CN114250320B - 一种检测猪轮状病毒的rt-cpa引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的RT‑CPA引物组和试剂盒，属于猪病毒病类病毒检测技术领域。本发明提供的检测猪轮状病毒的RT‑CPA引物组，包括VP‑CPF、VP‑CPR、VP‑F、VP‑R、VP‑DF和VP‑DR。本发明以6条精确设计的引物进行扩增，灵敏度高，特异性好，有效避免了反应混合物中存在的非靶序列对检测结果的影响，显著降低了假阳率；另外，本发明的RT‑CAP引物组在扩增时不需通过温度循环变化就可实现，不需要昂贵、特殊的仪器，操作简单，检测成本低，反应时间短，非常适合现场快速检测。
Description
技术领域
本发明属于猪病毒病类病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组和试剂盒。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是1974年Woode和Bridge首次分离出，是呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，按病毒内衣壳上群抗原的差异将RV分为7个血清群(A-G)，其中A/B/C/E可感染猪。猪轮状病毒(Porcine Rot avirus，PoRV)为无囊膜的双股RNA病毒，其病毒基因组由11段双股RN A组成，每一片段编码一种蛋白，即6种结构蛋白(VP1-VP7)和5种非结构蛋白(NSP1-NSP5)。VP6基因序列高度保守，是主要的诊断抗原，与VP4和VP7构成病毒的框架。猪轮状病毒是引起猪病毒性腹泻的主要病原之一，多发于2月龄内仔猪，以厌食、腹泻、呕吐、水样或糊状粪便为主要特征，严重者脱水，甚至死亡；育成猪和成年猪常为隐性感染。目前，该病毒的单纯感染及混合感染均可直接或间接影响猪群生产力，往往造成巨大的经济损失。
猪轮状病毒诊断方法较多，如病毒分离和鉴定、PCR、荧光定量PCR和LAMP法等。病毒的分离和鉴定难度大，所需时间长，不能满足当前快速诊断的要求；PCR、荧光定量PCR等检测方法对仪器设备要求较高，不利于基层单位使用；猪轮状病毒LAMP检测方法虽对仪器设备要求不高，但存在假阳率高、弱阳性结果判别不够准确。这些方法都有各自的局限性，因此建立简单、快速、准确的检测方法，并开发适用于现场应用的PoRV检测试剂盒显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组和试剂盒，采用本发明提供的引物能够简单、快速、准确地检测猪轮状病毒。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组，包括VP-CPF、VP-CPR、VP-F、VP-R、VP-DF和VP-DR；
所述VP-CPF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述VP-CPR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述VP-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述VP-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述VP-DF的5’端标记有生物素；
所述VP-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述VP-DR的5’端标记有FITC或5-FAM。
本发明提供了上述技术方案中所述的检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组在制备用于检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒和/或扩增反应试剂中的应用。
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的试剂盒，包括上述技术方案中所述的RT-CPA引物组。
优选的，所述试剂盒还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPs、甜菜碱和Mg2+。
优选的，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。
优选的，所述核酸检测试纸条包括杭州优思达生物技术有限公司生产的型号D003-03的一次性核酸检测试纸条。
优选的，所述RT-CPA引物组使用时，扩增体系每20μL中包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各0.8～1.2μM，VP-F、VP-R各0.5～1.0μM，VP-DF、VP-DR各0.2～1.0μM，MgSO40.6～2.0mM，dNTPs0.6～2.0mM，甜菜碱0.2～1.6M，Bst DNA聚合酶1～8.8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA0.5～2.0μL，ddH2O补足至20μL。
优选的，所述扩增体系每20μL中包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各1.0μM，VP-F、VP-R各1.0μM，VP-DF、VP-DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，AMV逆转录酶5U，模板RNA2μL，ddH2O补足至20μL。
优选的，所述扩增的条件包括：在温度为57～65℃下反应15～90min。
优选的，扩增后进行灭活，所述灭活条件为80～90℃下灭活1.5～3min。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组，包括VP-CPF、VP-CPR、VP-F、VP-R、VP-DF和VP-DR；所述VP-CPF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述VP-CPR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述VP-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述VP-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述VP-DF的5’端标记有生物素；所述VP-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述VP-DR的5’端标记有FITC或5-FAM。本发明以6条精确设计的引物进行扩增，灵敏度高，特异性好，有效避免了反应混合物中存在的非靶序列对检测结果的影响，显著降低了假阳性；本发明的RT-CAP引物组在扩增时不需通过温度循环变化就可实现，不需要昂贵、特殊的仪器，操作简单，检测成本低，反应时间短，非常适合现场快速检测。实施例的结果表明：本发明的RT-CPA引物组用于检测猪轮状病毒时的灵敏度可达10copies/μL，且特异性良好，与TGEV、PEDV、PCV、大肠杆菌和沙门氏菌的检测结果无交叉。
附图说明
图1为实施例4中不同浓度的MgSO4的优化结果图，其中，M为DN A Marker；1～8分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM和2.0mM的MgSO4；
