CN113122629A - 用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用 - Google Patents

用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用。本发明提供的引物和探针包括通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P；通用引物A和B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠；优选探针P以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P‑通用引物A复合物的形式存在。本发明的技术可用于基因突变的快速检测，灵敏度小于1％。

Description

用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是关于一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针，所述引物和探针的设计方法，以及所述引物和探针的相关应用。
背景技术
美国人Mullis于1985年发现了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并且早已广泛用于科学研究和临床检测。引物、模板、聚合酶是PCR反应系统的必要组分，目前市场上已有大量成熟的PCR反应试剂提供，用户只需加入引物和模板即进行PCR反应。因此，引物设计是决定PCR反应应用成功与否的关键因素。
随着生命科学的飞速发展，基因突变检测的重要性越来越受关注。目前已知部分主流肿瘤靶向治疗药物的疗效，与肿瘤基因突变密切相关。K-Ras基因是公认的癌基因，参与EGFR信号传导过程。2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果，即K-Ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-Ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-Ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-Ras基因状态，二是只有K-Ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。2009年《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：如果K-Ras基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。因此，肿瘤基因突变检测越来越受重视。
目前为了特异性抑制野生型序列的扩增并选择性扩增突变型序列，常见的基因突变检测方法有测序法、等位特异性扩增法及非全匹配的等位特异性扩增法、蝎形引物法、环形引物法、肽核酸阻断法、MGB探针阻断法等。传统的DNA测序法虽然被公认是基因突变检测的“金标”方法，但由于其检测灵敏度仅约10％，不能满足临床检测需要，不能广泛应用。采用突变特异性引物，如等位特异性扩增法、蝎形引物法、环形引物法，用于检测多重突变，如KRAS密码子12和密码子13的基因突变的12种，通常每个反应管只能检测一种突变，因此试剂的成本较高，相关产品用于临床检测时，医院也是按照突变反应管的数量来收费，因此检测KRAS的8种突变的收费价格就普通基因检测的8倍。目前厦门某公司提供的KRAS基因突变检测产品可检7种KRAS基因突变，但每个样品均需做8个反应管；此产品在郑州2011的中标价格高达1050元每人份。北京某公司提供的KRAS基因突变检测产品可检8种KRAS基因突变，但每个样品均需做8个反应管；此在中山肿瘤医院2011的中标价格高达1180元每人份。同时广东省物价局规定的收费标准为：k-ras基因突变荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法1323元/次(约为普通荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法的8倍)。中山肿瘤医院公布的“双脱氧链终止法-测序法”收费标准为230元/次。现有MGB探针阻断法用于基因突变检测，通常也需结合突变特异性引物，才能有较好的特异性。肽核酸阻断法用于KRAS基因突变检测等，已有现成检测试剂盒，但目前肽核酸仍有专利保护，全世界仅数家公司提供肽核酸的合成服务，中国国内还没有提供肽核酸合成服务的公司，因此，肽核酸的合成成本较高，肽核酸阻断法的运用受到较大限制。
发明内容
本发明的一个目的在于以高特异性检测非常低含量的体细胞突变，提供一种快速、高精度和低成本的基因突变检测方法。
一方面，本发明提供了一种引物和探针组合物，其包括：通用引物A，通用引物B和野生型阻断探针P；其中：
通用引物A和通用引物B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，通用引物A和通用引物B与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；
野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；
野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P是以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P-通用引物A复合物的形式存在。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P的3'端通过共价基团与引物A的5'端结合，其中的共价基团包括但不限于磷酸基，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PC Spacer或Spacer 18。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠的长度为1-15个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，通用引物B的3'端与所述野生型阻断探针P重叠，靠近所述突变位点，间隔为0-10个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，与野生型阻断探针共价结合的通用引物A的3'端，不靠近突变位点，间隔不小于15个碱基。
根据本发明的具体实施方案，本发明的引物和探针组合物中，通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P各自的长度分别为15-40个碱基，熔解温度为50-65℃。通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P之间的熔解温度差不超过10℃。
本发明的通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P设计位点可参见图1所示。野生型阻断探针P特异性识别通用引物A的野生型延伸产物可参见图2所示。
