CN105349701A - 一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪戊型肝炎病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪戊型肝炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3和内引物FIP与BIP，其应用包括使用该试剂盒检测猪戊型肝炎病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的逆转录环节导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪戊型肝炎病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪戊型肝炎病毒带来便利。

Description

一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪戊型肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

戊型肝炎(HepatitisE)是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要通过粪-口消化道传播。戊型肝炎呈全球分布,以暴发流行或散发感染的形式存在，在世界范围内,无论HEV在这个地区是否流行,猪感染HEV的现象非常普遍。HEV主要包括1～4个基因型,其中,基因4型具有人兽共患的性质，在人群和猪群中,主要以基因4型HEV感染为主。研究发现从猪体内分离的基因4型HEV能够感染人,反之亦然,并且基因4型HEV对人的致病性较其他基因型更强,危害也更大。

戊型肝炎从1955～1956年在印度新德里第一次HE大暴发至今，已广泛分布于亚洲、非洲及中美洲等发展中国家。我国HE的高发地区新疆，曾在1986～1988年间暴发该病，是世界上一次大规模的流行，共计发病119280例，死亡707例。1997年Meng从猪体内分离出１株野生型HEV，发现其与人类的HEV有极高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，因此推测猪可能是HEV感染的一个动物宿主。目前研究表明，HEV在猪群中普遍存在，已经被世界卫生组织认定是发展中国家的一个重要公共卫生问题,从而引起公众对公共健康和食品安全的普遍关注。因此，对猪源戊型肝炎诊断方法的研究十分必要。

对戊型肝炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪戊型肝炎病毒的关键。目前实验室诊断HEV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫荧光等；②分子生物学方法。血清学方法存在假阳性过多的问题和现象，并且不适于HEV急性感染的早期做出快速准确的诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种为基层快速、准确并且实时地检测猪戊型肝炎病毒的方法，提供一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，从而解决基层检测猪戊型肝炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪戊型肝炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）；

其中：

F3TGCTTGACTTTGCACTCGA

B3TCAGTGCTATACCACGACCA

FIPACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC

BIPACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的猪戊型肝炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪戊型肝炎的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪戊型肝炎病毒以及疑似猪戊型肝炎病变组织或猪粪便排泄物中是否感染有猪戊型肝炎病毒，具体检测步骤包括：

（1）RT-LAMP引物的设计与合成

（2）猪戊型肝炎病毒RNA模板的提取

（3）RT-LAMP反应体系建立

（4）RT-LAMP检测方法。

以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，

2×反应缓冲液12.5μL

EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

F35pmol

B35pmol

猪戊型肝炎病毒RNA5μL

超纯水补足25μL。

以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在20分钟前后出现扩增。

本发明的实质性特点和进步是：

1）特异性强

本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出猪戊型肝炎病毒，而所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。普通RT-PCR法需先进行反转录（RT），然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，一个小时即可完成扩增。

2）灵敏度高

提取的猪戊型肝炎病毒RNA原始浓度为6.310×10ng/μL，普通PCR检测方法的灵敏度为6.31×10-6ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为6.31×10-8ng/μL，敏感性是普通PCR的100倍。

3）迅速获得结果

普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA提取到获取试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在23分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，依据反应管浊度值的变化情况即可判读结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析或者反应结束后加入荧光染料来判读结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

4）不造成污染

目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖，能有效避免实验环境的污染。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。

5）可实时定量

本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪戊型肝炎病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。

附图说明

图1是本发明猪戊型肝炎病毒RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1：猪戊型肝炎病毒；2：猪瘟病毒；3：猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；4：口蹄疫病毒；5：伪狂犬病毒；6：传染性胃肠炎病毒；7：流行性腹泻病毒；8：猪细小病毒；9：空白对照（水）。结果显示猪戊型肝炎病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。

图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪戊型肝炎病毒敏感性检测的结果。其中1：6.31×10ng/μL；2：6.31ng/μL；3：6.31×10-1ng/μL；4：6.31×10-2ng/μL；5：6.31×10-3ng/μL；6：6.31×10-4ng/μL；7：6.31×10-5ng/μL；8：6.31×10-6ng/μL；9：6.31×10-7ng/μL；10：6.31×10-8ng/μL；11：水。猪戊型肝炎病毒基因组RNA的起始浓度为6.31×10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为6.31×10-8ng/μL，而普通PCR方法检测限约为6.31×10-6ng/μL。

图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪戊型肝炎病毒基因组RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。