图2为实施例5中不同浓度dNTPs的优化结果图，其中，M为DNA Marker；1～8分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM和2.0mM的dNTPs混合液；
图3为实施例6中不同浓度甜菜碱的优化结果图，其中，M为DNA M arker；1～8分别为0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M、1.2M、1.4M和1.6M的Betaine；
图4为实施例7中不同浓度Bst DNA聚合酶的优化结果图，其中，M为DNA Marker；1～7分别为1U、1.6U、3.2U、4.8U、6.4U、8U、8.8U的Bst DNA聚合酶；
图5为实施例8中不同反应温度的优化结果图，其中，M为DNA Mar ker；1～5分别为反应温度57℃、59℃、61℃、63℃、65℃。
图6为实施例8提供的一种猪轮状病毒RT-CPA检测试剂盒中不同反应时间的优化结果图，其中，M为DNA Marker；1～6分别为反应时间15m in、30min、45min、60min、75min、90min；
图7为实施例9提供的一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒的特异性检测结果图，样品从左至右依次为PoRV、TGEV、PEDV、PCV、大肠杆菌、沙门氏菌、空白对照(H2O)；
图8为实施例10提供的一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒灵敏度检测结果图，样品从左至右猪轮状病毒VP6重组质粒浓度依次为109copies/μL、108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL和空白对照(H2O)。
具体实施方式
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组，包括VP-CPF、VP-CPR、VP-F、VP-R、VP-DF和VP-DR；
所述VP-CPF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：5’-CTAGATTAAGTAAAGTAGTACCCAACAATTTAATCAAATG-3’；
所述VP-CPR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：5’-CAACAATTTAATCAAATGCTAGATTAAGTAAAGTAGTACC-3’；
所述VP-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：5’-GTTGAAGGTACATTATATT-3’；
所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：5’-ATTCAATAGTAGTTCTAGC-3’；
所述VP-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：5'-ATAGTTACTATGAATGGAAATG-3'，所述VP-DF的5’端标记有生物素；
所述VP-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：5'-AAGTAATCCAAAATCAAAAG-3'，所述VP-DR的5’端标记有FITC或5-FAM。将荧光标记和生物素分别标记在一对检测引物的5'末端，使扩增产物同时带荧光标记和生物素标记，便于后续扩增产物的检测。
本发明所述RT-CPA引物组根据根据GenBank公布的PoRV毒株的VP6基因编码序列(KR052739.1)设计，利用RT-CPA技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对猪轮状病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和高灵敏性的特点。本发明以6条精确设计的引物进行扩增，灵敏度高，特异性好，有效避免了反应混合物中存在的非靶序列对检测结果的影响，显著降低了假阳率；本发明的RT-CAP引物组在扩增时不需通过温度循环变化就可实现，不需要昂贵、特殊的仪器，操作简单，检测成本低，反应时间短，非常适合现场快速检测。
本发明提供了上述技术方案中所述的检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组在制备用于检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒和/或扩增反应试剂中的应用。
本发明提供了一种检测猪轮状病毒的试剂盒，包括上述技术方案中所述的RT-CPA引物组。
在本发明中，所述RT-CPA引物组使用时，扩增体系每20μL中优选包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各1.0μM，VP-F、VP-R各0.5～1.0μM，VP-DF、VP-DR各0.2～1.0μM，MgSO40.6～2.0mM，dNTPs0.6～2.0mM，甜菜碱0.2～1.6M，Bst DNA聚合酶1～8.8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA 1μL，ddH2O补足至20μL；更优选包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各1.0μM，VP-F、VP-R各1.0μM，VP-DF、VP-DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，AMV逆转录酶5U，模板RNA2μL，ddH2O补足至20μL。
在本发明中，所述扩增的条件优选包括：在温度为57～65℃下反应15～90min；进一步优选为63℃下反应60min。
扩增后，本发明优选进行灭活，所述灭活条件优选为85℃灭活2min。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPs、甜菜碱和Mg2+。本发明对上述试剂盒的试剂来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明对试剂盒中试剂放置的量没有特殊限定，采用常规试剂盒中试剂放置的量即可。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括核酸检测试纸条。所述核酸检测试纸条优选包括杭州优思达生物技术有限公司生产的型号D003-03的一次性核酸检测试纸条。当使用核酸检测试纸条进行检测时，取扩增产物，用核酸检测试纸条检测，仅在质控区C出现一条红线，表示样品检测结果阴性；出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品检测结果阳性；在质控区C和检测区T均无红色线条出现，表明核酸检测试纸条失效，检测结果无效。
本发明所述试剂盒也可以不使用核酸检测试纸条，检测时，优选取扩增产物，用1.0％(W/V)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示RT-CPA特征性梯状条带，则结果为阳性；无任何条带，则结果为阴性。
