KR102416635B1

KR102416635B1 - 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트

Info

Publication number: KR102416635B1
Application number: KR1020200002261A
Authority: KR
Inventors: 윤영호; 이남식; 이인환; 오지민; 박우관
Original assignee: 주식회사 이원바이오텍
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2022-07-01
Also published as: KR20220098113A; KR20210089040A

Abstract

본 발명은 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트 및 검출 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 카바페넴 내성 장내세균을 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과를 나타낸다.

Description

카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트{Kits for Detecting Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae}

본 발명은 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트에 관한 것이다.

카바페넴계열의 항생제는 그람음성세균 감염의 치료제로 광범위하게 사용되고 있는 항생제이다. 카바페넴계열의 항생제로는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 인반즈(Invanz, ertapenem) 및 도리페넴(doripenem) 등 이 있다. 현재 카바페넴계열의 항생제는 가장 강력한 항생제로 알려져 있으며, 주로 중증도 감염환자에게 사용된다.

하지만 항생제의 무분별한 사용으로 인하여, 여러 항생제에 내성을 지니는 세균이 발생하여 사회적으로 문제가 되고 있으며, 카바페넴계열의 항생제 또한 내성균주발생이 전 세계적으로 보고되면서 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 이러한 카바페넴계열의 항생제에 내성을 지니는 장내세균을 CRE(carbapenem resistant enterobacteriaceae)라 한다.

이러한 카바페넴계열의 항생제에 내성을 지니는 장내세균은 β-락타마아제(β-lactamase)라는 효소를 생성하여 카바페넴계열의 항생제를 무력화시키는 것으로 알려져 있다.

β-락타마아제를 생성하는 유전자로는 NDM(New Delhi metallo beta lactamase) 유전자를 비롯하여, KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemases), IMP(imipenemase), GES(Guiana extended spectrum β-lactamase), SIM(seoul imipenemase), VIM(Verona integron-encoded metallo-β-lactamase) 등의 유전자들이 보고되고 있다. 이러한 β-락타마아제 효소를 생성하는 유전자들은 여러 종류의 유전자형으로 존재하고 있다. 이중 가장 대표적인 NDM(New Delhi metallo beta lactamase)은 2008년 스웨덴 환자가 인도 뉴델리에서 수술 중 감염된 사실이 확인된 후 명명되었다. NDM 유전자를 가지고 있는 박테리아는 현존하는 거의 모든 항생제에 내성이 있는 것으로 알려져 치명적인데, 최근 인도와 파키스탄에서 발생한 후 미국과 일본 등지에서도 잇따라 발견되면서 전세계로 확산될 가능성이 높아 감염 전문가들은 우려하고 있다. 이와 같이 CRE를 비롯한 다제내성균의 위험성이 전세계적으로 대두되면서 한국에서도 2010년 9월에 다제내성균 중 '카바페넴 내성 장내균(CRE)'을 법정 전염병으로 긴급 지정했다.

국내 질병관리본부 국립보건연구원에서 발행한 CPE (Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae) 진단 지침서에 따르면 카바페넴 내성 장내세균 검출을 위한 표준검사법은 직접 배양검사 통한 1단계 Carbapenemase 선별검사와 2단계 Carbapenemase 확진시험의 순차적 항생제 내성균 선별법이 채택되고 있다.

이러한 2단계 검출방식은 카바페넴 내성 장내세균의 최종 확진까지 검출시간이 오래 걸리고, 검출방법이 복잡하며, 검출비용이 고비용인 점 등의 단점이 있다. 따라서 검출시간 단축을 위해 핵산증폭기술 기반의 분자진단제품들이 개발되어 시장에 공급되고 있으나 검출특이도, 검출민감도, 시장공급가, 사용자 편의성 및 고가의 분석장비 사용 등의 선결 문제점들이 다수 존재하고 있어 이러한 문제점들이 개선된 방법의 개발이 시급한 상황이다.

대한민국 등록특허공보 제10-1038519호 (2011.6.2)

본 발명자들은 검출시간을 단축하고 검출특이도, 검출민감도, 시장공급가, 사용자 편의성 등이 개선된 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신속하면서도 민감도가 높은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 카바페넴 내성 장내세균의 유전자를 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍;

(ii) 서열번호 3 및 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍;

(iii) 서열번호 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍;

(iv) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍;

(v) 서열번호 9 및 10의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 GES 유전자 검출용 프라이머 쌍; 및

(vi) 서열번호 11 및 12의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (i)의 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (ii)의 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (iii)의 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (iv)의 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (v)의 서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 GES 유전자 검출용 프라이머 쌍; 및 상기 (vi)의 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍은 실시간 PCR 용 프라이머 쌍이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함한다:

상기 (i) KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;

상기 (ii) NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;

상기 (iii) OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;

상기 (iv) VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;

