CN110857948A - H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110857948A
CN110857948A CN201810972395.XA CN201810972395A CN110857948A CN 110857948 A CN110857948 A CN 110857948A CN 201810972395 A CN201810972395 A CN 201810972395A CN 110857948 A CN110857948 A CN 110857948A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
fluorescein isothiocyanate
influenza virus
avian influenza
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810972395.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨海
杨宝凤
计梦琴
张德军
成诗琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Nadakang Biological Technology Co Ltd
Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Wuhan Nadakang Biological Technology Co Ltd
Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Nadakang Biological Technology Co Ltd, Huazhong University of Science and Technology filed Critical Wuhan Nadakang Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810972395.XA priority Critical patent/CN110857948A/zh
Publication of CN110857948A publication Critical patent/CN110857948A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用，属于免疫学检测领域。所述试剂盒含有酶标抗体、磁标异硫氰酸荧光素抗体、异硫氰酸荧光素修饰抗原、标准品溶液、样本稀释液、发光底物液和浓缩洗涤液；所述酶标抗体中的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰抗原中的抗原能特异性结合；所述磁标异硫氰酸荧光素抗体为核壳结构；所述核壳结构为包裹磁性纳米颗粒的异硫氰酸荧光素抗体；所述发光底物液中的发光底物与所述酶标抗体中的酶特异性结合，使发光底物发出荧光。采用所述的试剂盒检测抗体，具有灵敏度和准确度高以及特异性强的效果。

Description

H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，特别地，涉及一种H7禽流感病毒抗体化学发光检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，导致此病的病毒属于正黏病毒科，RNA病毒。形态近似球形，直径80～120nm，病毒外有包膜，包膜内部为螺旋对称的核衣壳。甲型流感病毒的基因组由8个片段组成。病毒表面的糖蛋白抗原分为16个血细胞凝集素(HA亚型)和9个神经氨酸酶(NA亚型)。不同亚型病毒之间的基因可“杂交”，形成一个庞大而复杂的病毒家族。近年来，由于禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)的抗原漂移，该病毒已跨越种间屏障，威胁人类的健康。禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性病毒。全球曾报道过包括H5N1、H7N7、H7N3和H9N2等不同亚型禽流感病毒感染人并发病、死亡的事件。H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，截至2015年01月10日，全国已确诊134人感染禽流感，37人死亡，病死率为27.6％。
H7亚型高致病性禽流感列强制免疫项目，其抗体是疫苗免疫后抗体水平监测的主要指标，抗体水平高低与其免疫直接相关，通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证。现有的禽流感病毒抗体诊断技术主要有血凝抑制法、ELISA方法、病毒中和试验、免疫荧光法、胶体金试纸条等方法。血凝抑制法是检测禽流感病毒抗体最常用的方法，但该技术对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性，且基本不能实现高通量的检测，而禽类养殖一般规模、养殖密度较大，需要检测的样本量也较大。因此，迫切需要开发一种操作简单、高灵敏度、高准确度、高通量的检测方法。
发明内容
本发明解决了现有技术中抗体检测特异性不强、灵敏度和准确度不高的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种磁标异硫氰酸荧光素抗体的制备方法，含有以下步骤：
