CN104694670A

CN104694670A - 猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用

Info

Publication number: CN104694670A
Application number: CN201510122293.5A
Authority: CN
Inventors: 李广兴; 高睿泽; 任玉东; 白云云; 黄小丹
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: CN104694670B

Abstract

本发明公开了一种猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用。所述检测方法步骤如下：（1）建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25μL，包括：模板2μL，0.8μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25μL，2μL dNTP，5 mM MgS0₄，8UBst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1μL MLV反转录酶，用灭菌水体积补足至25 μL；所述阴性对照的模板为灭菌水；（2）在恒温水浴锅中61-65℃反应20-60 min后，80℃终止20 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。本发明为PRV的临床诊断与流行病学调查提供了一种简单、快速和准确的分子生物学诊断方法。

Description

猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种猪轮状病毒的快速检测方法以及该方法在鉴别检测PRV与PrV、PPV、PEDV、TGEV和PRRSV中的应用。

背景技术

轮状病毒( rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体。猪轮状病毒( porcine rotavirus, PRV)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一，给世界各地的养猪业造成了严重的经济损失。我国猪轮状病毒感染也非常普遍，有些地区断奶仔猪阳性率高达72%。轮状病毒基因组由11个dsRNA片段组成，分别编码病毒6个结构蛋白和6个非结构蛋白(NSP)，病毒结构很稳定。VP6蛋白是其重要的群抗原，属于内层衣壳蛋白，占病毒蛋白总量的51%，具有病毒特异性抗原决定簇，而且在病毒的复制和装配过程中发挥重要的作用。RV根据其基因组结构和抗原性分为A--G等7个组。A组、B组和C组可引起人类和动物感染，而D组、E组、F组和G组主要引起动物感染。其中A组RV在人类和动物中感染最为普遍。

1968年美国的Mebus等首次从犊牛粪便中分离出轮状病毒，1973年澳大利亚学者Bishop在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中也发现轮状病毒，该病毒是引起婴儿及多种幼龄动物非菌性腹泻的主要病原。目前，我国对PRV的诊断主要依赖于常规实验室诊断，其操作过程复杂耗时，并且需要昂贵的仪器。因此，建立一种敏感性高、特异性好并能应用于早期临床检测PRV的方法是十分必要的。传统的血清学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金技术等临床常用的检测方法很难检测出早期的PRV感染，且敏感性低。LAMP是Notorni等发明的DNA扩增方法。由于RT-LAMP方法具有较高的敏感性与特异性，加之无需特殊仪器设备、操作简单、检测快速等优点，该方法己被用于检测感染性病原体，其中包括H5N1亚型禽流感病毒、乙型肝炎病毒和口蹄疫病毒等。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪轮状病毒（PRV）反转录环节导等温扩增（RT-LAMP）检测方法及应用，为PRV的临床诊断与流行病学调查提供了一种简单、快速、准确的分子生物学诊断方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：

一、建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25 μL，包括：模板2 μL，0.8 μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25 μL，2 μL dNTP，5 mM MgS0₄，8 U Bst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1 μL MLV反转录酶，用灭菌水体积补足至25 μL；所述阴性对照的模板为灭菌水；

二、在恒温水浴锅中61-65℃反应20-60 min后，80℃终止20 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。

本发明的猪轮状病毒与猪A群轮状经典毒株OSU的VP6核苷酸同源性为86.8%，氨基酸同源性为97%，所以选用VP6基因序列设计RT-LAMP引物，建立了PRV的RT-LAMP检测方法，该方法可用于鉴别检测猪轮状病毒（PRV）与猪伪狂犬病毒（PrV）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。

本发明具有如下优点：

1、根据PRV DN30209株 VP6基因序列设计4条RT-LAMP引物，进行反应条件的优化，建立能特异性扩增PRV VP6基因的RT-LAMP检测方法，通过加入SYBR Green I紫外灯下颜色变化判断结果。该方法在62℃恒温下作用40 min，使PRV VP6基因获得了高效率的特异性扩增，与其他猪易感病毒，如PEDV等无交叉反应；且具有极高的灵敏性，可检测到89.5 fg/μL的目标病毒RNA，比普通PCR的灵敏度高四个数量级；反应结束后加入SYBR Green I观察的结果与扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果一致。

2、将哈尔滨市周边猪场的47份临床样品RT-LAMP检测结果与已得到验证的RT-PCR和ELISA结果进行比对，结果显示符合率为100%。

3、本发明建立的PRV的RT-LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点，具有实地检测PRV的前景。

附图说明

图1为PRV RT-LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M，DL5000；1，RT-LAMP产物；2，阴性对照；