本发明对检测的样本类型无特殊要求，粪便样本、肠组织样本和血液样本均可。样本的前处理采用本领域常规方法处理即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组，由VP-CPF、VP-CPR、VP-F、VP-R、VP-DF和VP-DR组成；
所述VP-CPF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：5’-CTAGATTAAGTAAAGTAGTACCCAACAATTTAATCAAATG-3’；
所述VP-CPR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：5’-CAACAATTTAATCAAATGCTAGATTAAGTAAAGTAGTACC-3’；
所述VP-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：5’-GTTGAAGGTACATTATATT-3’；
所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：5’-ATTCAATAGTAGTTCTAGC-3’；
所述VP-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：5'-ATAGTTACTATGAATGGAAATG-3'，所述VP-DF的5’端标记有生物素；
所述VP-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：5'-AAGTAATCCAAAATCAAAAG-3'，所述VP-DR的5’端标记有FITC。
实施例2
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒，由以下成分组成：反应缓冲液(2×Taq反应缓冲液)、1.0M甜菜碱、1.0mM dNTPs、1.0mM/L MgSO4、8U/μL Bst DNA聚合酶、10μM引物VP-CPF、10μM引物VP-CPR、10μM引物VP-DF、10μM引物VP-DR、10μM引物VP-DPF、10μM引物VP-DPR、5U/μL AMV逆转录酶，核酸检测试纸条(杭州优思达公司)。
实施例3
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1.感染猪轮状病毒的猪肠道病变组织或感染细胞预处理
将感染猪轮状病毒的猪肠道病变组织加入1：5的PBS经研磨后或感染细胞液反复冻3次，12000rpm离心10min，取上清液作为待测样品。
2.RT-CPA扩增
采用20μl反应体系：2×Taq反应缓冲液2.0μL，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，Mg2+1.0mM，dNTPs 1.0mM，AMV 5U，模板1μL，ddH2O补足至20μL。最佳反应条件为63℃下等温扩增60min。
3、扩增产物分析
1)取5～10μL扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示梯状CPA特征性条带，结果显示为阳性；若无任何条带，结果显示为阴性。
2)反应结束后应用核酸检测试纸条对反应产物进行可视化检测，将产物滴入试纸条样品加样处10μL后，静置15～30min后观察结果，如果出现两条红线：一条位于检测区(T)，另一条位于质控区(C)，则判断检测为阳性，即有反应发生；如果只出现一条位于质控区的红线，则无判定为阴性；如果两条红线均未出现，则说明检测结果无效。
实施例4
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒中不同浓度的MgSO4的优化
1、轮状病毒VP6质粒制备：
取猪轮状病毒液(CVCCAV55，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)200μL，按试剂盒按说明书(OMEGA试剂公司)提取PoRV病毒总RNA，RT-PCR扩增猪轮状病毒VP6基因(KR052739.1)全序列，并克隆至PUC57质粒(普通市售产品即可)，构建了PoRV-VP6重组质粒。将PoRV-VP6重组质粒导入DH5α细胞(TaKaRa公司)中，扩大培养，提取并纯化重组质粒(OMEGA试剂公司质粒小提试剂盒)，测定重组质粒浓度并计算质粒拷贝数，并用DEPC水调整质粒浓度至1010copies/μL。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，BstDNA聚合酶1U，不同浓度的MgSO4，ddH2O补足至20μL。
其中MgSO4的浓度分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM和2.0mM。
3、扩增条件：
反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgSO4的浓度在0.6～2.0mM均能够显示梯状CPA特征性条带，其中MgSO4的浓度浓度为1.0mM时效果最好(图1)。
实施例5
一种检测猪轮状病毒RT-CPA试剂盒中不同浓度dNTPs的优化
1、轮状病毒VP6质粒制备：
制备方法同实施例4。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，SD-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，Bst DNA聚合酶1U，不同浓度的dNTPs，甜菜碱1.0M，ddH2O补足补足至20μL。
其中dNTPs的浓度分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM和2.0mM。
3、扩增条件：
反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示dNTPs浓度在0.6～2.0mM均能够显示梯状CPA特征性条带，其中dNTPs的浓度为1.0mM时效果最好(图2)。
实施例6
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒中不同浓度甜菜碱的优化
1、轮状病毒VP6质粒制备：
制备方法同实施例4。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，SD-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 0.8mM，BstDNA聚合酶1.0U，不同浓度的Betaine，ddH2O补足至20μL。
其中甜菜碱的浓度分别为0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M、1.2M、1.4M和1.6M。
3、扩增条件：
反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示甜菜碱浓度在0.2～1.6mM均能够显示梯状CPA特征性条带，其中甜菜碱的浓度为1.0M时效果最好(图3)。
实施例7
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒中不同浓度Bst DNA聚合酶的优化：
1、轮状病毒VP6质粒制备：