(1)将异硫氰酸荧光素作为免疫抗原刺激生物体后，抽取血清获得异硫氰酸荧光素粗抗体A，向所述血清中加入酪蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋白形成异硫氰酸荧光素粗抗体B；或者将所述血清纯化后提取异硫氰酸荧光素抗体，向该异硫氰酸荧光素抗体中加入酪蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋白形成异硫氰酸荧光素粗抗体C；
(2)向步骤(1)所述异硫氰酸荧光素粗抗体A、异硫氰酸荧光素粗抗体B或异硫氰酸荧光素粗抗体C中加入超顺磁性纳米颗粒，得到粗乳液；
(3)向步骤(2)所述粗乳液中加入还原剂，使所述粗乳液中的蛋白质在还原剂的作用下打开二硫键，暴露出巯基和疏水区域；所述粗乳液中的蛋白质通过巯基配位和疏水作用与所述超顺磁性纳米颗粒连接，得到磁标异硫氰酸荧光素抗体；所述磁标异硫氰酸荧光素抗体内核为超顺磁性纳米颗粒，外壳为异硫氰酸荧光素抗体和异硫氰酸荧光素抗体位点之外的封闭蛋白。
按照本发明的另一方面，提供了所述方法制备得到的磁标异硫氰酸荧光素抗体，所述磁标异硫氰酸荧光素抗体为核壳结构；所述核壳结构的内核为超顺磁性纳米颗粒，所述核壳结构的外壳为异硫氰酸荧光素抗体和异硫氰酸荧光素抗体位点之外的封闭蛋白；所述超顺磁性纳米颗粒与所述异硫氰酸荧光素抗体和封闭蛋白通过巯基配位和疏水作用连接。
优选地，所述超顺磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒或超顺磁性三氧化二铁纳米颗粒。
按照本发明的另一方面，提供了一种H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，所述试剂盒含有以下试剂：酶标H7禽流感病毒单克隆抗体、权利要求2所述的磁标异硫氰酸荧光素抗体、异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原、标准品溶液、样本稀释液、发光底物液和浓缩洗涤液；
权利要求2所述的磁标异硫氰酸荧光素抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的异硫氰酸荧光素特异性结合；
所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原特异性结合；
所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的酶降解所述发光底物液中的发光底物，使所述发光底物发光。
优选地，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为碱性磷酸酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷或3-氨基苯二甲酰肼。
优选地，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。
优选地，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐活化的碱性磷酸酶与用2-亚氨基硫烷盐酸盐巯基化的H7禽流感病毒单克隆抗体反应得到。
按照本发明的另一方面，提供了所述的试剂盒应用于检测抗体的方法，含有以下步骤：
(1)将磁标异硫氰酸荧光素抗体与异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原进行混合，所述磁标异硫氰酸荧光素抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的异硫氰酸荧光素特异性结合；
(2)向步骤(1)得到的产物中加入标准品溶液或待检测样品，20℃-37℃条件下反应10min-15min，使所述标准品溶液或所述待测溶液中的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原特异性结合，然后进行磁分离30s～2min，弃上清液后将沉淀物用浓缩洗涤液清洗；将酶标H7禽流感病毒单克隆抗体加入到上述清洗后的沉淀物中，在20℃-37℃下反应10min-15min，使酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原进行结合，然后进行磁分离30s～2min，弃上清液后将沉淀物用浓缩洗涤液清洗；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入发光底物液，使所述发光底物液中的发光底物与结合到所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的酶标H7禽流感病毒单克隆抗体中的酶反应，检测发光值，以加入标准品溶液的发光值绘制标准曲线，以加入待检测样品的发光值从所述标准曲线上计算待测样品中抗体的含量。
优选地，步骤(3)所述标准曲线是通过以下方法建立的：
S1：将血凝抑制效价分别为0、2log2、4log2、6log2、8log2和12log2相对应的标准品的浓度分别定义为0AU/mL、0.1AU/mL、0.3AU/mL、0.5AU/mL、1AU/mL和2AU/mL；
S2：将步骤S1所述标准品浓度为横坐标，将所述标准品浓度对应的发光值为纵坐标，用四参数Logistic曲线拟合得到标准曲线。
优选地，步骤(2)所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为碱性磷酸酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体；步骤(3)所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷或3-氨基苯二甲酰肼；
优选地，步骤(2)所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，步骤(3)所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明H7禽流感病毒抗体的磁免疫化学发光检测试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对H7禽流感病毒抗体的检测灵敏度可达到0.04AU/mL；并根据血凝抑制实验的不同样本效价如全阴样本、2log2、4log2、6log2、8log2、12log2建立起和血凝抑制实验样本效价相对应的线性关系，并且建立新的计量单位AU/mL，实现了H7禽流感病毒抗体的定量检测，并可以同时定量检测大批样本，技术上有明显的进步；通过对样本抗体含量的检测，可实现抗体水平的监测，通过监测结果可制定合理、有效的免疫程序，提高群体免疫水平。
(2)本发明磁珠标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体，采用的是还原自组装FITC抗体包裹超顺磁性纳米粒的制备方法，还原剂打开FITC抗体及杂蛋白中的二硫键，使抗体中的疏水区域和巯基暴露出来，磁性微球通过配位键以及疏水作用与抗体紧密的结合在一起，形成较强稳定性的磁性微球；磁标FITC抗体制备过程中条件温和，制备过程中可直接固定FITC抗体，一步得到FITC抗体磁性微球，且磁球具有活性，不易聚集，非特性吸附较低，应用在化学发光检测试剂盒中具有特异性强和准确度高的效果。
(3)本发明提供的试剂盒应用于检测H7禽流感抗体时，具有较高的灵敏度、特异性和准确度的效果，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，提高检测通量，减少人为操作误差。
附图说明
图1为本发明磁免疫化学发光检测试剂盒标准曲线。
图2磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的制备过程图。
图3磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的透射电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：试剂盒具体组分的制备
1、酶标抗体的制备
A、碱性磷酸酶活化
以DMSO为溶剂，配制10mM SMCC溶液；向29.5uL 10mM SMCC溶液中加入240uL 5mg/mL碱性磷酸酶，混匀后室温静置15min，再加入2.7uL 1M pH 7.3甘氨酸缓冲液，室温静置5min；0.01M pH 7.4的PBS溶液超滤脱盐，测定280nm的吸光度，酶浓度为：ABS280*稀释因子/1.0，酶质量：酶浓度*产物体积(mg/mL)，2～8℃保存。
B、H7禽流感病毒单克隆抗体活化
以0.1M硼酸盐为溶剂，配制pH 8.0的5mM EDTA.2H2O溶液；取400uL的3mg/mL的单克隆抗体用上述溶液作为流动相，过GE Healthcare Life Science的蛋白质分离纯化系统PD10脱盐柱，收集产物，产物2mg/mL；以0.1M硼酸盐为溶剂配制0.02M的2-IT溶液，取4uL的0.02M的2-IT溶液将其加入500uL的2mg/mL的脱盐产物内，混匀后室温静置30min，再加入5uL的1M pH7.3甘氨酸缓冲液，室温静置5min；0.01M的pH为7.4的PBS溶液超滤脱盐，产物加入2倍体积的1M的MgCl2，测定280nm的吸光度，蛋白浓度为：ABS280*稀释因子/1.36,蛋白质量：酶浓度*产物体积(mg/mL)，2～8℃保存。
C、偶联
活化的碱性磷酸酶与活化的抗体质量比0.91:1偶联，2～8℃静止反应16-18h；加入10uL 10mM马来酰亚胺溶液，混匀静止10min，10mM马来酰亚胺溶液配制过程为1.03mLDMF溶解10mg马来酰亚胺固体，再用0.01M的pH7.4的PBS溶液稀释10倍，即配成10mM马来酰亚胺溶液；加入10uL的100mM乙醇胺溶液，混匀静止10min，100mM乙醇胺溶液配制过程为20uL乙醇胺溶于1.98mL的0.01M pH为7.4的PBS溶液中，再取上述乙醇胺溶液600uL，加入到400uL的0.01M pH为7.4的PBS溶液中，即得100mM乙醇胺溶液；用Superdex 200层析柱在GEHealthcare Life Science的蛋白质分离纯化系统上分离纯化上述产物，洗脱缓冲液为0.1M pH 7.4含5mM MgCl2，0.1mM ZnCl2和0.3％叠氮钠的Tris缓冲盐溶液，保存于含0.1MpH为7.4含5mM MgCl2、0.1mM ZnCl2和0.3％叠氮钠的Tris缓冲盐溶液。2～8℃保存。
2、磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的制备
磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体是通过还原自组装抗体包裹磁性微球的方法实现的。首先用异硫氰酸荧光素(FITC)免疫抗原作为刺激，在鼠或兔等生物体内产生异硫氰酸荧光素(FITC)抗体。抽取血清获得含有杂蛋白的粗抗体，或是将抽取的血清加入适量杂蛋白(如牛血清白蛋白BSA)形成的粗抗体,或是将抽取的血清纯化提取抗体后，人为加入适量杂蛋白(如牛血清白蛋白BSA)形成的粗抗体；然后将超顺磁性氧化铁SPIO纳米颗粒通过物理混合手段与异硫氰酸荧光素(FITC)抗体混均形成粗乳液。异硫氰酸荧光素(FITC)抗体及杂蛋白在还原剂的作用下打开抗体的二硫键，使抗体暴露出巯基和疏水区域，抗体通过巯基配位和疏水作用与超磁性氧化铁纳米粒(SPIO)自组装形成核壳结构的异硫氰酸荧光素(FITC)抗体包裹的磁性微球反应液。图2为磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的制备过程图。图3为磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的透射电镜图，由图3可知，异硫氰酸荧光素(FITC)抗体包裹了纳米微球。具体操作如下：
A、物理混合
取5mg超顺磁性氧化铁纳米粒(SPIO)，加入3mL乙醇后涡旋30s，磁铁收集SPIO，去上清，加入100ul氯仿重新将SPIO溶解，再加入100ul乙醇，1mL pH 7.3Tris缓冲盐溶液。超声清洗器中超声3min，将SPIO转至25ml玻璃瓶中继续超声1min，加入4mL pH 7.3Tris缓冲盐溶液，超声2min，将50mg FITC粗抗体加入SPIO中，血浆混匀仪上混匀12h得到粗乳液。
B、还原自组装包裹：粗乳液转至25ml圆底烧瓶中，37℃水浴缓慢加入2mol/L巯基乙醇，反应6min。
C、分离纯化：以反应液和0℃Tris缓冲盐溶液1:1(V:V)的比例终止反应。磁分离2min，弃上清，pH 7.4 0.05M Tris缓冲盐溶液清洗2次，保存在pH 8.0，含0.02％WPS(V:V)，1％TritionX-100(M:V)，0.5％BSA(M:V)，0.05M Tris缓冲盐溶液中，终浓度为2mg/ml。
3、异硫氰酸荧光素(FITC)标记H7禽流感病毒抗原的制备
取适量FITC，用浓度为1.68％(M:V)的碳酸氢钠溶解，配制成1mg/ml的溶液，现配现用，避光保存。向64ul H7禽流感病毒抗原中缓慢加入100ul FITC溶液，避光进行，2～8℃避光反应过夜。以碳酸氢钠缓冲液为流动相，过GE Healthcare Life Science的蛋白质分离纯化系统PD10脱盐柱。1:1加入甘油，保存在pH 7.4，0.05M Tris缓冲盐溶液中，-20℃保存。
实施例2：试剂盒的组建
组建检测H7禽流感病毒抗体的磁免疫化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
(1)碱性磷酸酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体的标记物
(2)磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体
(3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗原
(4)H7禽流感病毒抗体标准品溶液
(5)样本稀释液
(6)化学发光底物液
(7)浓缩洗涤溶液
本发明所用的酶标抗体稀释液是pH 7.2～pH 7.4浓度为0.05M Tris缓冲盐溶液。
所述磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体稀释液是pH 8.0，含0.02％WPS(V:V)，1％TritionX-100(M:V)，0.5％BSA(M:V)，0.05M Tris缓冲盐溶液。
本发明所述异硫氰酸荧光素(FITC)修饰抗原稀释液是pH 7.4，0.05M Tris缓冲盐溶液。
H7禽流感病毒抗体标准品溶液，浓度分别为：0AU/mL、0.1AU/mL、0.3AU/mL、0.5AU/mL、1AU/mL、2AU/mL，标准品稀释液为pH 7.4，0.05M Tris缓冲盐溶液。
样本稀释液为pH 7.2～pH 7.4浓度为0.05M Tris缓冲盐溶液。
所述化学发光底物液的缓冲液是pH 9.0，0.1M Tris缓冲盐溶液。
所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数1％吐温-20的pH＝7.4，0.05M Tris缓冲盐溶液。
实施例3：样品中H7禽流感病毒抗体的检测
检测与结果分析：
将稀释后的酶标抗体装入化学发光检测仪酶标抗体工作液容器中,其中与酶标抗体稀释液是按照1:1000～1:10000的体积比进行稀释的；将稀释的磁标异硫氰酸荧光素(FITC)抗体，稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗原装入化学发光检测仪磁珠抗原工作液容器中，其中与相应的稀释液是分别按照1:20～1:40，1:1000～10000的体积比进行稀释的；将样本稀释液装入化学发光检测仪样本稀释工作液容器中；对每个样本/标准品设置样品架上的位置，输入样本信息和需要检测的测试项目名称；将样本管/标准品管放入已设定好的样品架上，化学发光检测仪分别吸取10μL样本，100μL样本稀释液和100μL磁标抗原，依次加入到反应杯中，在37℃下反应10min，再通过清洗装置进行磁分离30s，弃上清液后用洗涤液250μL～500μL对沉淀清洗3次～5次；吸取50μL酶标抗体加入到反应杯中，在37℃下反应10min，再通过清洗装置进行磁分离30s，弃上清液后用洗涤液250μL～500μL对沉淀清洗3次～5次；加入化学发光底物液100μL，检测发出的光强度(RLU)，标准品RLU为纵坐标，对应标准品的浓度为横坐标，用四参数Logistic曲线拟合标准曲线；将样本的发光值代入标准曲线中，每一个样本的浓度可以从标准曲线上读出，含量值≥0.3AU/mL，判定为阳性；含量值＜0.3AU/mL，判定为阴性。
本发明采用6个H7禽流感病毒抗体标准品(0AU/mL、0.1AU/mL、0.3AU/mL、0.5AU/mL、1AU/mL、2AU/mL)进行曲线测绘。计量单位AU/mL的建立方法为，根据样本的血凝抑制实验结果，挑选效价分别为全阴样本、2log2、4log2、6log2、8log2、12log2的样本，建立起和血凝抑制实验样本效价相对应的线性关系，并且建立起和血凝抑制实验效价分别为全阴样本、2log2、4log2、6log2、8log2、12log2相对应的标准品，标准品分别为0、0.1、0.3、0.5、1、2，并且建立计量单位AU/mL。标准品RLU为纵坐标，H7禽流感病毒抗体的含量为横坐标，用四参数Logistic曲线拟合标准曲线，每一个样本的浓度可以从标准曲线上读出。含量值≥0.3AU/mL，判定为阳性；含量值＜0.3AU/mL，判定为阴性。标准曲线如图1所示。
实施例4：试剂盒质量的测定
1、试剂盒特异性
按照实例3的方法测定H5禽流感病毒、H9禽流感病毒、新城疫(NDV)、马立克病毒(MDV)、传染行支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DPV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副黏病毒(GPMV)阳性样本，检测结果为H5禽流感病毒、H9禽流感病毒、新城疫(NDV)、马立克病毒(MDV)、传染行支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DPV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副黏病毒(GPMV)阳性样本的含量均小于0.1AU/mL，无特异性反应。数据如下：
Figure BDA0001776542300000111
2、试剂盒的检测限
试剂盒检测限(分析灵敏度)的定义为：测定20次阴性样品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的检测限为：0.04AU/mL。
3、试剂盒的准确度
准确度是指测定值与真值间的符合程度，选择20份血凝抑制效价不同的样本，以血凝抑制实验为标准，血凝抑制效价≥4log2为阳性，效价＜4log2为阴性；本试剂盒含量值≥0.3AU/mL，判定为阳性；含量值＜0.3AU/mL，判定为阴性。有数据可知本试剂盒和血凝抑制实验的阴阳符合率为100％，数据如下：
Figure BDA0001776542300000112
Figure BDA0001776542300000121
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁标异硫氰酸荧光素抗体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)将异硫氰酸荧光素作为免疫抗原刺激生物体后，抽取血清获得异硫氰酸荧光素粗抗体A，向所述血清中加入酪蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋白形成异硫氰酸荧光素粗抗体B；或者将所述血清纯化后提取异硫氰酸荧光素抗体，向该异硫氰酸荧光素抗体中加入酪蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋白形成异硫氰酸荧光素粗抗体C；
(2)向步骤(1)所述异硫氰酸荧光素粗抗体A、异硫氰酸荧光素粗抗体B或异硫氰酸荧光素粗抗体C中加入超顺磁性纳米颗粒，得到粗乳液；
(3)向步骤(2)所述粗乳液中加入还原剂，使所述粗乳液中的蛋白质在还原剂的作用下打开二硫键，暴露出巯基和疏水区域；所述粗乳液中的蛋白质通过巯基配位和疏水作用与所述超顺磁性纳米颗粒连接，得到磁标异硫氰酸荧光素抗体；所述磁标异硫氰酸荧光素抗体内核为超顺磁性纳米颗粒，外壳为异硫氰酸荧光素抗体和异硫氰酸荧光素抗体位点之外的封闭蛋白。
2.如权利要求1所述方法制备得到的磁标异硫氰酸荧光素抗体，其特征在于，所述磁标异硫氰酸荧光素抗体为核壳结构；所述核壳结构的内核为超顺磁性纳米颗粒，所述核壳结构的外壳为异硫氰酸荧光素抗体和异硫氰酸荧光素抗体位点之外的封闭蛋白；所述超顺磁性纳米颗粒与所述异硫氰酸荧光素抗体和封闭蛋白通过巯基配位和疏水作用连接。
3.如权利要求2所述的磁标异硫氰酸荧光素抗体，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒或超顺磁性三氧化二铁纳米颗粒。
4.一种H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有以下试剂：酶标H7禽流感病毒单克隆抗体、权利要求2或权利要求3所述的磁标异硫氰酸荧光素抗体、异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原、标准品溶液、样本稀释液、发光底物液和浓缩洗涤液；
权利要求2或权利要求3所述的磁标异硫氰酸荧光素抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的异硫氰酸荧光素特异性结合；
所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原特异性结合；
所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的酶降解所述发光底物液中的发光底物，使所述发光底物发光。
5.如权利要求4所述的H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为碱性磷酸酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷或3-氨基苯二甲酰肼。
6.如权利要求4所述的H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。
7.如权利要求4所述的H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐活化的碱性磷酸酶与用2-亚氨基硫烷盐酸盐巯基化的H7禽流感病毒单克隆抗体反应得到。
8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒应用于检测抗体的方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)将磁标异硫氰酸荧光素抗体与异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原进行混合，所述磁标异硫氰酸荧光素抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的异硫氰酸荧光素特异性结合；
(2)向步骤(1)得到的产物中加入标准品溶液或待检测样品，20℃-37℃条件下反应10min-15min，使所述标准品溶液或所述待测溶液中的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原特异性结合，然后进行磁分离30s～2min，弃上清液后将沉淀物用浓缩洗涤液清洗；将酶标H7禽流感病毒单克隆抗体加入到上述清洗后的沉淀物中，在20℃-37℃下反应10min-15min，使酶标H7禽流感病毒单克隆抗体上的抗体与所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的H7禽流感病毒抗原进行结合，然后进行磁分离30s～2min，弃上清液后将沉淀物用浓缩洗涤液清洗；
(3)向步骤(2)得到的产物中加入发光底物液，使所述发光底物液中的发光底物与结合到所述异硫氰酸荧光素修饰H7禽流感病毒抗原上的酶标H7禽流感病毒单克隆抗体中的酶反应，检测发光值，以加入标准品溶液的发光值绘制标准曲线，以加入待检测样品的发光值从所述标准曲线上计算待测样品中抗体的含量。
9.如权利要求8所述的检测抗体的方法，其特征在于，步骤(3)所述标准曲线是通过以下方法建立的：
S1：将血凝抑制效价分别为0、2log2、4log2、6log2、8log2和12log2相对应的标准品的浓度分别定义为0AU/mL、0.1AU/mL、0.3AU/mL、0.5AU/mL、1AU/mL和2AU/mL；
S2：将步骤S1所述标准品浓度为横坐标，将所述标准品浓度对应的发光值为纵坐标，用四参数Logistic曲线拟合得到标准曲线。
10.如权利要求8所述的检测抗体的方法，其特征在于，步骤(2)所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为碱性磷酸酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体；步骤(3)所述发光底物液中的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷或3-氨基苯二甲酰肼；
优选地，步骤(2)所述酶标H7禽流感病毒单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的H7禽流感病毒单克隆抗体，步骤(3)所述发光底物液中的发光底物为3-氨基苯二甲酰肼。
CN201810972395.XA 2018-08-24 2018-08-24 H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用 Pending CN110857948A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810972395.XA CN110857948A (zh) 2018-08-24 2018-08-24 H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810972395.XA CN110857948A (zh) 2018-08-24 2018-08-24 H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110857948A true CN110857948A (zh) 2020-03-03

Family

ID=69635467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810972395.XA Pending CN110857948A (zh) 2018-08-24 2018-08-24 H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110857948A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114113588A (zh) * 2020-08-28 2022-03-01 华中科技大学 一种新型冠状病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及应用
WO2022198925A1 (zh) * 2021-03-22 2022-09-29 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114113588A (zh) * 2020-08-28 2022-03-01 华中科技大学 一种新型冠状病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及应用
WO2022198925A1 (zh) * 2021-03-22 2022-09-29 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 纳米磁珠包被物及其制备方法、检测试剂和检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bai et al. Rapid enrichment and ultrasensitive detection of influenza A virus in human specimen using magnetic quantum dot nanobeads based test strips
CN107817232A (zh) 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统
CN110672844A (zh) 一种新城疫病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
KR102351653B1 (ko) 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체와 항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 진단 키트
CN101975859A (zh) 一种乙型肝炎病毒表面抗原的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法
CN108982834A (zh) 纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法
US20230228752A1 (en) Kits and methods for the enrichment and detection of RNA viruses of the Coronaviridae family
WO2021227994A1 (zh) 一种采用血管紧张素转化酶ii（ace2）检测冠状病毒的方法
WO2021169664A1 (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
CN104697830B (zh) 用于hiv检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法
CN104090101A (zh) 人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
CN110857948A (zh) H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
CN101936997A (zh) 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒
US20230160895A1 (en) Sars coronavirus 2 diagnostic kit including receptor and antibody binding to sars coronavirus 2 spike protein
Zhang et al. Second near-infrared fluorescent dye for lateral flow immunoassays rapid detection of influenza A/B virus
JPH03502248A (ja) アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法
CN208795747U (zh) H7禽流感病毒抗体磁免疫化学发光检测试剂盒
CN104204801A (zh) 免疫分析方法及试剂
CN108303530A (zh) 一种猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒及其检测方法
CN110954695A (zh) 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用
CN113252911B (zh) SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒及其应用
CN105181956B (zh) 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用
Huang et al. Au/Fe 3 O 4 core–shell nanoparticles are an efficient immunochromatography test strip performance enhancer—a comparative study with Au and Fe 3 O 4 nanoparticles
CN108303542A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒及其检测方法
CN112540175A (zh) 一种新型冠状病毒IgM检测试剂盒及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination