CN111088314A - 一种改良的细菌活菌计数方法 - Google Patents

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周霜艳
解付兵
欧阳书径
曾宪军
刘宜德
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Shenzhen Yuepeng Environmental Protection Technology Co Ltd
Hunan Jingyi Xiangtai Environmental Protection High Tech Development Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

Abstract

本发明提出了一种改良的细菌活菌计数方法，包括以下具体步骤：(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜经过灭菌处理后组装好，放入超净工作台中待用；(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡均匀；(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，将滤膜缓慢贴至培养基上，避光培养，然后用甲醛固定；(4)将固定后的滤膜用吖啶橙染色，置于载玻片上，用显微镜计数荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。本发明的改良的细菌活菌计数方法，可降低取样量少带来的随机性，免去较长的静置时间，同时避免平板检测法浪费大量平板，直接采取显微镜计数，极大的提高了细菌活菌计数效率，具有节省材料、平行重复数多、效率高等优点。

Description

一种改良的细菌活菌计数方法
技术领域
本发明涉及生物科技技术领域，具体涉及一种改良的细菌活菌计数方法。
背景技术
现在常用的平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。将待测含菌样品经过一系列适当倍比稀释、充分振荡均匀之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，然后取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，统计培养出的菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中所含的活菌数。此法灵敏度较高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
但该方法在试剂操作过程中，仍有以下几个方面的问题有待改进：
1、稀释样液的取样量为0.1-0.2ml，取样量较小，若菌液没有完全分散、混匀，容易产生随机性，无法真实反应样品中实际活菌数的总体情况；
2、一个平板只能对一个样品的一个浓度梯度进行一次检测，一般一个样品的一个浓度梯度需要做3个平行样进行检测，若要检测多个浓度，则需要准备大量的平板；
3、平板涂布完毕后，需要静置5min-180min不等的时间，待稀释样液完全吸收后才可倒置放入培养箱培养，加上前期灭菌准备、操作时间，整个实验所需时间较长。
发明内容
本发明的目的在于提出一种改良的细菌活菌计数方法，可降低取样的随机性，免去较长的静置时间，极大的提高了细菌活菌计数效率，极大的提高了细菌活菌计数效率。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种改良的细菌活菌计数方法，包括以下具体步骤：
(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜经过灭菌处理后，再放入烘箱烘干至完全干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台中待用；
(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡均匀；
(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，抽滤完成后，将滤膜缓慢贴至培养基上，滤膜有菌的一面向上，避光培养，然后用甲醛固定；
(4)将固定后的滤膜用吖啶橙染色1-2min，置于载玻片上，用显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。
作为本发明的进一步改进，所述的砂芯过滤器、微孔滤膜要在121℃条件下灭菌30min。
作为本发明的进一步改进，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm，直径为50mm。
作为本发明的进一步改进，所述振荡时间为30s-90s。
作为本发明的进一步改进，所述吖啶橙的浓度为0.1-0.5wt％。
作为本发明的进一步改进，所述培养基中含有0.001-0.005wt％的萘啶酮和0.02-0.025wt％酵母膏。
作为本发明的进一步改进，所述避光培养条件为避光、25-30℃培养4-8h。
作为本发明的进一步改进，所述甲醛的最终浓度为1-3wt％。
作为本发明的进一步改进，所述烘箱温度为60-120℃。
作为本发明的进一步改进，所述显微镜为落射荧光显微镜。
本发明具有如下有益效果：本发明的改良的细菌活菌计数方法，使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤稀释样液，将细菌全部截留在滤膜上，再将滤膜贴培养基上进行培养，可降低取样量少带来的随机性，免去较长的静置时间，同时避免平板检测法浪费大量平板，直接采取显微镜计数，极大的提高了细菌活菌计数效率，具有节省材料、平行重复数多、效率高等优点。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种改良的细菌活菌计数方法
包括以下具体步骤：
(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜(孔径为0.22μm，直径为50mm)经过灭菌处理(121℃条件下灭菌30min)后，再放入烘箱60℃烘干至完全干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台中待用；
(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡30s；
(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，抽滤完成后，将滤膜缓慢贴至培养基上，培养基中含有0.001wt％的萘啶酮和0.02wt％酵母膏，滤膜有菌的一面向上，避光、25℃培养4h，然后用最终浓度为1wt％甲醛固定；
