CN211122896U - 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，属于免疫学检测领域。试剂盒包括盒体以及试剂瓶；试剂瓶分别为酶标抗IgY抗体试剂瓶、磁标新城疫病毒抗原试剂瓶、标准品溶液试剂瓶、样本稀释液试剂瓶、发光底物液试剂瓶和浓缩洗涤液试剂瓶。本实用新型中的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒结构设置合理，取用方便，便于携带和运输。

Description

一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于免疫学检测领域，特别地，涉及一种新城疫病毒抗体化学发光检测试剂盒。

背景技术

新城疫病毒(NDV)，有些地方称之为禽副粘病毒I型(APMV-1)，为副粘病毒科的腮腺炎病毒数。NDV的基因组是一条全程15156kb的单链负股RNA，分子量在5.2×10⁶～5.6×10⁶之间，可编码6种特异性结构蛋白。病毒颗粒具有双层包膜结构，该包膜由受感染机体细胞外膜的脂类与病毒的糖蛋白结合而衍生得到的。病毒颗粒内含一多盘绕的竹状衣壳，囊膜表面的糖蛋白具有血凝素和神经酰胺酶酶活性。

新城疫俗称“鸡瘟”，新城疫病毒的强毒株引起多种禽类急性、高接触性、致死性传染病。由于其传播快、死亡率高，给禽养殖业带来毁灭性打击，造成非常严重的影响，国际兽疫局(OIE)将新城疫列为A类传染病，我国农业部也将其列为动物的一类疫病和优先防控的动物重大疫病之一。

目前，我国大多数禽类养殖场都进行了新城疫病毒疫苗的免疫接种，为了了解ND免疫状况，经常采用ND抗体水平来检测禽类的免疫效果。其中血清学诊断技术中最为流行的是血凝抑制实验，但该技术对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性，且对实验环境也有一定的要求，基本不能实现高通量的检测，而禽类养殖一般规模、养殖密度较大，需要检测的样本量也较大。因此，迫切需要开发一种操作简单、高灵敏度、高准确度、高通量的检测方法。

实用新型内容

本实用新型解决了现有技术中新城疫病毒抗体试剂盒使用不便的技术问题，提供了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒。

根据本实用新型的目的，提供了一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体以及盒体内的盛装不同溶剂的试剂瓶；所述不同溶剂的试剂瓶分别为酶标抗IgY抗体试剂瓶、磁标新城疫病毒抗原试剂瓶、标准品溶液试剂瓶、样本稀释液试剂瓶、发光底物液试剂瓶和浓缩洗涤液试剂瓶。

优选地，所述盒体为纸质盒体或塑料盒体。

优选地，所述盒体的盒内包括放置试剂瓶的下凹瓶位；所述下凹瓶位共11个。

优选地，所述酶标抗IgY抗体试剂瓶数量为1个，体积分别为10mL；所述磁标新城疫病毒抗原试剂瓶数量为1个，体积分别为6mL；所述标准品溶液试剂瓶数量为6个，体积分别为5mL；所述样本稀释液试剂瓶数量为1个，体积分别为25mL；所述发光底物液试剂瓶数量为1个，体积分别为100mL；所述浓缩洗涤液试剂瓶数量为1个，体积分别为100mL。

优选地，所述酶标抗IgY抗体试剂瓶中的酶标抗体为碱性磷酸酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。

优选地，所酶标抗IgY抗体试剂瓶中的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。

总体而言，通过本实用新型所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本实用新型中的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒结构设置合理，取用方便，便于携带和运输。且具有用时短、操作简便、灵敏度高和特异性好的效果，能快速、简便、高灵敏度定量地检测新城疫病毒抗体。

(2)本实用新型新城疫病毒抗体的磁免疫化学发光检测试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对新城疫病毒抗体的检测灵敏度可达到0.3AU/mL；并根据血凝抑制实验的不同样本效价如log2、2log2、3log2、4log2、5log2、6log2建立起和血凝抑制实验样本效价相对应的线性关系，并且建立新的计量单位AU/mL，实现了新城疫病毒抗体的定量检测，并可以同时定量检测大批样本，技术上有明显的进步；通过对样本抗体含量的检测，可实现抗体水平的监测，通过监测结果可制定合理、有效的免疫程序，提高群体免疫水平。

附图说明

图1为本实用新型磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线。

图2为本实用新型磁免疫化学发光检测试剂盒的盒体结构示意图，其中，1-盒体，2-酶标抗IgY抗体试剂瓶、3-磁标新城疫病毒抗原试剂瓶、4-标准品溶液试剂瓶、5-样本稀释液试剂瓶、6-发光底物液试剂瓶、7-浓缩洗涤液试剂瓶。

具体实施方式

为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。此外，下面所描述的本实用新型各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：试剂盒具体组分的制备

1.酶标二抗的制备(一)

A.碱性磷酸酶活化

以DMSO为溶剂，配制10mM SMCC溶液；向29.5μL 10mM SMCC溶液中加入240μL 5mg/mL碱性磷酸酶，混匀后室温静置15～30min；0.01M pH 7.4的PBS溶液对活化后的AP酶过脱盐柱除杂并超滤浓缩，产物测定280nm的吸光度，酶浓度为：ABS280*稀释因子/1.0，酶质量：酶浓度*产物体积(mg/mL)，2～8℃保存。

B.抗体的还原

以0.01M PBS为溶剂，配制0.1M还原剂二硫苏糖醇(DTT)；取1.2mg的抗IgY抗体，向其中加入16μL 0.1M的DTT溶液，混匀后室温静置15min～30min；过脱盐柱除杂并超滤浓缩，测定280nm的吸光度，蛋白浓度为：ABS280*稀释因子/1.36，蛋白质量为：酶浓度*产物体积(mg/mL)，2～8℃保存。

C.碱性磷酸酶与抗体的偶联

将活化的碱性磷酸酶与被还原的抗体按照质量比为0.91:1进行偶联，2℃～8℃静止反应16h-18h。

D.偶联反应的终止

第一步终止：每毫升连接物加入10μL 10mM马来酰亚胺溶液，混匀后静止10min。其中10mM马来酰亚胺溶液配制过程为：称取10mg马来酰亚胺固体溶于1.03mL DMF，再用0.01M的pH7.4的PBS溶液对上述溶液稀释10倍，即配成10mM马来酰亚胺溶液。

第二步终止：每毫升连接物加入10μL 100mM乙醇胺溶液，混匀静止10min。其中100mM乙醇胺溶液配制过程为：20μL乙醇胺溶于1.98mL的0.01M pH为7.4的PBS溶液中，再取上述乙醇胺溶液600μL，加入到400μL的0.01M pH为7.4的PBS溶液中，即得100mM乙醇胺溶液。

E.偶联产物的最终纯化和长期保存

用Superdex 200层析柱在GE Healthcare Life Science的蛋白质分离纯化系统上分离纯化碱性磷酸酶与抗体的偶联产物，洗脱和保存缓冲液均为0.05M pH 7.4，含5mMMgCl₂的Tris缓冲盐溶液，产物于2～8℃保存。

2.酶标二抗的制备(二)

A.碱性磷酸酶活化

以DMSO为溶剂，配制10mM SMCC溶液；向29.5μL 10mM SMCC溶液中加入240μL 5mg/mL碱性磷酸酶，混匀后室温静置15～30min；0.01M pH 7.4的PBS溶液对活化后的AP酶过脱盐柱除杂并超滤浓缩，产物测定280nm的吸光度，酶浓度为：ABS280*稀释因子/1.0，酶质量：酶浓度*产物体积(mg/mL)，2～8℃保存。

B.抗体的活化

以DMSO为溶剂，配制5mg/mL SATA溶液。用0.01M PBS缓冲液配制浓度为2～5mg/mL的抗体。取2.5μL配制好的SATA溶液加入到1.2mg抗体中，室温搅拌反应15～30min。

用含0.01M EDTA的PBS缓冲溶液配制0.5M羟胺溶液，每毫升连接物取10μL该羟胺溶液加入至上述溶液中，室温搅拌反应30min以上。过脱盐柱纯化除杂，收集活化好的抗体。

C.碱性磷酸酶与抗体的偶联

将活化好的碱性磷酸酶与抗体混合，室温反应30min以上。

D.偶联产物的最终纯化和长期保存

用Superdex 200层析柱在GE Healthcare Life Science的蛋白质分离纯化系统上分离纯化碱性磷酸酶与抗体的偶联产物，洗脱和保存缓冲液均为0.05M pH 7.4，含5mMMgCl₂的Tris缓冲盐溶液，产物于2～8℃保存。

3.磁标新城疫抗原的制备

磁标新城疫抗原是通过活化超顺磁性微球官能团后与抗原共价结合的方法制备。具体操作如下：

A、磁性微球官能团的活化

取40mg经过修饰后带有羧基的超顺磁性微球，先用0.01M PBS清洗磁性微球2次以洗去磁性微球保存缓冲液中的保护成分，再用4-吗啉乙磺酸(MES，pH5.0～5.5)对磁性微球进行清洗使磁性微球处于适合活化反应的缓冲体系中。其上述磁性微球悬浊液中加入1mg的EDC和0.5mg的NHS，充分混匀后置于血浆混匀仪上中速混匀，活化反应条件和时间为室温活化15min～20min。

