CN108841729A - 一种用于真菌和细菌的细胞裂解液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于真菌和细菌的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液由NaOH、十二烷基硫酸钠(SDS)和蒸馏水组成，其中，NaOH浓度为4mM，SDS重量百分比含量为2％。本发明的用于真菌和细菌的细胞裂解液，成分很简单，只含有NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)，不需要额外添加氯仿等有害成分，成本低，经济高效。

Description

一种用于真菌和细菌的细胞裂解液及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，特别涉及一种微生物检验领域中用于真菌和细菌细胞裂解液及其制备方法和细胞裂解方法。

背景技术

近几年来，细菌和真菌的变异快，品种多，用普通的培养以及药敏已经很难完全准确的鉴定出其型别。所以核酸检测成为目前能够精确判断型别的可靠便利手段，核酸检测的前提条件是提取足够且质量可以的DNA或RNA，而对于这个要求的前提条件是细菌和真菌的细胞壁需要充分破裂，使得核酸充分释放出来，从而有利于进一步实验。

另一方面细菌和真菌都有一定的传染性，所以在提取核酸时为了避免扩散，所以希望能在第一步就使细菌和真菌灭活同时使得核酸释放，达到快速，少步骤地获取高质量核酸。

酚－氯仿方法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配。酚-氯仿方法经典、便宜，用的都是实验室常用试剂，提纯效率和纯度都很高，但缺点是费时费力，苯酚和氯仿还有一定毒性。

另外，目前市场上的DNA提取试剂盒原理是在特定溶液环境下(高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质(一般是硅胶膜)上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中。这些DNA提取试剂盒价格高，成分比较复杂，且步骤多，而且不能在第一步通过煮沸使细菌灭活，增加了感染的危险性。

发明内容

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供了一种用于真菌和细菌的细胞裂解液。

一种用于真菌和细菌的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液由NaOH、十二烷基硫酸钠(SDS)和蒸馏水组成，其中，NaOH浓度为4mM，SDS重量百分比含量为2％。

本发明的用于真菌和细菌的细胞裂解液，成分很简单，只含有NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)，不需要额外添加氯仿等有害成分，成本低，经济高效。经过大量的实验筛选出当NaOH浓度为4mM、SDS重量百分比含量为2％时，更有利于细胞裂解，提取DNA的效果最佳。

本发明还提供了一种用于真菌和细菌的细胞裂解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制NaOH储备液：在100ml蒸馏水中加入1.6gNaOH，磁力搅拌完全溶解，放入无菌带盖玻璃瓶中，保存于室温；

(2)配制NaOH工作液：取4mlNaOH储备液，加入96ml蒸馏水中制成浓度为4mM的NaOH工作液；

(3)加入SDS：取2g SDS溶液直接加入100ml NaOH工作液中，磁力搅拌使其完全溶解，SDS重量百分比含量为2％；得到用于真菌和细菌的细胞裂解液。

本发明的细胞裂解液的制备方法配制过程简单，操作方便。

本发明最后一个目的是提供一种真菌和细菌的细胞裂解方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制浓度为4mM的NaOH溶液：

(2)往NaOH溶液中加入SDS，使SDS的重量百分比含量为2％；获得细胞裂解液；

(3)挑取真菌或细菌细胞加入细胞裂解液中，振荡混匀，沸水浴10min，冷却后，7000rpm离心5min。

本发明具有以下优点：

(1)本发明的细胞裂解液成分极其简单，但是DNA提取效果能达到一般试剂盒的水平，使得DNA提取的成本大幅降低。

(2)细胞裂解方法操作快速简便，提取时间短，重复性强。

(3)避免了使用苯酚、氯仿等有毒物质，不会对操作人员的健康产生影响。

(4)用这个真菌和细菌细胞裂解液可以简单快速的提取真菌和细菌的核酸，减少污染，具有省时、省力的优势，在微生物检验领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明细胞裂解液提取的核酸PCR扩增后电泳图。其中样本1代表1S40001900018；2代表1S40001900023；3代表1S40001900002；4代表1S40001900035。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：配制真菌和细菌细胞裂解液

