CN101210269A - 用于检测戊型肝炎病毒的lamp扩增用核酸引物组 - Google Patents

Abstract

用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物，上述LAMP扩增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，从由序列编号1～67或其互补序列构成的序列组中至少选择一个，使用选择序列中的15个碱基以上的连续序列，作为包含序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3的任一个LAMP引物的构成单位的核酸引物。

Description

用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组

相关申请的交互参考：

本申请基于并要求之前于2006年12月26日申请的日本专利申请号2000-350363的优先权，其全部内容在本申请中引入作为参考。

发明背景

1、发明领域

本发明涉及迅速检测戊型肝炎病毒的手段。

2、相关技术的描述

导致戊型肝炎的戊型肝炎病毒(以下也记为“HEV”)是于1990年其基因已被克隆的病毒。HEV在世界局部地区被发现，感染途径以发生水系污染的地区经口感染为主。由此可认为在日本和欧美那样的先进诸国被发现是很稀少的。可是近年来，新的日本固有株的存在变得明朗，认为起因于所述病毒株的肝炎患者也在国内开始被确认(Takahashi K，Iwata K，Watanabe N等人，Viroligy；2001；287；9-12)。由该病毒引起的肝炎病态也存在着从几乎没有症状的轻度的肝炎、至急性肝炎、甚至重症肝炎的症例。因此，有必要迅速鉴定原因病毒，由它的病毒型推测预后，开始恰当的治疗。

另外，据最近的报告确认输血也会感染戊型肝炎病毒(MatsubayashiK，Nagaoka Y，Sakata H等人，Transfusion 2004；44(6)；934-940；Mitsui T，Tsukamoto Y，Yamazaki C等人，J.Med.Virol.2004；74(4)；563-572)。由此，开发能够适应大规模筛选那样的戊型肝炎病毒的简便且高灵敏度的检测法的需求正在增强。

现在，HEV的主要检测法是采用测定患者血清中存在的抗体，或通过PCR扩增基因的方法。然而，在抗体检查中，不仅已治愈的患者被判定为阳性，而且尽管戊型肝炎病毒实际上为阳性时期，但由于抗体产生的时间延迟，往往也被判定为阴性。而通过直接测定病毒基因组的PCR法存在着要从基因组提取开始经历逆转录反应、PCR扩增反应后电泳的步骤而最终艰难获得结果这一烦杂问题。不仅如此，尽管确认了HEV RNA由于菌株不同存在很多变异，但是未必能说使用可一次稳定地检测出它们各种各样的基因型的扩增体系。因此，由于上述原因导致阳性率低也是个问题。

现在，在检测戊型肝炎病毒的检查方法中，适用于健康保险的体系还没有开发。但现实是既使在日本人中，随着年龄增大，抗体阳性率正在上升。鉴于这样现状，感染戊型肝炎病毒的人比已掌握的医疗关系者还多的可能性大。因此，期盼开发简便、灵敏度高、而且费用低的检查体系。

本发明的课题在于提供用于检测戊型肝炎病毒的迅速且正确的手段。

发明概述

为了解决上述课题，本发明者找到了以下的手段。即

(1)用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组，上述LAMP扩增用核酸引物组包含FIP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一种引物，其中

上述FIP引物为包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2(其中，x为0以上的整数个碱基的核酸，序列F1c为序列F1的互补序列)；

上述F3引物为序列F3；

上述BIP引物为包含序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中，y为0以上的整数个碱基的核酸，序列B1c为序列B1的互补序列)；

上述B3引物为序列B3；

上述序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3为包含在选自序列编号1～67或其互补序列的至少一个序列中的连续序列所示的15个碱基以上的核酸。

(2)用于检测戊型肝炎病毒的基因型的LAMP扩增用核酸引物组，上述LAMP扩增用核酸引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中

上述FIP引物为包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2(其中，x为0以上的整数个碱基的核酸，序列F1c为序列F1的互补序列)；

上述F3引物为序列F3；

上述BIP引物为包含序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中，y为0以上的整数个碱基的核酸，序列B1c为序列B1的互补序列)；

上述B3引物为序列B3；

上述引物组中包含的所有序列是为了确定戊型肝炎病毒的基因型，通过使用戊型肝炎病毒基因组的可读框2的部分序列而设计的序列。

本发明提供了用于迅速且正确地检测戊型肝炎病毒的手段。

本发明的优点在以下说明书中示出，一部分从说明书中显然可见，一部分可通过本发明的实践而习得。本发明的优点可通过尤其是下文中指出的手段和组合来实现和获得。

附图简述

所附的附图整合入说明书中并构成说明书的一部分，其阐述了本发明的实施方案，其与上文的总体描述和下文给出的实施方案的详细描述一起用于解释本发明的原理。

图1是表示LAMP法中使用的引物与被检核酸的关系的模式图。

图2是表示使用LAMP法获得的扩增产物的模式图。

图3是表示在使用环引物时的LAMP法中使用的引物与被检核酸的关系的图。

图4A是表示从HEV RNA中的5’非编码区至ORF-1的序列与引物设定区的模式图。

图4B是表示续图4A的图。

图4C是表示续图4B的图。

图5A是表示HEV RNA中的ORF-2区的一部分序列与引物设定区的模式图。

图5B是表示续图5A的图。

图5C是表示续图5B的图。

图6是表示一个显示LAMP扩增结果的电泳照片例子的图。

图7是表示一个用浊度计测定LAMP扩增结果例子的曲线图。

图8是表示用于显示在LAMP扩增中反应温度影响的结果的曲线图。

图9是表示为了确定HEV的LAMP扩增的最适区的实验结果的曲线图。

图10是表示选择在ORF-2(即区域编号4和区域编号5)的保守性高的区域中扩增上升最早的引物组的研究结果的曲线图。

图11是对通过使用区域编号004与区域编号002的引物组，以来自患者样本的提取产物为模板的LAMP扩增上升的速度进行比较的曲线图。

发明内容

1、用语说明

此处使用的“核酸”可以是来自天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或设计的人工核酸等以及它们的混合物等。

此处使用的“样本样品”或“样本”并不限定于所使用的，可以是例如血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、组织、活组织、口腔内粘膜、培养细胞、喀痰等，或是通过任意本来已知的手段从来自上述任一个或它们的混合物提取核酸成分的样本。

本发明提供迅速且正确测定人、家畜、宠物等动物体内有无戊型肝炎病毒，以及有关在对于治疗方针的决定有用的病毒的基因型等戊型肝炎病毒的信息的手段。因此，样本样品只要是可用于以上手段的样品，可以是任意样品。

此处使用的“LAMP法”是环介导等温扩增(Loop-Mediated IsothermalAmplification)的简称，是对于靶基因的6个区域设计4种引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物，利用链的置换反应，在一定温度反应的方法(即等温基因扩增法的一种)。本发明中使用的LAMP法包括通常为本领域技术人员公知的方法，或其部分改变的方法等。后面给出了LAPM法的基本说明，也可参照例如特开2002-186481等文献。其中被引用的文献由于参照也包含在本发明中。

另外，此处使用的“RT-LAMP”法是逆转录环介导等温扩增(Reverse-Transcribed Loop-Mediated Isothermal Amplification)的略称。这个方法是应用LAMP法的方法，是当靶基因为RNA时，合成cDNA可与扩增同时或根据要求间隔一定时差进行的可在检测中利用的方法。在这个技术领域中公知的任意的RT-LAMP和其改变法都可在本发明中利用。

下面，就有关基本的LAMP法中的引物设计和获得的扩增产物，利用图1和图2进行说明。另外，在本图、本说明书和本专利申请的范围内，带有“c”的记号表示与不带“c”的同一记号彼此互补。例如“F1c”与“F1”就是彼此互补。

参照图1。当要检测的被检核酸为双链时，任一条链都可含有靶序列，在此设定在一条链核酸中含有靶序列。要按照能够将靶序列夹在中间那样设定用作引物杂交的序列的引物区域F1c、F2c、F3c、B1、B2、B3。设计用于与这些序列杂交的引物，即FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物。然后，在使上述4种引物与作为模板核酸的被检核酸能够获得适当扩增的条件下进行LAMP扩增。象图2所示那样，由此获得的LAMP扩增产物是含有靶序列的扩增产物和其互补链(参照图2)，靶序列位于扩增产物的茎-环结构的中央。

另外，为了提高扩增速度，也可使用象图3所示那样的环引物。在被检核酸中，用于环引物杂交的位置可以处于引物区域F2与F1c之间(其中，环引物的序列也可以包含F2区域)、引物区域B1与B2c之间(其中，环引物的序列也可以包含B2c区域)的任一位置。如图3所示那样，例如，当设定在引物区域F2与F1c之间时，适合的环引物是环引物FLc。而当设定在引物区域B1与B2c之间时，适合的引物是环引物BL。环引物可以同时使用这两个位置，也可以使用其中的至少1个。

