CN105734175A - 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105734175A
CN105734175A CN201610259598.5A CN201610259598A CN105734175A CN 105734175 A CN105734175 A CN 105734175A CN 201610259598 A CN201610259598 A CN 201610259598A CN 105734175 A CN105734175 A CN 105734175A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reverse transcription
isothermal amplification
mediated isothermal
lamp
porcine rotavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610259598.5A
Other languages
English (en)
Inventor
秦毅斌
刘磊
卢冰霞
何颖
赵武
段群棚
陈忠伟
李斌
周英宁
梁家幸
杨思仪
蒋冬福
苏乾莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Veterinary Research Institute
Original Assignee
Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Veterinary Research Institute filed Critical Guangxi Veterinary Research Institute
Priority to CN201610259598.5A priority Critical patent/CN105734175A/zh
Publication of CN105734175A publication Critical patent/CN105734175A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种猪轮状病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT?LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪轮状病毒RNA模板；所述的RT?LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪轮状病毒病变组织、带毒粪便和和猪轮状病毒病原定性研究。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪轮状病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪轮状病毒带来便利。

Description

一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪轮状病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus , RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属，为双股正链RNA，分为A、B、C、D、E和F 6个群，在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。RV于1968年由美国的Mebus M S等首次从犊牛粪便中分离成功，后来发现其可用非洲绿猴肾原代细胞进行培养。ElAttar L等试验结果表明，在适宜的条件下，感染某种动物的轮状病毒会因一种致病的适应轮状病毒给其他不同种属动物带来感染隐患，例如在犊牛和猪、人和猪之间可交叉感染。该病主要以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害。自1974年Woode等在英国首次报道猪的RV后，RV在猪群中的传播引起了许多国家的重视，接着澳大利亚、北爱尔兰、美国、法国等均有RV 引起仔猪腹泻的报道。据报道，美国断奶仔猪感染阳性率为80 %，病死率为15 %，当有混合感染时，病死率更高。中国自1982年从腹泻猪粪便中分离到RV，证实猪RV感染在我国普遍存在。该病可以引起仔猪的死亡、成年猪的掉膘、饲料报酬的降低、增加人工费和药费的开支等，在猪病毒性腹泻中由RV 造成的损失仅次于猪流行性腹泻病毒（TGEV），所以国内外非常重视的对RV的防制。
对猪轮状病毒的快速准确诊断，不仅有利于养殖场对该病做出正确的防制措施，而且有利于其他猪消化道疾病的防治以及防止该病毒在病畜和人之间的交叉传播。目前实验室诊断RV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫荧光等；②分子生物学方法。血清学方法存在假阳性过多的问题和现象，并且不适于RV急性感染的早期做出快速准确的诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较长，不适合基层和现场检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决基层检测猪轮状病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪轮状病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪轮状病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；
其中：
F3 CATCTGATTACATTGAGAATTGG
B3 TGCATTAAAAGCACACGAAT
FIP AGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA
BIP TAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA
LF GGCTTATGGAACACGAATCCAG
LB TTAATGGGGACTATGTGGATTAACG；
所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
以上所述的猪轮状病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪轮状病毒的RNA。
以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-50mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪轮状病毒病变组织、猪粪便排泄物或培养物中是否含有猪轮状病毒，具体检测步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪轮状病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系建立
（4）RT-LAMP检测方法。
以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μL计，
2×反应缓冲液 12.5μL
EM 1μL
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
LF 20 pmol
LB 20 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
猪轮状病毒RNA 5μL
超纯水 补足25μL。
以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在20-30分钟间出现扩增。
本发明的实质性特点和进步是：
1）特异性强
本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
2）灵敏度高
普通PCR检测方法的灵敏度为1.12×10-7 ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为1.12×10-9 ng/μL，是普通PCR的100倍。
3）迅速获得结果
普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在20分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪轮状病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1：猪轮状病毒；2：猪蓝耳病病毒；3：猪圆环病毒2型；4：猪瘟病毒；5：猪嵴病毒；6：流行性腹泻病毒；7：传染性胃肠炎病毒；8：猪伪狂犬病毒；9：空白对照（水）。猪轮状病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪轮状病毒敏感性检测的结果。其中1：1.12×102 ng/μL；2：1.12×101 ng/μL；3：1.12 ng/μL； 4：1.12×10-1ng/μL； 5：1.12×10-2ng/μL； 6：1.12×10-3ng/μL；7：1.12×10-4ng/μL；8：1.12×10- 5ng/μL；9：1.12×10-6ng/μL；10：1.12×10-7ng/μL； 11：1.12×10-8ng/μL；12：1.12×10-9ng/μL；13：水（空白对照）。猪轮状病毒基因组RNA的起始浓度为1.12×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1.12×10-9ng/μL，而普通PCR方法检测限约为1.12×10-7ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪轮状病毒基因组RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明猪轮状病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪轮状病毒拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
