KR20210156932A - 돼지 로타바이러스 a, b, c 군 동시감별 진단용 키트 및 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단용 키트 및 감별진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단용 키트 및 감별진단 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 로타바이러스 그룹 A 내지 C를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.

Description

돼지 로타바이러스 A, B, C 군 동시감별 진단용 키트 및 진단방법{Kit and method for differential diagnosis of swine rotavirus group A, B, C}

본 발명은 3가지 유형(A, B, C 군)의 돼지 로타바이러스를 동시에 감별진단할 수 있는 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.

돼지 로타바이러스는 전세계적으로 발생보고가 있는 질병으로, 우리나라의 경우도 대부분의 양돈장에 상재화 된 것으로 알려져 있다. 전체연령대의 돼지 에서 발생하는 질병으로 알려져 있으나, 주로 1~5주령의 이유자돈에서 발병율이 높으며, 8주령 이상의 자돈에서는 거의 발생하지 않는다. 흰색 또는 황색의 수양성 설사가 특징이며 설사는 수시간에서 수일간 지속되다가 회복된다. 폐사율은 10% 정도이지만 전염성 위장염 (transmissible gastroenteritis, TGE), 유행성설사 (porcine endemic diarrhea, PED) 등과 혼합 감염되면 증세가 악화되고 폐사율이 높게 나타난다. 돼지 로타바이러스가 농장에 유입될 경우, 지속적으로 순환 발생할 가능성이 높으며, 돼지설사병을 유발하는 원인체 중 24%를 차지할 정도로 농장에 경제적으로 큰 피해를 입히는 질병이다. 돼지 로타바이러스의 치료제는 없으며, 로타바이러스를 빠르게 진단하여 설사가 발생한 자돈은 보온, 건조 등의 사양관리를 철저히 하고 2차 세균감염을 예방하기 위해 항생제와 전해질 제제 급여 등의 대증요법을 실시한다. 돼지 로타바이러스는 VP6의 항원성에 따라 총 7개의 군 (A, B, C, D, E, F, G)이 알려져 있으며, A, B, C 군의 경우 인간과 동물 모두에게 감염되며, 4가지 군 (A, B, C, E)이 주로 돼지에서 문제를 일으키는 것으로 보고되어 있다. A 군의 경우 전세계적으로 가장 많이 발생하고 있으며, C 군 역시 질병의 발생과 연관된 것으로 보고되어 있다.

Marthler et al. Rapid Detection and High Occurrence of Porcine Rotavirus A, B, and C by RT-qPCR in Diagnostic Samples. J Virol Methods. 2014 Dec;209:30-4.

본 발명자들은 빠르고 정확한 진단을 바탕으로 돼지 로타바이러스를 검출하여 돼지 로타바이러스로 인한 양돈농가의 경제적인 손실을 최대한 막고, 가축 방역 및 공중방역에 기여하고자 돼지 로타바이러스 3개군(A, B, C)를 동시에 감별할 수 있는 진단 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 서열번호 1 내지 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 또는 프라이머 셋트를 이용하면 돼지 로타바이러스 A, B, 및 C군을 빠르고 정확하게 감별진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 로타바이러스 감별진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 A (RVA) 검출용 프라이머 쌍; (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 B (RVB) 검출용 프라이머 쌍; (iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 C (RVC) 검출용 프라이머 쌍; 또는 이들의 조합을 포함하는 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것이다:

상기 (i)의 프라이머 쌍은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 상기 (ii)의 프라이머 쌍은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 상기 (iii)의 프라이머 쌍은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는 이들의 조합.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 상기 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링, 또는 증폭 조건 하에서 프라미어 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

보다 구체적으로는 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며 본 명세서에서 혼용된다.

상기 서열번호 1 내지 3의 프라이머와 프로브는 로타바이러스 그룹 A에 속하는 돼지 로타바이러스의 NSP4 유전자를 표적으로 하는 것으로, 상기 NPS4 유전자는 RNA로 로타바이러스의 비구조단백질을 암호화한다.

상기 서열번호 4 내지 6의 프라이머와 프로브는 로타바이러스 그룹 B에 속하는 돼지 로타바이러스의 NSP5 유전자를 표적으로 하는 것으로, 상기 NPS5 유전자는 RNA로 로타바이러스의 비구조단백질을 암호화한다.

상기 서열번호 7 내지 9의 프라이머와 프로브는 로타바이러스 그룹 C에 속하는 돼지 로타바이러스의 VP6 유전자를 표적으로 하는 것으로, 상기 VP6 유전자는 RNA로 로타바이러스의 캡시드 단백질을 암호화한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 서열번호 3, 서열번호 6, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5, TxR, 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 다른 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 (i) 내지 (iii)의 프라이머 쌍 중 2종 이상을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 로타바이러스 감별진단용 조성물을 포함하는 로타바이러스 감별진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시된다.

상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 중합효소연쇄반응방식을 통해 돼지 로타바이러스 그룹 A, 돼지 로타바이러스 그룹 B 및 돼지 로타바이러스 그룹 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 바이러스를 동시에 멀티플렉스 검출(multiplex detection or multiplexing detection)한다.

상기 "멀티플렉스 검출" 또는 "멀티플렉싱 검출"은 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에서 복수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)"은 반응 용기에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의하여 복수의 타겟이 동시적으로 증폭되는 것을 의미한다.

상기 중합효소연쇄반응에는 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.

상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl ., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques ., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat ., Vol 23(5): 513-521(2004)).

Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 △Rn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, △Rn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2^TM(506), YOPRO^TM-1(509), YOYO^TM-1 (509), Calcein(517), FITC(518), FluorX^TM(519), Alexa^TM(520), rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon Green^TM500(522), Oregon Green^TM488(524), RiboGreen^TM(525), RhodamineGreen^TM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green^TM(531), Calcium Green^TM(533), TO-PRO^TM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3^TM(570), Alexa^TM546(570), TRITC(572), Magnesium Orange^TM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium Orange^TM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine Red^TM(590), Cy3.5^TM(596), ROX(608), Calcium Crimson^TM(615), Alexa^TM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO^TM-3(631), YOYO^TM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PRO^TM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5^TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705), Quasar 705(610) 및 TxR(592).

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 돼지 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단 방법을 제공한다:

(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;

(b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 로타바이러스 그룹 A 검출용 조성물;

(ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 로타바이러스 그룹 B 검출용 조성물;

(iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 로타바이러스 그룹 C 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i), (ii), 또는 (iii)의 조성물은 각각 서열번호 3, 서열번호 6, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 포함하는 것이다.

이하 상기 방법을 단계별로 설명한다.

(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계

본 명세서에서 용어 "검체시료"는 다양한 시료를 포함한다. 보다 구체적으로 상기 검체시료는 상기 바이러스 감염 의심 대상체에서 분리한 시료일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 대상체에서 분리한 시료는 세포, 조직, 분변, 뇨, 체액일 수 있으며, 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 안구 유액, 타액 및 조직 추출물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계는 상기 검체시료를 PCR 방법에 적용하기 위해 처리하는 단계이다. 상기 검체시료의 처리 방식은 DNA 추출 또는 RNA 추출 방식을 적용할 수 있으며 보다 구체적으로는 DNA 추출방식을 적용할 수 있다. 상기 시료로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).

(b) 상술된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 서열을 증폭하는 단계

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시된다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시된다.

본 발명의 방법은 상기 로타바이러스 감별진단용 키트를 이용하는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.

전통적인 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우에는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동에 의해 증폭 결과를 확인할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 전기영동 후에는 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색 등의 방식으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다.

실시간 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우 미지시료의 양성, 음성여부에 관계없이 증폭되는 인터널 콘트롤의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이러한 인터널 콘트롤의 Cp값 또는 Ct값과 형광 세기의 표준 곡선은 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 명확하게 구별되어 미지시료의 양성 또는 음성 여부를 판단하는 기준을 제공할 수 있다. 따라서, 검체시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기 에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 인터널 콘트롤 및 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 비교하여 시료 내에 표적이 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있다.

상기 방법은 증폭 결과를 확인하는 예시적인 방법으로, 상기 증폭 결과를 확인하는 방법은 이에 한정되지 않고 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 돼지 로타바이러스 감별진단용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 돼지 로타바이러스 감별진단용 키트를 제공한다.

(c) 본 발명은 돼지 로타바이러스 감별진단 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물, 키트 및 방법을 이용하는 경우 한 번의 PCR 반응으로 돼지 로타바이러스 그룹 A 내지 그룹 C를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 효과를 나타낸다.

도 1 내지 도 3은 본 발명의 멀티플렉스 qPCR 키트의 RVA, RVB 및 RVC에 대한 검출한계 측정을 위하여 실시한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 멀티플렉스 qPCR 키트의 특이도를 평가하기 위하여 RVA, RVB 및 RVC와, 돼지의 전염성 바이러스성 질환 원인체 12종 및 세균성 질환 원인체 13종에 대하여 실시한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 돼지 로타바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 제작

본 발명자들은 NCBI에 등록된 표 1의 각 그룹 별 (RVA, RVB, RVC) 돼지 로타바이러스의 염기서열을 다중서열 정렬한 후 가장 보존적인 지역을 선별하였다. 그 다음, 프라이머의 2차구조분석과 서열 수정을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 하기 표 2와 같이 제작하였다.

연번	Genbank Accession No.	그룹
1	MK228080.1	RVA
2	MN556675.1
3	LC477648.1
4	MK302418.1
5	MK417793.1
6	JQ904284.1	RVB
7	GU391311.1
8	AF206724.1
9	KP753133.1
10	AY217765.1
11	MH282890.1	RVC
12	KX374480.1
13	AB889510.1
14	LC122591.1
15	KJ814477.1

서열번호	구분	Primer 및 Probe 서열	Position
1	RVA Primer F	TAAAAGTTCTGTTCCGAGAGA	NSP4 7-27
2	RVA Primer R	TGTGTCATTCATTAAAGTGATTACA	NSP4 77-101
3	RVA Probe	GGAAAGATGGAIAAGCTTGCCGACCTC	NSP4 36-62
4	RVB Primer F	TAACTATAGTGCTTACGATAA	NSP5 220-243
5	RVB Primer R	CTGACGCTTTACTTGATGGTCTA	NSP5 325-347
6	RVB Probe	TGAAGAATCAAATGACGCGAAGTAT	NSP5 265-289
7	RVC Primer F	ATCTGTGAAGAGAATGGTGATGTAG	VP6 1185-1209
8	RVC Primer R	TAGTTCACATTTCATCCTCCTG	VP6 1324-1345
9	RVC Probe	CCTACGCAAGCATGGACTAAACCCA	VP6 1271-1295

실시예 2: 돼지 로타바이러스 검출시험

시료로부터 핵산을 분리하고, 표 3의 조건에 따라 동일한 튜브에서 Reverse transcription과 PCR이 연쇄적으로 일어나는 1 step 실시간 RT-PCR로 PCR을 수행하였다.

Step (단계)	temperature (도)	시간	Cycle (반복수)
reverse transcription (RT)	50	15분	1
initial Denatureation	95	10분	1
denaturation	95	10초	45
annealing % extension	60	30초

2-1. 멀티플렉스 qPCR 검출한계 측정 평가

최종 확립된 RVA 내지 RVC 감별을 위한 멀티플렉스 qPCR의 검출한계를 조사한 결과, RVA는 1x10¹ copy, RVB는 1x10² copy, RVC는 1x10¹ copy까지 검출하였다(표 4).

구분	RVA_Cy5	RVB_FAM	RVC_TxR	RI-IPC_JOE
Rota A/B/C-control 1x109	9.28	12.57	9.38	-
Rota A/B/C-control 1x108	12.98	16.30	13.10	-
Rota A/B/C-control 1x107	16.55	20.04	16.76	-
Rota A/B/C-control 1x106	20.07	23.56	20.24	-
Rota A/B/C-control 1x105	23.62	27.34	23.78	-
Rota A/B/C-control 1x104	26.83	30.39	27.05	-
Rota A/B/C-control 1x103	30.14	34.30	30.50	-
Rota A/B/C-control 1x102	33.80	38.00	33.99	-
Rota A/B/C-control 1x101	37.23	42.66	37.19	-

2-2. 특이도 평가

돼지에서 전염성 질병을 일으키는 바이러스 원인체 12종 및 세균성 원인체 13종을 대상으로 상기 프라이머 및 프로브 셋트를 이용한 진단법을 평가한 결과 비특이 반응이 존재하지 않음을 확인하였다(도 4).

구분	연번	원인체명
바이러스성	1	CSFV (Classical Swine Fever Virus, 돼지열병바이러스)
	2	PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스)
	3	PCV2 (Porcine Circovirus 2, 돼지써코바이러스 2형)
	4	PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus, 돼지유행성설사바이러스)
	5	TGEV (Transmissinble Gastroenteritis Virus, 전염성위장염바이러스)
	6	SIV (Swine Influenza Virus, 돼지인플루엔자바이러스)
	7	PPV (Porcine Parvovirus, 돼지파보바이러스)
	8	ADV (Aujesky Virus, 오제스키바이러스)
	9	JEV(Japanese Encephalitis Virus, 일본뇌염바이러스)
	10	EMCV (Encephalomyocarditis Virus 뇌심근염 바이러스)
	11	PDCoV (Porcine Delta coronavirus, 돼지 델타 코로나바이러스)
	12	PCV3 (Porcine Circovirus 3, 돼지써코바이러스 3형)
세균성	1	ST (Salmonella Typhimurium, 살모넬라감염증)
	2	SEP (swine enzootic pneumonia, 돼지유행성폐렴)
	3	Hps (Haemophilus parasuis, 글래스병)
	4	Pm (Pasteurella multocida, 파스튜렐라폐렴)
	5	App (Actinobacillus pleuropneumoniae, 흉막폐렴)
	6	S.suis (Streptococcus suis, 연쇄상구균감염증)
	7	CpA (Clostridium perfringens A, 클로스트리디움 퍼프린젠스 A)
	8	Law (Lawsonia intracellularis, 로소니아)
	9	SD (Swine Dysentery, 돼지적리)
	10	SE (Swine Erysipelas, 돼지단독)
	11	Cd (Clostridium difficile, 클로스트리디움 디피실)
	12	A.suis (Actinobacillus suis)
	13	S.hyicus (Staphylococcus hyicus, 삼출성 표피염)

실시예 3: 야외 시료를 이용한 멀티플렉스 qPCR 효능 시험

본 발명자들은 62개의 야외 시료(돼지 장 조직 시료)를 대상으로 본 발명의 멀티플렉스 qPCR을 수행하였다. 상기 야외 시료는 구체적으로 미리 유전자 증폭 및 염기서열 분석을 통해 양성으로 확인된 시료 47개(A 그룹 25개, B 그룹 0개, C 그룹 22개, A+C 그룹 복합감염 18개), 및 음성시료 15개로 이루어진 것이었다. 비교 대상으로는 Marthler et al. (J Virol Methods. 2014 Dec;209:30-4.)에 개시된 프라이머 및 프로브 세트를 논문에 개시된 조건 하에서 멀티플렉스 qPCR을 수행하였다. 결과는 표 6과 같았다.

구분 (양성 개수)	Marthaler의 멀티플렉스 키트의 양성 검출 개수	본 발명의 멀티플렉스 키트의 양성 검출 개수	비고
Group A 양성 (25)	25	25	-
Group B 양성 (0)	2 (위양성)*	0	*음성시료를 group B로 검출함, 시퀀싱 결과 비특이 결과였음
Group C 양성 (22)	22	22	-
Group A+B 복합 양성 (0)	1 (위양성)*	0	*음성시료를 group A+B로 검출함, 시퀀싱 결과 비특이 결과였음
Group B+C 복합 양성 (0)	0	0	-
Group A+C 복합 양성 (18)	18	18	-
Group A+B+C 복합 양성 (0)	1 (위양성)*	0	*음성시료를 group A+B+C 로 검출함, 시퀀싱 결과 비특이 결과였음
음성 (15)	6 (Group A 3개, Group B 2개, Group C 1개)*	3 (Group A 2개, Group C 1개)**	* 시퀀싱 결과 Group A 1개, Group C 1개는 시컨싱 결과 양성이 맞았으나, 나머지 Group A 2건 및 Group B 2건은 비특이 결과였음 **시퀀싱 결과 Group A 2개와 Group C 1개로 검출

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 야외 실험 62개로 본 발명의 멀티플렉스 qPCR 키트의 유효성을 시험한 결과, Marthaler et al.에 개시된 진단법과 비교하여, 본 발명의 진단법은 비슷한 민감도를 나타내었다. 그러나, 특이도의 면에서는 Marthaler et al.과 비교하여 높은 특이도를 나타내는 것을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Kit and method for differential diagnosis of swine rotavirus group A, B, C <130> PN200118 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVA Primer F <400> 1 taaaagttct gttccgagag a 21 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVA Primer R <400> 2 tgtgtcattc attaaagtga ttaca 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVA Probe <400> 3 ggaaagatgg aaagcttgcc gacctc 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVB Primer F <400> 4 taactatagt gcttacgata a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVB Primer R <400> 5 ctgacgcttt acttgatggt cta 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVB Probe <400> 6 tgaagaatca aatgacgcga agtat 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVC Primer F <400> 7 atctgtgaag agaatggtga tgtag 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVC Primer R <400> 8 tagttcacat ttcatcctcc tg 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVC Probe <400> 9 cctacgcaag catggactaa accca 25

Claims (14)

1. (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 A 검출용 프라이머 쌍;
   (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 B 검출용 프라이머 쌍;
   (iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 로타바이러스 그룹 C 검출용 프라이머 쌍; 또는 이들의 조합을 포함하는 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 조성물:
   상기 (i)의 프라이머 쌍은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
   상기 (ii)의 프라이머 쌍은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
   상기 (iii)의 프라이머 쌍은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는 이들의 조합.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 3, 서열번호 6, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5, TxR, 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 다른 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된 것인, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 (i) 내지 (iii)의 프라이머 쌍 중 2종 이상을 포함하는 것인, 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 로타바이러스 감별진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것인, 로타바이러스 감별진단용 키트.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 로타바이러스 감별진단용 키트.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 로타바이러스 감별진단용 키트.
   
9. 다음의 단계를 포함하는 돼지 로타바이러스 그룹 A, B, C의 감별진단 방법:
   (a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
   (b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 로타바이러스 그룹 A 검출용 조성물;
   (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 로타바이러스 그룹 B 검출용 조성물;
   (iii) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 로타바이러스 그룹 C 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
   (c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 (i), (ii), 또는 (iii)의 조성물은 각각 서열번호 3, 서열번호 6, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 방법.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 방법.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것인, 방법.
    

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