本发明中环引物杂交的区域是处于扩增产物的哑铃构造中的单链环位置的区域。实施LAMP法时，通过使作为与该单链区的链互补的DNA片段的环引物存在，可保持必要的立体结构，以便目标扩增可顺利进行。因此，环引物的使用在本发明中是优选的。

2、戊型肝炎病毒基因组

戊型肝炎病毒的基因组为RNA。因此，无论现在的哪一种扩增法，利用逆转录酶进行cDNA的合成是不可缺的。因此优选利用RT-LAMP。在RT-LAMP法中，如果在本身已公知的LAMP反应液中添加逆转录酶，对含有别的步骤的不进行逆转录反应的被检核酸的被检样品，例如从来自血液的提取产物等直接开始扩增目标核酸是可能的。但是，也可以在进行了cDNA合成后实施LAMP法，此方法也属于本发明的范围内。

已知在LAMP法中通过DNA合成酶进行的延伸反应中，作为副产物生成焦磷酸，它与存在于反应溶液中的镁离子结合。本发明中使用的LAMP法由于扩增产物的生成量多，焦磷酸镁超过溶解度积，产生白浊。如果用仪器测定白浊(即浊度)，可更容易地实时确认有无扩增。这样的方案也是本发明的1个优选方案。

3、LAMP扩增用核酸引物

根据本发明，LAMP扩增用核酸引物(也简称为“引物”或“LAMP引物”)是FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物，作为它们的构成单位，FIP引物中可含有序列F1与序列F2，F3引物中可含有序列F3，BIP引物中可含有序列B1与序列B2，而B3引物中可含有序列B3。另外，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物除了含有FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物之外，还可以含有环引物。

根据本发明，通过检测患者体内有无HEV时，可以判定病毒的基因型。因此，一方面当判定有无病毒时，需要在所有的株间选择保守性高的区域。另一方面，当判定病毒的基因型时，优选是选择在基因型中的保守性高、基因型间差异较大的序列。作为满足这些要求的区域，本发明者选择了上述的2个区域。图4A、图4B和图4C的区域主要在提供用于检测病毒有无的通用引物时有用。另外，图5A、图5B和图5C的区域在提供用于判定病毒类型的型判定用引物时有用。

其中，有关图4A、图4B和图4C表示的序列是连续的序列，并比较了各种株间从HEV基因组的5’末端到可读框1(也记为“ORF-1”)的碱基序列。同样有关图5A、图5B和图5C表示的序列是连续的序列，并比较了各种株间可读框2(也记为“ORF-2”)的一部分碱基序列。现在已知根据HEV基因的特征，HEV被分为4种基因型。

将各个区域中可作为与扩增有关的单位序列使用的序列设定在区域编号001、002、004、005这4个部位，按照对应于序列F3、序列F2、序列F1、序列B1、序列B2、序列B3那样用实线或虚线框架表示。以这些序列为基础，设计必需的4种引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物。虽然任一个在图4中均没有显示，但作为区域编号003使用图4A所示序列的1位～193位的区域设计了引物。

另外，在设计上述引物时，由于菌株不同，或区域不同，有时在序列中会看到细微的变异。因此，根据需要有时使用混合碱基，有时需要将选择的序列的一部分序列组合后设计引物。这里所谓“使用混合碱基”指的是将用对应变异或可能对应变异的碱基置换的多个序列混合使用、或不混合使用。作为这样的研究结果，设计了对构成用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组有效的序列。其结果如表1-1～表1-2所示。表1-2是续表1-1。这里将表1-1和表1-2合起来称为表1。

[表1-1]

HEV用LAMP引物序列
						序列组	区域编号	序列编号	序列(5′→3′)
001-F3	第1序列组	1	14	TCGATGCCATGGAGGCCCA
					001-F3-1			15	GCAGACCAC GTATGTGGTCG
001-FIP			16	TTGGCCGCAGCCAGAGCAGTTYATTAAGGCTCCTGGCAT
					001-FIP-2			17	GGCCGCAGCCAGAGCAGTTYATTAAGGCTCCTGGCAT
001-BIP			18	AATGCTGTGGTGGTTCGGCCAACTGCCGGGGTTGCATCAA
					001-BIP-1			19	AATGCTGTGGTGGTYCGGCCAACTGCCGGGGTTGCATCAA
001-BIP-2			20	AATGCTGTGGTGGTCCGGCCAACTGCCGGGGTTGCATCAA
					001-B3			21	CAAAGCACCTCAGGGCGGAA
001-B3-1			22	CCAAAGCACCTCAGGGCGG
					002-F3		2	23	GGCAGACCACGTATGTGG
002-FIP			24	CAATGGCAGTAGTAATGCTCGATGCCATGGAGGCCCA
					002-FIP-1			25	CTATGGCAGTAGTAATGCTCGATGCCATGGAGGCCCA
002-FIP-2			26	GCTCAATGGCAGTAGTAATTCGATGCCATGGAGGCCCA
					002-BIP			27	AGGCTGCTCTGGCTGCGGCAACGGCCGRACCACCACAG
002-BIP-1			28	GGCTGCTCTGGCTGCGGCCAACGGCCGRACCACCACAG
					002-BIP-2			29	AGGCTGCTCTGGCTGCGGCAACGGCCGAACCACCACAG
002-BIP-3			30	AGGCTGCTCTGGCTGCGGCAACGGCCGGACCACCACAG
					002-B3			31	AACTGCCGGGGTTGCATCAA
002-B3-1			32	CAACTGCCGGGGTTGCATC
					003-FIP		3	33	TGGCAGTAGTAATGCCAGTCGATGCCATGGAGGCCC
003-BIP			34	AGCAGGCTGCTCTGGRACCACCACAGCATTCG
					003-B3			35	ACCAACTGCCGGGGTTGCAT
004-F3		4	36	ACCGGCCGGYCAGCCGTCTG
					004-F3-1			37	CGGCCGGYCAGCCGTCTG
004-F3-2			38	TCGTGGGCGGCGCAGCGG
					004-FIP-1			39	TAGGGGATTGCGAAGGGCTGTCGTGGGCGGCGCAGCGG

[表1-2]

004-FIP-2			40	TAGGGGATTGCGAAGGGCTGGGTGCCGGCRGTGGTTTCT
					004-FIP-3			41	GGGGAGGGCGAAGGGCTGTCGTGGGCGGCGCAGCGG
004-FIP-4			42	GGGGAGGGCGAAGGGCTGGGTGCCGGCRGTGGTTTCT
					004-FIP-5			43	TAGGGGATTGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCGGT
004-FIP-6			44	GGGGAGGGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCAGT
					004-FIP-7			45	GGGGAGGGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCGGT
004-FIP-8			46	CTGAGAATCAACCCGGTCACTCGTGGGCGGCGCAGCGG
					004-FIP-9			47	CTGAGAATCAACCCTGTCACTCGTGGGCGGCGCAGCGG
004-FIP-10			48	GAAGGGCTGAGAATCAACCCTCGTGGGCGGCGCAGCGG
					004-FIP-11			49	ATATAGGGGAGGGCGAAGGCCGGCGGTGGTTTCTGGG
004-FIP-12			50	ATATAGGGGAGGGCGAAGGCCGGCAGTGGTTTCTGGG
					004-FIP-13			51	CAATAGCAGTWGTGACGCTCGACGCCATGGAGGCCCA
004-BIP			52	CATCCAACCAACCCCTTCGCACACGAGGTCCAGCCCCGG
					004-BIP-1			53	CATCCAACCAACCCCTTCGCGGCGAGCTCCAGCCCCGG
004-BIP-2			54	AGGCAGCTCTAGCAGCGGCARCGGCCGAACCACCACAG
					004-B3			55	TGGGACTGGTCACGCCAAG
004-B3-1			56	TGGTCACGCCAAGCGGAGC
					005-F3		5	57	CTCCTCATGTTTYTGCCTAT
005-F3-1			58	CTCTTCGTGCTTYTGCCTAT
					005-F3-2			59	YTGCCTATGCTGCCCGCG
005-FIP			60	CAGAAACCACCGCCGGAACACCGCCCGGTCAGCCGTCTG
					005-FIP-1			61	CAGAAACCACCGCCGGYACACCGGCCGGCCAGCCGTCTG
005-FIP-2			62	CAGAAACCACYGCCGGCACACCGGCCGGCCAGCCGTCTG
					005-FIP-3			63	CAGAAACCACCGCCGGCACACCGGCCGGTCAGCCGTCTG
005-BIP			64	GACCGGGTTGATTCTCAGCGCGAAGGGGTTGGTTGGATG
					005-BIP-1			65	TGACAGGGTTGATTCTCAGCGCGAAGGGGTTGGTTGGATG
005-B3			66	ACACGAGGTCCAGCCCCGG
					005-B3-1			67	GGCGAGCTCCAGCCCCGG

