CN105779398A

CN105779398A - 12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法

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Publication number: CN105779398A
Application number: CN201510013217.0A
Authority: CN
Inventors: 王新杰; 高姗姗; 孙晓明; 胡祥钰
Original assignee: BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明提供一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法。所述试剂盒包括试剂A、试剂B和试剂C，试剂A为链霉素磁珠悬液，试剂B为12种生物素化的单克隆抗体混合液，试剂C为10×免疫磁珠分离纯化体系缓冲液。所述方法步骤包括：(1)病原悬液的准备过程；(2)生物素抗体制备过程；(3)病原的免疫纯化过程。本发明提供的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法，可同时、快速、有效地纯化样品中的猪细小病毒(PPV)、猪链球菌II型(SS-II)、猪伪狂犬病毒(PRV)等12种病毒及细菌。所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，有利于后续的快速诊断和有效检测工作。

Description

12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法

技术领域

本发明涉细菌及病毒的生物技术检测领域，特别是涉及一种采用免疫磁珠同时分离纯化12种猪常见病毒及细菌的试剂盒及方法。

背景技术

我国是农业畜牧业大国，猪类养殖以规模化集约化养殖为主，高密度的养殖方式也使得猪类的传染性疾病难以预防，且问题日益显著。而且多种病原同时感染，导致诊断及预防疾病发生也十分困难。猪类常见的传染性疾病病原有猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、猪链球菌II型(Streptococcussuistype2，SS-II)、猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus，PRV)、猪圆环II型病毒(Porcinecircovirus-2，PCV-2)、传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TEGV)、流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)、轮状病毒(Porcinerotavirus，PRTV)、猪流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)、猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)、猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)、猪蓝耳病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Highpathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，Hp-PRRSV)等。目前对猪细菌的分离纯化方法主要是采用挑菌、接种培养基平板的方法，该方法不仅费时，而且漏检率高。病毒的分离纯化方法主要是使用细胞培养的方法，该方法对操作人员要求较高，且对实验室环境及实验设备要求较高，且周期较长。

免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbead-basedseparation)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，可以有效捕获样品中的病原，去除复杂样本中的抑制物，减少培养时间，富集大量样本中的靶目标。本发明免疫磁珠是以免疫学为基础，将链霉素磁珠偶联生物素化的多种单克隆抗体，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离纯化病原。免疫磁珠具有特异性好，敏感度高的特点，提高了分离纯化的准确率，减少假阳性的出现。

目前已有相关的研究针对不同病原菌或病毒利用免疫磁珠进行分离纯化。例如，申请号为CN201110349281.8公开了腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法，它采用免疫磁珠对腐败希瓦氏菌进行富集，并进行FQ-PCR检测。申请号为CN200810198009.2公开了一种轮状病毒实时荧光PCR检测试剂盒。申请号为CN201210062791.1公开了一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法。申请号为CN201410182398.5公开了一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法。但对于使用免疫磁珠对多种病毒及细菌进行免疫纯化分离的研究较少，对于生物素化链霉素磁珠的分离纯化条件没有进行详细的研究。本发明利用免疫反应、生物素-链霉素偶联及磁场动力效应，对12种猪常见病毒及细菌的进行分离纯化，可提高病原的富集浓度及检测灵敏度。同时通过该方法的操作简单，稳定性好，耗时少的特点，可减少病原检测时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，能够对12种病原进行快速分离纯化。