制备方法同实施例4。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，不同浓度的Bst DNA聚合酶，ddH2O补足至20μL。
其中Bst DNA聚合酶的浓度分别为1.0U、1.6U、3.2U、4.8U、6.4U、8.0U和8.8U。
3、扩增条件：
反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳结果显示Bst DNA聚合酶浓度在1.0～8.8mM均能够显示梯状CPA特征性条带，其中Bst DNA聚合酶浓度为1.0U时效果最好(图4)。
实施例8
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒中不同反应温度的优化
1、轮状病毒VP6质粒制备：
制备方法同实施例4。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，SD-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1.0U，ddH2O补足至20μL。同时设置空白对照。
3、扩增条件：
反应管分别置于57℃、59℃、61℃、63℃、65℃温育60min后，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示反应温度在57～65℃均能够显示梯状CPA特征性条带，其中温度为63℃时效果最好(图5)。
实施例9
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒中不同反应时间的优化
1、轮状病毒VP6质粒制备：
制备方法同实施例4。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，在PCR管中加入PoRV-VP6重组质粒1μL，2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，ddH2O补足至20μL。
3、扩增条件：
反应管置于63℃，分别温育15min、30min、45min、60min、75min、90min后，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
取10μL扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示反应时间在15～90min均能够显示梯状CPA特征性条带，其中时间为60min时效果最好(图6)。
实施例10
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒的特异性检测
1、待检样品：
PoRV感染的MA104细胞、TGEV感染的ST细胞、PEDV感染的Vero细胞、PCV感染的PK15细胞(上述细胞均购自中科院上海生命科学研究院)，出现90％病变后分别收获，于-20℃至室温间反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清200μL，-20℃保存备用。另外常规培养大肠杆菌(CVCC3959)和肠炎沙门氏菌(CVCC3949)(上述菌株来源于中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，菌液浓度分别为1×109CFU/mL。
2、扩增体系：
采用20μL反应体系，由如下组分组成：2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，NTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，AMV逆转录酶5U，模板2μL，ddH2O补足至20μL。
3、扩增条件：
反应管分别置于63℃温育60min后，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
用核酸检测试纸条检测(杭州优思达)，试纸条加样处滴加5～8μL扩增反应产物，再滴加缓冲液100μL，15～30min后判读结果。检测结果显示，PoRV呈阳性，而TGEV、PEDV、PCV、大肠杆菌、沙门氏菌、空白对照(水)均为阴性(图7)，从而说明针对PoRV设计的特异性RT-CPA引物组只对PoRV具有特异性。
实施例11
一种检测猪轮状病毒RT-CPA试剂盒的灵敏度检测
1、PoRV VP6基因克隆及标准重组质粒构建：
取猪轮状病毒液200μL，按试剂盒按说明书(OMEGA试剂公司)提取PoRV病毒总RNA，RT-PCR扩增VP6基因(KR052739.1)全长序列，并克隆进PUC57质粒，构建PoRV-VP6基因标准重组质粒。将PoRV-VP6重组质粒导入DH5α细胞(TaKaRa公司)中，扩大培养，提取并纯化重组质粒(OMEGA试剂公司质粒小提试剂盒)，测定质粒浓度，计算质粒拷贝数，并用纯水将标准质粒浓度调整到1010copies/μL。灵敏度测定时，将标准质粒用纯水进行10倍梯度稀释，使质粒浓度范围为109copies/μL～100copies/μL，作为CPA反应的模板。
2、RT-CPA扩增体系：
采用20μL反应体系，由如下组分组成：2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 0.8mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，质粒模板1μL，ddH2O补足至20μL。
3、扩增条件：
反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
4、检测结果判定：
用核酸检测试纸条检测，试纸条加样处滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液100μL，15～30min后可用肉眼判读。核酸检测试纸条显示能够检测到10copies/μL的RV(图8)。
应用实例1
一种检测猪轮状病毒的RT-CPA检测试剂盒性能评价
1、待检样品的预处理：
待检样品为40份腹泻仔猪的粪便棉拭子样本；10份腹泻死亡仔猪的肠道组织。待检样品为粪便棉拭子样本：分别加入1000μL生理盐水，反复研磨，吸取液体作为待检样品备用；待检样品为死亡仔猪的肠道组织样本；取少量样本加入1:5的PBS经研磨后，收集液体，反复冻3次，12000rpm离心10min，取上清液作为待测样品。
2、待检样品的RT-CPA扩增：
采用20μL反应体系，由如下组分组成：2×Taq反应缓冲液2.0μL，VP-CPF/R各1.0μM，VP-F/R各1.0μM，VP-DF/DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 0.8mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，待检样品5μL，ddH2O补足至20μL。将反应管于63℃温育60min，85℃灭活2min。
3、检测结果判定：
用核酸检测试纸条检测，试纸条加样处滴加5～8μL扩增产物，再加缓冲液100μL，15～30min后可用肉眼判读。检测结果为：检出2份腹泻仔猪的粪便棉拭子样本为阳性，其余为阴性，阳性率5％；而腹泻死亡仔猪的肠道组织样本检出2份为阳性，阳性率为20％。
而用猪轮状病毒金标检测卡(韩国BioNote,Inc.1803D001)对应用实例1待检样品40份进行检测，检测结果与应用实例1的RT-CPA结果一致，即：2份腹泻仔猪的粪便棉拭子样本为阳性，其余为阴性，阳性率5％；而腹泻死亡仔猪的肠道组织样本检出2份为阳性，阳性率为20％。
由上述实施例的结果可知，利用本发明的RT-CPA引物组检测猪轮状病毒具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点；同时，本发明的RT-CAP引物组在扩增时不需通过温度循环变化就可实现，不需要昂贵、特殊的仪器，操作简单，检测成本低，反应时间短，非常适合现场快速检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 甘肃省畜牧兽医研究所
<120> 一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组和试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagattaag taaagtagta cccaacaatt taatcaaatg 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacaattta atcaaatgct agattaagta aagtagtacc 40
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgaaggta cattatatt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attcaatagt agttctagc 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atagttacta tgaatggaaa tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagtaatcca aaatcaaaag 20
Claims (10)
1.一种检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组，其特征在于，包括VP-CPF、VP-CPR、VP-F、VP-R、VP-DF和VP-DR；
所述VP-CPF的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述VP-CPR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述VP-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述VP-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述VP-DF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述VP-DF的5’端标记有生物素；
所述VP-DR的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述VP-DR的5’端标记有FITC或5-FAM。
2.权利要求1所述的检测猪轮状病毒的RT-CPA引物组在制备用于检测猪轮状病毒的RT-CPA试剂盒和/或扩增反应试剂中的应用。
3.一种检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RT-CPA引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPs、甜菜碱和Mg2+。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试纸条包括杭州优思达生物技术有限公司生产的型号D003-03的一次性核酸检测试纸条。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-CPA引物组使用时，扩增体系每20μL中包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各0.8～1.2μM，VP-F、VP-R各0.5～1.0μM，VP-DF、VP-DR各0.2～1.0μM，MgSO40.6～2.0mM，dNTPs 0.6～2.0mM，甜菜碱0.2～1.6M，BstDNA聚合酶1～8.8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA 0.5～2.0μL，ddH2O补足至20μL。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增体系每20μL中包括：反应缓冲液2.0μL，VP-CPF、VP-CPR各1.0μM，VP-F、VP-R各1.0μM，VP-DF、VP-DR各1.0μM，MgSO41.0mM，dNTPs 1.0mM，甜菜碱1.0M，Bst DNA聚合酶1U，AMV逆转录酶5U，模板RNA 2μL，ddH2O补足至20μL。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增的条件包括：在温度为57～65℃下反应15～90min。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，扩增后进行灭活，所述灭活条件为80～90℃下灭活1.5～3min。
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|---|---|---|---|---|
| CN103740861A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-04-23 | 北京伟嘉人生物技术有限公司 | 一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒及检测方法 |
| CN104694670A (zh) * | 2015-03-20 | 2015-06-10 | 东北农业大学 | 猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用 |
| CN105734175A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-07-06 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 |
| CN110408727A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-05 | 华南农业大学 | 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 |
| KR20210156932A (ko) * | 2020-06-18 | 2021-12-28 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 돼지 로타바이러스 a, b, c 군 동시감별 진단용 키트 및 진단방법 |
-
2020
- 2020-11-13 CN CN202011268679.4A patent/CN114250320B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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