表1中的区域编号相当于图4A～图5C表示的区域001～005。例如，表1的区域编号1的序列编号14对应于图4A的区域编号001-F3，作为F3引物的F3序列使用。同样表1的001-F3-1表示区域编号001的序列，也可以作为F3引物的F3序列使用，或将序列编号14的连续序列与序列编号15连续的序列组合为包含合计15个碱基以上的核酸的F3引物使用。在这种情况下，来自于序列编号14的序列和来自于序列编号15的序列中的任一个序列处于5’端都可以。可将同样的使用方式运用到表1中“HEV用LAMP引物序列”栏记载的末尾编号“-1”～“-13”。就是说，可以将这些末尾编号“-1”～“-13”中每一个序列单独含有的连续的15个碱基以上的序列作为构成单位，也可以将它们中的至少2个序列中分别含有的连续的序列(无论那一个为5’侧)结合，做成15个碱基以上的序列，作为构成单位。另外，也可以将末尾编号的任一个序列、或其中的连续的15个碱基以上的序列作为目的引物使用。

因此，根据本发明的一种方案可提供用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物，上述LAMP扩增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，从由序列编号14～67或它们的互补序列组成的序列组中至少选择一个，使用所选择序列中的15个碱基以上的连续序列作为包含序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3的任一个LAMP引物的构成单位。

另外，当以表1记载的序列编号14～67或它们的互补序列作为构成单位时，由此设计的核酸引物只要是不妨碍作为引物的功能，至少存在1个变异、缺失、添加也可以。含有那样的变异、缺失、添加的序列的LAMP扩增用核酸引物也包括在本发明的范围内。

另外，为了鉴定作为戊型肝炎病毒的基因型存在的亚种(即亚型)，也有必要在表现亚型差别的特征部位设计引物。这样的引物可作为分型用引物使用。详细的如下面所述，表2给出了可在这样的引物中利用的序列的例子。

[表2]

HEV用LAMP引物序列(型判定用)
							序列组	区域编号	HEV基因型	序列编号	序列(5′→3′)
004-F3-I	第2序列细	4	I	68	ACCGCCCGGTCAGCCGTCTG
						004-F3-II			II	69	ACCGACCGGTCAGCCGTCTG
004-F3-III			III	70	ACCGGCCGGGCAGCCGTCTG
						004-F3-IV			IV	71	ACCGGCCGGTCAGCCGTCTG
004-FIP-I			I	72	ATGGGGATTGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCGGTT
						004-FIP-II			II	73	ATGGGGATTGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCGGTA
004-FIP-III			III	74	TGGGGAGGGCGAAGGGCTGGGGCGGCGCAGCGGCGGTG
						004-FIP-IV			IV	75	TGGGGAGGGCGAAGGGCTGTCGCCGCGGGCGGCGCAG
004-BIP-I			I	76	CATCCAACCAACCCCTTCGCACACGAGGTCCAGCCCCGG
						004-BIP-II			II	77	CATCCAACCAACCCCTTCGCAGGCGAGGTCCAGACCCGG
004-BIP-III-1			III-1	78	CATCCAACCAACCCCTTCGCGGGCGAGYTCCAGCCCCGG
						004-BIP-III-2			III-2	79	CATCCAACCAACCCCTTCGCGGGCGGACTCCAGCCCCGG
004-BIP-IV			IV	80	CATCCAACCAACCCCTTCGCGGGCGAGCTCCAGRCCCGG
						004-B3-I			I	81	CGAGTGGTCGGGCGGGTTG
004-B3-II			II	82	CAAGTGGCCGGGCTGGTTG
						004-B3-III			III	83	GGGGGCGGGGCGGCTG
004-B3-IV			IV	84	GAGTGGACGGGCYGGCTG
						005-F3-I		5	I	85	CTCCTCATGTTTYTGCCTAT
005-F3-II			II	86	TTCCTCTTGTTTCTGCCTAT
						005-F3-III			III	87	CTCTTCGTGCTTYTGCCTAT
005-F3-IV			IV	88	YTGCCTATGCTGCCCGCG
						005-FIP-I			I	89	CAGAAACCACCGCCGGAACACCGCCCGGTCAGCCGTCTG
005-FIP-II			II	90	CAGAAACCACCGCCGGTACACCGACCGGTCAGCCGTCTG
						005-FIP-III-1			III-1	91	CAGAAACCACCGCCGGYACACCGGCCGGCCAGCCGTCTG
005-FIP-III-2			III-2	92	CAGAAACCACYGCCGGCACACCGGCCGGCCAGCCGTCTG
						005-FIP-IV			IV	93	CAGAAACCACCGCCGGCACACCGGCCGGTCAGCCGTCTG
005-BIP-I			I	94	GACCGGGTTGATTCTCAGCGCGAAGGGGTTGGTTGGATG
						005-BIP-II			II	95	GACCGGGTTGATTCTCAGCGCAAAGGGGTTGGTTGGATG
005-BIP-III			III	96	TGACAGGGTTGATTCTCAGCGCGAAGGGGTTGGTTGGATG
						005-BIP-IV			IV	97	GACCGGGTTGATTCTCAGCGCGAAGGGGTTGGTTGGATG
005-B3-I			I	98	ACACGAGGTCCAGCCCCGG
						005-B3-II			II	99	AGGACGAGGTCCAGACCCGG
005-B3-III			III	100	GGCGAGCTCCAGCCCCGG
						005-B3-IV			IV	101	GGCGAGCTCCAGMCCCGG

(1)通用引物

表1给出的序列中的任一个作为通用引物用于检测有无HEV都是有效的区域。这里所谓的通用引物是不管HEV的基因型如何都可检测HEV的引物。由于提供这样的通用引物，有可能做到对对象中的HEV无遗漏地进行检测。这样的通用引物中使用的区域优选表1给出的序列。本发明者获得与任何引物、特别是保守性高的HEV基因组的其它区域相比，这些区域扩增效率显著高的实验结果。然而，能够说明有关为什么本发明的引物非常优越的任何机制还完全不清楚。关于机制的这样的见识，不限于HEV，在LAMP法中使用的任一个引物也是同样的，现状是任一个引物是否显著有效，只有通过实验研究才能知道。

如上所述，已确认表1中给出的各引物区域用于检测HEV的有无是有效的区域。其中，扩增速度最快，效率好的引物区域是区域002(这里也记为“区域编号002”)。区域002是从HEV基因组的5’末端开始的可读框1的2位延伸至190位的区域。这个区域不仅在上述的区域001、002、003、004、005这5个区域中是效率最好的区域，而且即使与对应于HEV基因组整体设计的任一个引物比较，也是最好的LAMP用引物区域(实施例3中详细叙述)。

因此，避开该区域中的变异部位，对根据本发明的引物的各构成单位进行设计，结果可得到以下的序列。

序列编号1：GGCAGACCACNTATGTGG

序列编号2：TCGANGCCATGGAGGCCCA

序列编号3：CAGTTNATNAAGGCTCCTG

序列编号4：GCATTACTACTGCCATTGAG

序列编号5：GCGTCACNACTGCTATTGAG

序列编号6：AGGCTGCTCTGGCTGCGGC

序列编号7：AGGCAGCTCTAGCAGCGGC

序列编号8：GCCTTGGCGAATGCTGTGG

序列编号9：CTGTGGTGGTTCGGCCNTT

序列编号10：CAAACCGAGATCCTTATTAAT

序列编号11：CAGACAGAGATACTTATTAAC

序列编号12：TTGATGCAACCCCGGCAGTTG

序列编号13：NTGATGCAGCCCCGGCAGCTT

其中，序列编号1的11位的“N”表示“A”或“G”中的任一个碱基。序列编号2的5位的“N”表示“C”或“T”中的任一个碱基。序列编号3的6位的“N”表示“C”或“T”中的任一个碱基，序列编号3的9位的“N”表示“A”或“T”中的任一个碱基。序列编号5的8位的“N”表示A或T中的任一个碱基。序列编号9的17位的“N”表示G或T中的任一个碱基。序列编号13的1位的“N”表示“C”或“T”中的任一个碱基。

其中，序列编号4与序列编号5、序列编号6与序列编号7、序列编号10与序列编号11、以及序列编号12与序列编号13分别是在同样部位设定的引物，优选这2种混在以便于能够对应于存在于那个区域的种种变异。