猪轮状病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪轮状病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和伪狂犬病毒，均为市售疫苗。RT-LAMP RNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
2 、RT-LAMP引物的设计与合成
根据GenBank 中的猪轮状病毒3D基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LF和LB为环引物，其中
F3 CATCTGATTACATTGAGAATTGG
B3 TGCATTAAAAGCACACGAAT
FIP AGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA
BIP TAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA
LF GGCTTATGGAACACGAATCCAG
LB TTAATGGGGACTATGTGGATTAACG；
3、病毒基因组RNA提取
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548）提取猪轮状病毒或疑似猪轮状病毒感染的病变组织、粪便和培养物中的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组DNA/RNA。
4、RT-LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：
2×反应缓冲液 12.5μL
EM 1μL
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
LF 20 pmol
LB 20 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
猪轮状病毒RNA 5μL
超纯水 补足25μL。
RT-LAMP反应在以实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、RT-LAMP检测方法
1）特异性检测
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪轮状病毒以及对照毒株-猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪嵴病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和猪伪狂犬病毒的基因组DNA/RNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
提取的猪轮状病毒基因组RNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释成12个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的RT-LAMP方法和普通PCR方法对检测猪轮状病毒的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1 RT-LAMP检测方法的特异性结果
对1株猪轮状病毒、7株对照病毒和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，猪轮状病毒反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2 RT-LAMP检测方法的敏感性结果
猪轮状病毒基因组RNA的起始浓度为1.12×102 ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1.12×10-9ng/μL，而普通PCR 法检测限为1.12×10-7ng/μL。
实施例3 RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪轮状病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃ 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4猪轮状病毒定量标准曲线的绘制
以猪轮状病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒RNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质粒pMD18-T-VP6的起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释12个稀释度，取各稀释度5μL作为模板进行RT-LAMP扩增，
设置对照：浓度为1.122×101 ng/μL、1.122 ng/μL、1.122×10-1 ng/μL、1.122×10-2 ng/μL、1.122×10-3ng/μL、1.122×10-4 ng/μL、1.122×10-5 ng/μL、1.122×10-6ng/μL 、1.122×10-7 ng/μL、1.122×10-8 ng/μL和1.122×10-9 ng/μL的标准重组质粒pMD18-T- VP6样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y = 0.4782x–11.5，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2 = 0.9933，呈良好的线性关系。以时
间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数1.12，即为1.12 ×10-y ng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL =（6.02 ×1023 × (ng/ul ×10-9)） / (RNAlength × 660)，RNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+206=2899bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02 × 1023×（1.12 ×10-y ×10-9）/ (2899 ×660)，简化为：3.52 × 108 ×10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于2.846，则浓度为10-2.846，再乘以基数1.12，即为该试验样品的浓度1.12×10-2.846ng/μL，拷贝数为3.52 × 108 ×10-2.846，即为3.52 × 105.154 copies/μL，从而达到定量的效果。
表1样品浓度负对数值与PKV-LAMP浊度值时间线性关系表
时间（分） 20 22 24 26.5 28 29.5 33 34.5
浓度负对数 -2 -1 0 1 2 3 4 5
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120>一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
<160>6
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CATCTGATTACATTGAGAATTGG
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TGCATTAAAAGCACACGAAT
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA
<210> 4
<211>38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA
<210> 5
<211>22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
GGCTTATGGAACACGAATCCAG
<210> 6
<211>25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TTAATGGGGACTATGTGGATTAACG

