CN111961706A - 一种核酸提取纯化方法 - Google Patents

一种核酸提取纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111961706A
CN111961706A CN202010810557.7A CN202010810557A CN111961706A CN 111961706 A CN111961706 A CN 111961706A CN 202010810557 A CN202010810557 A CN 202010810557A CN 111961706 A CN111961706 A CN 111961706A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
nucleic acid
magnetic beads
sample
extracting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010810557.7A
Other languages
English (en)
Inventor
徐健林
洪旭伟
官振群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaishuo Bio Tech Xiamen Co ltd
Original Assignee
Kaishuo Bio Tech Xiamen Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaishuo Bio Tech Xiamen Co ltd filed Critical Kaishuo Bio Tech Xiamen Co ltd
Priority to CN202010810557.7A priority Critical patent/CN111961706A/zh
Publication of CN111961706A publication Critical patent/CN111961706A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种核酸提取纯化方法，包括：在样品中加入PEG8000溶液和磁珠溶液充分混合，使磁珠充分抓取样品中的微生物，再将含有微生物的磁珠转移到含有GT缓冲液的孔中进行孵化裂解微生物外壳，将细胞乃至核酸暴露出来，利用裂解液对微生物细胞进行裂解；在结合液的环境下磁珠与核酸结合；在洗涤液1溶液下进行初洗去除大量杂质；在洗涤液2溶液下进行精洗；最后核酸在洗脱液里与磁珠分离，收集洗脱液，然后进行核酸测量。本发明利用细胞具有亲水的特性，采用同样具有亲水性的纤维素磁珠，在粘稠度大的缓冲液中抓取细胞，富集细胞以达到样品浓缩的效果，本发明无需使用离心机，简化检测操作步骤，节省检测成本，具有较高的经济效益。

Description

一种核酸提取纯化方法
技术领域
本发明涉及生物分析测定领域，尤其涉及一种核酸提取纯化方法。
背景技术
在细菌检测中，细菌在样品中的浓度量级较小，因此在检测细菌浓度前，通常需要对样品中的细菌进行浓缩。现有较常规的细菌浓缩采用离心法。离心法则需要用到离心机，而实验室专业离心机一般体积较大、价格昂贵、操作复杂且占用实验台的操作面积，导致检测步骤繁琐、检测成本高。尤其当需要现场检测的场所，由于离心机不易携带与搬运，导致无法在现场进行检测，只能将样品采样后送抵实验室后再进行处理与检测，如此在转运过程，将极大地增加样品污染的机率，从而影响检测结果的正确性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种核酸提取纯化方法，省略离心步骤，增加细菌核酸捕获率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种核酸提取纯化方法，包括以下步骤：
S1：将样品放入均质杯内，均质杯内加入培养基，均质混合，培养12小时；
S2：将裂解液、结合液、磁珠溶液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、GT缓冲液于试剂条空位中；
S3：将样品液移至样品管中，加入PEG8000溶液；
S4：将试剂条、样品管、吸头放置于核酸提取仪中，吸头吸取磁珠溶液转移至样品管中，将样品溶液、PEG8000溶液与磁珠溶液充分混合，使磁珠充分抓取样品中的微生物；
S5、将含有微生物的磁珠转移到含有GT缓冲液的孔中进行孵化裂解微生物外壳，将细胞乃至核酸暴露出来，加入裂解液，在65℃环境下将裂解液、含微生物磁珠及GT缓冲液利用PST充分混匀，反复吹打；加入结合液及磁珠于裂解好的混合液中，充分混合，让加入的磁珠在结合液环境下特异结合核酸；利用磁铁富集混合液中的磁珠，然后转移至洗涤液1中，反复吹打，除去核酸中的大量杂质；利用磁铁富集的磁珠转移至含有洗涤液2中，反复吹打，用磁铁富集磁珠除去废液；将含有核酸的磁珠自然环境下晾干，除去残留的乙醇；取洗脱液，将磁珠与洗脱液充分混合，吹打，除去磁珠，收集含有核酸的洗脱液，备用；
S6：测量核酸值；
所述磁珠溶液为申请人生产的恺硕CL纤维素磁珠用40%乙醇稀释成1倍质量浓度。
进一步，所述PEG8000溶液由PEG8000置于80℃环境下充分溶解，按体积比加入配制好的2mol/L、pH6.0的Tris-Hcl溶液，当所述样品溶液量少于200 μl时，加入1 ml 20%PEG8000；样品溶液量为200-500 μl时，加入1 ml 30% PEG8000；样品溶液量大于500 μl时，加入等样品溶液体积的40% PEG800。
进一步，所述培养基为LB培养基。
进一步，所述裂解液包括：LSS 4~5.6%（W/V）、曲拉通5.2~10% 、吐温10~15% 、盐酸胍62.5~70% 、尿素10%（W/V）。
进一步，所述结合液包括：异丙醇75~85% 、8 mol/L乙酸铵15~25%。
进一步，所述洗涤液1包括：无水乙醇45~55%、8 mol/L盐酸胍45~55%。
进一步，所述洗涤液2包括：无水乙醇75~85% 、水14.5~24.5% 、Tris溶液0.5%。
进一步，所述洗脱液包括：无水乙醇75~85% 、水14.5~24.5% 、Tris溶液0.5%。
进一步，所述GT缓冲液包括：SDS、2mol/L、pH8.5 Tris-Hcl溶液、0.5mol/LEDTA。
本发明的有益效果：
本发明利用细胞具有亲水的特性，采用同样具有亲水性的纤维素磁珠，在粘稠度大的缓冲液中抓取细胞，富集细胞以达到样品浓缩的效果，从而进行后续的检测提取步骤，因而无需使用离心机，简化检测操作步骤，节省检测成本，具有较高的经济效益。
具体实施方式
为了便于理解，更好地解释本发明，以下结合实验对本发明内容作进一步描述：
实施例：
一、试剂配制：
1、配制2mol/L Tris-Hcl溶液：称取Tris 2倍分子质量重量，加入1L水溶解，用Hcl调节pH=6.0；
2、配制各浓度的PEG8000溶液：取足够量的PEG8000置于80℃环境下充分溶解，按体积比加入配制好的2mol/L、pH6.0的Tris-Hcl溶液，配制成10% PEG8000，20% PEG8000，30%PEG8000，40% PEG8000。
3、配制纤维素磁珠溶液：纤维素磁珠（由恺硕生物科技（厦门）有限公司提供的“恺硕CL磁珠”）用40%乙醇稀释成1倍质量浓度。
4、配制GT缓冲液1L：
SDS：10g
Tris-Hcl溶液（2mol/L、pH8.5）：15ml
EDTA（0.5mol/L）：20ml
5、裂解液5L：LSS：20~28 g、曲拉通：5.2~10% 、吐温：10~15% 、盐酸胍：62.5~70% 、尿素：500 g
6、结合液5L：异丙醇：4000ml 、乙酸铵：8 mol/L 1000 ml
7、5L洗涤液1：无水乙醇：2500 ml、盐酸胍：8 mol/L 2500 ml
8、5L洗涤液2：无水乙醇：4000 ml、水：950 ml、Tris：25ml
9、5L洗脱液：Tris：20~100ml、水：4900~4980 ml。
二、样品处理：
1、如果样品为冷冻食品，应于2～5 ℃解冻，且不超过18 h。若不能及时检验，应置于-20℃±5℃保存。非冷冻的易腐样品若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，24h 内检验。
2、无菌操作称取25g鸡肉、牛肉或猪肉等样品，用剪刀充分剪碎，放入均质杯内。
3、在均质杯内加入50 mL LB培养基，均质混匀，36℃±1℃培养过夜备用。
三、核酸提取纯化
1、量取500 μL裂解液、1 mL结合液、500 μL磁珠溶液、1 mL洗涤液1、1 mL洗涤液2、1mL洗脱液、500 μLGT缓冲液于试剂条空位中。
2、加入样品溶液至样品管中。
3、当样品溶液量少于200 μl时，加入1 ml 20% PEG8000至含有样品溶液的样品管中；当样品溶液量为200-500 μl时，加入1 ml 30% PEG8000至样品管中；当样品溶液量大于500 μl时，加入等样品溶液体积的40% PEG800至样品管中。对照组中加入等样品溶液体积的2mol/L Tris-Hcl溶液。
4、将试剂条、样品管、吸头放置于核酸提取仪中，吸头吸取磁珠溶液转移至样品管中，将样品溶液、PEG8000与磁珠溶液充分混合，使磁珠充分抓取样品中的微生物，磁过程15-30min。
5、将含有微生物的磁珠转移到含有GT缓冲液的孔中进行孵化裂解微生物外壳，将细胞乃至核酸暴露出来，加入裂解液500ul，在65℃环境下裂解液、含微生物磁珠及GT缓冲液利用PST充分混匀，反复吹打10min；加入1ml结合液及500ul磁珠于裂解好的混合液中，充分混合5min，让加入的磁珠在结合液环境下特异结合核酸；利用磁铁富集混合液中的磁珠，然后转移至含有1ml洗涤液1中，反复吹打5min，除去核酸中的大量杂质；利用磁铁富集的磁珠转移至含有1ml洗涤液2中，反复吹打5min，用磁铁富集磁珠除去废液；将含有核酸的磁珠自然环境下晾干40 s，目的尽量除去残留的乙醇；取200ul洗脱液，将磁珠与洗脱液充分混合，吹打10min，除去磁珠；收集含有核酸的洗脱液测量核酸值。
四、数据对比
本发明对不同容量的样品溶液加入不同浓度的PEG8000进行实验，核酸浓度对比如表一：
　核酸浓度（ng/ml）
0% PEG（对照） 6.234
10% PEG 13.44
20% PEG 18.24
30% PEG 12.42
从表一可知，使用PEG8000可以提升细菌捕获率，核酸浓度达对照组3倍以上。
本发明操作步骤中的常规操作作为本领域的技术人员所熟知，再此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅对本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种核酸提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将样品放入均质杯内，均质杯内加入培养基，均质混合，培养12小时；
S2：将裂解液、结合液、磁珠溶液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、GT缓冲液于试剂条空位中；
S3：将样品液移至样品管中，加入PEG8000溶液；
