:5混合形成的混合物；所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:1.1:3.5混合形成的混合物；所述表面活性剂为吐温20；所述促溶剂为三乙胺、乙醇钠、叔丁基醇钾按质量比1:3:5混合形成的混合物。
所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:4.5混合形成的混合物；所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
实施例5
一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂1.5％、背景染料0.25％、渗透剂13％、抗荧光衰退剂4.5％、表面活性剂0.05％、稳定剂32％、樟脑磺酸钠0.4％、茶多酚0.6％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.3％、甜菜碱0.03％、水溶性环糊精聚合物0.03％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.04％，余量为去离子水。
所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:3:1.2混合形成的混合物；所述背景染料为伊文思蓝；所述渗透剂为N-甲基吡咯烷酮；所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:1.2:4混合形成的混合物。
所述表面活性剂为吐温20；所述促溶剂为叔丁基醇钾；所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:5混合形成的混合物；所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
一种所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
对比例1
本例提供一种高识别的真菌荧光染色液，其配方和制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加烟酰胺腺嘌呤双核苷酸。
对比例2
本例提供一种高识别的真菌荧光染色液，其配方和制备方法与实施例1基本相同，不同的是没有添加水溶性环糊精聚合物和N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠。
为了进一步说明本发明实施例中所涉及的高密度聚氨酯泡棉的有益技术效果，将以上实施例1-5及对比例1-2制备的高识别的真菌荧光染色液进行相关性能实验，实验结果见表1。
测试方法如下：提前半小时打开超净工作台紫外灯消毒灭菌，操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；拿出配置好的培养基，与妇科样本相对应进行编号；按照对应编号，打开平板先在其上滴一滴已灭菌的生理盐水，将采样拭子蘸上生理盐水后均匀涂布在平板上，盖上培养皿盖，将采样拭子放回原管中；倒置培养皿于33℃生化培养箱中培养24～72h，期间观察培养皿内菌落生长情况。将样本转圈均匀涂至载玻片中间，滴加真菌荧光染色液，盖上盖玻片，镜检。对灵敏度、特异度、准确度和漏检率进行统计计算。
表1
| 项目 | 灵敏度 | 特异度 | 准确度 | 漏检率 |
| 单位 | ％ | ％ | ％ | ％ |
| 实施例1 | 75.16 | 99.59 | 92.98 | 8.33 |
| 实施例2 | 76.02 | 99.71 | 93.55 | 8.01 |
| 实施例3 | 76.89 | 99.78 | 94.02 | 7.69 |
| 实施例4 | 77.54 | 99.84 | 94.67 | 7.21 |
| 实施例5 | 78.22 | 99.90 | 95.11 | 6.98 |
| 对比例1 | 70.30 | 99.04 | 90.32 | 9.78 |
| 对比例2 | 71.05 | 89.89 | 90.10 | 9.32 |
由以上数据结果可以看出，本发明实施例公开的高识别的真菌荧光染色液较对比例灵敏度、特异度和准确度更高，漏检率更低；烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、水溶性环糊精聚合物和N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠的添加对改善上述性能均有益。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，由如下按质量百分比计的各组分制成：荧光增白剂0.3-1.5％、背景染料0.05-0.25％、渗透剂3-13％、抗荧光衰退剂1.5-4.5％、表面活性剂0.01-0.05％、稳定剂14-32％、樟脑磺酸钠0.1-0.4％、茶多酚0.3-0.6％、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸0.1-0.3％、甜菜碱0.01-0.03％、水溶性环糊精聚合物0.01-0.03％、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠0.01-0.04％，余量为去离子水。
2.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述荧光增白剂为荧光增白剂28、荧光增白剂31、荧光增白剂220按质量比1:(1-3):(0.8-1.2)混合形成的混合物。
3.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述背景染料为伊文思蓝、溴甲酚蓝、溴酚蓝中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述渗透剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述抗荧光衰退剂为抗坏血酸、肌醇六磷酸钾、没食子酸丙酯按质量比1:(0.8-1.2):(2-4)混合形成的混合物。
6.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20。
7.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述促溶剂为三乙胺、乙醇钠、叔丁基醇钾中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述稳定剂为水溶性聚合环糊精、甘油按质量比1:(3-5)混合形成的混合物。
9.根据权利要求1所述的高识别的真菌荧光染色液，其特征在于，所述水溶性聚合环糊精的CAS号为25655-42-9，购于上海麦克林生化科技有限公司，产品编号：S871829。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述高识别的真菌荧光染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按质量百分比混合均匀后，得到高识别的真菌荧光染色液。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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