(4)将固定后的滤膜用浓度为0.1wt％吖啶橙染色1min，置于载玻片上，用落射荧光显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。
实施例2一种改良的细菌活菌计数方法
包括以下具体步骤：
(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜(孔径为0.22μm，直径为50mm)经过灭菌处理(121℃条件下灭菌30min)后，再放入烘箱120℃烘干至完全干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台中待用；
(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡90s；
(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，抽滤完成后，将滤膜缓慢贴至培养基上，培养基中含有0.005wt％的萘啶酮和0.025wt％酵母膏，滤膜有菌的一面向上，避光、30℃培养8h，然后用最终浓度为3wt％甲醛固定；
(4)将固定后的滤膜用浓度为0.5wt％吖啶橙染色2min，置于载玻片上，用落射荧光显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。
实施例3一种改良的细菌活菌计数方法
包括以下具体步骤：
(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜(孔径为0.22μm，直径为50mm)经过灭菌处理(121℃条件下灭菌30min)后，再放入烘箱90℃烘干至完全干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台中待用；
(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡60s；
(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，抽滤完成后，将滤膜缓慢贴至培养基上，培养基中含有0.003wt％的萘啶酮和0.022wt％酵母膏，滤膜有菌的一面向上，避光、27℃培养6h，然后用最终浓度为2wt％甲醛固定；
(4)将固定后的滤膜用浓度为0.3wt％吖啶橙染色1.5min，置于载玻片上，用落射荧光显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。
对比例1普通平板方法
1、将容量为250ml的砂芯过滤器和微孔滤膜放入高压蒸汽灭菌在121℃条件下灭菌30min，灭完菌后放入烘箱，80℃烘干至干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台待用；
2、将河水样品充分振荡均匀，并进行10倍倍比的梯度稀释，用涡旋振荡器将各稀释度的样品振荡30s，待用；
3、选择3个稀释浓度(10-4、10-5、10-6)的稀释样液，用微孔滤膜过滤，每个稀释浓度分别过滤3张滤膜；
4、将滤膜有菌的一面朝上，缓慢贴在细菌计数平板上，滤膜与平板之间不要留有气泡，同一个稀释度的三张滤膜可贴在同一个平板内，共9张滤膜、3个平板；
5、将贴有滤膜的平板倒置放入30℃恒温培养箱中培养24h后，取出计数。
对比例2普通荧光计数法
将样品加入甲醛固定，甲醛最终浓度2wt％，取10mL固定后样品加入浓度为0.3wt％吖啶橙，将染色水样经滤膜(孔径为0.22μm，直径为50mm)过滤；过滤后将滤膜置于载玻片上，用落射荧光显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体。
测试例1
将本发明实施例3和对比例1、2的方法进行比较，结果见表1。
表1
计数(10<sup>4</sup>个) RSD
实施例3 1.32 0.02
对比例1 0.82 0.12
对比例2 1.05 0.09
由表1可知，本发明实施例3改良的方法RSD更小，计数更为准确。
与现有技术相比，本发明的改良的细菌活菌计数方法，使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤稀释样液，将细菌全部截留在滤膜上，再将滤膜贴培养基上进行培养，可降低取样量少带来的随机性，免去较长的静置时间，同时避免平板检测法浪费大量平板，直接采取显微镜计数，极大的提高了细菌活菌计数效率，具有节省材料、平行重复数多、效率高等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)将过滤用的砂芯过滤器、微孔滤膜经过灭菌处理后，再放入烘箱烘干至完全干燥，冷却至室温后组装好，放入超净工作台中待用；
(2)使用涡旋振荡器将稀释样液振荡均匀；
(3)混匀的稀释样液用砂芯过滤器和微孔滤膜进行抽滤，抽滤完成后，将滤膜缓慢贴至培养基上，滤膜有菌的一面向上，避光培养，然后用甲醛固定；
(4)将固定后的滤膜用吖啶橙染色1-2min，置于载玻片上，用显微镜计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体，视野中长大或变粗的菌体为活菌。
2.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述的砂芯过滤器、微孔滤膜要在121℃条件下灭菌30min。
3.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm，直径为50mm。
4.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述振荡时间为30s-90s。
5.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述吖啶橙的浓度为0.1-0.5wt％。
6.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述培养基中含有0.001-0.005wt％的萘啶酮和0.02-0.025wt％酵母膏。
7.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述避光培养条件为避光、25-30℃培养4-8h。
8.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述甲醛的最终浓度为1-3wt％。
9.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述烘箱温度为60-120℃。
10.根据权利要求1所述一种改良的细菌活菌计数方法，其特征在于，所述显微镜为落射荧光显微镜。
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