상기 (v) GES 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는

상기 (vi) IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 42 또는 43의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 42, 및 43의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된다. 보다 구체적으로 상기 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 JOE로 변형되며; 상기 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 Cy5로 변형되며; 상기 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 Cy5로 변형되며; 상기 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 JOE로 변형되며; 상기 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM으로 변형되며; 상기 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM으로 변형되며; 및 상기 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열의 5-말단은 FAM으로 변형된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 (i) 내지 (vi)의 프라이머 쌍 중 2종 이상을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 상기 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링, 또는 증폭 조건 하에서 프라미어 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

보다 구체적으로는 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유전자 증폭은 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 방식에 의해 실시된다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응 방식을 통해 KPC, NDM, OXA-48, VIM, GES 및 IMP 유전자를 동시에 멀티플렉스 검출(multiplex detection or multiplexing detection)한다

상기 "멀티플렉스 검출" 또는 "멀티플렉싱 검출"은 반응 용기(예컨대, 반응 튜브)에서 복수의 타겟 핵산서열을 동시적으로 검출하는 것을 의미한다.

상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)"은 반응 용기에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의하여 복수의 타겟이 동시적으로 증폭되는 것을 의미한다.

상기 중합효소연쇄반응에는 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소를 포함한다.

본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.

상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).

Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 △Rn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, △Rn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(www.appliedbiosystems.co.kr/).

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, TaqMan 프로브는 서열번호 1 및 2에 의해 증폭되는 cryptic plasmid DNA 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.

본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2^TM(506), YOPRO^TM-1(509), YOYO^TM-1 (509), Calcein(517), FITC(518), FluorX^TM(519), Alexa^TM(520), rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon Green^TM500(522), Oregon Green^TM488(524), RiboGreen^TM(525), RhodamineGreen^TM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green^TM(531), Calcium Green^TM(533), TO-PRO^TM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3^TM(570), Alexa^TM546(570), TRITC(572), Magnesium Orange^TM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium Orange^TM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine Red^TM(590), Cy3.5^TM(596), ROX(608), Calcium Crimson^TM(615), Alexa^TM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO^TM-3(631), YOYO^TM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PRO^TM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5^TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.

적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.

본 발명의 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트는 중합효소연쇄반응이 정상적으로 실시되었는지 확인하기 위한 PCR 대조군 세트를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법을 제공한다:

(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;

(b) (i) 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 KPC 유전자 검출용 조성물;

(ii) 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 NDM 유전자 검출용 조성물;

(iii) 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 OAX-48 유전자 검출용 조성물;

(iv) 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 VIM 유전자 검출용 조성물;

(v) 서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 GES 유전자 검출용 조성물; 및

(vi) 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브, 또는 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 IMP 유전자 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및

(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.

이하 상기 방법을 단계별로 설명한다.

(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;

본 명세서에서 용어 "검체시료"는 다양한 시료를 포함하며, 검체시료는 본 발명의 방법을 이용하여 분석된다. 보다 구체적으로는 본 발명에 기재된 카바페넴 내성 장내세균을 분리 배양한 시료이거나, 상기 카바페넴 내성 장내세균에 감염된 대상체에서 분리한 시료일 수 있다. 대상체로부터 분리한 시료는 세포, 조직, 체액일 수 있으며, 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 안구 유액, 타액 및 조직 추출물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계는 상기 검체시료를 PCR 방법에 적용하기 위해 처리하는 단계이다. 상기 검체시료의 처리 방식은 DNA 추출 또는 RNA 추출방식을 적용할 수 있으며 보다 구체적으로는 DNA 추출방식을 적용할 수 있다. 상기 시료로부터 DNA 또는 RNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).

(b) 상술된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 서열을 증폭하는 단계

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시된다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시된다.

본 발명의 방법은 상기 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.

전통적인 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우에는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동에 의해 증폭 결과를 확인할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 전기영동 후에는 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색 등의 방식으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다.

실시간 PCR 방식을 이용하여 서열을 증폭하는 경우 미지시료의 양성, 음성여부에 관계없이 증폭되는 인터널 콘트롤의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻을 수 있다. 이러한 인터널 콘트롤의 Cp값 또는 Ct값과 형광 세기의 표준 곡선은 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 명확하게 구별되어 미지시료의 양성 또는 음성 여부를 판단하는 기준을 제공할 수 있다. 따라서, 검체시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기 에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 인터널 콘트롤 및 음성 대조군의 Cp값 또는 Ct값과 형광세기의 곡선 패턴과 비교하여 시료 내에 표적 유전자가 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있다.

상기 방법은 증폭 결과를 확인하는 예시적인 방법으로, 상기 증폭 결과를 확인하는 방법은 이에 한정되지 않고 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 카바페넴 내성 장내세균 검출 방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트 및 검출 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 카바페넴 내성 장내세균을 높은 민감도로 검출할 수 있는 효과를 나타낸다.

도 1은 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 검출민감도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출민감도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3b는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4c는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4d는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4e는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4f는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4g는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 검출특이도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(hemoglobin)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(Bilirubin)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5c는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(Immunoglobin G)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5d는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(Glucose)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5e는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(BSA)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5f는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(Amoxicillin)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5g는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 간섭물질(Clarithromycin)에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 KPC 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6b는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 NMD 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6c는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 VIM 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6d는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 IMP 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6e는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 GES 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6f는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 OXA-48 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 간섭물질에 대한 간섭효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7a는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 재현성(Lot 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7b는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 재현성(사용자 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7c는 전통적인 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머의 재현성(시험장비 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8a는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 KPC, NDM, VIM 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 재현성(Lot 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8b는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 GES, IMP, OXA-48 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 재현성(Lot 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8c는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 재현성(실험자 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8d는 실시간 PCR을 통해 실시예 3에 기재된 KPC, NDM, VIM 유전자 검출용 프라이머 및 프로브의 재현성(시험장비 별)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 양성대조군을 대상으로한 전통적인 PCR 및 실시간 PCR을 통해 실시예 2에 기재된 프라이머 및 실시예 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 성능을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 시험대상 양성, 음성 표준물질의 준비

본 개발 제품인 항생제 내성 신속 감별 진단 키트의 유효성을 증명하기 위하여 실험에 사용할 다양한 음성 병원성 미생물 및 genomic DNA 126종을 항생제내성균주은행, 한국미생물보존센터, 한국생명공학연구원(KCTC), ATCC 등으로부터 분양 받아 확보하였다.

또한, 항생제내성균주은행 및 임상검체로부터 양성 표준물질 KPC(121), NDM(122), VIM(123), IMP(124), GES(125)와 합성 유전자 OXA-48(126)을 확보하였다.

확보된 병원성 미생물 및 genomic DNA 126종

No.	표준물질 명	균주번호	No.	표준물질 명	균주번호
1	Mycobacterium tuberculosis	00200-00007	64	Escherichia coli	CCARM 0277
2	Candida albicans	KCTC-7678	65	Klebsiella pneumoniae	CCARM 0281
3	Candida glabrata	KCTC-7219	66	Escherichia coli	CCARM 0282
4	Candida krusei	KCTC-11426	67	Escherichia coli	CCARM 0283
5	Candida parapsilosis	KCTC-7653	68	Enterococcus faecium	CCARM 5012
6	Candida tropicalis	KCTC-7830	69	Enterococcus faecium	CCARM 5133
7	Aspegillus fumigatus	KCCM-60293	70	Staphylococcus aureus	CCARM3A020
8	Staphylococcus aureus	ATCC-49444	71	Staphylococcus aureus	CCARM3A063
9	Streptococcus pneumoniae	KCTC-5080	72	Escherichia coli	CCARM 1134
10	Enterococcus faecium	KCTC-13225	73	Escherichia coli	CCARM 1155
11	Enterococcus faecalis	KCTC-3206	74	Klebsiella pneumonia	CCARM 10075
12	Streptococcus agalactiae (GBS)	KCCM-40417	75	Staphylococcus aureus	CCARM 3090
13	Bacteroides fragilis	KCTC-3688	76	Staphylococcus epidermidis	KCTC 1917
14	Haemophilus influenzae	KCCM-42099	77	Bordetella pertussis	NCCP13671
15	Klebsiella pneumonia	KCTC-2242	78	Mycoplasma pneumoniae	ATCC qCRM-15531D
16	Pseudomonas aeruginosa	KCTC-2004	79	Chlamydophila penumoniae	ATCC 53592DQ
17	Escherichia coli	KCTC-1682	80	Moraxella catarrhalis	CCARM 9004
18	Mycobacterium avium	00200-41449	81	Corynebacterium ammoniagenes	KCTC1018
19	Mycobacterium celatum	00200-49117	82	Staphylococcus delphini	KCTC 3592
20	Mycobacterium chelonae	00200-61210	83	Staphylococcus equorum subsp. equorum	KCTC 3589
21	Mycobacterium fortuitum	00200-60140	84	Staphylococcus gallinarum	KCTC 3585
22	Mycobacterium gordonae	00200-32158	85	Streptococcus vestibularis	KCTC 3650
23	Mycobacterium intracellulare	00200-41420	86	Streptococcus parauberis	KCTC3651
24	Mycobacterium kansasii	00200-20171	87	Klebsiella pneumoniae	NCCP14764
25	Mycobacterium marinum	00200-21106	88	pseudomonas aeruginosa	NCCP14640
26	Mycobacterium nonchromogenicum	00200-70104	89	Acinetobacter baumannii	NCCP14607
27	Mycobacterium peregrinum	00200-75002)	90	Acinetobacter baumannii	NCCP 14654
28	Mycobacterium szulgai	00200-31145	91	Staphylococcus aureus	NCCP14647
29	Mycobacterium abscessus	00200-61201	92	Bacillus cereus	NCCP14043
30	Enterobacter cloacae	KCTC-2361	93	Bacillus subtilis	NCCP16297
31	Klebsiella oxytoca	KCTC-1686	94	Campylobacter jejuni	NCCP11192
32	Klebsiella pneumoniae	KCTC-2242	95	Citrobacter freundii	NCCP14611
33	Proteus mirabilis	KCTC-2510	96	Enterobacter aerogenes	NCCP14761
34	Serratia marcescens	KCTC-22076	97	Enterobacter cloacae	NCCP14620
35	Staphylococcus arlettae	KCTC-3588	98	Enterococcus faecium	NCCP14674
36	Staphylococcus caprae	KCTC-3582	99	Klebsiella oxytoca	NCCP14710
37	Staphylococcus chromogenes	KCTC-3579	100	Propionibacterium acnes	NCCP14784
38	Haemophilus influenzae	KCCM-11908	101	Proteus mirabilis	NCCP14683
39	Staphylococcus cohnii	KCTC-3574	102	Proteus vulgaris	NCCP14765
40	Staphylococcus haemolyticus	KCTC-3341	103	Serratia marcescens	NCCP14721
41	Staphylococcus kloosii	KCTC-3590	104	Sphingomonas paucimobilis	NCCP 15635
42	Staphylococcus pasteuri	KCTC-13167	105	Staphylococcus capitis	NCCP 14664
43	Staphylococcus simulans	KCCM-41686	106	Staphylococcus caprae	NCCP15629
44	Staphylococcus warneri	KCTC-3340	107	Staphylococcus cohnii ssp. urealyticum	NCCP15851
45	Staphylococcus xylosus	KCTC-3342	108	Staphylococcus epidermidis	NCCP14768
46	Streptococcus alactolyticus	KCTC-3644	109	Staphylococcus haemolyticus	NCCP14692
47	Streptococcus criceti	KCTC-3292	110	Staphylococcus warneri	NCCP15692
48	Streptococcus downei	KCTC-3634	111	Streptococcus intermedius	NCCP15853
49	Streptococcus equi subsp. equi	KCCM-40886	112	Streptococcus anginosus	KCTC 14730
50	Streptococcus equi subsp.	KCCM-12122	113	Streptococcus pyogenes	NCCP14783
51	Streptococcus ferus	KCTC-3637	114	Legionella pneumophila	CCARM 19004
52	Streptococcus gallinaceus	KCTC-3876	115	Streptococcus suis	NCCP15852
53	Streptococcus gordonii	KCTC-3297	116	Streptococcus parasanguinis	CCARM4525
54	Streptococcus hyointestinalis	KCTC-3660	117	Streptococcus oralis	CCARM4546
55	Streptococcus intermedius	KCTC-3268	118	Staphylococcus xylosus	CCARM0086
56	Streptococcus lutetiensis	KCTC-3877	119	Corynebacterium glutamicum	CCARM 0318
57	Streptococcus anginosus	KCTC-3983	120	Streptococcus suis	NCCP15852
58	Streptococcus macacae	KCTC-3659	121	Klebsiella pneumoniae	CCARM 0015-
59	Streptococcus mutans	KCTC-3065	122	Klebsiella pneumoniae	CCARM 0246-
60	Listeria monocytogenes	ATCC-7644	123	Klebsiella pneumoniae	-
61	Escherichia coli	CCARM 0274	124	Serratia marcescens	CCARM 0255
62	Klebsiella pneumoniae	CCARM 0275	125	Escherichia coli	CCARM 1362
63	Escherichia coli	CCARM 0276	126	OXA-48 합성 유전자	-