序列编号1～序列编号13中的这些序列按照能够即使在保守性高的区域中也能避开散布的变异那样设定，或按照不能避开的变异位于对扩增的影响小的部位那样分区域设定。另外，在使混合碱基的使用控制在最小需要水平等方面也想了些办法。在本发明中，通过反复进行各种各样的引物设定的研究，将这些区域分开是可能的。

根据本发明的1个方案的用于检测HEV的LAMP扩增用核酸引物可以从由序列编号1～13或它们的互补序列组成的序列组中至少选择1个序列，使用选择序列中的15个碱基以上的连续序列作为包含序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3的任一个LAMP引物的构成单位的核酸引物。另外，根据本发明的引物在不妨碍作为目的引物发挥功能的限度内，在序列编号1～13中任一个序列中至少再进行一次变异、缺失、添加也可以。含有这样的变异、缺失、添加的序列的LAMP扩增用核酸引物也属于本发明的范围内。

根据本发明的上述序列作为用于检测HEV的LAMP扩增用核酸引物组的使用方式可以是例如以下那样的方式。首先当用于检测HEV的LAMP扩增用核酸引物组按照包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物设计时，上述FIP引物是含有序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2。其中x为0以上的整数个碱基的核酸，优选0～3个碱基的任意碱基，例如优选的例子“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列，更优选x为0个碱基。即，不存在x的引物由于可防止自身分子内高级结构的形成，是最优选的。另外，上述F3引物是序列F3。上述BIP引物是含有序列B1和序列B2c的序列B1-y-B2c。其中，y为0以上的整数个碱基的核酸，优选0～3个碱基的任意碱基，例如，优选的例子“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列，更优选y为0个碱基。根据与x同样的理由，优选不存在y。另外，上述B3引物是序列B3。序列F1c、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2c和序列B3是用从由序列编号1～序列编号13和它们的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，而且按照序列F3、序列F2、序列F1c、序列B1c、序列B2和序列B3的顺序选择以上位的序列编号表示序列或它们的互补序列。例如，当序列F3为序列编号1时，序列F2可以是序列编号2、序列F1c可以是序列编号3、序列B1c可以是序列编号4、序列B2可以是序列编号5、序列B3可以是序列编号6等。

例如，其中当序列F3是用从由序列编号1～5组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸时，序列F2是用从由序列编号2～7组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列F1c是用从由序列编号3～8的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列B1是用从由序列4～9组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列B2c是用从由序列6～11的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及序列B3是用从由序列7～13的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，在同上的情况下，当序列F3是用从由序列编号1～8的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸时，序列F2是用从由序列编号2～9的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列F1c是用从由序列编号3～10组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列B1c是用从由序列4～11的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，序列B2是用从由序列5～12组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及序列B3是用从由序列6～13组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外，有关含有变异位点“N”的序列，可以使用上述的含有任一碱基的序列，也可以将用分别含有作为混合碱基(即，也称为mix碱基)的两方碱基那样的序列制作的多个引物同时加入到1个反应体系中。

另外，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组可以包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，在这些引物中还可组合环引物，也可称为LAMP扩增用核酸引物组。环引物的合成可以使用上述那样的已公知的任一方法进行。含有那样的环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内，使用含有或不含有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

以下就使用表1的各区域时的引物组进行说明。另外，对于表1的各区域使用中有利的环引物的例子如表3所示。

[表3]

HEV用LAMP引物序列
						序列组	区域编号	序列编号	序列(5′→3′)
001-LFc	第3序列组	1	102	CTGCTCAATGGCAGTAGTA
					001-LBc			103	CAAACCGAGATCCTTATTAAT
002-LFc		2	104	CAGGAGCCTTAATRAACTG
					002-LBc			105	AAYTCCGCCTTGGCGAATG
004-LFc		4	106	CAGGAGCCTTTATRAACTG
					004-LFc-1			107	CCCCAGAAACCACYGCCGG
004-LFc-2			108	GTCACCCCAGAAACCACYG
					004-LFc-3			109	ATCAACCCKGTCACCCCAGA
004-LFc-4			110	TGAGAATCAACCCKGTCACC
					004-LBc			111	CCGATGTCACCGCTGCGG
004-LBc-1			112	CAGACGTTGCCGCTGCGT
					004-LBc-2			113	CCGATGTCGTTTCACAAY
004-LBc-3			114	CTGACATTCCARCCGCAG
					005-LFc		5	115	GCCGCTGCGCCGCCCRCG
005-LBc			116	CCTTCGCAATCCCCTATATT
					005-LBc-1			117	CCTTCGCCCTCCCCTATA

(a)当使用表1的区域编号1时

当使用表1的区域编号1的序列时的引物组如下所示。如上所述，当用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物时，上述FIP引物是包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2，(其中x为0以上的整数个碱基的核酸、优选0～3个碱基的任意碱基，例如，“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选x为0碱基。即，不存在x的引物由于防止自身分子内高级结构的形成而最优选)；另外上述F3引物是序列F3，而上述BIP引物是含有序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2，(其中，y为0以上的整数个碱基的核酸、优选0～3个碱基的任意碱基。例如“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选y为0个碱基。根据与x同样的理由，不存在y的更好)；另外当在上述B3引物为序列B3，使用表1的区域编号1时，引物组如下所示。

即，上述F3引物是用从由序列编号14和序列编号15组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号16和序列编号17组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号18～20组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号21和序列编号22组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，同上的情况下，上述F3引物是用从由序列编号14和序列编号15的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号16和序列编号17的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号18～20的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号21和序列编号22的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外当利用表1的区域编号1时，在LAMP扩增用核酸引物组中还可具备利用了表3所述的序列的环引物。例如，优选使用包含序列编号102和/或103的序列的环引物。含有这样的环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内，使用含有或不含有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

(b)使用表1的区域编号2时

在像上述那样的情况下，使用表1的区域编号2时，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。上述F3引物是用序列编号23中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号24～26组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号27～30组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号31和序列编号32组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号23的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号24～26的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号27～30的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号31和序列编号32的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外，当利用表1的区域编号2时，作为LAMP扩增用核酸引物组，还可具备利用了表3所述的序列的环引物。例如，优选使用包含序列编号104和/或105的序列的环引物。含有这样的环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内，使用含有或不舍有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也包括在本发明的范围内。

(c)使用表1的区域编号3时

另外，在同上的情况下，当使用表1的区域编号3时，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。上述F3引物是用序列编号23中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号33中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号34中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列编号35中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号23的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号33的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号34的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列编号35的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(d)使用表1的区域编号4时

另外，在同上那样的情况下，当使用表1的区域编号4时，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。上述F3引物是用从由序列编号36～38组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号39～51组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号52～54组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号55和序列编号56组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用从由序列编号36～38的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号39～51的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号52～54的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号55和序列编号56的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外，当利用表1的区域编号4时，LAMP扩增用核酸引物组中还可以具备利用了表3所述的序列的环引物。例如，优选使用包含由序列编号106～114的序列组成的序列组中选择的至少一个序列的环引物。含有这样的环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内，使用含有或不含有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

(e)当使用表1的区域编号5时

另外，在同上那样的情况下，当使用表1的区域编号5时，根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。上述F3引物是用从由序列编号57～59组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号60～63组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号64和序列编号65组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号66和序列编号67组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用从由序列编号57～59的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号60～63的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用从由序列编号64和65的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用从由序列编号66和序列编号67的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外，当利用表1的区域编号5时，在LAMP扩增用核酸引物组中还可具备利用了表3所示序列的环引物。例如，优选使用包含从序列编号116～117的序列组成的序列组中选择的至少一个序列的环引物。含有这样的环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内，使用含有或不含有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

另外，根据本发明的扩增反应可以按照每1管1种引物组进行，或者也可以使多种引物组混在1管中进行。也可将后述的分型用引物组同时混在1管中进行，也可以象后述那样只将多种分型用引物组混在1管中进行。另外，也可在1管中只存在单独的一种分型用引物组进行反应。在需要一次鉴定戊型肝炎病毒的多种亚型时，通过使多个分型用引物组同时存在于1管中的方法进行更有效。利用这样的扩增反应的HEV检测方法和扩增方法也在本发明的范围内。

(2)分型用引物

作为本发明的另一方案，为了对作为HEV的基因型存在的亚种、即亚型进行鉴定，在表现亚型差别的特征部位设计引物、即设计分型用引物。

如上所述那样，为了对作为HEV的基因型存在的亚种、即亚型进行鉴定，有必要在表现亚型差别的特征部位设计引物。用于该目的的分型用引物使用图5A～C所述的可读框2的一部分序列制作。在制作的引物中含有的优选的各序列如表2所示。利用这些序列制备的引物可以准备各型用的反应管，在各个管中使用各自分型用引物，进行各自的反应。依靠添加到可获得扩增产物的管中的引物的类型，即依靠对引物组的类型的特异性，判定供试验的样本样品的HEV基因型成为可能。另外，利用带有可检测每一类型的标记物也可以检测每一类型。这样的方法可利用本身已公知的任一现有技术的手段。