具体的针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

(1)免疫磁珠的制备。

进一步的，所述步骤(1)具体包括以下步骤：

1)将12种单克隆抗体进行生物素化标记；

2)将步骤1)的12种生物素化的单克隆抗体偶联链霉素磁珠(StreptavidinParticlesPlus-DM)；

3)制备含有生物素化单克隆抗体包被的链霉素磁珠的反应体系；

进一步的，步骤1)中单克隆抗体终浓度为480ng/ml。

进一步的，步骤2)链霉素磁珠终浓度为20μg/ml，室温下孵育30min。

进一步的，步骤2)链霉素磁珠需要使用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次备用。

进一步的，步骤3)单克隆抗体-磁珠复合物需在磁力作用下6-8min并弃去上清。

进一步的，步骤3)的洗涤过程需要使用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次。

(2)制备待测样品：

将待检样品离心，弃上清，重悬于3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)缓冲液中。

(3)目的细菌或病毒富集：

进一步的，所述步骤(3)具体包括以下步骤：

1)将3ml待检样品重悬液加入生物素化的单克隆抗体偶联链霉素磁珠反应体系中在室温下孵育30min，缓慢震荡。

2)将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。

3)用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.4)洗涤磁珠3次，用磁力架辅助。

4)将分离纯化后的悬液样品3000rpm离心10min，弃去上清。

(4)纯化病毒或细菌的核酸提取

按DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP422)说明书操作，分别提取猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA及猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Hp-PRRSV)RNA，保存于-20℃备用。

(5)荧光定量PCR检测

进一步的，所述步骤(5)具体包括以下步骤：

1)根据12种病原不同保守性特异序列设计并合成特异性引物：所述猪圆环II型的特异上游引物序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；所述猪圆环II型的特异下游引物序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；所述猪伪狂犬的特异上游引物序列为SEQIDNO：4所示的核苷酸序列；所述猪伪狂犬的特异下游引物序列为SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；所述猪细小病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：7所示的核苷酸序列；所述猪细小病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：8所示的核苷酸序列；所述猪链球菌II型的特异上游引物序列为SEQIDNO：10所示的核苷酸序列；所述猪链球菌II型的特异下游引物序列为SEQIDNO：11所示的核苷酸序列；所述猪瘟病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：13所示的核苷酸序列；所述猪瘟病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：14所示的核苷酸序列；所述猪口蹄疫病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：16所示的核苷酸序列；所述猪口蹄疫病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：17所示的核苷酸序列；所述猪蓝耳病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：19所示的核苷酸序列；所述猪蓝耳病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：20所示的核苷酸序列；所述高致病猪蓝耳病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：22所示的核苷酸序列；所述高致病猪蓝耳病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：23所示的核苷酸序列；所述猪流感病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：25所示的核苷酸序列；所述猪流感病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：26所示的核苷酸序列；所述传染性胃肠炎病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：28所示的核苷酸序列；所述传染性胃肠炎病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：29所示的核苷酸序列；所述流行性腹泻病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：31所示的核苷酸序列；所述流行性腹泻病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：32所示的核苷酸序列；所述轮状病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：34所示的核苷酸序列；所述轮状病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：35所示的核苷酸序列。

2)使用RealMasterMix(SYBRGreen)(天根生化科技公司，货号FP202)检测提取的DNA，荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；检测样品核酸1μl；2.5×RealMasterMix/20×SYBRSolution，9μl；余量为无核酸酶水。使用QuantOneStepqRT-PCR(SYBRGreenI)Kit(天根生化科技公司，货号FP303)检测提取的RNA，荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；检测样品核酸1μl；2×QuantOneStepSYBRqRT-PCRMasterMix，10μl；HotmasterTaqPolymerase1μl；QuantRTase0.4μl；余量为无核酸酶水。

进一步的，所述以DNA为模板的荧光定量PCR反应条件为：95℃2min，为第一步循环；95℃15s，60℃30s，68℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。所述以RNA为模板的荧光定量PCR反应条件为：50℃30min，为第一步循环；95℃2min，为第二步循环；94℃20s，60℃20s，68℃20s，为第三步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

(1)免疫磁珠分离纯化法能够有效的分离病原，去除样品中杂质及抑制物。

(2)免疫磁珠分离纯化法可对同一样品进行多种病原的分离纯化。

(3)免疫磁珠分离纯化操作简单，仪器设备简单，且不易受环境影响，可实现野外操作(可使用金标卡等便携式检测试剂或设备进行后续检测)，操作时间短(不到半个工作日内就能完成分离纯化工作)。

(4)特异性强，敏感性高，是一种准确而快速的微生物分离纯化方法。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1荧光定量PCR反应液对猪圆环II型病毒检测。1：猪圆环II型病毒经免疫磁珠纯化后提取的DNA；2：猪圆环II型病毒样品直接提取的DNA；3：阴性对照。

图2荧光定量PCR反应液对猪伪狂犬病毒特异性检测。1：猪伪狂犬病毒经免疫磁珠纯化后提取的DNA；2：猪伪狂犬病毒样品直接提取的DNA；3：阴性对照。

图3荧光定量PCR反应液对猪链球菌II型细菌特异性检测。1：猪链球菌II型细菌经免疫磁珠纯化后提取的DNA；2：猪链球菌II型细菌样品直接提取的DNA；3：阴性对照。

图4荧光定量PCR反应液对猪细小病毒特异性检测。1：猪细小病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：猪细小病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图5荧光定量PCR反应液对猪瘟病毒特异性检测。1：猪瘟病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：猪瘟病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图6荧光定量PCR反应液对猪口蹄疫病毒特异性检测。1：猪口蹄疫病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：猪口蹄疫病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图7荧光定量PCR反应液对猪蓝耳病毒特异性检测。1：猪蓝耳病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：猪蓝耳病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图8荧光定量PCR反应液对高致病猪蓝耳病毒特异性检测。1：高致病猪蓝耳病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：高致病猪蓝耳病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图9荧光定量PCR反应液对猪流感病毒特异性检测。1：猪流感病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：猪流感病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图10荧光定量PCR反应液对传染性胃肠炎病毒特异性检测。1：传染性胃肠炎病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：传染性胃肠炎病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图11荧光定量PCR反应液对流行性腹泻病毒特异性检测。1：流行性腹泻病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：流行性腹泻病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

图12荧光定量PCR反应液对轮状病毒特异性检测。1：轮状病毒经免疫磁珠纯化后提取的RNA；2：轮状病毒样品直接提取的RNA；3：阴性对照。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例112种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化方法建立

一、材料：链霉素磁珠(货号SVP-05-100)购自美国Becton，DickinsonandCompany公司；猪圆环II型病毒单克隆抗体(货号ab183908)、猪伪狂犬病毒单克隆抗体(货号ab3534)、猪链球菌II型单克隆抗体(货号ab251629)、猪细小病毒单克隆抗体(货号ab140431)、传染性胃肠炎病毒单克隆抗体(货号ab10024)、流行性腹泻病毒单克隆抗体(货号ab161706)、轮状病毒单克隆抗体(货号ab130835)、猪流感病毒单克隆抗体(货号ab128412)、猪瘟病毒单克隆抗体(货号ab161081)和猪口蹄疫病毒单克隆抗体(货号ab82724)均购自艾博抗(上海)贸易有限公司；猪蓝耳病毒单克隆抗体(货号bs-4507R)和高致病猪蓝耳病毒单克隆抗体(货号bs-4504R)购自北京博奥森生物技术有限公司；病毒及细菌保存株由北京亿森宝生物科技有限公司保存。

其它试剂的制备：

含有3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)的制备：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g；

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g；

氯化钠(NaCl)：8g；

氯化钾(KCl)：0.2g；

牛血清蛋白(BSA)：3g；

加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

二、磁珠的准备过程

1.轻轻摇晃装磁珠小瓶，悬浮磁珠，获得均匀一致的悬浮液。计算磁珠和生物素化抗体所需用量。每mg链霉亲和素磁珠需要大约5-20μg生物素化抗体。根据抗血清体积对磁珠结合单克隆抗体的影响，于是用3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)稀释的链霉素磁珠包被终浓度为20μg/ml，设置12种抗体终浓度各为40ng/ml，总抗体浓度为480ng/ml。

2.取60μl浓度为1mg/ml的链霉素磁珠悬浮液到备用12mm×75mm的流式细胞管中，加入3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)。

3.将管子放在磁力架6-8min。

4.磁力架辅助，用移液器将管中上清移去(此时管置于磁力架上)，避免移液器枪头触及管内壁。

5.从磁力架上取下管子，加入3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)。

6.重复洗一次(步骤3-5)，然后加入3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)。放置于室温备用。

三、细菌或病毒悬液的准备过程

1.将样品加适量灭菌水混匀制成悬液，3000rpm离心10min弃上清。

2.用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)反复冲洗后离心弃上清，保留沉淀。

3.用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)将沉淀物质稀释重悬，制备成样品悬液。放置于室温备用。

四、生物素化单克隆抗体制备

1.将待生物素化的单克隆抗体用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)缓冲液(pH8.6)稀释到1mg/ml。

2.交互用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)，对蛋白质充分透析。

3.用1mlDMSO溶解NHSB1mg。

4.向1ml蛋白质溶液(蛋白质浓度为1mg/ml)加入120μlNHSB溶液(NHSB浓度为1mg/ml)。

5.在室温下持续搅拌2～4小时。

6.加入9.6μl1mol/LNH₄Cl，室温搅拌10分钟。

7.4℃下进行充分透析，除去游离的生物素。

8.将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1～3ml之间洗下。

9.最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。将结合产物加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。

10.将标记有生物素的12种单克隆抗体进行等比例混匀，并制备成总抗体浓度为1mg/ml的混合液。

五、12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化

1.取清洗好的磁珠悬液3ml终浓度为20μg/ml的链霉素磁珠。

2.加入1.44μl12种生物素化单克隆抗体混合液。在室温下孵育30min，缓慢震荡。

3.将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。

4.用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次，弃去上清，用磁力架辅助。

5.将待分离纯化的样品悬液加入到体系中，每管加入量为3ml。

6.将链霉素磁珠和生物素化抗体复合物与样品在室温下孵育30min，缓慢震荡。

7.将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。

8.用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次，用磁力架辅助。

9.将分离纯化后的细菌或病毒悬液3000rpm离心10min，弃去上清。

六、纯化病毒或细菌的核酸提取

按DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP422)说明书操作，分别直接提取各200μl猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)样品的基因组DNA及猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒(Hp-PRRSV)样品的RNA。同时使用DNA/RNA共提取试剂盒提取经过免疫磁珠分离纯化后的各200μl样品的DNA或RNA，保存于-20℃备用。

七、荧光定量PCR检测

1.根据12种病原不同保守性特异序列设计并合成特异性引物：

表1引物序列表

2.荧光定量PCR扩增：

1)使用RealMasterMix(SYBRGreen)(天根生化科技公司，货号FP202)检测猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA。先将20×SYBRSolution在室温下平衡并彻底混匀。将20×SYBRSolution全部加入至2.5×RealMasterMix中充分混匀。

表2DNA荧光定量PCR反应体系配制表

试剂	使用量
		上游引物	0.4μl
下游引物	0.4μl
		2.5×Real MasterMix/20×SYBR Solution	9μl
DNA	1μl
		灭菌去离子水	9.2μl

荧光定量PCR反应条件为：95℃2min，为第一步循环；95℃15s，60℃30s，68℃30s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

2)使用QuantOneStepqRT-PCR(SYBRGreenI)Kit(天根生化科技公司，货号FP303)检测猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒(Hp-PRRSV)RNA。

表3RNA荧光定量PCR反应体系配制表

荧光定量PCR反应条件为：50℃30min，为第一步循环；95℃2min，为第二步循环；94℃20s，60℃20s，68℃20s，为第三步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

结果如图1所示，检测直接提取样本中的猪圆环II型病毒DNACt值为13.31，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪圆环II型病毒DNACt值为10.21，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如2所示，检测直接提取样本中的猪伪狂犬病毒DNACt值为21.49，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪伪狂犬病毒DNACt值为15.96，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如3所示，检测直接提取样本中的猪链球菌II型DNACt值为22.67，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪链球菌II型DNACt值为21.35，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如4所示，检测直接提取样本中的猪细小病毒RNACt值为12.66，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪细小病毒RNACt值为8.67，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如5所示，检测直接提取样本中的猪瘟病毒RNACt值为23.12，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪瘟病毒RNACt值为22.17，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如6所示，检测直接提取样本中的猪口蹄疫病毒RNACt值为22.67，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪口蹄疫病毒RNACt值为22.11，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如7所示，检测直接提取样本中的猪蓝耳病毒RNACt值为10.50，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪蓝耳病毒RNACt值为7.93，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如8所示，检测直接提取样本中的高致病猪蓝耳病毒RNACt值为18.65，检测免疫磁珠分离纯化后提取的高致病猪蓝耳病毒RNACt值为13.41，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如9所示，检测直接提取样本中的猪流感病毒RNACt值为21.80，检测免疫磁珠分离纯化后提取的猪流感病毒RNACt值为19.30，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如10所示，检测直接提取样本中的传染性胃肠炎病毒RNACt值为16.80，检测免疫磁珠分离纯化后提取的传染性胃肠炎病毒RNACt值为13.69，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如11所示，检测直接提取样本中的流行性腹泻病毒RNACt值为19.81，检测免疫磁珠分离纯化后提取的流行性腹泻病毒RNACt值为16.69，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。如12所示，检测直接提取样本中的轮状病毒RNACt值为29.05，检测免疫磁珠分离纯化后提取的轮状病毒RNACt值为24.13，扩增曲线均呈S形，阴性对照样品无非特异性扩增。从结果中可以看出经过免疫磁珠纯化的病原核酸检测结果均比直接提取样品中的核酸的Ct值小1-5个循环，即经过免疫磁珠纯化的靶目标病原核酸提取量约为直接提取样品中的靶目标病原核酸的10倍-100倍。

实施例2：12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒制备及样品检测

一、试剂盒的制备：

试剂A：链霉素磁珠1ml(1mg/ml)。(Becton，DickinsonandCompany，美国)

试剂B：生物素化的单克隆抗体混合液1μg/μl，25μl。

试剂C：10×免疫磁珠分离纯化体系缓冲液100ml，制备方法如下：

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g

氯化钠(NaCl)：8g

氯化钾(KCl)：0.2g

牛血清蛋白(BSA)：3g

加去离子水约80ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到100ml。高温高压灭菌后4℃保存。(使用时需用灭菌水进行10倍稀释)

二、细菌或病毒悬液的准备过程

1.使用前将试剂C使用灭菌的去离子水稀释10倍。

2.将132份已知样品制成3ml悬液，具体为将样品加适量灭菌水混匀制成悬液，3000rpm离心10min弃上清。

3.用3ml试剂C反复冲洗后离心弃上清，保留沉淀。

4.用3ml试剂C将沉淀物质稀释重悬，制备成样品悬液。放置于室温备用。

三、免疫磁珠分离纯化步骤：

1.轻轻摇晃装试剂A小瓶，悬浮磁珠，获得均匀一致的悬浮液。

2.取60μl试剂A到备用12mm×75mm的流式细胞管中，加入3ml试剂C。

3.将管子放在磁力架6-8min。

4.用移液器将管中上清移去(此时管置于磁力架上)，避免移液器枪头触及管内壁。

5.从磁力架上取下管子，加入3ml试剂C。

6.重复洗一次(步骤3-5)，放置于室温备用。

7.在上述体系中，加入1.44μl试剂B，室温下孵育30min，缓慢震荡。

8.将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。

9.将待分离纯化的样品悬液加入到体系中，每管加入量为3ml。

10.将磁珠和生物素化抗体复合物与样品在室温下孵育30min，缓慢震荡。

11.将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。

12.用3ml试剂C洗涤磁珠3次，用磁力架辅助。

13.将分离纯化后的样品3000rpm离心10min，弃去上清，得沉淀。

四、免疫磁珠分离纯化后样品的核酸提取

使用DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP422)提取上述经免疫纯化样品核酸，保存于-20℃备用。

五、样品荧光定量PCR检测

1.荧光定量PCR扩增：

1)使用RealMasterMix(SYBRGreen)(天根生化科技公司，货号FP202)检测样品中的猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA。先将20×SYBRSolution在室温下平衡并彻底混匀。将20×SYBRSolution全部加入至2.5×RealMasterMix中彻底混匀。荧光定量PCR反应体系见表3。

2)使用QuantOneStepqRT-PCR(SYBRGreenI)Kit(天根生化科技公司，货号FP303)检测样品中的猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒(Hp-PRRSV)RNA。荧光定量PCR反应体系见表4。

结果如表5所示样品的阳性检出率均为90％以上。且可检测同一样品中的多种病原。

表5样品检测表

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，包括试剂A、试剂B、试剂C。

2.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂A的链霉素磁珠终浓度为20μg/ml。

3.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂B为12种生物素化的单克隆抗体混合液，试剂B中的单克隆抗体终浓度为480ng/ml。

4.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂C为10×免疫磁珠分离纯化体系缓冲液，3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)。

5.根据权利要求2-3所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒中的试剂A与试剂B，其特征在于，试剂A与试剂B的共同孵育条件为室温，30min，形成生物素抗体-免疫磁珠复合物。

6.根据权利要求5所述的生物素抗体-免疫磁珠复合物与样品中的病原的捕获条件为室温孵育30min。