本发明的引物和探针组合物，可以在扩增过程中选择性扩增突变靶序列。扩增后的产物可用于DNA测序，能够检测含量低至1％-0.1％的基因突变。
另一方面，本发明还提供了一种用于基因突变检测的试剂盒，其包括前述的本发明的引物和探针组合物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还选择性包括以下中的一种或多种：DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸，测序引物。优选地，其中所述测序引物为通用引物A。
另一方面，本发明还提供了一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，其中，核酸扩增反应系统主要包括野生型阻断探针P-通用引物A复合物，通用引物B，热稳定的DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸和DNA模板。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，核酸扩增反应的退火温度为55-65℃，退火时间为5-60秒。
本发明的用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，其中核酸扩增反应可进一步结合荧光PCR检测技术，可以通过分析荧光PCR检测结果快速确定样品是否突变。
本发明的用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，其还包括对核酸扩增反应的产物进行测序以确定样品是否突变和/或突变类型的过程。优选地，其中通过使用通用引物A作为测序引物对核酸扩增反应的产物进行测序。进一步，分析DNA测序的结果以确定样品是否突变以及突变的类型。
本发明的有益效果：
根据本发明的技术方案，野生型阻断探针与通用引物共价连接，与引物的野生型延伸产物形成有效且稳定的分子内杂交，有效地阻断了野生型模板的扩增而不影响突变模板的扩增。通过应用一对通用引物和野生型阻断探针，可以在每个反应管中检测到一个或多个目标突变位点。本发明设计的引物和探针易于合成，并且可以由任何专业的合成公司合成。本发明设计的引物和探针结合荧光PCR技术，可用于基因突变的快速检测，灵敏度小于1％。本发明的技术可以应用于液体活检。通过本发明设计的引物和探针扩增的产物可以用于DNA测序，并且可以准确地反映待测样品的靶基因突变信息，灵敏度小于1％。KRAS突变检测的成本可以降低7-8倍。
附图说明
图1显示本发明的通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P设计位点。
图2显示本发明中野生型阻断探针P特异性识别通用引物A的野生型延伸产物。
图3显示实施例1中设计的KRAS通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P设计位点。
图4显示实施例1中对照实验扩增野生型模板的曲线(曲线A)与本发明的试剂盒扩增野生型模板的曲线(曲线B)。
图5显示实施例1中对照实验扩增突变型模板的曲线(曲线A)与本发明的试剂盒扩增突变型模板的曲线(曲线B)。
图6显示实施例1中的灵敏度验证的扩增曲线。
图7a显示实施例1中30纳克野生型模板测序结果，测序结果表明样品为KRAS野生型。
图7b显示实施例1中0.03纳克突变型模板测序结果，测序结果表明样品为34A突变。
图7c显示实施例1中0.3纳克突变型模板测序结果，测序结果表明样品为34A突变。
图7d显示实施例1中3纳克突变型模板测序结果，测序结果表明样品为34A突变。
图8显示实施例2中设计的EGFR通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P设计位点。
图9显示实施例2中对照实验扩增野生型模板的曲线(曲线A)与本发明的试剂盒扩增野生型模板的曲线(曲线B)。
图10显示实施例2中对照实验扩增突变型模板的曲线(曲线A)与本发明的试剂盒扩增突变型模板的曲线(曲线B)。
图11a显示实施例2中EGFR野生型模板测序结果。
图11b显示实施例2中0.1％EGFR突变混合模板测序结果。
图11c显示实施例2中1％EGFR突变混合模板测序结果。
图11d显示实施例2中10％EGFR突变混合模板测序结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例中以本发明的方法设计的一组通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P同时结合荧光PCR技术和DNA测序技术用于检测K-ras基因密码子12和密码子13最常见的12种点突变。其优势一是在于可一个反应管里同时检测12种突变，且特异性强、灵敏度高，可检出<1％含量的基因突变；优势二是低成本、速度、简便；优势三是可替代肽核酸、锁核酸、MGB blocker、Scorpion等技术在肿瘤基因突变检测领域的应用。
一、引物设计
K-ras基因野生型序列(SEQ ID No.1)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列1(SEQ ID No.2)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列2(SEQ ID No.3)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列3(SEQ ID No.4)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列4(SEQ ID No.5)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列5(SEQ ID No.6)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列6(SEQ ID No.7)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列7(SEQ ID No.8)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列8(SEQ ID No.9)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTCGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列9(SEQ ID No.10)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTTGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列10(SEQ ID No.11)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列11(SEQ ID No.12)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGCCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
K-ras基因突变型序列12(SEQ ID No.13)：
CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGTCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAG
通用引物A(SEQ ID No.14)：5’-CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAA-3’，长度28个碱基，溶解温度58.4℃；
通用引物B(SEQ ID No.15)：5’-CAAGGCACTCTTGCCTACG-3’，长度19个碱基，熔解温度55.7℃；
野生型阻断探针P(SEQ ID No.16)：5’-ACGCCACCAGCTCCAACTA-3’，长度19个碱基，熔解温度57.9℃；
野生型阻断探针P-通用引物A复合体(SEQ ID No.17)：以磷酸基团共价连接，
5’-ACGCCACCAGCTCCAACTA-CATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAA-3’
野生型阻断探针P的5’端3bp与通用引物B序列的3’端重迭，如下划线所示区域；引物序列B的3’端位于目标突变位点的下游第1个碱基位置。序列位置如图3所示。
通用引物A、上述野生型阻断探针P-通用引物A复合体和通用引物B等交由DNA合成公司合成，然后用于构建KRAS基因突变检测试剂盒。
二、检测试剂盒构建
检测试剂盒包括3个主要组分，即10x扩增引物混合液、2x PCR反应液和测序引物。10x扩增引物混合液为野生型阻断探针P-通用引物A复合体和通用引物B的混合物，浓度均为2μmol/L，引物从Invitrogen香港公司合成；2x PCR反应液为
Figure BDA0002345409340000071
Premix Ex TaqTMII，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR820A，其主要成分包含Taq酶、dNTP、镁离子和缓冲液等；测序引物为通用引物A，浓度为10μmol/L。
三、检测试剂盒使用方法
本试剂盒用于检测人类K-ras基因密码子12和密码子13上的12种体细胞基因突变。适用样品为从细胞株、石腊切片组织标本或新鲜冻存的组织标本中提取的高纯度的人基因组DNA。
检测反应的配制如下：每个PCR反应管分别加入10微升2x PCR反应液、2微升10x引物混合液和8微升约20纳克的待测DNA标本。
将上述PCR反应管置于StepONe荧光PCR仪(美国Appliedbiosystems公司)中，扩增反应程序设置：95度预变性10分钟；然后进入“95度15秒-60度30秒”扩增循环，循环40次，荧光信号收集设于“60度30秒”。
分析荧光PCR检测结果，当待测标本检测结果为阴性或检出Ct值大于等于40时，即可判定为KRAS突变阴性或低于检测限；当待测标本检出Ct值小于30，即可判定为KRAS突变阳性；当待测标本检出Ct值大于等于30但小于40时，判定为KRAS可疑突变，需根据下一步的测序结果进行判定是否突变。
上述扩增产物和测序引物一起送测序服务机构，如上海生工工程有限公司，进行DNA测序。
分析测序结果，与靶序列进行比较，判定待测样品是否突变及突变的种类。
四、检测试剂盒的分析性能验证
检测试剂盒的分析性能验证，包括灵敏度验证和特异性验证。特异性验证时，以没有共价连接的野生型阻断探针P和通用引物A替代野生型阻断探针P-通用引物A复合体作对照实验，分别检测30纳克的野生型模板和0.3纳克的突变型模板；对照实验检测野生型模板的检出Ct值为23.37，本试剂盒检测相同的野生型模板的检出Ct值34.19，两者的Ct差为10.82，如图4所示，此结果说明没有与通用引物A共价连接的野生型阻断探针P对野生型模板没有阻断效果，而野生型阻断探针P-通用引物A复合体对野生型模板的扩增抑制明显；对照实验检测突变型模板的检出Ct值为27.43，本试剂盒检测相同的突变型模板的检出Ct值28.47，两者的Ct差为1.04，如图5所示，此结果表明采用野生型阻断探针P-通用引物A复合体时，突变模板的扩增几乎不受影响，2纳克的突变型模板荧光PCR检测结果可直接判定为突变阳性。灵敏度验证时，将0.03纳克(0.1％)、0.3纳克(1％)、3纳克(10％)的突变型模板分别与30纳克(约10000拷贝)的野生型模板混合，分别用本试剂盒检测，检出Ct值分别为31.90、28.99、25.85，同时30纳克(约10000拷贝)的野生型模板检出Ct值为32.81，其中0.3纳克和3纳克突变型混合模板的检测结果可直接判定为突变阳性，扩增曲线如图6所示，此结果表明本试剂盒结合荧光PCR技术的检测灵敏度可达1％；同时所有产物进行DNA测序，结果如图7a、图7b、图7c、图7d所示，测序结果显示30纳克野生型模板检出为KRAS野生型、0.03纳克、0.3纳克和3纳克突变混合模板的检出为KRAS 34A突变，此结果表明本试剂盒结合DNA测序法灵敏度更高，可达0.1％，并可准确判定突变类型。
实施例2
本实施例中以本发明方法设计的一组通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P同时结合荧光PCR技术和DNA测序技术用于检测EGFR基因外显子19的缺失突变。其优势一是在于可一个反应管里同时检测多种突变，且特异性强、灵敏度高，可检出<1％含量的基因突变；优势二是低成本、速度、简便；优势三是可替代肽核酸、锁核酸、MGB blocker、Scorpion等技术在肿瘤基因突变检测领域的应用。
一、引物设计
EGFR基因外显子19野生型序列(SEQ ID No.18)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列1(SEQ ID No.19)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列2(SEQ ID No.20)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列3(SEQ ID No.21)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列4(SEQ ID No.22)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列5(SEQ ID No.23)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATATTTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列6(SEQ ID No.24)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGACTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列7(SEQ ID No.25)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列8(SEQ ID No.26)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列9(SEQ ID