图5是本发明猪戊型肝炎病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪戊型肝炎病毒拷贝数。

具体实施方式

1、材料的准备

猪戊型肝炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、猪细小病毒，均为市售疫苗，或为广西兽医研究所分离鉴定和保存。RT-LAMPRNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP246；病毒基因组RNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。

2、RT-LAMP引物的设计与合成

根据GenBank中的戊型肝炎病毒部分ORF2基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，其中F3、B3为猪瘟病毒RT-PCR检测引物，其中

F3TGCTTGACTTTGCACTCGA

B3TCAGTGCTATACCACGACCA

FIPACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC

BIPACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA

3、病毒基因组RNA提取

使用病毒基因组RNA/RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548）提取猪戊型肝炎病毒或疑似猪戊型肝炎病毒感染的病变组织的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组RNA/DNA。

4、RT-LAMP反应体系建立

按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：

2×反应缓冲液12.5μL

EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

F35pmol

B35pmol

猪戊型肝炎病毒RNA5μL

超纯水补足25μL。

RT-LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。

5、RT-LAMP检测方法

1）特异性检测

使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪戊型肝炎病毒以及对照毒株-猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒的基因组DNA/RNA，作为RT-LAMP反应的模板，进行各毒株的RT-LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。

2）敏感性检测

提取的猪戊型肝炎病毒基因组RNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成10个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和RT-PCR扩增，对比本发明的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对检测猪戊型肝炎病毒的敏感性。

3）荧光可视化检测

根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。

实施例1RT-LAMP检测方法的特异性结果

对1株猪戊型肝炎病毒、7株对照病毒和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，猪戊型肝炎病毒反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。

实施例2RT-LAMP检测方法的敏感性结果

猪戊型肝炎病毒基因组RNA的起始浓度为6.31×10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为6.31×10-8ng/μL，而普通PCR法检测限为6.31×10-6ng/μL。

实施例3RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果

根据浊度仪监控优化的条件，反应前加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪戊型肝炎病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，本发明建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。

实施例4猪戊型肝炎病毒定量标准曲线的绘制

以猪戊型肝炎病毒的RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将RT-PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒RNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质粒的起始浓度，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释10个稀释度，各稀释度溶液作为标准样品，进行RT-LAMP扩增。

设置对照：浓度为6.31×10ng/μL、6.31ng/μL、6.31×10-1ng/μL、6.31×10-2ng/μL、6.31×10-3ng/μL、6.31×10-4ng/μL、6.31×10-5ng/μL、6.31×10-6ng/μL、6.31×10-7ng/μL、6.31×10-8ng/μL的标准重组质粒pMD18-T-ORF2样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.4078x-10.05，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9924，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数6.31，即为6.31x10-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02x1023x(ng/ulx10-9)）/(RNAlengthx660)，RNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+216=2909bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02x1023x（6.31x10-yx10-9）/(2913x660)，简化为：1.97x108x10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于2.184，则浓度为10-2.184，再乘以基数6.31，即为该试验样品的浓度6.31×10-2.184ng/μL，拷贝数为1.97x108x10-2.184，即为1.97x106.184copies/μL，从而达到定量的效果。

表1样品浓度负对数值与HEV-LAMP浊度值时间线性关系表

时 间	23	25	26	29	32	35	37	39	42
										浓度负对数	-1	0	1	2	3	4	5	6	7

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

<160>4

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TGCTTGACTTTGCACTCGA

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TCAGTGCTATACCACGACCA

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA

Claims (8)

1.一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪戊型肝炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）；

其中引物序列分别为：

F3TGCTTGACTTTGCACTCGA

B3TCAGTGCTATACCACGACCA

FIPACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC

BIPACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA

所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根据权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪戊型肝炎病毒RNA模板提取是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，自猪病变组织样品或粪便中提取的猪戊型肝炎病毒的RNA。

3.根据权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

4.根据权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM。

5.一种猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于兽医临床上检测疑似猪戊型肝炎病变组织或猪粪便排泄物等是否含有猪戊型肝炎病毒，具体检测步骤包括：

（1）RT-LAMP引物的设计与合成

（2）猪戊型肝炎病毒RNA模板的提取

（3）RT-LAMP反应体系的建立

（4）RT-LAMP检测方法。

6.根据权利要求5所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，

2×反应缓冲液12.5μL

EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

F35pmol

B35pmol

猪戊型肝炎病毒RNA5μL

超纯水补足25μL。

7.根据权利要求5所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。

8.根据权利要求5所述的猪戊型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。