另外，由于根据HEV的亚型还可以更细地分组。对于需要更严密的分型时，认为图5A～C的可读框2的区域也是有效的。这种场合下，可以选择对各个型特异的序列设计各自的引物。这样的详细的分型用的引物组也在本发明的范围内。这样的详细的分型用的引物组用于检测混有较少量的型也有效，在反应特异性高的LAMP法中可有效使用。

另外，如上所述，作为分型用引物组，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，还可以再组合环引物使用。具备这样的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和环引物的LAMP扩增用核酸引物组也在本发明的范围内。另外，使用含有或不含有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

以下就使用表2的各区时的引物组进行说明。

(a)使用表2的区域编号4时

(i)I型用的引物组

使用表2的区域编号4的序列可提供的HEVI型用的引物组如下。

当用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物时，上述FIP引物是包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2，(其中，x为0以上的整数个碱基的核酸、优选0～3个碱基的任意碱基，例如“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选x不存在)，另外上述F3引物是序列F3，而上述BIP引物是含有序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2，(其中y为0以上的整数个碱基的核酸、优选0～3个碱基的任意碱基。例如“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选y不存在)，另外当上述B3引物为序列B3时，使用表2的区域编号2，用于检测I型HEV的LAMP扩增用核酸引物组如下。

例如，上述F3引物可以是用序列编号68中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号72中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号76中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号81中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物可以是用序列编号68的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号72的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号76的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号81的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(ii)II型用引物组

在与I型用引物组同样的场合下，使用表2的区域编号4，用于检测II型HEV的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。

即，上述F3引物可以是用序列编号69中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号73中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号77中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号82中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物可以是用序列编号69的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号73的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号77的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号82的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(iii)III型用的引物组

在与I型用引物组同样的场合下，使用表2的区域编号4，用于检测III型HEV的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。

上述F3引物可以是用序列编号87中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用从由序列编号91和序列编号92组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号96中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号100中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物可以是用序列编号87的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号91的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号96的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号100的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(iV)IV型的引物组

在与I型用引物组同样的场合下，使用表2的区域编号4，用于检测IV型HEV的LAMP扩增用核酸引物组可以是如下那样。

即，上述F3引物可以是用序列编号71中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号75中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号80中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号84中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物可以是用序列编号71的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列编号75的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列编号80的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号84的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(b)当使用表2的区域编号5时

(i)I型用的引物组

使用表2的区域编号5的序列可提供的HEVI型用的引物组如下。

当用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物时，上述FIP引物为包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2，(其中，x为0以上的整数个碱基的核酸、优选0～3个碱基的任意碱基，例如“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选x不存在)，另外上述F3引物是序列F3，而上述BIP引物是含有序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2，(其中，y为0以上的整数个碱基的核酸，优选0～3个碱基的任意碱基。例如“TTT”、“AAA”、“CCC”和“GGG”等序列是优选的例子，更优选y不存在)，另外在上述B3引物为序列B3时，使用表2的区域编号2，用于检测I型HEV的LAMP扩增用核酸引物组如下。

例如，上述F3引物是用序列编号85中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号89中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号94中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号98中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号85的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号89的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号94的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号98的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(ii)II型用引物组

在与I型用引物组同样的情况下，使用表2的区域编号5，用于检测II型HEV的LAMP扩增用核酸引物组如下。

例如，上述F3引物是用序列编号86中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号90中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号95中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号99中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号85的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号89的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号94的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号98的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(iii)III型用引物组

在与I型用引物组同样的情况下，使用表2的区域编号5，用于检测III型HEV的LAMP扩增用核酸引物组如下。

例如，上述F3引物是用序列编号87中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用从由序列编号91和序列编号92组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号96中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号100中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号87的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号91的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号96的互补序列中舍有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列编号100的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

(iV)IV型用的引物组

在与I型用引物组同样的情况下，使用表2的区域编号5，用于检测IV型HEV的LAMP扩增用核酸引物组如下。

例如，上述F3引物是用序列编号88中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号92中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号97中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列编号101中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

或者，上述F3引物是用序列编号88的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述FIP引物是用序列编号92的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，上述BIP引物是用序列编号97的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列编号101的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

另外，如上所述，作为分型用引物组，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，还可以再组合环引物使用。具备这样的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和环引物的LAMP扩增用核酸引物组也包括在本发明的范围内。另外，使用含有或不合有环引物的LAMP扩增用核酸引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

通过以上这样的根据本发明的引物组，可提供迅速且正确地检测HEV和/或确定感染的HEV的基因型的可能的手段。其中可在任一引物组中使用的构成单位的序列中，在只要不妨碍作为目的的引物的功能，也可以进行至少一次的变异、缺失、添加。含有这样的变异、缺失、添加的序列的LAMP扩增用核酸引物和/或引物组也在本发明的范围内。另外利用这样的引物或引物组的核酸扩增方法和HEV检测方法也在本发明的范围内。

4、HEV检测方法

通过使用从由上述那样的根据本发明的LAMP扩增用核酸引物组组成的引物组中选择的至少一个引物组，可以提供用于检测戊型肝炎病毒的方法。另外，通过使用分型引物组可在检测HEV的同时或与检测分开地进行HEV的分型。

根据本发明的方法可以在可获得恰当扩增的条件下使用根据本发明的引物组通过LAMP反应进行样本样品的核酸扩增反应，以及在上述扩增反应后或反应过程中对扩增产物进行检测。

样本样品如果需要，也可以在进行核酸扩增反应前通过本身公知的提取手段做成核酸成分。例如，这样的提取手段的例子可以使用酚-氯仿法等液-液提取法、使用了单一物体的固-液提取法等，但并不限定于这些。另外，也可以利用市售的核酸提取试剂盒QIAamp(QIAGEN社制)、Smitest EX-R&D(医学生物学研究所社制)等。而当样本样品是核酸成分时，不需要提取过程。

当对核酸成分的样本样品进行LAMP扩增时，优选在例如下面那样的条件下进行。LAMP扩增的温度优选开发LAMP法的荣研化学社推荐的约60℃～约65℃之间的温度，优选例如58℃～59℃的反应温度。

进行HEV的分型时，在可获得恰当扩增的条件下通过LAMP反应进行样本样品的核酸扩增反应，可在上述扩增反应后或反应过程中对引物组特异的扩增产物进行检测，以及根据上述引物组特异性确定戊型肝炎病毒的基因型。例如，用于对引物组特异的扩增产物进行检测的手段可以在用于鉴定1管1种基因型的引物组存在下进行反应，确认有无扩增。由此可以进行引物组特异性、即取决于引物组的型特异性的检测。

另外，扩增产物的检测可以在例如扩增反应时或扩增反应后检测反应液的浊度，或者利用可见光、荧光、化学发光、电化学发光、化学荧光、荧光能量转移法、ESR等各种光学的手段。这些手段对于本领域技术人员是公知的。

另外，也可以通过测定浊度判断有无扩增。例如，当测定浊度时，并不限定于可以使用例如TERAMECS株式会社制的Loopamp实时浊度测定仪器LA-200或MORITEX公司制的Realoop-30等。另外，也可以使用整合到双链DNA后发荧光那样的溴化乙锭、Cyber GreenI等进行监测。通过这些方法可以实时对扩增产物的合成量进行监测。

通过上述的根据本发明的方法可以迅速且正确地进行HEV检测和/或确定感染的HEV的基因型。

5、测定试剂盒

根据本发明，提供了用于实行本发明的方法的测定试剂盒。这样的测定试剂盒的例子至少具备上述那样的根据本发明的引物组，此外还可以具备核酸扩增酶、逆转录酶、扩增酶的底物、逆转录酶的底物、反应用缓冲液、反应用缓冲剂和/或反应容器等。

通过提供这样的测定试剂盒，可以进行更简便地迅速且正确的HEV的检测和/或确定感染的HEV的基因型。

[例]

例1

对应于引物区域的序列使用了表1和表2给出的序列表示的核酸组。另外，作为环引物使用表3给出的序列表示的核酸。

以下通过实施例对本发明的核酸检测方法进行更具体的说明。

(1)合成寡核苷酸

使用表1、表2给出的序列，制备用于HEV的检测和基因型分类的核酸引物。这样的引物的合成也可以使用本领域技术人员已知的任何方法。

(2)LAMP反应液

本例中，作为LAMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反应液的组成如下。

RT-LAMP法的反应液组成

20mM  Tris-HCL(pH8.8)