Claims (9)

1.一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物，其引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）；
其中：
F3 CATCTGATTACATTGAGAATTGG
B3 TGCATTAAAAGCACACGAAT
FIP AGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA
BIP TAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA
LF GGCTTATGGAACACGAATCCAG
LB TTAATGGGGACTATGTGGATTAACG。
2.根据权利要求1所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪轮状病毒RNA模板；所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
3.根据权利要求2所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求2所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4mM。
5.根据权利要求2所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，具体操作步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪轮状病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系的建立
（4）RT-LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25 μL计，
2×反应缓冲液 12.5μL
EM 1μL
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
LF 20 pmol
LB 20 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
猪轮状病毒RNA 5μL
超纯水 补足25μL。
7.根据权利要求5所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
9.根据权利要求5所述的猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法反应温度为63℃，反应在20-30分钟出现扩增。
CN201610259598.5A 2016-04-25 2016-04-25 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 Pending CN105734175A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610259598.5A CN105734175A (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610259598.5A CN105734175A (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105734175A true CN105734175A (zh) 2016-07-06

Family

ID=56255288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610259598.5A Pending CN105734175A (zh) 2016-04-25 2016-04-25 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105734175A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114250320A (zh) * 2020-11-13 2022-03-29 甘肃省畜牧兽医研究所 一种检测猪轮状病毒的rt-cpa引物组和试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
CN103014178A (zh) * 2012-12-18 2013-04-03 广东省微生物研究所 轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组和检测方法
CN103451315A (zh) * 2013-06-26 2013-12-18 龙岩学院 轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法
CN104611464A (zh) * 2015-02-04 2015-05-13 四川农业大学 检测猪轮状病毒的lamp检测试剂盒
CN104694670A (zh) * 2015-03-20 2015-06-10 东北农业大学 猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用
CN105349701A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671746A (zh) * 2009-10-21 2010-03-17 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测a群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列
CN103014178A (zh) * 2012-12-18 2013-04-03 广东省微生物研究所 轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组和检测方法
CN103451315A (zh) * 2013-06-26 2013-12-18 龙岩学院 轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法
CN104611464A (zh) * 2015-02-04 2015-05-13 四川农业大学 检测猪轮状病毒的lamp检测试剂盒
CN104694670A (zh) * 2015-03-20 2015-06-10 东北农业大学 猪轮状病毒反转录环节导等温扩增检测方法及应用
CN105349701A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REN,X.等: "Accession No：JN977137", 《GENBANK》 *
谭贵良等主编: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114250320A (zh) * 2020-11-13 2022-03-29 甘肃省畜牧兽医研究所 一种检测猪轮状病毒的rt-cpa引物组和试剂盒
CN114250320B (zh) * 2020-11-13 2023-10-20 甘肃省畜牧兽医研究所 一种检测猪轮状病毒的rt-cpa引物组和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102146466B (zh) 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法
CN105349707A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN104651534A (zh) 一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105349702A (zh) 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN104726567A (zh) 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN111876502B (zh) 双重实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌s2疫苗株的方法及其使用的成套试剂
CN104651535A (zh) 一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106435033A (zh) 一种检测鉴别猪脐带血中猪瘟病毒野毒株与疫苗株的双重实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途
CN102816847A (zh) 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒
CN114774563B (zh) 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用
Postel et al. Development of a new LAMP assay for the detection of CSFV strains from Cuba: a proof-of-concept study
CN107460255A (zh) 一种检测猪丁型冠状病毒的rt‑lamp引物组、试剂盒及应用
CN101381767B (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
CN103276104B (zh) 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN106148566B (zh) 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用
CN105349672A (zh) 一种猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105400902A (zh) 一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒
CN101392299B (zh) 一种马流感检测试剂盒和检测方法
CN108531660A (zh) 一种检测猪圆环病毒3型实时定量lamp引物、试剂盒及应用
CN105821160A (zh) 一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105734175A (zh) 一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105385789A (zh) 一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106435015B (zh) 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒
CN104651518A (zh) 一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN105779656A (zh) 一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160706