실시예 2: 전통적인 PCR 방법을 통한 목표 유전자의 검출을 위한 프라이머 설계 및 PCR 조건

1) 프라이머의 설계

6 개의 표적 유전자를 대상으로 하는 프라이머를 아래와 같이 설계하였다 (표 2).

표적 유전자	프라이머명	서열(5'-> 3')	TM (℃)	GC (%)	Mer	크기 (bp)	서열번호
KPC	KPC F	GTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTG	82	52	27	798	1
KPC	KPC R	GCTGTGCTTGTCATCCTTGTTAGGCG	82	52	27	798	2
NDM	NDM F	GACCAACGGTTTGGCGATCTGGTTTTC	82	52	27	621	3
NDM	NDM R	GGGGGCGGAATGGCTCATCACGATC	82	64	25	621	4
OXA-48	OXA F	GATTTGGGCGTGGTTAAGGATGAACAC	80	48	27	438	5
OXA-48	OXA R	CACATTATCATCAAGTTCAACCCAACCG	80	43	28	438	6
VIM	VIM F	AGATTGCCGATGGTGTTTGGTCGCATA	80	48	27	390	7
VIM	VIM R	TTGTCGGTCGAATGCGCAGCACCAG	80	60	25	390	8
GES	GES F	CACCATGCGCTTCATTCACGCACTATT	80	48	27	300	9
GES	GES R	ATGTGTCCCGATGCTAGAAACCGCTC	80	54	26	300	10
IMP	IMP F	CACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAYTC	80	54	26	232	11
IMP	IMP R	AAACCGTTCGGTTTAAYAAAACAACCACC	78	39	28	232	12
mnp2 (대조군)	PCRC F	GAGTTTTCTGGTGGGGCAGCACAG	76	58	24	100	13
mnp2 (대조군)	PCRC R	ATGCTGCGACTACGATCTGCACTCC	78	56	25	100	14

2) 양성 대조군의 설계

6 종의 CRE 유전자 중 4 종의 유전자(KPC, VIM, IMP, GES)를 벡터에 클로닝한 플라스미드를 양성대조군으로 이용하였다. 표 3은 양성대조군으로 사용될 수 있는 플라스미드 제작에 사용된 프라이머를 나타낸다.

또한, 2종의 유전자(NDM, OXA-48)는 유전자 합성을 의뢰하였고, 해당 합성 유전자 산물은 벡터에 클로닝하여 플라스미드 DNA로 만들어 양성대조군으로 이용하였다.

표적 유전자	프라이머명	서열(5'-> 3')	크기 (bp)	서열번호
KPC	KPC-Fm_outer	CGTTGATGTCACTGTATCGCCG	882	15
KPC	KPC-Rm_outer	GAGCCTTACTGCCCGTTGACG	882	16
VIM	VIM-F_outer2	CTAGCGGTGAGTATCCGACAGT	801	17
VIM	VIM-R_outer2	GAGCAAGTCTAGACCGCCCGG	801	18
GES	GES-F_outer2	TGCGCTTCATTCACGCACTATTAC	741	19
GES	GES-R_outer2	CTATTTGTCCGTGCTCAGGATGA	741	20
IMP	IMP-F_outer2	AACAAAGTTAGAAAAGGAAAAGTATGA	813	21
IMP	IMP-R_outer2	CGTGCTGCAACGACTTGTTAGAAA	813	22

3) PCR 혼합물의 제조

다음과 같은 조성을 같는 PCR 혼합물을 제조하여 PCR 반응을 수행하였다.

Oligo mix는 표 2에 기재된 프라이머를 포함하는 수용액이다.

성분	부피 (μl)
2X PCR Enzyme Mix	10
Oligo Mix (CRE)	5
Template	5
Total	20

4) PCR 조건

표 5의 조건으로 PCR을 수행하였다.

온도	시간	사이클
50 ℃	3 분	1
95 ℃	15 분	1
95 ℃	60 초	40
60 ℃	40 초
72 ℃	60 초
72 ℃	5 분	1
10 ℃	∞	1

실시예 3: 실시간 PCR 방법을 통한 목표 유전자의 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계 및 PCR 조건

1) 프라이머의 설계

실시간 PCR을 수행하기 위하여 6 개의 표적 유전자를 대상으로 하는 프라이머를 아래와 같이 설계하였다 (표 6).

표적 유전자	프라이머명	서열 (5' → 3‘)	TM (℃)	GC (%)	Mer	서열 번호	증폭 형광
KPC	KPC F	CGCCGTGCAATACAGTGATAACG	70	52	23	23	JOE
	KPC R	CGATAGAGCGCATGAAGGCCG	68	62	21	24
	KPC probe	JOE-AATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGGCGG-BHQ1	78	50	26	25
NDM	NDM F	TGACAATATCACCGTTGGGATCG	68	48	23	26	Cy5
	NDM R	GAGCGACTTGGCCTTGCTGTC	68	62	21	27
	NDM probe	Cy5-CACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGC-BHQ3	80	60	25	28
OXA-48	OXA F	GGGACGTTATGCGTGTATTAGCC	70	52	23	29	Cy5
	OXA R	GAGCGACTTGGCCTTGCTGTC	68	62	21	30
	OXA probe	Cy5-TTGGTGGCATCGATTATCGGAATGCC-BHQ-3	78	50	26	31
VIM	VIM F	GGGAGGTCCGGCTTTACCAGA	68	62	21	32	JOE
	VIM R	GGTAGACTGCGCCATCAAACGA	68	55	22	33
	VIM probe	JOE-ATGGTGTTTGGTCGCATATCGCAACGC-BHQ-1	82	52	27	34
GES	GES F	GACGGTTCTCGAGGCAGCGC	68	70	20	35	FAM
	GES R	CGTCATTGCAGCAGGTCCGCC	70	67	21	36
	GES probe	FAM-ACAATGGGGCTACTAACCTCTTACTGA-BHQ1	78	44	27	37
IMP	IMP-1 F	TTCCTCTCATTTTCATAGCGACAG	68	42	24	38	FAM
	IMP-1 R	GAATTTGTGGCTTGAACCTTACCG	70	46	24	39
	IMP-2 F	TTTCCTCTCATTTTCATAGTGACAG	68	36	25	40
	IMP-2 R	TGAATTTTTAGCTTGAACCTTACCG	68	36	25	41
	IMP-1 probe	FAM-GAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATCTATC-BHQ1	80	38	29	42
	IMP-2 probe	FAM-GAATAGAGTGGCTTAATTCTCGATC-BHQ1	80	38	29	43
mnp2 (대조군)	PCRC F	CGACTCTGCTGAACTATTGCC	64	52	21	44	Cal Red 610
	PCRC R	GCGACTACGATCTGCACTCC	64	60	20	45
	PCRC probe	CR610-ACACCAGCTGATATAGGGCCATCAACAT-BHQ2	82	46	28	46

2) 양성 대조군의 설계

3) PCR 혼합물의 제조

Oligo mix(OM-1 및 OM-2)는 표 6에 기재된 프라이머 및 프로브를 포함하는 수용액이다. 구체적으로 OM-1은 IMP, KPC, NDM 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하며, OM-2는 GES, VIM, OXA-48 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함한다. 또한, OM-1 및 OM-2는 PCR 대조군 프라이머와 프로브를 추가로 포함한다.

PCR contents	Volume (μl)
2X PCR Enzyme Mix	10
OM-1 (CRE) / OM-2 (CRE)	5
Template	5
Total	20

4) PCR 조건

표 8의 조건으로 PCR을 수행하였다.

No.	단계	온도	시간	사이클
1	UDG 반응	50 ℃	3 분	1
2	초기 PCR 활성화	95 ℃	15 분	1
3	변성	95 ℃	20 초	40
4	어닐링	60 ℃	40 초	40
6	최종 연장	72 ℃	5 분	1

실시예 4: 실시예 2 및 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 수행 결과의 확인

실시예 4-1. 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 수행 결과의 확인

실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 양성 대조군을 표 9와 같이 혼합한 시료를 대상으로 실시예 2에서 설계된 프라이머 및 Thermo 사의 PCR thermo cycler (Veriti 96-well Thermal Cycler)를 사용하여 그 결과를 확인하였다.

Plasmid DNA	사용 농도	Plasmid stock Conc.	1 test에 사용되는 양	20 test에 사용되는 양
KPC pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
NDM pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
VIM pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
OXA-48 pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
GES pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
IMP pDNA	0.5 fg/μl	0.5 fg/μl	0.1 μl	2 μl
1X TE	-	-	4.4 μl	88 μl
합	-	-	5 μl	100 μl

혼합된 양성 대조군(CRE)을 대상으로 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 수행 결과를 전기영동을 통해 확인하였다.

전기영동을 통해 분석한 결과 샘플 내 KPC, NDM, VIM, OXA-48, GES, IMP 유전자의 존재 여부를 확인 하였다(도 9).

실시예 4-2. 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 수행 결과의 확인

실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 양성 대조군을 표 9와 같이 혼합한 시료를 대상으로 실시예 3에서 설계된 프라이머와 프로브 및 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 그 결과를 확인하였다.

혼합된 양성 대조군(CRE)을 대상으로 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 수행 결과를 증폭 곡선 분석을 통해 확인하였다.

증폭 곡선 분석 결과, 샘플 내 KPC, NDM, VIM, OXA-48, GES, IMP 유전자의 존재 여부를 확인 하였다 (도 9).

실시예 5: 실시예 2 및 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 결과의 검출 민감도(최소검출한계)

실시예 5-1. 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 결과의 검출 민감도

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA를 대상으로 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 Thermo 사의 PCR thermo cycler (Veriti 96-well Thermal Cycler)로 검출 민감도(limit of detection, LOD)를 확인하였다.

검출 민감도의 검증은 제작된 plasmid DNA를 최고 10⁴부터 최저 10⁰까지 5단계로 희석하여 6 종류의 검출목표 바이오마커별 (KPC, VIM, IMP, NDM, GES, OXA-48 유전자) 최소검출한계(LOD)에 대한 검증을 통해 검출민감도를 측정하였다.

실험을 통해 검출목표 KPC의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 VIM의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 IMP의 검출한계는 10~100 copies, 검출목표 GES의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 NDM의 검출한계는 10~100 copies, 검출목표 OXA-48의 검출한계는 1~10 copies로 확인하였다 (도 1).

실시예 5-2. 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 결과의 검출 민감도

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA를 대상으로 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 검출 민감도를 확인하였다.

검출 민감도의 검증은 제작된 plasmid DNA를 최고 10⁴부터 최저 10⁰까지 5단계로 희석하여 6 종류의 검출목표 바이오마커별(KPC, VIM, IMP, NDM, GES, OXA-48 유전자) 최소검출한계 (LOD)를 검증을 통한 검출민감도를 측정하였다.

실험을 통해 검출목표 KPC의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 VIM의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 IMP의 검출한계는 10~100 copies, 검출목표 GES의 검출한계는 1~10 copies, 검출목표 NDM의 검출한계는 10~100 copies, 검출목표 OXA-48의 검출한계는 1~10 copies로 확인하였다 (도 2).

실시예 6: 실시예 2 및 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 결과의 검출 특이도

실시예 6-1. 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 결과의 검출 특이도

음성 표준물질 120종 및 양성표준물질 6종을 대상으로 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 Thermo 사의 PCR thermo cycler (Veriti 96-well Thermal Cycler)로 검출 특이도를 확인하였다.

실험을 통해 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용하는 경우 모든 음성표준물질에서는 특이도를 나타내지 않았으며, 양성표준물질 6종에서만 특이도를 나타냄을 확인하였다 (도 3a, 3b).

실시예 6-2. 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 결과의 검출 특이도

음성 표준물질 120종 및 양성표준물질 6종을 대상으로 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 검출 민감도를 확인하였다.

실험을 통해 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하는 경우 모든 음성표준물질에서는 특이도를 나타내지 않았으며, 양성표준물질 6종에서만 특이도를 나타냄을 확인하였다 (도 4a 내지 4g).

실시예 7: 실시예 2 및 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 결과의 교차 반응 검증

실시예 7-1. 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 결과의 교차 반응 검증

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA 및 간섭물질의 존재하에 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 Thermo 사의 PCR thermo cycler (Veriti 96-well Thermal Cycler)로 교차 반응을 일으키는지 검증하였다.

간섭물질은 CLSI 가이드라인을 참고하여 선정하였다(Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, BSA, Collagen, Clarithromycin, Amoxicillin)(표 10). 제시한 간섭물질 농도 범위 내에서 최소검출한계 (LOD) 인 10~100 copies 의 검출목표 바이오마커의 검출여부를 평가하였다.

No.	간섭물질	간섭물질 유래	고농도	저농도
1	Hemoglobin(1mg/ml)	혈액	2.5μg/rxn	0.15μg/rxn
2	Bilirubin, unconjated (MW 584.66) (2mM)	혈액	40μM	17μM
3	Immunoglobulin G (IgG)	혈액	4.1μg/ml	0.1μg/ml
4	40% BSA	조직	5%	3.5%
5	10% Glucose	조직	0.12%	0.08%
6	Clarithromycin	항생제	10μg/ml	0.2μg/ml
7	Amoxicillin	항생제	20μg/ml	0.4μg/ml

실험을 통해, 간섭물질 7종 (Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, Glucose, BSA, Clarithromycin, Amoxicillin)을 포함한 상태에서의 각 검출목표 바이오마커별 최소검출한계는 각각 1~100 copies 로 측정됨에 따라 간섭물질 7종의 간섭효과는 매우 미미함을 증명하였다 (도 5a 내지 도5f).

실시예 7-2. 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 결과의 교차 반응 검증

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA 및 간섭물질의 존재하에 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 교차 반응을 일으키는지 검증하였다.

간섭물질은 CLSI 가이드라인을 참고하여 선정하였다(Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, BSA, Collagen, Clarithromycin, Amoxicillin) (표 10). 제시한 간섭물질 농도 범위 내에서 최소검출한계 (LOD) 인 10~100 copies 의 검출목표 바이오마커의 검출여부를 평가하였다.

실험을 통해, 간섭물질 7종 (Hemoglobin, Bilirubin, Immunoglobulin G, Glucose, BSA, Clarithromycin, Amoxicillin)을 포함한 상태에서의 각 검출목표 바이오마커별 최소검출한계는 각각 1~100 copies 로 측정됨에 따라 간섭물질 7종의 간섭효과는 매우 미미함을 증명하였다 (도 6a 내지 도6f).

실시예 8: 실시예 2 및 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 PCR 결과의 재현성 검증

실시예 8-1. 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 PCR 결과의 재현성 검증

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA 및 실시예 2에서 설계된 프라이머를 이용한 Thermo 사의 PCR thermo cycler (Veriti 96-well Thermal Cycler)로 재현성을 검증 하였다.

재현성 검증을 위해 각 바이오마커별 설정된 최소검출한계 검증 시험은 최소 2회 이상 반복 검증을 통해 진행하며, 반복 시험은 실험자간 2회 반복, 시작품 LOT 간 2회 반복, 시험장비간 2회 반복시험을 진행하여 재현성을 검증하였다.

실험을 통해 상술한 방법으로 수행된 반복 시험간 검출한계의 차이가 없음을 증명하였음 (도 7a 내지 7c).

실시예 8-2. 실시예 3에서 설계된 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 결과의 재현성 검증

각 검출목표 바이오마커를 plasmid DNA로 제작하였고, 제작된 plasmid DNA 및 실시예 3에서 설계된 프라이머, 프로브를 이용한 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 재현성을 검증 하였다.

실험을 통해 상술한 방법으로 수행된 반복 시험간 검출한계의 차이가 없음을 증명하였음 (도 8a 내지 8d).

고찰

실시예 2, 3에서 설계된 프라이머 및 프로브는 검출민감도, 검출특이도, 재현성 및 교차반응성 모두에서 우수한 효과를 나타내었다.

<110> EONE Life Science Institute <120> Kits for Detecting Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae <130> PN190418 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC F primer <400> 1 gtatcgccgt ctagttctgc tgtcttg 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC R primer <400> 2 gctgtgcttg tcatccttgt taggcg 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM F primer <400> 3 gaccaacggt ttggcgatct ggttttc 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM R primer <400> 4 gggggcggaa tggctcatca cgatc 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA F primer <400> 5 gatttgggcg tggttaagga tgaacac 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA R primer <400> 6 cacattatca tcaagttcaa cccaaccg 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM F primer <400> 7 agattgccga tggtgtttgg tcgcata 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM R primer <400> 8 ttgtcggtcg aatgcgcagc accag 25 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES F primer <400> 9 caccatgcgc ttcattcacg cactatt 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES R primer <400> 10 atgtgtcccg atgctagaaa ccgctc 26 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP F primer <400> 11 cacgggcgga atagagtggc ttaaytc 27 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP R primer <400> 12 aaaccgttcg gtttaayaaa acaaccacc 29 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC F primer <400> 13 gagttttctg gtggggcagc acag 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC R primer <400> 14 atgctgcgac tacgatctgc actcc 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-Fm_outer primer <400> 15 cgttgatgtc actgtatcgc cg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC-Rm_outer primer <400> 16 gagccttact gcccgttgac g 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-F_outer2 primer <400> 17 ctagcggtga gtatccgaca gt 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM-R_outer2 primer <400> 18 gagcaagtct agaccgcccg g 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES-F_outer2 primer <400> 19 tgcgcttcat tcacgcacta ttac 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES-R_outer2 primer <400> 20 ctatttgtcc gtgctcagga tga 23 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-F_outer2 primer <400> 21 aacaaagtta gaaaaggaaa agtatga 27 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-R_outer2 primer <400> 22 cgtgctgcaa cgacttgtta gaaa 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC F primer (realtime PCR) <400> 23 cgccgtgcaa tacagtgata acg 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC R primer (realtime PCR) <400> 24 cgatagagcg catgaaggcc g 21 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KPC probe <400> 25 aatttgttgc tgaaggagtt gggcgg 26 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM F primer (realtime PCR) <400> 26 tgacaatatc accgttggga tcg 23 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM R primer (realtime PCR) <400> 27 gagcgacttg gccttgctgt c 21 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDM probe <400> 28 caccgacatc gcttttggtg gctgc 25 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA F primer (realtime PCR) <400> 29 gggacgttat gcgtgtatta gcc 23 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA R primer (realtime PCR) <400> 30 gagcgacttg gccttgctgt c 21 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXA probe <400> 31 ttggtggcat cgattatcgg aatgcc 26 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM F primer (realtime PCR) <400> 32 gggaggtccg gctttaccag a 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM R primer (realtime PCR) <400> 33 ggtagactgc gccatcaaac ga 22 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VIM probe <400> 34 atggtgtttg gtcgcatatc gcaacgc 27 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES F primer (realtime PCR) <400> 35 gacggttctc gaggcagcgc 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES R primer (realtime PCR) <400> 36 cgtcattgca gcaggtccgc c 21 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GES probe <400> 37 acaatggggc tactaacctc ttactga 27 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 F primer (realtime PCR) <400> 38 ttcctctcat tttcatagcg acag 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 R primer (realtime PCR) <400> 39 gaatttgtgg cttgaacctt accg 24 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 F primer (realtime PCR) <400> 40 tttcctctca ttttcatagt gacag 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 R primer (realtime PCR) <400> 41 tgaattttta gcttgaacct taccg 25 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-1 probe <400> 42 gaatagagtg gcttaattct cgatctatc 29 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IMP-2 probe <400> 43 gaatagagtg gcttaattct cgatc 25 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC F primer (realtime PCR) <400> 44 cgactctgct gaactattgc c 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC R primer (realtime PCR) <400> 45 gcgactacga tctgcactcc 20 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCRC probe <400> 46 acaccagctg atatagggcc atcaacat 28

Claims

서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 GES 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물은 하기의 프라이머 쌍 중 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 추가적으로 포함하는 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물:
(i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 3 및 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍; 및
(v) 서열번호 11 및 12의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 GES 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (i)의 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (ii)의 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (iii)의 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍; 상기 (iv)의 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍; 및 상기 (v)의 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍은 실시간 PCR 용 프라이머 쌍인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 하기의 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물:
상기 GES 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (i) KPC 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (ii) NDM 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (iii) OXA-48 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브;
상기 (iv) VIM 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 또는
상기 (v) IMP 유전자 검출용 프라이머 쌍의 경우, 서열번호 42 또는 43의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브.
제 4 항에 있어서, 상기 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 42, 및 43의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단은 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되고, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 BHQ-3의 퀀처(quencher)로 변형된 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균 검출용 키트.
다음의 단계를 포함하는 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법:
(a) 검체시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) 서열번호 35 및 36의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 GES 유전자 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 (b)단계에서 하기의 유전자 검출용 조성물 중 선택되는 1종 이상의 유전자 검출용 조성물을 추가적으로 포함하여 서열을 증폭하는 것인, 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법:
(i) i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 ii) 서열번호 23 및 24의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 KPC 유전자 검출용 조성물;
(ii) i) 서열번호 3 및 4의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 ii) 서열번호 26 및 27의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 NDM 유전자 검출용 조성물;
(iii) i) 서열번호 5 및 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 ii) 서열번호 29 및 30의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 OAX-48 유전자 검출용 조성물;
(iv) i) 서열번호 7 및 8의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 ii) 서열번호 32 및 33의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 VIM 유전자 검출용 조성물;
(v) i) 서열번호 11 및 12의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 ii) 서열번호 38 및 39의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브, 또는 iii) 서열번호 40 및 41의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 IMP 유전자 검출용 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것인, 카바페넴 내성 장내세균의 검출 방법.