B、新城疫抗原包被活化后的磁性微球

用0.01M PBS清洗磁性微球去除活化剂和反应副产物，活化后的磁性微球暂存于0.01M PBS中，向磁性微球悬浊液中加入0.01mg的新城疫抗原，充分混匀后置于血浆混匀仪上中速混匀，包被反应条件和时间为4℃反应16h～18h。

C、对磁标新城疫抗原进行封闭

用0.01M PBS清洗磁性微球去除游离抗原和反应副产物。配制pH 7.2～7.4，含0.05％Tween-20(V:V)的0.05M Tris缓冲液，用此缓冲液配制5％脱脂奶(M:V)作为封闭剂。用封闭剂将磁标新城疫抗原充分混匀后置于血浆混匀仪上中速混匀，封闭反应条件和时间为22℃～25℃反应2h。

D、磁标新城疫抗原的长期保存

用pH 7.2～7.4，含0.05％Tween-20(V:V)的0.05M Tris缓冲液对磁标新城疫抗原清洗2次。磁分离2min，弃上清，保存在pH 7.2～7.4，含1％Trition X-100(M:V)和0.5％BSA(M:V)，0.05M Tris缓冲盐溶液中，终浓度为10mg/mL。

实施例2：试剂盒的组建

组建检测新城疫病毒抗体的磁免疫化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：

(1)碱性磷酸酶标记抗IgY抗体

(2)磁标新城疫抗原

(3)新城疫病毒抗体标准品溶液

(4)样本稀释液

(5)化学发光底物液

(6)浓缩洗涤溶液

本实用新型所用的酶标二抗稀释液是pH 7.2～pH 7.4，含0.1％BSA(M:V)和15％牛血清(V:V)，0.05M Tris缓冲盐溶液。

所述磁标新城疫抗原稀释液是pH 7.2～pH 7.4，含1％TritionX-100(M:V)和0.5％BSA(M:V)，0.05M Tris缓冲盐溶液。

所述样品稀释液是pH7.2～7.4，0.01％Tween-20(V:V)，0.01M PBS缓冲液溶液。

新城疫病毒抗体标准品溶液，浓度分别为：0.3AU/mL、0.6AU/mL、1.2AU/mL、2.4AU/mL、4.8AU/mL、9.6AU/mL。

所述标准品稀释液是pH7.2～7.4，含0.01％Tween-20(V:V)、0.5％BSA(M:V)和15％牛血清(V:V)，0.01M PBS缓冲液溶液。

所述化学发光底物液的缓冲液是pH 9.0，0.1M Tris缓冲盐溶液。

所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数pH 8.0～8.5，含2％Tween-20，0.75M Tris缓冲盐溶液，将浓缩洗涤液用纯化水稀释15倍即可使用。

实施例3：样品中新城疫病毒抗体的检测

1、用试剂盒检测与结果分析

将稀释后的酶标二抗装入化学发光检测仪酶标二抗工作液容器中，其中与酶标二抗稀释液是按照1:1000～1:3000的体积比进行稀释的；将稀释的磁标新城疫抗原装入化学发光检测仪磁珠抗原工作液容器中，与相应的稀释液是按照1:9～1:14的体积比进行稀释的；将样本稀释液装入化学发光检测仪样本稀释工作液容器中；将浓缩洗涤液用纯化水稀释15倍后装入化学发光检测仪洗涤工作液容器中；对每个样本/标准品设置样品架上的位置，输入样本信息和需要检测的测试项目名称；将样本管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪分别吸取10μL样本，90μL样本稀释液和30μL磁标抗原，依次加入到反应杯中，在37℃下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离30s，弃上清液后用洗涤液300μL对沉淀清洗3次；吸取100μL酶标二抗加入到反应杯中，在37℃下反应15min，再通过清洗装置进行磁分离30s，弃上清液后用洗涤液300μL对沉淀清洗3次；加入化学发光底物液100μL，检测发出的光强度(RLU)，标准品RLU为纵坐标，对应标准品的浓度为横坐标，用四参数Logistic曲线拟合标准曲线；将样本的发光值代入标准曲线中，每一个样本的浓度可以从标准曲线上读出，含量值≥2.4AU/mL，判定为阳性；含量值＜2.4AU/mL，判定为阴性。

本实用新型采用6个新城疫病毒抗体标准品(0.3AU/mL、0.6AU/mL、1.2AU/mL、2.4AU/mL、4.8AU/mL、9.6AU/mL)进行曲线测绘。计量单位AU/mL的建立方法为，根据样本的血凝抑制实验结果，挑选效价分别为log2、2log2、3log2、4log2、5log2、6log2的样本，建立起和血凝抑制实验样本效价相对应的线性关系，并且建立起和血凝抑制实验效价分别为log2、2log2、3log2、4log2、5log2、6log2相对应的标准品，标准品分别为0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6，并且建立计量单位AU/mL。标准品RLU为纵坐标，新城疫病毒抗体的含量为横坐标，用四参数Logistic曲线拟合标准曲线，每一个样本的浓度可以从标准曲线上读出。含量值≥2.4AU/mL，判定为阳性；含量值＜2.4AU/mL，判定为阴性。标准曲线如图1所示。