10mM  KCL

8mM   MgSO₄

10mM  (NH₄)₂SO₄

0.1％ 吐温20

0.8M  甜菜碱

1.4mM dNTPs。

当用这样组成的总量为25μL的反应液进行反应时，按照下述浓度加入各个引物。

引物添加量

FIP引物 40pmoL

BIP引物 40pmoL

F3引物  5pmoL

B3引物  5pmoL。

实施例中使用的引物使用区域编号002的序列。FIP引物使用序列编号24、BIP引物使用序列编号27、F3引物使用序列编号23、B3引物使用序列编号31。

另外，在总量25μL进行反应时，向各反应体系添加1μL作为酶混合物的将Bst DNA聚合酶(New England Bio Labs社制)和AMV逆转录酶(Takara Bio公司制)按照同比或任何比率混合的酶液、或添加在荣研化学社制的RNA扩增试剂盒中带有的酶混合物。被检样品使用从感染HEV的患者1、患者2和患者3分别采集的血清中用Smitest EX-R&D(医学生物学研究所社制)提取得到的HEV RNA。

(3)利用LAMP法进行核酸扩增

温度设定为63℃、时间设定为1.5小时进行核酸扩增。此时取代来自血清的提取产物，将添加灭菌水的样品作为阴性对照。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增的LAMP产物。其结果，从含有来自患者的被检样品的反应体系得到的样品在LAMP产物中出现典型的梯状的图形(图6)。而不含有模板DNA的阴性对照，则完全看不到扩增(图6中的n泳道)。以上结果表明使用选择的引物组，可以序列特异地进行HEV基因组的扩增。

(4)利用LAMP法进行浊度测定

通过浊度测定检测利用LAMP法进行的扩增。浊度测定使用TERAMECS公司制的浊度测定仪器LA-200，对使用作为构成单位使用了区域编号002序列的引物组实施了LAMP法的扩增进行检测。其结果如图7所示。在图中的解释性记号中，对于区域编号002中标记“L”的例子中，在该反应体系中添加表3的序列编号104的环引物。另外，解释性记号中的末尾的编号分别表示如下的模板浓度。

1：10³个拷贝/反应体系

2：10²个拷贝/反应体系

3：10¹个拷贝/反应体系

4：10⁰个拷贝/反应体系。

根据这些结果可确认添加了环引物的反应体系要比没有添加的更早开始扩增，模板浓度高的反应体系比低的更早开始扩增。

例2

进行了用于求在通过LAMP法进行HEV检测时指出反应温度的研究。使用的引物如下。

实施例中使用的引物使用了区域编号002的序列。FIP引物使用了序列编号24，BIP引物使用了序列编号27，F3引物使用了序列编号23，B3引物使用了序列编号31，环引物使用了序列编号104。

FIP引物、BIP引物、F3引物和B3引物在与例1相同的浓度下使用，环引物按照20pmoL/25μL加到反应体系中。

反应温度设定为63℃和59℃，测定了扩增开始的时间。其结果如图8所示。在图中的解释性记号中，标记为63的是在63℃下进行反应的情况，标记为59的是在59℃下进行反应时的结果。

另外，解释性记号中的末尾的编号分别为以下这样的模板浓度。

2：10²个拷贝/反应体系

1：10¹个拷贝/反应体系

0：10⁰个拷贝/反应体系

n：作为阴性对照添加水。

从这些结果可看出当存在充分的模板浓度的情况下，于63℃进行反应的场合下扩增开始得早。但如果模板浓度低下，会看到不扩增的现象。另外，对于在59℃进行反应的场合下，模板浓度即使差100倍，扩增开始的时间也不会差别10分钟。因此，在使用区域编号002的上述引物组合的体系中，认为与63℃相比，59℃反应更适合。

例3

在利用LAMP法进行的戊型肝炎病毒的检测法中，进行了用于表示使用了从序列编号1至13的区域编号002与其它任何区域相比在扩增效率方面更优越的实验。

以下，在表4-1～表4-3中表示的第4序列组中给出了本研究使用的引物区域和在各区域设定的引物序列。表4-2和表4-3是依次续在表4-1后的表，其中表4-1～表4-3合起来记为表4。

[表4-1]

HEV用LAMP引物序列
					HEV101-F3HEV101-FIPHEV101-BIPHEV101-B3	序列组	区域编号	序列编号	序列(5′→3′)
第4序列组	101	118	CCACCCAAGATCYATTAATG
						119	GAGTACCAGCGCTGAACRTCCCAATGTTCTGCACCGGTG
		120	CCCACCCGTGGTCCTGCACGGGGGGGAGACCACGC
						121	TCAAAACAATAGGTGCGGTC
	HEV102-F3HEV102-FIPHEV102-BIPHEV102-B3	102	122					CCTTTACTCTCTGCAYGACC
					123	GTGCAGCRTATAGACGTGTCGGCCAGCCGATGTCGCGG
			124				CCTCCCTCCTGAGGTGCTATCAGRAGATACGAGGTTGT
					125	CATARGTCACAACAGCACGG
		HEV103-F3HEV103-FIPHEV103-BIPHEV103-B3	103				126	CCGTACGACYAAAATAGTTGG
				127	GCTGCGGTGAGCAGCAGCACCATCCGTTGGTTATAGAGCG
						128	CCGTCGCCTATGCCTTATGTCAAATATAGATCGACATAC
				129	AYGGGGAGCCGCCAGGGC
			HEV104-F3HEV104-FIPHEV104-BIPHEV104-B3			104	130	TGCTGCTCACGGCTYATGAC
		131		GAGGCATTCCACCCCTCATTCCGTGGCATTAGYTACAAGG
						132	GATGCCCTTACYGCAGTAATGGAGGTAGCGCTGGTGGC
		133		CCCTTGGATATCGCCTGGGT
					HEV105-F3HEV105-FIPHEV105-BIPHEV105-B3	105	134	TTYATGCGGTGGTTAGGGC
		135	GCCTCATTATCATGGCCWTGGGAGTGCACCTGCTTCTTGG
						136	GAGGGYTCTGAGGTCGACCCACGGCATAGGTCCCCGACAC
		137	GGCCTCAAGCTGGCGCCC
				HEV106-F3HEV106-FIPHEV106-BIPHEV106-B3		106	138	CCTCCCGCCAGTCTATGGG
		139	CATTAGATGAAATCCTAACCTGGTCRCATAGCCTCACTTATG
						140	GCGCCCCTAGCGCAGCGCGGGTGAATCTGTTATACCTG
		141	GCCGGTCAGCGAATGCCG

[表4-2]

HEV107-F3HEV107-FIPHEV107-BIPHEV107-B3		107	142	GGRTCATTGTTTGAGTCAGA
						143	ARGCATGACAGAGGGGACCGACTGGCTGGTGAATGCCTC
			144	TTTCCCTGAGGCGTTCTACCTRATAGGGCGCGGGGTCA
						145	TAGTCGGGGGCCACTGCA
		HEV108-F3HEV108-FIPHEV108-BIPHEV108-B3	108	146				GGGATTGTGCAYTATCAGTT
					147	CACAACATCFACATCCCCCTACTGCCGGGGTCCCGGGC
				148			CCCACCCGGGAGCTTCGCAATGGGGTGTAAAGGCCGCAAA
					149	TATAGTGACACGGGCCGC
			HEV109-F3HEV109-FIPHEV109-BIPHEV109-B3	109			150	ACCACAATTATAGCYACGGC
		151			GTGTGGCGGGTRAGTGCAACCCAGGGGTCTCATCCAGTC
						152	GAAGTGTGTTATTTTAGATGCCAATCACATCWGATATGCCG
		153			CCACCAGCGAGGAAAAAGTT
				HEV110-F3HEV110-FIPHEV110-BIPHEV110-B3		110	154	GGAAGGCCGTCCTCTCAAC
		155	CGAACATCTGAATGMGCTGCTTGTGGGGAGGTATGGCCG
						156	GTCCCTAGCTAGGTTCATCCATATAACTCACAYGTGGTGGC
		157	ACCATAGCCTCAACCAGTTG
					HEV111-F3HEV111-FIPHEV111-BIPHEV111-B3	111	158	TGCATGGTATTTGAAAATGA
		159	CACTCCTCCATAACCACACACTGAATTTGACAGTACTCAGAA
						160	GTATCAYCTGGTTCGGTCAGCAAAAACCTTTAAGAGACTCCA
		161	CAGGCTCACCAGAATGCTTG
				HEV112-F3HEV112-FIPHEV112-BIPHEV112-B3		112	162	GGTTGATTACCGCCCTATTG
		163	GCAAAWCGCACCACATCAGGGCTGTATGCCGGTGTGGTG
						164	GAACTGGGGCCCCGGCCCTCGAAGRAAATCACAAACAGC
		165	CARACCTGCGCAACATTCGT

[表4-3]

HEV113-F3HEV113-FIPHEV113-BIPHEV113-B3		113	166	CCACTGAACCCWCTCTTACC
						167	CCCGGTACTGGGCGTAATTACTTCAGGATGGCACCAACAC
			168	ATCCGTTATCGCCCGCTGGTGGCCAAAARGAAATAGAAATAGC
						169	CATATCAACAGARGTAGGGG
		HEV114-F3HEV114-FIPHEV114-BIPHEV114-B3	114	170				TGCATTTCACYGGCACGAA
					171	CCGAGAAGCGTATCAGCAAGTTGGTGAGGTGGGYCGAGG
				172			CCGACAGAATTGATTTCGTCGGGCTGAGACGACAGGGCGGG
					173	AGCTTTACAGTCGGCTCGCC
			HEV115-F3HEV115-FIPHEV115-BIPHEV115-B3	115			174	TTGCCCGYTCCCTTGATTGG
		175			GCGGGAGGACATAGAATGTCTACTTTGGACGGCCGCCCC
						176	CGCGGTAAGCTGTCTTTCTGTATAATTATAAGGGTAGCCAGC
		177			ATTTGRTCACTAGCAGTTGT

另外，作为使用从序列编号1至13的区域编号002的引物，使用了下面的序列编号。

F3：序列编号1

FIP：序列编号2和序列编号4

BIP：序列编号6和序列编号9

B3：序列编号12

没有环引物。

(1)LAMP反应溶液

在本实验中，作为LAMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反应溶液组成如下。

RT-LAMP法的反应溶液组成

20mM Tris-HCl(pH8.8)

10mM KCl

8mM MgSO₄

10mM(NH₄)₂SO₄

0.1％吐温20

0.8M甜菜碱

1.4mM dNTPs。

当用该组成的总量为25μL的反应液进行反应时，按照以下浓度加入表4中的各个引物。

引物添加量

FIP引物 40pmol

BIP引物 40pmol

F3引物  5pmol

B3引物  5pmol

没有添加环引物。

另外，当在总量25μL中进行反应时，作为酶混合液，添加1μL的BstDNA聚合酶与AMV逆转录酶混合的酶液，即添加1μL荣研化学社制的RNA扩增试剂盒附带的酶混合物。

模板使用HEV RNA，该RNA是使用Smitest EX-R&D(医学生物学研究所社制)从感染了戊型肝炎病毒的患者1(III型，JRA-1)、患者2(III型，JKN-1)的血清提取的。

(2)使用LAMP法进行核酸扩增

将温度设定为60℃、时间为100分钟，进行核酸扩增。此时，取代来自血清的提取产物，将添加灭菌水的反应作为阴性对照。

(3)使用LAMP法进行浊度测定

作为浊度测定结果的例子，使用TERAMECS公司制的浊度测定仪器LA-200，对使用了用从区域编号101至115的序列设计的引物和设定在区域002内的引物(组成与上述的例3(1)所述的同样)时的扩增开始进行实时测定。其结果如图9所示。在图中的解释性记号中，JRA表示来自患者1的结果，JKN是来自患者2的结果。附在解释性记号的末尾的101至115和002的编号表示使用的引物的区域编号。

(4)研究中使用的引物区域的保守性与扩增开始时间的比较

表5中汇总了本研究中使用的引物的区域与各个患者样本的扩增开始时间以及该区域的序列保守性。

[表5]

引物组	使用的区域(F3-B3)	JRA-1株扩增开始时间	JKN-1株扩增开始时间	序列的保守性
					101	299-469	100.12	108	在型间存在变异
102	512-691	76.06	40.48	在型间存在变异
					103	743-926	-	-	在型内部也存在变异
104	1033-1207	85.18	77.42	在型间存在变异
					105	1444-1619	-	110	在型内部也存在变异
106	1812-2027	-	-	在型内部也存在变异
					107	2392-2600	91.48	-	在型内部也存在变异
108	2922-3094	96.48	89.18	在型间存在变异
					109	3478-3650	74.06	61.06	在型间存在变异
110	3951-4094	77.48	54.36	在型间存在变异
					111	4387-4587	-	-	在型内部也存在变异
112	4760-4950	-	-	在型内部也存在变异
					113	5620-5816	53.18	54.18	在型间存在变异
114	6204-6380	29.3	35.06	在型内部也存在变异
					115	6674-6851	-	-	在型内部也存在变异
002	1-190	46.18	38.12	保守性高
					004	5205-5421	59	73.24	保守性高

根据表5给出的结果，与本发明中效率最好的区域编号002相比，区域编号114一方扩增开始时间更早，显示出了良好的结果。然而，这个区域编号114与区域编号002相比，是变异集积的区域，不仅在型间，即使在同一型的内部也是出现不同序列多的区域。因此，当增加除了此次使用的JRA-1株和JKN-1株以外的型时，扩增效率降低的可能性大。与此相比，实验数据表明区域编号002附近无论型间还是型内都是变异少的区域。因此区域编号002不仅型间、型内的变异少，而且从通过设计在该区域的引物进行的扩增开始早这一点也可证明是最适于HEV的LAMP扩增的引物设定区域。

例4

通过使用HEV基因组中的其它保守性高的区域，进行了使用图4给出的区域编号002区进行扩增显示扩增开始的时间更早的研究。

在HEV基因组中，在从图4所示的5’末端开始至可读框1的区域中存在保存性高的区域。然而，除此之外，在可读框2区域的一部分也存在着同等程度的保守性高的区域(图5)。当分别用这2个区域组成LAMP扩增体系时，研究了有关作为扩增效率的扩增开始究竟有怎样不同。

(1)可读框2区域中的2种引物组的研究

在可读框2中，设计区域编号004和区域编号0052种引物组，比较扩增开始。

LAMP反应溶液组成如下。

RT-LAMP法的反应溶液组成

20mM Tris-HCl(pH8.8)

10mM KCl

8mM MgSO₄

10mM(NH₄)₂SO₄

0.1％吐温20

0.8M甜菜碱

1.4mM dNTPs。

另外，在总反应液25μL中添加1μL作为酶混合液的Bst DNA聚合酶与AMV逆转录酶混合的酶液，即添加1μL的荣研化学社制的RNA扩增试剂盒附带的酶混合液。另外在用同样总量25μL进行反应时，按照下面浓度添加各个引物。

引物添加量

FIP  40pmol

BIP 40pmol

F3  5pmol

B3  5pmol。

另外，在各个区域中，加入到反应中的引物如下。

区域编号004：

序列编号36、序列编号37、序列编号38、序列编号41、序列编号42、序列编号52、序列编号53、序列编号55、序列编号56

区域编号005：

序列编号57、序列编号58、序列编号59、序列编号60、序列编号61、序列编号62、序列编号63、序列编号64、序列编号65、序列编号66、序列编号67。

为了对应于在保守性高的区域中也存在少量变异，将不同型引物混合后使用。没有使用环引物。

至于模板，将使用Smitest EX-R&D(医学生物学研究所社制)从预先已知病毒浓度的戊型肝炎病毒阳性患者20例的血清中提取的HEVRNA经阶段稀释后使用。

反应温度定为60℃，测定扩增开始的时间。结果如图10所示。

图10的解释性记号中的末尾编号分别表示下面的模板浓度。

1：10²个拷贝/反应体系

2：10¹个拷贝/反应体系

3：10⁰个拷贝/反应体系

4：作为阴性对照，添加水。

根据这些结果确认当存在的模板的浓度充足时，区域编号005的引物一方虽然扩增开始稍早些，但存在着随着模板减少，区域005引物的开始大幅度延迟的倾向。而区域编号004即使模板浓度减少，但只要存在模板，在1小时以内扩增开始，认为与区域005的引物组相比更好。

根据以上结果，获得了在可读框2中用区域编号004设计的引物组优越的结果。

(2)比较使用分别用区域编号004与区域编号002设计的引物组的扩增开始。

LAMP反应溶液组成做成例4的(1)那样。加入的引物对于区域编号004做成例4(1)那样。区域编号002使用序列编号23、序列编号24、序列编号27、序列编号31。而作为环引物，对于区域编号004的反应使用序列编号107、108、109，对于区域编号002的反应使用序列编号104。使用的量做成20pmoL/25μL反应体系。

作为扩增反应中的模板，使用用Smitest EX-R&D(医学生物学研究所社制)从感染了HEV的患者21、患者22、患者24的血清提取的HEVRNA。

反应温度设定为60℃，测定扩增开始的时间。得到的结果如图11所示。图11中，解释性记号中的末尾编号表示患者编号。

从图11给出的结果看到在由各3例患者样本提取的样品的扩增中，如果使用区域编号004的引物组，即使引入环引物，扩增开始也需要48分至1个多小时的时间。明白了如果使用另外的区域编号002，在20分钟至30分钟的短时间内可确认扩增开始。也就是说，即使是同样的保守性高的这2个区域，扩增开始需要的时间有很大差异，设计在区域编号002的引物组一方在较早的时间就能够开始扩增。

因此，为了设计用于HEV检测体系的更好的引物，在LAMP扩增中使用从5’末端到可读框1的区域可以说是重要的一点。

实际上，在这2个保守性高的区域中，在GC含量中确实看到了大的差别。GC含量越多，看到模板更容易呈现高级结构，而且高级结构难以解除的现象。此时与模板没有呈现高级结构时相比，用于解离成扩增需要的单链形状的能量需要的更多。如果使用此次LAMP扩增那样的等温扩增法，由于一旦形成的高级结构存在原本难以解除的倾向，模板为难以呈现高级结构的序列成了在进行好的引物设计上的一个关键点。因此，可以说即使是同样程度的高保守性的区域，选择区域编号002的5’末端区是个重要的发现。

本领域技术人员易于理解有其它优点和改进。因此，本发明在广义的方面不限于本说明书中显示并描述的特定的详细说明和代表性实施方案。所以，在不偏离后附的权利要求书和它们的等同物所定义的总的发明性概念的精神和范围下可进行多种改变。

                        序列表

Claims (25)

1.用于检测戊型肝炎病毒的LAMP扩增用核酸引物组，其包含FIP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一种引物，其中

上述FIP引物为包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2(其中，x为0以上的整数个碱基的核酸，序列F1c为序列F1的互补序列)；

上述F3引物为序列F3；

上述BIP引物为包含序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中，y为0以上的整数个碱基的核酸，序列B1c为序列B1的互补序列)；

上述B3引物为序列B3；

上述序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3为包含在选自序列编号1～67或其互补序列的至少一个序列中的连续序列所示的15个碱基以上的核酸。

2.权利要求1的核酸引物组，其中上述引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，

其中序列F3是用从由序列编号1～5组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

序列F2是用从由序列编号2～7组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

序列F1c是用从由序列编号3～8的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸、

序列B1c是用从由序列4～9组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

序列B2是用从由序列6～11的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

序列B3是用从由序列7～13的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，或者

当序列F3是用从由序列编号1～5的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸时，

序列F2是用从由序列编号2～7的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸、

序列F1c是用从由序列编号3～8组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

序列B1c是用从由序列4～9的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

序列B2是用从由序列6～11组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

序列B3是用从由序列7～13组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

其中按照序列F3、序列F2、序列F1c、序列B1c、序列B2和序列B3的顺序选择以上位的序列编号表示的序列或它们的互补序列。

3.权利要求2的核酸引物组，其还含有环引物。

4.权利要求1的核酸引物组，其中上述引物组包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，

上述F3引物是用从由序列编号14和序列编号15组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号16和序列编号17组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号18～20组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号21和序列编号22组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用从由序列编号14和序列编号15的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号16和序列编号17的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号18～20的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号21和序列编号22的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

5.LAMP扩增用核酸引物组，其中在权利要求4的核酸引物组中，还包含含有由序列编号102、103的序列和它们的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列的环引物。

6.权利要求2的核酸引物组，其中

上述F3引物是用序列编号23中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号24～26组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号27～30组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号31和序列编号32组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号23的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号24～26的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号27～30的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号31和序列编号32的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

7.权利要求6的核酸引物组，其还包含含有由序列编号104、序列编号105和它们的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列的环引物。

8.权利要求1的核酸引物组，其中

上述F3引物是用序列编号23中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号33中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号34中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号35中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号23的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号33的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号34的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号35的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

9.权利要求1的核酸引物组，其中

上述F3引物是用从由序列编号36～38组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号39～51组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号52～54组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号55和序列编号56组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用从由序列编号36～38的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号39～51的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号52～54的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由从由序列编号55和序列编号56的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

10.LAMP扩增用核酸引物组，其中在权利要求9所述的LAMP扩增用核酸引物组中，还包含含有从由序列编号106～114的序列和它们的互补序列组成的序列组选择的至少1个序列的环引物。

11.权利要求1的核酸引物组，其中

上述F3引物是用从由序列编号57～59组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号60～63组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号64和序列编号65组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号66和序列编号67组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用从由序列编号57～59的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号60～63的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用从由序列编号64和65的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用从由序列编号66和序列编号67的互补序列组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

12.LAMP扩增用核酸引物组，其中在权利要求11所述的LAMP扩增用核酸引物组中，还包含含有由从序列编号115～117的序列和它们的互补序列中选择的至少1个序列的环引物。

13.用于检测戊型肝炎病毒的基因型的LAMP扩增用核酸引物组，其包含FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中

上述FIP引物是包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2，(其中x为0以上的整数个碱基的核酸，序列F1c是序列F1的互补序列)，

上述F3引物是序列F3，

上述BIP引物是含有序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中y是0以上的整数个碱基的核酸，序列B1c是序列B1的互补序列)，

上述B3引物是序列B3，

上述LAMP扩增用核酸引物组中含有的全部序列是为了确定戊型肝炎病毒的基因型，使用戊型肝炎病毒基因组的可读框2的一部分序列设计的序列。

14.权利要求13的核酸引物组，其中

上述核酸引物组为用于检测戊型肝炎病毒的I型而使用的，

上述F3引物是用序列编号68中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号72中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号76中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号81中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号68的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号72的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号76的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号81的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

15.权利要求13的核酸引物组，其中

上述核酸引物组是用于检测戊型肝炎病毒的II型而使用的，

上述F3引物是用序列编号69中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号73中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号77中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号82中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号69的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号73的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号77的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号82的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

16.权利要求13的核酸引物组，其中

上述核酸引物组是用于检测戊型肝炎病毒的III型而使用的，

上述F3引物是用序列编号70中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸、

上述FIP引物是用序列编号74中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸、

上述BIP引物是用从由序列编号78和序列编号79构成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号83中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号70的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号74的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号78和序列编号79的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号83的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

17.权利要求13所述的用于检测戊型肝炎病毒的IV型的LAMP扩增用核酸引物组，其中

上述F3引物是用序列编号71中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号75中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号80中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号84中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号71的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号75的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号80的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号84的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

18.权利要求13的核酸引物组，其中

上述引物组是用于检测戊型肝炎病毒的I型而使用的，

上述F3引物是用序列编号85中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号89中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号94中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号98中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号85的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号89的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号94的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号98的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

19.权利要求13的核酸引物组，其中

上述引物组是用于检测戊型肝炎病毒的II型而使用的，

上述F3引物是用序列编号86中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号90中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号95中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号99中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号86的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号90的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号95的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号99的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

20.权利要求13的核酸引物组，其中

上述引物组是用于检测戊型肝炎病毒的III型而使用的，

上述F3引物是用序列编号87中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用从由序列编号91和序列编号92组成的序列组中选择的至少1个序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号96中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号100中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号87的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号91和序列编号92的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号96的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号100的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

21.权利要求13所述的用于检测戊型肝炎病毒的IV型的LAMP扩增用核酸引物组，其中

上述F3引物是用序列编号88中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号93中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号97中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号101中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

或者

上述F3引物是用序列编号88的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述FIP引物是用序列编号93的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，

上述BIP引物是用序列编号97的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸，以及

上述B3引物是用序列编号101的互补序列中含有的连续序列表示的15个碱基以上的核酸。

22.用于检测戊型肝炎病毒的方法，其包括使用从由权利要求1所述的LAMP扩增用核酸引物组组成的引物组中选择的至少1个引物组，在可获得适当扩增的条件下进行LAMP反应，实施样本样品的核酸扩增反应；以及在上述扩增反应后或反应过程中检测扩增产物。

23.权利要求22所述的方法，其中对所述扩增产物的检测是通过测定LAMP反应溶液的浊度而进行的。

24.用于检测戊型肝炎病毒的基因型的方法，其包括使用从由权利要求13所述的LAMP扩增用核酸引物组组成的引物组中选择的至少1个引物组，在可获得适当扩增的条件下进行LAMP反应，实施样本样品的核酸扩增反应；在上述扩增反应后或反应过程中检测引物组特异的扩增产物；以及根据上述引物组特异性确定戊型肝炎病毒的基因型。

25.权利要求24所述的检测戊型肝炎病毒的方法，其中对所述扩增产物的检测是通过测定LAMP反应溶液的浊度而进行的。

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