CN107860631B - 一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良分枝杆菌荧光染色液，所述染色液由氧化液、初染液、脱色液和复染液组成；所述氧化液采用H2O2溶液或H5IO6溶液，所述初染液采用香豆素溶液。本发明经氧化液氧化后染色，保存时间长，染出的片子颜色鲜艳，对比度高，且无毒无害。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法。
背景技术
结核分枝杆菌是结核病患者存在的一种病菌，查找抗酸染色阳性结核分枝杆菌仍然是诊断结核病有效和准确的重要方法之一。十九世纪八十年代Ziehi与Neelsen共同发明了分枝杆菌抗酸染色法，在以后的一百多年来国内来诸多学者对该方法进行了诸多改良，其中以荧光萋-尼氏抗酸染色法敏感性好，具有对比度好、敏感性好、阳性率高的优势，无疑是临床最佳的染色方法。但这种染色法存在严重的缺陷：
1、染色液中金胺O的高毒性及强致癌性，限制了其推广；
2、染色液中荧光极易衰减且不能保存涂片，染片后必须立即观察，否则造成假阴性结果或各临床单位结论不一致；
3、这种染色液需要避光保存，见光及反复打开都极易导致染色液失效，不利于染色液商品化提供和临床染色方法标准化，故一直未能很好的推广。
发明内容
本发明针对上述技术问题，目的在于提供一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，经氧化液氧化后染色，保存时间长，染出的片子颜色鲜艳，对比度高，且无毒无害。
本发明通过下述技术方案实现：
一种改良分枝杆菌荧光染色液，所述染色液由氧化液、初染液、脱色液和复染液组成；所述氧化液采用H2O2溶液或H5IO6溶液，所述初染液采用香豆素溶液。
优选地，所述H2O2溶液为：质量百分含量为3％～10％的H2O2水溶液。
优选地，所述H5IO6溶液为质量百分含量为5％～20％的H5IO6水溶液。
优选地，所述初染液的组成为：7-氨基-4甲基香豆素、乙醇、蒸馏水和渗透剂，所述渗透剂采用高分子量嵌段共聚物溶液。
优选地，所述高分子量嵌段共聚物溶液包括DISPERBYK-2200或DISPERBYK-180。
优选地，所述初染液组成配比为：7-氨基-4甲基香豆素2.0g～5.0g，乙醇200～400mL，蒸馏水600～800mL，DISPERBYK-2200或DISPERBYK-180 20～100mL。
优选地，所述脱色液采用3％～5％的盐酸乙醇溶液。
优选地，所述复染液组成为：橙黄G 3.0～6.0g、乙醇200～400mL、蒸馏水600～800mL、KOH 0.05～0.20g。
基于上述改良分枝杆菌荧光染色液的染色方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，涂片经火焰固定，切片脱蜡至水；
步骤2，滴加氧化液盖满玻片，氧化后倾去氧化液；
步骤3，滴加初染液盖满玻片，染色；
步骤4，水洗并沥干水分；
步骤5，滴加脱色液，轻轻摇动玻片，脱色，然后水洗；水洗后可见残余红色，再滴加脱色液，摇动玻片直至涂片无红色脱出或略呈粉红色为止，水洗；
步骤6，滴加复染液，复染，水洗；干后镜检。
优选地，所述步骤2中氧化时间为5～20min，所述步骤3中染色时间为5～15min。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，先使用氧化液将抗酸杆菌细胞壁中的分枝菌酸的羧基氧化成醛基，然后7-氨基-4甲基香豆素在渗透剂的作用下能与醛基发生席夫碱反应，产生抗酸性的荧光基团，从而使香豆素与抗酸杆菌结合更加牢固，在激发光源激发下，产生强烈的蓝色荧光，并且不会破坏抗酸菌的蜡质屏障，复染不能上色。经氧化液氧化后，染出的片子不但颜色鲜艳，对比度高(抗酸菌为蓝色、非抗酸菌为橙黄色)，保存时间长，现有荧光染色液避光保存4小时左右，便会失效，而本发明提供的染色液可在避光条件下保持1周左右仍可用于检测；
2、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，7-氨基-4甲基香豆素无高毒性及致癌性，能够保证生产及使用的安全性；另外7-氨基-4甲基香豆素具有良好的化学稳定性，不易见光漂白；
3、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，现有苯酚具有毒性和很强的刺激性及挥发性，易通过呼吸道和皮肤被人体吸收，造成健康危害；本发明采用带有颜料亲和基团的高分子量嵌段共聚物溶液替代苯酚作为渗透剂，该渗透剂无毒、无味，并且是一种良好的湿润分散剂，能够增加碱性品红的溶解性和稳定性(抗絮凝、抗结晶析出)；
4、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，同时本发明渗透剂还是一种良好的表面活性剂，能显著减低表面张力，无需加热即可帮助碱性品红穿透抗酸菌细胞壁的蜡质屏障；
5、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，复染液采用橙黄G水溶液，非抗酸菌着色良好(橙黄色)，由于抗酸菌的蜡质屏障抗酸菌不能复染着色，与抗酸菌(在荧光显微镜下为蓝色)形成鲜明对比；现有技术中采用高锰酸钾溶液进行复染。
6、本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，采用的H2O2溶液作为氧化液，H2O2溶液为常用药品，成本较低，配制简单，在本发明中具有较高的应用附加值；此外H2O2(过氧化氢)的相对于H5IO6(正高碘酸)的稳定性更好，不仅不会破坏抗酸菌的蜡质屏障，且使用较少量就可以达到良好的效果，产品更易商品化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：
①氧化液：3％H2O2溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素 2.0g
乙醇 200mL
蒸馏水 800mL
DISPERBYK-2200 20mL
③脱色液：3％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 3.0g
乙醇 200mL
蒸馏水 800mL
KOH 0.05g。
实施例2
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：
①氧化液：5％H2O2溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素 3.0g
乙醇 250mL
蒸馏水 700mL
DISPERBYK-2200 50mL
③脱色液：3％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 4.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 700mL
KOH 0.10g。
实施例3
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：5％H2O2溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素 5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 650mL
DISPERBYK-180 50mL
③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 700mL
KOH 0.12g。
实施例4
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：8％H2O2溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 650mL
DISPERBYK-2200 50mL
③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 5.0g橙黄
乙醇 300mL
蒸馏水 700mL
KOH 0.12g。
实施例5
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：10％H2O2溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素5.0g
乙醇 400mL
蒸馏水 600mL
DISPERBYK-2200 100mL
③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 6.0g橙黄
乙醇 400mL
蒸馏水 600mL
KOH 0.20g。
实施例6
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：10％H5IO6溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 650mL
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③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 700mL
KOH 0.12g。
实施例7
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：10％H5IO6溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 650mL
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③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 5.0g
乙醇 300mL
蒸馏水 700mL
KOH 0.12g。
实施例8
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：①氧化液：5％H5IO6溶液
②出染液：7-氨基-4甲基香豆素 2.0g
乙醇 200mL
蒸馏水 800mL
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③脱色液：3％盐酸乙醇(95％)溶液
④复染液：橙黄G 3.0g
乙醇 200mL
蒸馏水 800mL
KOH 0.05g。
实施例9
本发明一种改良分枝杆菌荧光染色液及染色法，按以下配比配制染色液：
①氧化液：20％H5IO6溶液
②初染液：7-氨基-4甲基香豆素 5.0g
乙醇 400mL
蒸馏水 600mL
DISPERBYK-180 100mL
③脱色液：5％盐酸乙醇(95％)溶液
⑤复染液：橙黄 G6.0g
乙醇 400mL
蒸馏水 600mL
KOH 0.20g。
上述实施例1～9中配制的染色液，均按以下方法进行染色：
步骤1，涂片经火焰固定，切片脱蜡至水；
步骤2，滴加氧化液盖满玻片，氧化5～20min后，倾去氧化液；
步骤3，滴加初染液盖满玻片，染色5～15min；实际操作中可依据涂片厚度、环境温度适当增加染色时间；
步骤4，水洗并沥干水分；
步骤5，滴加脱色液，轻轻摇动玻片，脱色1～2min，然后水洗；水洗后可见残余红色，再滴加脱色液，摇动玻片直至涂片无红色脱出或略呈粉红色为止，水洗；
步骤6，滴加复染液，复染0.5～1min，水洗；干后镜检。
对比例1
与实施例4提供的分支杆菌染色液配置相同、染色方法相同，区别在于：
初染液的组成为：7-氨基-4甲基香豆素5.0g，乙醇300mL，蒸馏水650mL，不添加DISPERBYK-2200。
对比例2
与实施例9提供的分支杆菌染色液配置相同、染色方法相同，区别在于：
初染液的组成为：7-氨基-4甲基香豆素5.0g，乙醇400mL，蒸馏水600mL，不添加DISPERBYK-180。
对比例3
与实施例4提供的分支杆菌染色液配置相同、染色方法相同，区别在于：复染液采用相同量的高锰酸钾溶液进行复染。
对比例4
与实施例9提供的分支杆菌染色液配置相同、染色方法相同，区别在于：复染液采用相同量的高锰酸钾溶液进行复染。
性能测试：收集疑似结核菌感染的病人痰标本200例，分别采用传统的Ziehi-Neelsen抗酸染色法、对比例1～4、及实施例1～9对比染色。传统的Ziehi-Neelsen抗酸染色液的配制、染色方法及所有染色结果判定根据《结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》实施，实施例染色方法见以上具体实施方式。同时以非抗酸菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠埃希氏菌(ATCC25922)涂片抗酸染色，每组10片，统计结果如表1所示：
表1性能测试结果
从以上测试可知，改良后的染色法与传统的Ziehi-Neelsen抗酸染色法相比，可大大提高阳性检出率，其中以实施例2、实施例3、实施例5、实施例9最优，四组无明显差异。
金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠埃希氏菌(ATCC25922)涂片抗酸染色，10组(每组10片)镜检均为阴性，证明不会产生假阳性的结果。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述染色液由氧化液、初染液、脱色液和复染液组成；所述氧化液采用H2O2溶液或H5IO6溶液，所述初染液采用香豆素溶液；
所述初染液的组成为：7-氨基-4甲基香豆素、乙醇、蒸馏水和渗透剂，所述渗透剂采用高分子量嵌段共聚物溶液，所述高分子量嵌段共聚物溶液包括DISPERBYK-2200或DISPERBYK-180。
2.根据权利要求1所述的一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述H2O2溶液为：质量百分含量为3％～10％的H2O2水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述H5IO6溶液为质量百分含量为5％～20％的H5IO6水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述初染液组成配比为：7-氨基-4甲基香豆素2.0g～5.0g，乙醇200～400mL，蒸馏水600～800mL，DISPERBYK-2200或DISPERBYK-180 20～100mL。
5.根据权利要求1所述的一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述脱色液采用3％～5％的盐酸乙醇溶液。
6.根据权利要求1所述的一种改良分枝杆菌荧光染色液，其特征在于，所述复染液组成为：橙黄G 3.0～6.0g、乙醇200～400mL、蒸馏水600～800mL、KOH 0.05～0.20g。
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