图2为加入SYBR Green I后紫外灯下观察结果，1，RT-LAMP产物；2，阴性对照；

图3为RT-LAMP反应温度优化结果，M，DL5000；1-5， 61℃，62℃，63℃，64℃和65℃；6，阴性对照；

图4为RT-LAMP反应时间优化结果，M，DL5000；1-5，20，30，40，50，60 min；6，阴性对照；

图5为RT-PCR灵敏性结果，M，DL2000，1-7，10倍比稀释浓度分别为895 ng/μL，89.5 ng/μL，8.95ng/μL，895 pg/μL，89.5 pg/μL，8.95pg/μL，895 fg/μL；8，阴性对照；

图6为RT-LAMP灵敏性结果，M，DL5000，1-9道，10倍比稀释浓度分别为895 ng/μL，89.5 ng/μL，8.95ng/μL，895 pg/μL，89.5 pg/μL，8.95pg/μL，895 fg/μL，89.5fg/μL；9，阴性对照；

图7为PRV RT-LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M，DL5000；1-6：PRV、 PEDV、 TGEV、 PPV、 PRRSV、 PrV；7，阴性对照；

图8为加入SYBR Green I后紫外灯下观察结果，M，DL5000；1-6：PRV、 PEDV、 TGEV、 PPV、 PRRSV、 PrV；7，阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，具体内容如下：

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 病毒

猪轮状病毒（porcine rotavirus, PRV），猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV），猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV），猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV），猪繁殖与呼吸综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV），伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PrV）。

1.1.2 临床样本

2014年11月从哈尔滨市周边猪场采集47份仔猪腹泻粪便样。

1.1.3 主要试剂包被稀释液

0.01 mol/L PBS、1×PBST、OPD显色液、2 mol/L H2504、0.5% 脱脂乳。Bst DNA聚合酶购自于NEB公司。SYBR Green I购自于Invitrogen公司。琼脂糖购自Promega公司。Easy Taq DNA聚合酶、标准分子质量核酸DL2000 DNA Marker购自博大泰克生物技术有限公司。DNA标准分子量DL5000购自大连宝生物公司。DMEM细胞培养液购自GIBCO公司。飞捷RNA提取试剂盒购自南京凯基公司。反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、RNA酶等均购自于Sigma公司。HRP标记的羊抗兔酶标抗体购自购自武汉博士德公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中登录的PRV毒株DN30209株序列，利用RT-LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V4（Eiken Chemical, Japan, http://www.primerexplorer.jp/e/）设计两对RT-LAMP引物FIP、BIP、F3、B3以及1对RT-PCR引物P1、P2（表1），以上引物均由北京华大科技有限公司合成。

表1 引物序列表

名称	序列	引物长度(bp)
			FIP	GCACAGATTCACAAACTGCAGATATATTTCATGCTACAGTTGGACT	46
BIP	CGCTTCCGAAACTTTATTGGCAATACCTGGTGGGAACACTG	41
			F3	CAAACCTATTTCCGCAAGC	19
B3	GAATAATTGGTAATCAATTCTGTCC	25
			P1	CAAACCTATTTCCGCAAGCA	20
P2	TCTTGAAGGTGAATAATTGG	20

1.3基因组RNA的提取

几种猪源相关病毒PRV、 PrV、 PPV、 PEDV、TGEV、 PRRSV的总RNA使用飞捷FSAT 200核酸提取试剂盒进行抽提。-80℃保存备用。

1.4 RT-LAMP法检测反应体系以及条件的优化

25 μL的反应体系包括：模板2 μL，0.8 μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25 μL，2 μL dNTP，5 mM MgS0₄，8 U Bst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1 μL MLV反转录酶，用灭菌水体积补足至25 μL，同时设立阴性对照，阴性对照的模板为灭菌水。反应在恒温水浴锅中65℃进行l h后，80℃终止20 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。RT-LAMP反应在恒温的水浴锅中进行。对RT-LAMP反应体系进行优化，将反应体系分别在61℃、62℃、63℃、64℃和65℃进行，反应时间为1 h，随后80℃灭活Bst酶20 min，根据琼脂糖凝胶电泳的结果，确定最佳反应温度。之后，将反应体系在最佳反应温度下分别反应20、30、40、50和60 min，根据琼脂糖凝胶电泳的结果确定最佳的反应时间。

1.5 RT-LAMP与RT-PCR敏感性的比较

RT-PCR实验，先将PRV的cDNA进行10倍倍比稀释，浓度依次为895 ng/μL，89.5 ng/μL，8.95ng/μL，895 pg/μL，89.5 pg/μL，8.95pg/μL，895 fg/μL。PCR 的条件设置为：预变性 95℃，10 min；之后进入 PCR 反应 30 个循环，94 ℃，1 min；退火温度 48℃，1 min；72℃，30 s；终延伸 72℃，10 min；降温至 4 ℃后取出反应物。体系为：1 μL HG PCR buffer，1 μL dNTP，上下游引物各0.2 μL，0.5 μL模版，0.2 μL Taq DNA聚合酶和6.9 μL灭菌水。

RT-LAMP实验在最适反应条件下进行（参照1.4）。

1.6 RT-LAMP检测PRV特异性评价

用优化的RT-LAMP检测方法分别检测PRV、 PEDV、 TGEV、 PPV、 PRRSV和PrV以确定RT-LAMP方法的特异性。

1.7临床样本检测

利用RT-LAMP方法检测47个来自哈尔滨市周边猪场的临床样本，检测结果与常规RT-PCR和ELISA检测结果进行比较。将样品制备为 10% （重量/体积）的PBS（pH 7.2）悬液2000 r/min下在4℃离心10 min。用上清液进行RNA提取，反转录，进行RT-PCR检测（参考1.5）；上清包被ELISA板，100 μL /孔，4℃包被过夜。弃液，加入封阻液 200 μL /孔，37℃作用 2 h。弃去封阻液，TBST洗板3次，5 min/次。一抗每孔100 μL孵育1:1 000稀释PRV单抗，37℃ 1 h。TBST洗板3次。洗板，HRP-山羊抗兔IgG 1:5 000倍稀释，100 μL/孔，37℃作用50 min。加入100 μL /孔OPD显色液避光显色。每孔加入 2 M H₂SO₄ 50 μL 终止反应，酶标仪读数。P/N >2 作为阳性结果的判定标准。

2 结果

2.1 PRV RT-LAMP检测方法的建立

针对PRV的VP6蛋白序列设计两对引物，按上述体系，在65℃水浴1 h。用琼脂糖凝胶电泳法检测RT-LAMP扩增产物出现特别的梯状条带（图1）。加2 μL SYBR Green I，SYBR Green I染料能插入双链DNA中发出荧光，通过肉眼观察反应液的变色现象，如果反应液变绿，可判定为检测结果为阳性；如果反应液为橙色，则为阴性（图2）。

2.2 PRV RT-LAMP检测最佳条件的确定

PRV VP6基因的RT-LAMP成功扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳分析测定得到62℃时最优（图3）。当在62℃下进行不同的时间段的RT-LAMP扩增中，扩增产物在40 min时表现出最强亮度（图4）。因此，RT-LAMP扩增的最佳反应条件被确定为62℃ 40 min。

2.3 PRV 的RT-LAMP检测灵敏度

在RT-LAMP法和常规RT-PCR测定法的比较进行分析，用10倍比连续稀释的PRV的 RNA：常规RT-PCR检测方法的检出限为895 pg/μL（图5），而RT-LAMP可以检测到89.5 fg/μL，比RT-PCR方法高四个数量级（图6）。

2.4 PRV的RT-LAMP检测特异性分析

用几种猪源相关病毒即 PEDV、 TGEV、 PPV、 PRRSV、 PrV的RNA作为模板，进行RT-LAMP扩增。结果表明，RT-LAMP法扩增产物在这些相关的猪源病毒未观察到，当PRV的RNA作模板，扩增产物有预期的阳性条带（图7）。加2 μL SYBR Green I，SYBR Green I染料能插入双链DNA中发出荧光，通过肉眼观察反应液的变色现象，如果反应液变绿，可判定为检测结果为阳性；如果反应液为橙色，则为阴性（图8）。结果表明，RT-LAMP具有很好的特异性。

2. 5临床样本检测

RT-LAMP法、RT-PCR和ELISA法同时检测47临床样品：其检出率分别为6.4%（3/47）、6.4%（3/47）和4.3%（2/47）（表2）。

表2 RT-LAMP，RT-PCR和ELISA方法检测47份临床样品

检测方法	样本总数	阳性样本数	阳性率
				RT-LAMP	47	3	6.4%
RT-PCR	47	3	6.4%
				ELISA	47	2	4.3%

Claims

1.一种猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所述检测方法步骤如下：

（1）建立RT-LAMP反应体系，同时设立阴性对照；所述RT-LAMP反应体系共25 μL，包括：模板2 μL，0.8 μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25 μL，2 μL dNTP，5 mM MgS0₄，8 U Bst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1 μL MLV反转录酶，用灭菌水体积补足至25 μL；所述阴性对照的模板为灭菌水；

（2）在恒温水浴锅中61-65℃反应20-60 min后，80℃终止20 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外灯下或肉眼观察结果。

2.根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所述最佳反应条件为62℃ 40 min。

3.根据权利要求1所述的猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于所述FIP引物序列如下：GCACAGATTCACAAACTGCAGATATATTTCATGCTACAGTTGGACT。

4.根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所述BIP引物序列如下：CGCTTCCGAAACTTTATTGGCAATACCTGGTGGGAACACTG。

5.根据权利要求1所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法，其特征在于所述F3引物序列如下：CAAACCTATTTCCGCAAGC。

6.根据权利要求1所述的猪轮状病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于所述B3引物序列如下：GAATAATTGGTAATCAATTCTGTCC。

7.权利要求1-6任一权利要求所述的猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法在鉴别检测猪轮状病毒（PRV）与猪伪狂犬病毒（PrV）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中的应用。