S4：将试剂条、样品管、吸头放置于核酸提取仪中，吸头吸取磁珠溶液转移至样品管中，将样品溶液、PEG8000溶液与磁珠溶液充分混合，使磁珠充分抓取样品中的微生物；
S5、将含有微生物的磁珠转移到含有GT缓冲液的孔中进行孵化裂解微生物外壳，将细胞乃至核酸暴露出来；加入裂解液，在65℃环境下将裂解液、含微生物磁珠及GT缓冲液利用PST充分混匀，反复吹打；加入结合液及磁珠于裂解好的混合液中，充分混合，让加入的磁珠在结合液环境下特异结合核酸；利用磁铁富集混合液中的磁珠，然后转移至洗涤液1中，反复吹打，除去核酸中的大量杂质；利用磁铁富集的磁珠转移至含有洗涤液2中，反复吹打，用磁铁富集磁珠除去废液；将含有核酸的磁珠自然环境下晾干，除去残留的乙醇；取洗脱液，将磁珠与洗脱液充分混合，吹打，除去磁珠，收集含有核酸的洗脱液，备用；
S6：测量核酸值；
所述磁珠溶液为申请人生产的恺硕CL纤维素磁珠用40%乙醇稀释成1倍质量浓度。
2.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述PEG8000溶液由PEG8000置于80℃环境下充分溶解，按体积比加入配制好的2mol/L、pH6.0的Tris-Hcl溶液，当所述样品溶液量少于200 μl时，加入1 ml 20% PEG8000；样品溶液量为200-500 μl时，加入1 ml 30% PEG8000；样品溶液量大于500 μl时，加入等样品溶液体积的40% PEG800。
3.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基。
4.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述裂解液包括：LSS 4~5.6%（W/V）、曲拉通5.2~10% 、吐温10~15% 、盐酸胍62.5~70% 、尿素10%（W/V）。
5.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述结合液包括：异丙醇75~85% 、8 mol/L乙酸铵15~25%。
6.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述洗涤液1包括：无水乙醇45~55%、8 mol/L盐酸胍45~55%。
7.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述洗涤液2包括：无水乙醇75~85% 、水14.5~24.5% 、Tris溶液0.5%。
8.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述洗脱液包括：无水乙醇75~85% 、水14.5~24.5% 、Tris溶液0.5%。
9.如权利要求1所述的一种核酸提取纯化方法，其特征在于，所述GT缓冲液包括：SDS、2mol/L、pH8.5 Tris-Hcl溶液、0.5mol/LEDTA。
CN202010810557.7A 2020-08-13 2020-08-13 一种核酸提取纯化方法 Pending CN111961706A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010810557.7A CN111961706A (zh) 2020-08-13 2020-08-13 一种核酸提取纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010810557.7A CN111961706A (zh) 2020-08-13 2020-08-13 一种核酸提取纯化方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111961706A true CN111961706A (zh) 2020-11-20

Family

ID=73365809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010810557.7A Pending CN111961706A (zh) 2020-08-13 2020-08-13 一种核酸提取纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111961706A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789323A (zh) * 2021-10-15 2021-12-14 苏州中科先进技术研究院有限公司 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法
CN114525274A (zh) * 2022-03-22 2022-05-24 合肥欧创基因生物科技有限公司 一种裂解液及基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103189747A (zh) * 2010-07-02 2013-07-03 米克罗森斯医疗技术有限公司 微生物的捕获
CN104450684A (zh) * 2014-12-26 2015-03-25 南京中科神光科技有限公司 一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法
US20160333339A1 (en) * 2015-05-14 2016-11-17 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid Methods for the Extraction of Nucleic Acids from Biological Samples