细胞裂解液由NaOH、十二烷基硫酸钠(SDS)和蒸馏水组成，其中，NaOH浓度为4mM，SDS重量百分比含量为2％。

配制方法如下：

(1)配制NaOH储备液：在100ml蒸馏水中加入1.6gNaOH，磁力搅拌完全溶解，放入无菌带盖玻璃瓶中，保存于室温；

(2)配制NaOH工作液：取4mlNaOH储备液，加入96ml蒸馏水中制成浓度为4mM的NaOH工作液；

(3)加入SDS：取2g SDS溶液直接加入100ml NaOH工作液中，磁力搅拌使其完全溶解，SDS重量百分比含量为2％；得到用于真菌和细菌的细胞裂解液。

实施例2：用真菌和细菌细胞裂解液提取真菌和细菌的核酸

1.接种环挑取10个菌落加入400μL细胞裂解液中，振荡混匀，沸水浴10min。冷却后，7000rpm离心5min，吸取上清转移至干净的EP管中(注：吸取上清时需避免吸到裂解后的菌体)。

2.加入等体积的异丙醇沉淀DNA，轻轻上下颠倒混匀。室温放置15min(期间可再颠倒混匀数次)，4℃12000rpm离心10min，弃上清(注：加入异丙醇后有时会产生较多的白色絮状沉淀，有可能是大量DNA，也有可能是蛋白等杂质)。

3.加入1mL75％冰冻乙醇，轻轻颠倒混匀，4℃12000rpm离心10min，弃上清，室温放置数分钟，晾干管内残余液体。

4.加入40μLTEbuffer，室温静置2min，溶解DNA，检测DNA浓度以及纯度后，-20℃或-30℃保存备用(注：2min后若仍有沉淀，则沉淀可能为蛋白等杂质，转移上清至另一干净EP管)。

实施例3

用实施例2方法提取3例细菌和1例真菌的DNA，并进行DNA浓度和纯度的测定，结果如下表：

样本编号	样本纯度OD260/280	样本浓度(ng/ml)
			1S40001900018	1.85	30.9
1S40001900023	1.87	43.9
			1S40001900035	1.79	37.3
1S50001800002	1.80	35.9

根据以上检测发现：一般核酸提取纯度在1.80-1.90之间是最好的，蛋白和盐离子的含量最少，所以用这个方法提取核酸，纯度和含量都与成品试剂盒提取到的核酸纯度一样，完全可以进行进一步的实验。

实施例4

为了进一步验证，本发明细胞裂解液提取的核酸是否完全可以应用到下一步的PCR扩增中，我们用真菌鉴定引物和细菌鉴定引物，用实施例3测完纯度和浓度的DNA为模板，进行PCR扩增，并跑胶结果如图1所示。从图可以看到，用真菌和细菌细胞裂解液提取的核酸完全可以用于后续的检测试验，而且条带清晰，产物含量很高。

Claims (3)

1.一种用于真菌和细菌的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液由NaOH、十二烷基硫酸钠(SDS)和蒸馏水组成，其中，NaOH浓度为4mM，SDS重量百分比含量为2％。

2.一种用于真菌和细菌的细胞裂解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制NaOH储备液：在100ml蒸馏水中加入1.6gNaOH，磁力搅拌完全溶解，放入无菌带盖玻璃瓶中，保存于室温；

(2)配制NaOH工作液：取4mlNaOH储备液，加入96ml蒸馏水中制成浓度为4mM的NaOH工作液；

(3)加入SDS：取2g SDS溶液直接加入100ml NaOH工作液中，磁力搅拌使其完全溶解，SDS重量百分比含量为2％；得到用于真菌和细菌的细胞裂解液。

3.一种真菌和细菌的细胞裂解方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制浓度为4mM的NaOH溶液：

(2)往NaOH溶液中加入SDS，使SDS的重量百分比含量为2％；获得细胞裂解液；

(3)挑取真菌或细菌细胞加入细胞裂解液中，振荡混匀，沸水浴10min，冷却后，7000rpm离心5min。