实施例4：试剂盒质量的测定

1、试剂盒特异性

按照实例3的方法测定H5禽流感病毒、H9禽流感病毒、新城疫(NDV)、马立克病毒(MDV)、传染行支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DPV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副黏病毒(GPMV)阳性样本，检测结果为H5禽流感病毒、H9禽流感病毒、新城疫(NDV)、马立克病毒(MDV)、传染行支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DPV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副黏病毒(GPMV)阳性样本的含量均小于0.3AU/mL，无特异性反应。数据如下：

2、试剂盒的检测限

试剂盒检测限(分析灵敏度)的定义为：测定20次阴性样品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的检测限为：0.3AU/mL。

3、试剂盒的准确度

准确度是指测定值与真值间的符合程度，选择20份血凝抑制效价不同的样本，以血凝抑制实验为标准，血凝抑制效价≥4log2为阳性，效价＜4log2为阴性；本试剂盒含量值≥2.4AU/mL，判定为阳性；含量值＜2.4AU/mL，判定为阴性。有数据可知本试剂盒和血凝抑制实验的阴阳符合率为100％，数据如下：

实施例5

一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，图2为本实用新型磁免疫化学发光检测试剂盒的盒体结构示意图，所述试剂盒包括盒体1以及盒体内的盛装不同溶剂的试剂瓶；所述不同溶剂的试剂瓶分别为酶标抗IgY抗体试剂瓶2、磁标新城疫病毒抗原试剂瓶3、标准品溶液试剂瓶4、样本稀释液试剂瓶5、发光底物液试剂瓶6和浓缩洗涤液试剂瓶7。

所述盒体1为纸质盒体或塑料盒体。

所述盒体1的盒内包括放置试剂瓶的下凹瓶位；所述下凹瓶位共11个。

所述酶标抗IgY抗体试剂瓶2为黄色瓶帽的黄色塑料瓶；所述磁标新城疫病毒抗原试剂瓶3为白色瓶帽的白色塑料瓶；所述标准品溶液试剂瓶4为黑色瓶帽的棕色玻璃瓶；所述样本稀释液试剂瓶5为透明瓶帽的白色塑料瓶；所述发光底物液试剂瓶6为黑色瓶帽的黑色塑料瓶；所述浓缩洗涤液试剂瓶7为透明瓶帽的白色塑料瓶。

所述酶标二抗试剂瓶2数量为1个，体积分别为10mL；所述磁标新城疫病毒抗原试剂瓶3数量为1个，体积分别为6mL；所述标准品溶液试剂瓶4数量为6个，体积分别为5mL；所述样本稀释液试剂瓶5数量为1个，体积分别为25mL；所述发光底物液试剂瓶6数量为1个，体积分别为100mL；所述浓缩洗涤液试剂瓶7数量为1个，体积分别为100mL。

所述酶标抗IgY抗体试剂瓶2中的抗体为碱性磷酸酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶6中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。

所酶标抗IgY抗体试剂瓶2中的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶6中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体(1)以及盒体内的盛装不同溶剂的试剂瓶；所述不同溶剂的试剂瓶分别为酶标抗IgY抗体试剂瓶(2)、磁标新城疫病毒抗原试剂瓶(3)、标准品溶液试剂瓶(4)、样本稀释液试剂瓶(5)、发光底物液试剂瓶(6)和浓缩洗涤液试剂瓶(7)。

2.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述盒体(1)为纸质盒体或塑料盒体。

3.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述盒体(1)的盒内包括放置试剂瓶的下凹瓶位；所述下凹瓶位共11个。

4.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗IgY抗体试剂瓶(2)数量为1个，体积分别为10mL；所述磁标新城疫病毒抗原试剂瓶(3)数量为1个，体积分别为6mL；所述标准品溶液试剂瓶(4)数量为6个，体积分别为5mL；所述样本稀释液试剂瓶(5)数量为1个，体积分别为25mL；所述发光底物液试剂瓶(6)数量为1个，体积分别为100mL；所述浓缩洗涤液试剂瓶(7)数量为1个，体积分别为100mL。

5.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗IgY抗体试剂瓶(2)中的酶标抗体为碱性磷酸酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶(6)中的发光底物为3-2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-3-磷氧酰-苯基-1,2-二氧环乙烷或3-氨基苯二甲酰肼。

6.如权利要求1所述的新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所酶标抗IgY抗体试剂瓶(2)中的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗IgY抗体，所述发光底物液试剂瓶(6)中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。

Images