No.27)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAACCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列10(SEQ ID No.28)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGGCATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列11(SEQ ID No.29)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列12(SEQ ID No.30)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列13(SEQ ID No.31)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列14(SEQ ID No.32)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列15(SEQ ID No.33)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGGAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列16(SEQ ID No.34)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGAAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列17(SEQ ID No.35)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列18(SEQ ID No.36)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCTGAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
EGFR基因外显子19缺失突变型序列19(SEQ ID No.37)：
GAGCCATGGACCCCCACACAGCAAAGCAGAAACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTAATTCCTTGATAGCGACGGGAATTTTAACTTTCTCACCTT
通用引物A(SEQ ID No.38)：5’-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCA-3’，长度23个碱基，熔解温度61.3℃；
通用引物B(SEQ ID No.39)：5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3’，长度25个碱基，熔解温度60.2℃；
野生型阻断探针P(SEQ ID No.40)：5’-CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAC-3’，长度25个碱基，熔解温度54℃；
野生型阻断探针P-通用引物A复合体(SEQ ID No.41)：以spacer 18基团共价连接，
5’-CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAC/iSp18/CCACACAGCAAAGCAGAAACTCA-3’
野生型阻断探针P的5’端3bp与通用引物B序列的3’端重迭，如下划线所示区域；引物序列(3)的3’端位于目标突变位点的下游第1个碱基位置。序列位置如下图8所示。
通用引物A、上述野生型阻断探针P-通用引物A复合体和通用引物B等交由DNA合成公司合成，然后用于构建EGFR基因外显子19缺失突变检测试剂盒。
二、检测试剂盒构建
检测试剂盒包括3个主要组分，即10x扩增引物混合液、2x PCR反应液和测序引物。10x扩增引物混合液为野生型阻断探针P-通用引物A复合体和通用引物B的混合物，浓度均为2μmol/L，引物从Invitrogen香港公司合成；2x PCR反应液为
Figure BDA0002345409340000111
Premix Ex TaqTMII，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR820A，其主要成分包含Taq酶、dNTP、镁离子和缓冲液等；测序引物为通用引物A，浓度为10μmol/L。
三、检测试剂盒使用方法
本试剂盒用于检测人类EGFR基因外显子19的缺失突变。适用样品为从细胞株、石腊切片组织标本或新鲜冻存的组织标本中提取的高纯度的人基因组DNA。
检测反应的配制如下：每个PCR反应管分别加入10微升2x PCR反应液、2微升10x引物混合液和8微升约20纳克的待测DNA标本。
将上述PCR反应管置于荧光PCR仪中，扩增反应程序设置：95度预变性10分钟；然后进入“95度5秒-60度10秒”扩增循环，循环40次，荧光信号收集设于“60度10秒”。
分析荧光PCR检测结果，当待测标本检测结果为阴性或检出Ct值大于等于40时，即可判定为KRAS突变阴性或低于检测限；当待测标本检出Ct值小于30，即可判定为KRAS突变阳性；当待测标本检出Ct值大于等于30但小于40时，判定为KRAS可疑突变，需根据下一步的测序结果进行判定是否突变。
上述扩增产物和测序引物一起送测序服务机构，如上海生工工程有限公司，进行DNA测序。
分析测序结果，与靶序列进行比较，判定待测样品是否突变及突变的种类。
四、检测试剂盒的分析性能验证
检测试剂盒的分析性能验证，包括灵敏度验证和特异性验证。特异性验证时，以没有共价连接的野生型阻断探针P和通用引物A替代野生型阻断探针P-通用引物A复合体作对照实验，分别检测30纳克的野生型模板和0.3纳克的突变型模板；对照实验检测野生型模板的检出Ct值为26.75，本试剂盒检测相同的野生型模板的检出Ct值36.32，两者的Ct差为9.57，如图9所示，此结果说明没有与通用引物A共价连接的野生型阻断探针P对野生型模板没有阻断效果，而野生型阻断探针P-通用引物A复合体对野生型模板的扩增抑制明显；对照实验检测突变型模板的检出Ct值为29.46，本试剂盒检测相同的突变型模板的检出Ct值29.45，两者的Ct差为0.01，如图10所示，此结果表明采用野生型阻断探针P-通用引物A复合体时，突变模板的扩增几乎不受影响，2纳克的突变型模板荧光PCR检测结果可直接判定为突变阳性。灵敏度验证时，将0.03纳克(0.1％)、0.3纳克(1％)、3纳克(10％)的突变型模板分别与30纳克(约10000)的野生型模板混合，分别用本试剂盒检测，检出Ct值分别为32.80、30.90、26.57，同时30纳克(约10000拷贝)的野生型模板检出Ct值为33.20，其中3纳克突变型混合模板的检测结果可直接判定为突变阳性，此结果表明本试剂盒结合荧光PCR技术的检测灵敏度可达10％以下；同时所有产物进行DNA测序，结果如图11a、图11b、图11c、图11d所示，测序结果显示30纳克野生型模板和0.03纳克突变混合模板检出为EGFR野生型、0.3纳克和3纳克突变混合模板检出为EGFR 19del突变，此结果表明本试剂盒结合DNA测序法灵敏度更高，可达1％，并可准确判定突变类型。
序列表
<110> 香港城市大学深圳研究院
<120> 用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用
<130> GAI19CN6317
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 2
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctagtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 3
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctcgtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 4
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
cttgtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 5
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctgatggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 6
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctgctggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 7
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctgttggcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 8
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtagcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 9
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtcgcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 10
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggttgcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 11
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtgacgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 12
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtgccgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 13
<211> 95
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60
ctggtgtcgt aggcaagagt gccttgacga tacag 95
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cattattttt attataaggc ctgctgaa 28
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
caaggcactc ttgcctacg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 16
acgccaccag ctccaacta 19
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型阻断探针P-通用引物A复合体
<400> 17
acgccaccag ctccaactac attattttta ttataaggcc tgctgaa 47
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt tgcttctctt aattccttga tagcgacggg aattttaact ttctcacctt 120
<210> 19
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt tttgatagcg acgggaattt taactttctc acctt 105
<210> 20
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt cttgatagcg acgggaattt taactttctc acctt 105
<210> 21
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagattc cttgatagcg acgggaattt taactttctc acctt 105
<210> 22
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcgattcctt gatagcgacg ggaattttaa ctttctcacc tt 102
<210> 23
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatat tttgatagcg acgggaattt taactttctc acctt 105
<210> 24
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagactt gatagcgacg ggaattttaa ctttctcacc tt 102
<210> 25
<211> 105
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgc cttgatagcg acgggaattt taactttctc acctt 105
<210> 26
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagcctt gatagcgacg ggaattttaa ctttctcacc tt 102
<210> 27
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggaacctt gatagcgacg ggaattttaa ctttctcacc tt 102
<210> 28
<211> 113
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt tggcattcct tgatagcgac gggaatttta actttctcac ctt 113
<210> 29
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatat tccttgatag cgacgggaat tttaactttc tcacctt 107
<210> 30
<211> 104
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggaattcc ttgatagcga cgggaatttt aactttctca cctt 104
<210> 31
<211> 111
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt taattccttg atagcgacgg gaattttaac tttctcacct t 111
<210> 32
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt aattccttga tagcgacggg aattttaact ttctcacctt 110
<210> 33
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgg aattccttga tagcgacggg aattttaact ttctcacctt 110
<210> 34
<211> 107
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagaaat tccttgatag cgacgggaat tttaactttc tcacctt 107
<210> 35
<211> 104
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggaattcc ttgatagcga cgggaatttt aactttctca cctt 104
<210> 36
<211> 104
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tctgaattcc ttgatagcga cgggaatttt aactttctca cctt 104
<210> 37
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
gagccatgga cccccacaca gcaaagcaga aactcacatc gaggatttcc ttgttggctt 60
tcggagatgt aattccttga tagcgacggg aattttaact ttctcacctt 110
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ccacacagca aagcagaaac tca 23
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aagttaaaat tcccgtcgct atcaa 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 40
ctatcaagga attaagagaa gcaac 25
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型阻断探针P-通用引物A复合体
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n为spacer 18基团
<400> 41
ctatcaagga attaagagaa gcaacnccac acagcaaagc agaaactca 49

Claims (10)

1.一种引物和探针组合物，其包括：
通用引物A，通用引物B和野生型阻断探针P；其中：
通用引物A和通用引物B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，通用引物A和通用引物B与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；
野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；
野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P是以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P-通用引物A复合物的形式存在。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P的3'端与引物A的5'端结合的共价基团包括：磷酸基，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PCSpacer或Spacer 18。
4.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠的长度为1-15个碱基。
5.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针组合物，其中，通用引物B的3'端与所述野生型阻断探针P重叠，靠近所述突变位点，间隔为0-10个碱基；
通用引物A的3'端，不靠近突变位点，间隔不小于15个碱基。
6.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针组合物，其中，通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P各自的长度分别为15-40个碱基，熔解温度为50-65℃；
优选地，通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P之间的熔解温度差不超过10℃。
7.一种用于基因突变检测的试剂盒，其包括权利要求1～6任一项所述的引物和探针组合物；
优选地，所述试剂盒还选择性包括以下中的一种或多种：DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸，测序引物；更优选地，所述测序引物为通用引物A。
8.一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，该方法包括采用权利要求1～6任一项所述的引物和探针组合物进行核酸扩增反应的过程，其中，核酸扩增反应系统包括：野生型阻断探针P-通用引物A复合物，通用引物B，热稳定的DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸和DNA模板；
优选地，核酸扩增反应的退火温度为55-65℃，退火时间为5-60秒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，核酸扩增反应进一步结合荧光PCR检测技术，通过分析荧光PCR检测结果确定样品是否突变。
10.根据权利要求8所述的方法，其还包括对核酸扩增反应的产物进行测序以确定样品是否突变和/或突变类型的过程；优选地，通过使用通用引物A作为测序引物对核酸扩增反应的产物进行测序，分析DNA测序的结果以确定样品是否突变和/或突变类型。
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