CN106244583A (zh) * 2016-09-23 2016-12-21 广东国盛医学科技股份有限公司 一种磁珠法核酸提取方法
CN109504678A (zh) * 2018-12-27 2019-03-22 广东食品药品职业学院 基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103189747A (zh) * 2010-07-02 2013-07-03 米克罗森斯医疗技术有限公司 微生物的捕获
CN104450684A (zh) * 2014-12-26 2015-03-25 南京中科神光科技有限公司 一种磁珠法提取细菌中核酸的试剂盒及提取方法
US20160333339A1 (en) * 2015-05-14 2016-11-17 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid Methods for the Extraction of Nucleic Acids from Biological Samples
CN106244583A (zh) * 2016-09-23 2016-12-21 广东国盛医学科技股份有限公司 一种磁珠法核酸提取方法
CN109504678A (zh) * 2018-12-27 2019-03-22 广东食品药品职业学院 基于磁珠法进行核酸提取的试剂盒及应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789323A (zh) * 2021-10-15 2021-12-14 苏州中科先进技术研究院有限公司 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法
CN114525274A (zh) * 2022-03-22 2022-05-24 合肥欧创基因生物科技有限公司 一种裂解液及基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101665785B (zh) 一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法
CN111690640A (zh) 一种高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液
CN111961706A (zh) 一种核酸提取纯化方法
CN113151397B (zh) 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒
US20180355346A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid purification from blood samples
CN113926432B (zh) 一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒及核酸提取方法
CN110229918A (zh) 一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒
CN101712986B (zh) 益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定性、定量测定方法
CN107663543A (zh) 检测六种禽源性成分的三重荧光pcr引物探针组、试剂盒及方法
CN112481254B (zh) 一步法去宿主dna并富集微生物的方法及试剂盒
CN106987588B (zh) 一种病毒/细菌的裂解液及荧光定量pcr检测方法
CN117004690A (zh) 一种外泌体核酸释放剂在制备血液外泌体核酸检测试剂盒中的应用
CN116064503B (zh) 一种不含蛋白酶的快速磁珠法核酸提取试剂盒及核酸的提取及纯化方法
CN101864489B (zh) 一种富集转基因产品中外源dna的方法
CN110628951A (zh) 一种非洲猪瘟病毒荧光定量pcr现场快速检测试剂盒
CN115404233A (zh) 一种核酸提取试剂及其使用方法
CN111607591B (zh) 一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒
CN111778237A (zh) 一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系
CN111139287A (zh) 一种应用于动物组织中核酸现场提取方法
CN107267497B (zh) 一种通用型总rna提取试剂盒及方法
CN114107284B (zh) 一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法
CN118256489B (zh) 一种循环核酸的提取试剂盒及循环核酸的提取方法
CN117106772B (zh) 一种用于病毒核酸检测的样本释放剂
CN111455021B (zh) 去除宏基因组中宿主dna的方法及试剂盒
CN211122896U (zh) 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201120

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication