CN103189747A - 微生物的捕获 - Google Patents

微生物的捕获 Download PDF

Info

Publication number
CN103189747A
CN103189747A CN2011800415061A CN201180041506A CN103189747A CN 103189747 A CN103189747 A CN 103189747A CN 2011800415061 A CN2011800415061 A CN 2011800415061A CN 201180041506 A CN201180041506 A CN 201180041506A CN 103189747 A CN103189747 A CN 103189747A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pearl
microorganism
solid surface
fragment
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800415061A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103189747B (zh
Inventor
C·J·斯坦利
S·M·威尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Microsens Medtech Ltd
Original Assignee
Microsens Medtech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Microsens Medtech Ltd filed Critical Microsens Medtech Ltd
Publication of CN103189747A publication Critical patent/CN103189747A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103189747B publication Critical patent/CN103189747B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

通过在固体表面的存在下向液体中加入足量的水溶性聚合物以使微生物和/或片段从液体转移至所述固体表面而将存在于水性液体中的所述微生物、包括真菌、病毒和细菌例如分枝杆菌和/或微生物片段、例如细胞壁组分捕获至固体表面。可通过珠子提供所述表面。所述水溶性聚合物可以是聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。

Description

微生物的捕获
本发明涉及从悬浮物中捕获微生物的方法，以及其随后的检测和/或鉴定。
背景
在许多应用中希望从其悬浮物中捕获微生物，这作为第一个步骤而允许随后对所述微生物进行其它工作，例如将微生物浓缩为不含杂质和污染物的小体积，用于例如诊断目的。所述微生物可起初存在于大体积样品材料中，例如痰，血液，分散的食物或饮用水中。浓缩为不含样品污染物的小体积在诊断程序中会优化灵敏度并去除抑制物，所述诊断程序是例如显微镜检查，免疫测定或核酸扩增程序，例如PCR。现存的用于实现微生物浓缩的方法包括使用涂覆了微生物特异性抗体的顺磁珠子;所述珠子可被用于从样品中特异性地捕获微生物，从而允许通过各种方法对其进行随后的检测(US7166425)。
然而，在一些应用中，捕获条件可能不适于基于抗体的系统:例如，在从痰中捕获分枝杆菌时，所述痰已用氢氧化钠稀释并且保持为高pH，这将使抗体失活。在这些以及其它严苛条件的情形中，不能使用抗体捕获。此外，在其它应用中可能需要捕获可能存在于样品中的任何微生物。例如，在败血症中，重要的是捕获可能存在于血液中的任何细菌或真菌细胞从而可进行诊断。类似地，在测试血液产品时（例如在血小板筛选中），重要的是了解所述血液产品(在此情形中是血小板)究竟是否被任何微生物污染。在这种情形中，用基于抗体的方法将难以进行这些，因为抗体倾向于是生物体或物种特异性的。
曾描述过不是基于抗体的方法。JP2001112497描述了通过沉淀其中的磷酸钙而从碱净化的液体中去除分枝杆菌的方法，推测沉淀物在形成时带下细菌。WO2009/086343描述了将碳水化合物涂覆的表面与生物素结合蛋白以及类固醇或三萜的两亲性糖苷一起使用以结合微生物。WO28072242A2描述了以氨基酸衍生的聚合物基质作为结合表面，且WO29046191A2描述了使用以各种金属或无机表面涂覆的硅藻土颗粒来实现相同的结果。这些方法比基于抗体的方法更为通用但是不是真正通用的，因为某些细菌种类比其它种类更好地被捕获，且某些细菌种类或菌株可能根本不被捕获。此外，没有显示这些方法用于捕获真菌。
这些问题是依赖于结合基质的表面特性（其在性质上必然受限）来结合可具有多样的外细胞壁结构的细菌的结果。在本发明中，我们描述了新的方法，其较少依赖于表面基质的性质并且被显示出除对分枝杆菌（倾向于具有独特的疏水性细胞壁）起作用外，也对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌起作用。
发明简述
我们现在发现了有可能使用水溶性聚合物来引起悬浮的微生物沉积在固体表面上。此方法还起作用以引起微生物的可沉淀和不可沉淀的片段沉积在固体表面上。虽然已经得知通过加入水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或右旋糖苷而不涉及固体表面可引起溶液中的蛋白沉淀有一段时间了，但是关于微生物及其片段的这些发现是出人预料的。
WO95/32304使用水性两相聚合物分离系统来选择性提高靶微生物相对于背景菌群的数目，但是没有暗示捕获至固体表面。
因此，本发明现在提供了将水性液体中的微生物和/或其片段捕获至固体表面上的方法，所述方法包括在固体表面的存在下向所述液体中加入足量的水溶性聚合物以将所述微生物和/或片段从所述液体转移至所述固体表面。
或者表述为，所述方法可包括将固体表面与含有微生物和/或其片段的水性液体及水溶性聚合物一同提供，以将所述微生物和/或其片段从所述液体转移至所述固体表面上。
可以此方式被捕获的微生物片段包括可沉淀的片段，可利用以4,000x g离心20min来离心所述片段而从液体中沉积，其中4,000x g是通常用于沉淀细菌的速度。令人惊讶地，所述方法也起作用以捕获片段，所述片段可包括在这种离心条件下不能被引起沉积并且可被称为不可沉淀的可溶性蛋白或其它可溶性细胞组分。
可根据聚合物的性质自由调节水性液体中所添加的水溶性聚合物的浓度，从而产生所希望的将微生物和/或片段从待沉积液体中的悬浮物或溶液中转移至固体表面上。任选地，所述聚合物浓度为2至30%w/v，优选5至20%w/v，更优选7至15%w/v，最优选约10%w/v。这些浓度特别适于与以PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(作为所述聚合物)一起使用。
优选地，所述水溶性聚合物是非离子亲水性聚合物。其例如可以是右旋糖苷，PVP或PEG。所述PEG可以是在分子量方面多分散的或者是单分散的，可以是分支的或直链的并且可以是星型的。
适当地，所述水溶性聚合物具有的重均分子量为200至100,000。其可例如具有下列分子量1,000至20,000，更优选5,000至13,000，例如约8000。这些分子量特别适于PEG或PVP的情形。
可通过使用高离子强度条件来提高微生物与固体表面的结合。适当地，通过加入水溶性无机盐而将所述水性液体的离子强度提高到150mM至6M，更优选0.25至0.75M，例如0.5M。
可向所述溶液中加入许多不同的盐以实现高离子强度，例如硫酸铵，氯化铵，硫酸镁，氯化镁，但是氯化钠是优选的。
可在1-14范围中的高或低pH条件下进行与表面的结合。当所述微生物是分枝杆菌时，高pH、例如9至14可以是优选的，以消灭或降低繁殖可能存在的其它种类的细菌的能力。
此外，可在去污剂的存在下进行与表面的结合，所述去污剂可包括离子性(例如十二烷基硫酸钠)或非离子性(例如Tween20和Triton X100)去污剂。
优选的是，所述固体表面具有高的比表面积，因而优选通过珠子提供所述固体表面。术语“珠子”包括但不限于下述不可溶颗粒：其性质为球形的或不规则的，大小为0.1微米至5mm。
根据本发明的方法还可包括从所述液体中分离所述固体表面。
对于微生物的一般性浓缩有完善的物理方法，例如:过滤样品，其中细胞被俘获在尺寸排阻滤器的表面上或深度滤器的结构内;或者离心，其中细胞被沉淀。虽然这些方法可用于制备不含样品污染物的微生物浓缩悬浮物，它们也有缺点。在过滤方法中，捕获确定大小的完整生物体是简单的(受制于过滤的内在缺点)，但是以这种方式来捕获不确定大小的生物体片段是更加困难的。此外，在通过过滤器俘获了微生物之后可能难以回收它们，并且当通过洗脱或逆流清洗过程进行回收时，所述微生物可能不利地存在于相对大的流体体积中。再一次地，离心可被用于浓缩完整的生物体但是在所使用的速度和时间下微生物的片段可能是不可沉淀的。此外，离心需要设备并且此步骤也不能被容易地并入微生物浓度和检测的自动化程序中。此外，在离心之后，以所希望的小体积可靠地重悬含有微生物的经沉淀的沉淀物是困难的，通常需要更大的体积来确保完全分散管中的沉淀物。
因此，优选的是，在其上接受微生物和/或片段的固体表面的性质使得不使用过滤或离心而能将所述固体表面从悬浮液体分离。因此优选的是，所述珠子可被吸引至磁体以进行分离或者其足够致密从而即使含有聚合物的液体十分粘稠也可通过沉淀被分离。因此，优选的是所述珠子是顺磁的或者具有充分高于所述液体密度的密度从而它们在不离心时发生沉淀，例如高于2.0g/ml，更优选高于3.0g/ml。备选地，它们可具有充分低于所述液体密度的密度从而它们将分离以浮在所述液体上，例如空心珠，其可以是玻璃的。此类有浮力的珠子可具有低于0.8g/ml的密度，例如0.4至0.7mg/ml。
合适的致密珠子材料，或珠核心材料是氧化铝，碳化硅，氮化硅，碳化钛，氧化铁(例如磁石)和玻璃。
所述固体表面可以是由具有正电或负电表面基团的聚合物构成的。合适的表面基团的实例是胺，季铵，羧酸，磺酸或硫酸盐基团。合适的材料包括硫酸葡聚糖和聚(二甲基二烯丙基氯化铵)(pDADMAC)。
所述珠子可以整个是一种材料的或者可以具有带有表面涂层的核心。我们发现使用呈现磁石表面的颗粒（未涂覆的磁石颗粒）具有特别的优势。此类颗粒是铁磁的(广义的，包括亚铁磁的)并因此容易地从液体培养基中被分离且通过液体培养基中可溶性聚合物的存在而容易地引起微生物和/或其片段附着至此类颗粒的表面。此外，去除含有此种聚合物的液体培养基以及用其中不存在此种聚合物的液体对其进行替代提供了从所述固体表面去除经捕获的材料的便利手段。
根据本发明的方法还可包括在将所述固体表面从所述液体分离后从所述固体表面洗脱所述微生物和/或片段。所述洗脱可以在广泛的条件下进行，例如在具有150mM至6M盐浓度的缓冲液中。此外，可包括非离子性、离子性或两性离子去污剂、例如Tween20，Triton X-100，CTAB，十二烷基肌氨酸钠或SDS来帮助从所述珠子表面洗脱。
为了实现微生物和/或片段的浓缩，优选将所述微生物和/或片段从固体表面洗脱到这样的液体体积中：其至少2倍、例如至少4倍少于所述微生物和/或片段原本在其中悬浮的液体的体积。
本发明的方法还可包括检测被捕获至固体表面上的微生物和/或片段。这可在从所述固体表面洗脱之后或者当所述微生物和/或片段保留在所述固体表面上时进行。这可在从所述固体表面去除水性液体之后或者当所述水性液体仍保留时进行。例如，在将微生物和/或片段捕获至珠子之后，可加入经标记的结合剂（例如特异于所述微生物和/或片段的抗体或者金胺染料）并且可使所述液体通过细胞分选装置以检测经标记的珠子。
可用微生物染料对珠子或者带有微生物和/或片段的其它形式的固体表面进行染色，所述染色是直接的或者是在培养所述生物体以增加其数目之后。例如，可通过使用用于可视化的酸快速染料(acid fast stain)来显示分枝杆菌。对于微生物本身或其细胞组分可使用其它的检测形式，例如核酸扩增技术(如PCR)，代谢物的检测，基于抗体的检测（例如ELISA）。一种合适的用于检测分枝杆菌和/或片段的ELISA方法是例如GB1004710.8中公开的。本文中所描述的捕获方法可被用作GB1004709.0中所描述的方法的修改。所使用的检测方法可以是要求存在活微生物的那种，例如培养。
根据本发明可被捕获的微生物和/或片段包括细菌、病毒、真菌细胞、动物细胞和植物细胞，以及它们的细胞组分。
通过下面的具体实施例将进一步描述和阐释本发明。
实施例1结合至不同珠子类型的生物体的证明
原理
使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和光滑念珠菌(Candida glabrata)的过夜培养物来研究在各种条件下与各种珠子类型的结合。使用了足够的每种培养物从而溶液是浑浊的且可通过眼睛追踪结合以及随后的洗脱。
方法
1.以8,000x g将10ml细菌培养物离心5min并重悬于10ml蒸馏水中以提供浑浊的生物体悬浮物。
2.用1M NaCl或1M NaCl，20%(w/v)PEG8000(引起培养基中的PEG浓度为10%)将500μl的每种悬浮物稀释至1ml。
3.加入25μl各种顺磁珠子(约1mg珠子)的悬浮物并孵育10min。
4.使用磁力架将所述珠子拉至管子侧边并去除上清液。
5.以8,000x g离心5min后就浑浊度以及生物体沉淀物的存在观察上清液。
6.为了洗脱所捕获的生物体，将所述珠子重悬于250μl0.5M NaCl中，然后放回磁力架中。
7.以8,000x g离心5min后就浑浊度以及生物体沉淀物的存在观察上清液。
结果
结果显示在下表中。所使用的顺磁珠类型如下所列:
A.BioMag Amine珠(Bangs Laboratories，目录号BM546)。
B.如A中的，但是以pDADMAC涂覆。
C.如B中的，但是以硫酸葡聚糖再涂一层。
D.Dynalbeads M-270胺(Invitrogen)。
E.碳化硅珠子(50微米)，涂覆了pDADMAC。
F.碳化硅珠子(50微米)，未经涂覆。
NA，不适用。没有捕获且没有要洗脱的生物体。<50%表示25%-50%结合
讨论
在10%(w/v)PEG的存在下，所有的生物体(革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌以及真菌)都被捕获到了所测试的所有珠子类型上，虽然捕获至碳化硅珠子效率较低。在PEG的存在下捕获至顺磁珠子非常高效;捕获之后的上清液没有浑浊且离心后没有可观察到的生物体沉淀物。类似地，洗脱物是浑浊的并且在离心后具有可观察到的生物体沉淀物，其与没经过捕获和洗脱过程的相仿培养物体积的沉淀物大小相似。在捕获中没有PEG时就没有微生物的捕获且所有的微生物都保留在上清液中。与顺磁珠子相比，当涂覆在碳化硅上时较少程度地被捕获至pDADMAC可能是由于涂覆效率方面的差异。
实施例2研究在PEG捕获中对于NaCl的要求。
原理
在此实施例中，使用含有PEG与NaCl的不同组合的缓冲液中的羧基顺磁珠子(Invitrogen)来浓缩大肠杆菌。
方法
使用了足够的大肠杆菌过夜培养物从而溶液是浑浊的并且可通过眼睛追踪结合。
方法
1.以8,000x g将10ml的细菌培养物离心5min并在10ml蒸馏水中重悬以提供生物体的浑浊悬浮物。
2.用1M NaCl或1M NaCl，20%(w/v)PEG8000或20%(w/v)PEG8000将500μl的每种悬浮物稀释至1ml。
3.加入100μl(约0.4mg珠子)的羧基顺磁珠子(Invitrogen)悬浮物并孵育10min。
4.使用磁力架将所述珠子拉至管子侧边并去除上清液。
5.以8,000x g离心5min后就浑浊度以及生物体沉淀物的存在观察上清液。
结果
所使用的结合缓冲剂 捕获的程度(%)
0.5M NaCl 0
0.5M NaCl，10%(w/v)PEG8000 100
10%(w/v)PEG8000 25
讨论
一般而言细菌是带负电的并且将被带负电的羧基珠子排斥。这种排斥可帮助在较晚的阶段从珠子上去除所述细菌。没有PEG(仅有NaCl)时，没有大肠杆菌与珠子的结合。仅用PEG时，有一些结合但是通过NaCl的存在增加了效率，其中推测所述NaCl帮助隔离杆菌和珠子二者上的负电荷并因此促进细菌与珠子的结合。
实施例3使用顺磁珠子从痰中浓缩结核分枝杆菌
原理
在此实施例中，使用涂覆了聚二甲基二烯丙基氯化铵(pDADMAC)的珠子(BioMag Amine珠，Bangs Laboratories，目录号BM546)从稀释的痰中浓缩结核分枝杆菌(TB)，所述稀释的痰具有高pH。然后通过酸快速显微镜检查证实了珠子上TB的存在。
方法
为了比较，用氢氧化钠、N-乙酰半胱氨酸稀释痰样品，然后将其分开，一半通过珠子捕获处理而另一半通过常规的实验室程序（包括杆菌的离心浓缩和对沉淀物的金胺染色）处理。
珠子捕获方案
1.通过加入等体积的0.5M NaOH，2%(w/v)N-乙酰半胱氨酸，根据标准的实验室程序来稀释痰。
2.将样品静置10min。
3.然后将2ml经稀释的痰加入等体积的20%PEG8000，3M NaCl中，并加入80μl经pDADMAC涂覆的珠子(约5mg珠子)且孵育10min。(注意:样品在此步骤前未被中和且捕获在使用pH试纸测量为14的高pH的情况下发生)。
4.然后使用磁体来收集珠子并且去除上清液。
5.将珠子重悬于1ml含有0.75M NaCl的PBS，再次以磁体来收集。
6.去除上清液并将珠子重悬于50μl PBS中，然后使其散布在显微镜玻片上并干燥。
7.使用标准方案，对于酸快速分枝杆菌用金胺O对玻片进行染色。
结果
测试了10个痰样品。用两种方法(即传统离心浓缩方法和珠子捕获方法)通过显微镜检查都得出6个样品是阳性的。用两种方法通过显微镜检查都得出4种样品为阴性的。因此，两种方法之间有100%的相关性。
讨论
此实施例显示出在碱性条件下，TB可从痰中被捕获并且此方法与通过离心浓缩的传统方法在效率方面是相当的。
实施例4使用沉降珠从痰中浓缩结核分枝杆菌
原理
在此实施例中，使用未经涂覆或经聚二甲基二烯丙基氯化铵(pDADMAC)涂覆的50微米碳化硅珠子从具有高pH的稀释的痰中浓缩结核分枝杆菌(TB)。然后通过酸快速显微镜检查来证实TB的捕获。
方法
为了比较，用氢氧化钠，N-乙酰半胱氨酸稀释痰样品，然后用未经涂覆的珠子处理一半并用经涂覆的珠子处理另一半。
珠子捕获方案
1.通过加入等体积的0.5M NaOH，2%(w/v)N-乙酰半胱氨酸，根据标准实验室程序稀释痰。
2.使样品静置10min。
3.然后将2ml经稀释的痰加入等体积的20%PEG8000，3M NaCl中，并加入200μl经涂覆或未经涂覆的碳化硅珠子的50%悬浮物并进行混合。(注意:在此步骤之前未将样品中和且捕获在使用pH试纸测量为14的高pH的情况下进行)。
4.当珠子通过重力沉降之后，通过重悬于1M Tris pH7.5中对其进行清洗并允许其再沉降一次。
5.最后在PBS中清洗珠子并且在沉降后去除上清液。
6.通过加入50μl氯仿和旋涡振荡来洗脱所捕获的杆菌。
7.允许珠子沉降后，去除液体上清液并将其点在显微镜载片上。
8.干燥之后，使用标准方案以用于酸快速分枝杆菌的金胺O对所述载片进行染色。
结果
测试了使用标准酸快速直接涂片时对于分枝杆菌为阳性的4种痰样品。在用未经涂覆和经涂覆的珠子进行处理后，通过显微镜检查发现所有的样品都是阳性的。
讨论
这显示出使用经涂覆或未经涂覆的碳化硅珠子以及高浓度的PEG在高pH时可从稀释的痰中捕获分枝杆菌。
实施例5从痰中浓缩结核分枝杆菌
原理
在此实施例中，以两步过程从痰中浓缩结核分枝杆菌(TB)。首先，通过离心浓缩TB并且在高盐和PEG8000的存在下，来自这个步骤的沉淀物被捕获到珠子上。然后通过酸快速显微镜检查证实所述珠子上TB的存在。
方法
1.从痰中制备直接涂片并通过标准方法用金胺O进行染色。然后就荧光分枝杆菌的存在通过荧光显微镜检查研究载片。
2.向剩余的痰中加入等体积的1m NaOH，2%N-乙酰半胱氨酸并伴随偶尔的摇动混合20min。
3.然后以4,000x g将痰离心20min。
4.将沉淀物重悬于0.5ml100mM磷酸钠缓冲液pH7.5中并加入0.5ml1M NaCl，20%(w/v)PEG8000且混合，随后加入100μl B型珠子（如实施例1中所定义的）。
5.10min后，在磁体上收集珠子并重悬于50μl1M NaCl中。
6.将所述珠子分布到玻片上并使用标准方案通过用于酸快速分枝杆菌的金胺O对玻片进行染色。
结果
通过直接涂片为阳性的所有样品在离心和珠子结合后也是阳性的。此外，与直接涂片相比，每显微镜检查视野有更多的杆菌，这表明TB从样品中被浓缩了。
讨论
此实施例显示出从痰中对TB的两步浓缩。第一步涉及离心，其将TB浓缩为1ml体积。这一体积对于直接应用至显微镜载片而言太大了，因此通过珠子捕获将TB进一步浓缩至足够小以被应用至玻片用于显微镜检查的体积。
实施例6在不同的珠子涂覆和结合条件下从痰中浓缩结核分枝杆 菌。
原理
在此实施例中，为了在显微镜检查之前从痰中捕获和浓缩结核分枝杆菌(TB)研究了不同的珠子涂覆和结合条件。
方法
1.向涂片阳性痰中加入等体积的1M NaOH，2%N-乙酰半胱氨酸并孵育10min以稀释痰。
2.然后将0.5ml等份的痰：a)通过加入等体积的20%PEG8000和100μl涂覆了polybreen的BioMag Amine珠子(Bangs Laboratories，目录号BM546)直接处理，或b)通过离心、在1M Tris pH7中清洗沉淀物并重悬于1ml1M Tris pH7.0，1M NaCl，10%PEG8000中、加入100μl polybreen涂覆的珠子来进行处理。作为对照，用PEG8000处理0.5ml珠子，pDADMAC涂覆的珠子如实施例5中所述。
3.10min之后，在磁体上收集珠子并将其重悬于1ml10x PBS中。
4.再次在磁体上收集珠子并重悬于50μl5x PBS中，且分布到玻片上，并使用标准方案通过用于酸快速分枝杆菌的金胺O对玻片进行染色。
结果
所有的方法都显示出分枝杆菌的捕获。在PEG的存在下、在高pH时，利用经polybreen涂覆的珠子捕获的分枝杆菌数目与对照捕获几乎相等。在高盐的存在下、在中性pH，使用经polybreen涂覆的珠子捕获的分枝杆菌数目与对照捕获相比略有减少。
讨论
此实施例显示出经polybreen涂覆的珠子可用于从痰中捕获分枝杆菌。
实施例7捕获微生物的不可沉淀片段的证明
原理
在此实施例中，通过离心从经稀释的痰中去除完整的分枝杆菌。然后测试了上清液以显示出在PEG8000的存在下可通过珠子捕获和浓缩分枝杆菌的不可沉淀片段。
方法
1.通过加入等体积的0.5M NaOH，2%(w/v)N-乙酰半胱氨酸、根据标准的实验室程序将对于分枝杆菌为涂片-阳性和涂片-阴性的痰样品进行稀释。
2.使样品静置10min。
3.然后将1ml经稀释的痰在13,000x g下离心5min并去除上清液。
4.将0.7ml上清液加入0.7ml20%PEG8000，3M NaCl中并加入100μl未经涂覆的50微米碳化硅珠子的50%悬浮物，并混合。
5.当珠子通过重力沉降之后，通过重悬于1M Tris pH7.5中对其进行清洗并允许其再沉降一次。
6.最终在PBS中清洗珠子并且在沉降后去除上清液。
7.通过加入50μl裂解珠（来自Fischer Scientific的裂解基质B珠)并以2800rpm在Disruptor Genie(Scientific Industries)上破坏5min而从珠子上洗脱不可沉淀微生物片段。
8.通过商业上可得的微板LAM ELISA(Clearview，InvernesssMedical)直接分析100μl的每种洗脱物，其中所述微板LAM ELISA识别特异于分枝杆菌的抗原。
结果
所分析的样品              吸光度450nm*
显微镜检查阳性痰上清液    2.20
显微镜检查阴性痰上清液    0.00
*减去结合对照空白之后的读数
讨论
在10%PEG存在下的碳化硅珠子能够捕获和浓缩分枝杆菌的不可沉淀片段，其然后可被ELISA检测到。
实施例8使用不同的聚合物和由磁石构成的磁性珠子从痰中浓缩 结核分枝杆菌
原理
测试了不同结构的不同聚合物。包括了下列:平均分子量为10,000的聚乙烯吡咯烷酮；平均分子量为200的聚乙二醇;平均分子量为8000的聚乙二醇(均由Sigma Aldrich，USA提供)。
方法
1.每种所述不同的聚合物均是由含有1.5M NaCl和2%磁石珠子[直径<5μm(Sigma Aldrich USA，310069-500G，铁II,III氧化物粉末)]的15%溶液制成。
2.用等体积的0.5M NaOH将通过显微镜检查对于酸快速结核分枝杆菌为阳性的痰样品稀释10min，然后分成2ml的等份。
3.向这些等份中加入等体积的聚合物溶液，使其与经稀释的痰混合并静置2min。
4.然后在磁体上捕获珠子并去除液体。
5.在从磁体上去除后，通过重悬于10ml10mM NaOH中来清洗珠子。
6.在放回磁体上之后，去除10mM NaOH并通过将珠子重悬于100μl洗脱缓冲液中(100mM磷酸盐缓冲液pH7.0，0.5%N-月桂酰肌氨酸)而洗脱任何所捕获的TB。
7.在使用磁体去除了珠子之后，通过标准的酸快速显微镜检查来研究50μl上清液。
结果
在使用不同的聚合物溶液(见下表)从经稀释的痰中捕获了之后，估算了每显微镜检查视野的TB杆菌数目。虽然高分子量(约8000)的聚乙二醇显示作用最佳，较低分子量的聚乙二醇作用也良好。聚合物聚乙烯吡咯烷酮也作用良好。
聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量10,000) 23
聚乙二醇(平均分子量200) 22
聚乙二醇8000(平均分子量8000) 33
无聚合物对照 6
直接涂片(无浓缩) 8
结论
当与无聚合物对照及直接涂片(未浓缩的显微镜检查)相比较时，数种聚合物均能够从痰中浓缩TB。此实验显示出与磁石珠子相结合时，不同化学结构和不同分子量的不同聚合物对于从痰中浓缩TB都是有效的。
实施例9显示对杆菌可溶性片段的捕获
原理
我们之前证明了捕获完整的杆菌。在这个实验中，我们通过高速离心（已知的沉淀细菌的方法）从临床样品中去除了完整的细菌，然后使用聚乙二醇8000(PEG8000)和磁石珠子来从上清液中捕获可溶性片段。在从所述珠子上洗脱后，通过ELISA显示了这些可溶性细菌片段的存在。
方法
1.通过标准的酸-快速显微镜检查就分枝杆菌的存在研究了痰样品。选择了阳性和阴性痰并以标准方式以氢氧化钠进行处理以稀释所述痰。
2.然后将1ml的每种样品高速（13,000x g）离心10min，该速度超过了通常用于沉淀细菌的离心力4000x g。
3.取出上清液用于测试而将沉淀物也重悬于1ml PBS中用于进一步测试。
4.通过加入等体积的15%聚乙二醇8000，1.5M NaCl，2%磁石珠子来提取样品中的细菌和细菌片段。在混合和孵育2min之后，在磁体上收集珠子并去除上清液。
5.将珠子重悬于10mM NaOH中并在磁体上再次捕获。
6.去除10mM NaOH并将珠子重悬于100μl洗脱缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液pH7.0，0.5%N-月桂酰肌氨酸)中。
7.使用磁体去除珠子并通过标准ELISA程序就分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的存在测试100μl洗脱物。分枝杆菌细胞壁组分LAM的存在用作存在细菌细胞壁片段的标记物。
结果
如所预期的，从阴性痰中提取的不含有分枝杆菌的上清液和沉淀物没有给出ELISA信号。相反，在上清液和沉淀物二者中都有来自经提取的分枝杆菌-阳性痰的ELISA信号(见下表)。
所分析的样品 ELISA读数(OD450nm)
显微镜检查阳性痰上清液 2.05
显微镜检查阳性痰沉淀物 0.78
显微镜检查阴性痰上清液 0.00
显微镜检查阴性痰沉淀物 0.07
结论
PEG8000与磁石的组合能够从通过离心去除了其中的完整细菌的上清液中提取LAM ELISA信号。这证明了可使用PEG/磁石程序从样品中提取细菌细胞壁片段。有趣的是，使用阳性痰样品时，来自上清液的信号高于来自沉淀物的信号，这表示痰中一大部分可提取的分枝杆菌组分是可溶形式的。
实施例10研究掺入尿中的可溶性细菌组分的提取
原理
在此实施例中，我们希望显示出PEG8000与磁石的组合能够被用于从尿中提取可溶性分枝杆菌组分，如通过抗-脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)ELISA所测量的。
方法
1.以13,000x g将1ml分枝杆菌卡介苗(BCG)的培养物离心5min并将50μl上清液掺入2ml尿中。
2.通过加入等体积的15%聚乙二醇8000，1.5M NaCl，2%磁石珠子提取经掺入的尿和未经掺入的对照尿。在混合及孵育2min后，在磁体上收集珠子并去除上清液。
3.将珠子重悬于10mM NaOH中并在磁体上再次捕获。
4.去除10mM NaOH并将珠子重悬于100μl洗脱缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液pH7.0，0.5%N-月桂酰肌氨酸)中。
5.使用磁体去除珠子并通过标准ELISA程序就LAM的存在测试100μl洗脱物。分枝杆菌细胞壁组分LAM的存在用作存在细菌细胞壁片段的标记物。
结果
所分析的样品 ELISA读数(OD450)
加入尿中的BCG培养物上清液 1.03
尿对照 0.00
结论
PEG8000与磁石珠子的组合能够提取被掺入尿中的可溶性BCG组分。
实施例11证明病毒的捕获
原理
PEG/磁石提取系统可提取细菌，真菌和可溶性细菌组分。在这个实验中，我们显示了其也可提取病毒。
方法
1.在250μl H2O中稀释不同量的腺病毒。
2.加入等体积的30%PEG8000，3M NaCl，4%磁石并混合。
3.10min后，使用磁体，用0.5ml7.5%PEG8000，0.5M NaCl将磁石珠子清洗两次。
4.最后，将所述珠子重悬于20μl PBS0.1%Triton X-100中以洗脱被捕获的病毒。
5.在使用磁体去除了珠子之后，使用下列引物通过PCR分析2μl的洗脱物:AdF，5’GGA CGC CTC GGA GTA CCT GAG3’；和AdR，5’ACC GTG GGG TTT CTA AAC TTG TT3’
结果
下表中显示了每个反应成为阳性的PCR循环(ct值)。
所添加的腺病毒的量(ng/ml) PCR Ct
300 23
30 26
3 28
0.3 无Ct
0 无Ct
可检测到3ng/ml的腺病毒，其等于所测试的样品体积中的0.75ng。
结论
通过PEG8000和磁石的组合从溶液中捕获了腺病毒，在洗脱和通过PCR进行检测之前，经过两次清洗而被保留在珠子上。
为了给从可能包括严苛pH条件或盐浓度的大的样品体积中浓缩最广泛的微生物及其片段、包括革兰氏阳性和阴性细菌、分枝杆菌以及真菌的通用方法的问题提供解决方案，我们开发了改善的方法，其涉及使用聚乙二醇和类似的物质来使微生物或片段沉积在捕获基质的表面上。使用聚乙二醇去除了对于捕获基质表面的性质的依赖性并且我们显示了可使用许多不同表面性质的许多不同的捕获基质来捕获一系列的微生物和真菌。
我们的观察是，在水溶性聚合物、例如聚乙二醇(PEG)的存在下，所测试的所有细菌和真菌、包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都能够结合至表面、例如带电的顺磁珠子。可使用许多不同大小的聚乙二醇。此外，可使用许多不同类型的珠子，包括经羧基，胺，pDADMAC或硫酸葡聚糖涂覆的那些，或者可不涂覆而直接使用所述珠子。所述珠子可以是顺磁的，铁磁的(包括亚铁磁性的)，或者是简单的碳化硅或氧化铝，但是对于大部分杆菌和真菌而言特别有用的实施方案是使用具有羧基表面的顺磁珠子，或未涂覆的碳化硅珠子，或未涂覆的磁石珠子。
如果使用顺磁或铁磁的珠子表面，可如下浓缩所述微生物：使用磁体从悬浮物中去除珠子，然后洗脱到含有减少的、或没有聚乙二醇含量的小体积缓冲液中。类似地，如果使用在重力下沉降的碳化硅珠子，可在珠子沉降后，将微生物浓缩并洗脱到含有减少的、或没有聚乙二醇含量的小体积缓冲液中。
在本说明书中，除非明确地另有所指，用语“或”在运算符的意义上使用，其在当满足所述条件之一或二者时返回真实值，这与运算符“互斥或”不同，后者要求仅满足条件之一。用语“包含”是在“包括”的意义上使用而不是指“由…组成”。所有上文认可的教导均在此通过引用而并入。对于本文中对任何之前所发表的文献的认可都不应被认为是承认或代表在其日期之时其教导在澳大利亚或别处是普通的一般性知识。

Claims (20)

1.将水性液体中存在的微生物和/或微生物片段捕获到固体表面上的方法，所述方法包括在固体表面的存在下向所述液体中加入足量的水溶性聚合物以将所述微生物和/或片段从所述液体中转移至所述固体表面。
2.权利要求1的方法，其中所述水性液体中添加的水溶性聚合物的浓度为2%至40%w/v。
3.权利要求2的方法，其中所述浓度为5-15%w/v。
4.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物为非离子亲水性聚合物。
5.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物为右旋糖苷，PVP或PEG。
6.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物具有1,000至20,000的分子量。
7.权利要求6的方法，其中所述水溶性聚合物具有5,000至13,000的分子量。
8.任意前述权利要求中的方法，其中通过加入水溶性无机盐将所述水性液体的离子强度提高至150mM至6M。
9.任意前述权利要求中的方法，其中所述盐的浓度为0.25至2.5M。
10.任意前述权利要求中的方法，其中所述固体表面是由珠子提供的。
11.权利要求10的方法，其中所述珠子为顺磁的，铁磁的或具有使得它们在静置时分离的密度。
12.权利要求11的方法，其中所述珠子为磁石的。
13.权利要求11的方法，其中所述珠子为碳化硅的。
14.任意前述权利要求中的方法，其中所述固体表面由具有带正电或带负电的表面基团的聚合物构成。
15.权利要求14的方法，其中所述表面基团为胺，季铵，羧酸，磺酸或硫酸盐基团。
16.任意前述权利要求中的方法，还包括从所述液体中分离所述固体表面。
17.权利要求16的方法，其还包括在将所述固体表面从所述液体中分离后，从所述固体表面上洗脱所述微生物和/或片段。
18.权利要求17的方法，其中将所述微生物和/或片段从所述固体表面上洗脱到一定体积的液体中，所述体积为至少两倍少于所述微生物和/或片段原始在其中悬浮的液体的体积。
19.任意前述权利要求中的方法，其还包括检测被捕获到所述固体表面上的微生物和/或片段。
20.权利要求19的方法，其还包括鉴定被捕获到所述固体表面上的微生物和/或片段。
CN201180041506.1A 2010-07-02 2011-06-29 微生物的捕获 Active CN103189747B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1011152.4 2010-07-02
GBGB1011152.4A GB201011152D0 (en) 2010-07-02 2010-07-02 Capture of micro-organisms
PCT/GB2011/051225 WO2012001407A1 (en) 2010-07-02 2011-06-29 Capture of micro-organisms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103189747A true CN103189747A (zh) 2013-07-03
CN103189747B CN103189747B (zh) 2015-03-11

Family

ID=42669090

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180041506.1A Active CN103189747B (zh) 2010-07-02 2011-06-29 微生物的捕获

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8603771B2 (zh)
EP (1) EP2588863B1 (zh)
CN (1) CN103189747B (zh)
AU (1) AU2011273142B2 (zh)
CA (1) CA2806468C (zh)
GB (1) GB201011152D0 (zh)
RU (1) RU2573921C2 (zh)
WO (1) WO2012001407A1 (zh)
ZA (1) ZA201300826B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111961706A (zh) * 2020-08-13 2020-11-20 恺硕生物科技(厦门)有限公司 一种核酸提取纯化方法
CN112574885A (zh) * 2019-09-29 2021-03-30 广东体必康生物科技有限公司 一种基于磁珠富集痰液样本的结核分枝杆菌检测方法及其专用试剂盒
CN112630245A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种利用碳毡捕获沉积物中长线状微生物及成像的方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016018474A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-adherent composition
MX2017000814A (es) 2014-07-31 2017-05-04 Kimberly Clark Co Composicion antiadherente a base de alcohol.
GB2544218B (en) 2014-07-31 2021-06-23 Kimberly Clark Co Anti-adherent composition
US11737458B2 (en) 2015-04-01 2023-08-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Fibrous substrate for capture of gram negative bacteria
EP3347485B1 (en) * 2015-09-11 2021-11-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
US12037497B2 (en) 2016-01-28 2024-07-16 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-adherent composition against DNA viruses and method of inhibiting the adherence of DNA viruses to a surface
AU2016408394B2 (en) 2016-05-26 2021-11-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Anti-adherent compositions and methods of inhibiting the adherence of microbes to a surface
US20220064695A1 (en) * 2018-03-11 2022-03-03 Bacteria Detection Ltd Methods for isolating microbial cells from a blood sample
WO2022159783A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-28 Drizzle Health Llc Apparatus and methods for selective capture of mycobacteria

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995032304A1 (en) * 1994-05-23 1995-11-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the rapid separation and identification of microbial contaminants from a complex matrix
CN1395620A (zh) * 2000-01-21 2003-02-05 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
WO2008072242A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions and methods for concentrating and depleting microorganisms
WO2009086343A2 (en) * 2007-12-31 2009-07-09 3M Innovative Properties Company Microorganism-capturing compositions and methods
CN101573621A (zh) * 2006-11-29 2009-11-04 米克罗森斯医疗技术有限公司 分枝杆菌样微生物的捕获
CN101760428A (zh) * 2009-12-30 2010-06-30 复旦大学 用于富集空气中微生物的微流控芯片及其制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523231A (en) * 1990-02-13 1996-06-04 Amersham International Plc Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules
GB9709728D0 (en) * 1997-05-13 1997-07-02 Dynal As Single step method
JP4260309B2 (ja) 1999-10-20 2009-04-30 日水製薬株式会社 抗酸菌菌体濃縮試薬、キット及び抗酸菌菌体濃縮方法
EP1540018B1 (en) 2002-04-12 2010-05-26 Colorado School Of Mines Method for detecting low concentrations of a target bacterium that uses phages to infect target bacterial cells
GB0525231D0 (en) * 2005-12-12 2006-01-18 Genpoint As Method
EP2092336B1 (en) * 2006-11-29 2012-08-29 Microsens Medtech Ltd Capture of mycobacteria like micro-organisms
EP2426194B1 (en) 2007-10-03 2014-07-09 3M Innovative Properties Company Microorganism concentration process and agent
GB201004709D0 (en) 2010-03-22 2010-05-05 Microsens Medtech Ltd Capture of mycobacteria
GB201004710D0 (en) 2010-03-22 2010-05-05 Microsens Medtech Ltd Detection of mycobacteria

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995032304A1 (en) * 1994-05-23 1995-11-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the rapid separation and identification of microbial contaminants from a complex matrix
CN1395620A (zh) * 2000-01-21 2003-02-05 简珀恩特联合股份有限公司 细胞分离方法
CN101573621A (zh) * 2006-11-29 2009-11-04 米克罗森斯医疗技术有限公司 分枝杆菌样微生物的捕获
WO2008072242A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions and methods for concentrating and depleting microorganisms
WO2009086343A2 (en) * 2007-12-31 2009-07-09 3M Innovative Properties Company Microorganism-capturing compositions and methods
CN101760428A (zh) * 2009-12-30 2010-06-30 复旦大学 用于富集空气中微生物的微流控芯片及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONALD L.ESHENBAUGH E AL: "Rapid Sedimentation of Escherichia coli in the Presence of Polyethylene Glycol at 1g", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
姜世英等: "底泥中芘高效降解菌株的富集分离及特性研究", 《生物技术通报-增刊》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112574885A (zh) * 2019-09-29 2021-03-30 广东体必康生物科技有限公司 一种基于磁珠富集痰液样本的结核分枝杆菌检测方法及其专用试剂盒
CN111961706A (zh) * 2020-08-13 2020-11-20 恺硕生物科技(厦门)有限公司 一种核酸提取纯化方法
CN112630245A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种利用碳毡捕获沉积物中长线状微生物及成像的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20130171689A1 (en) 2013-07-04
EP2588863B1 (en) 2017-07-19
EP2588863A1 (en) 2013-05-08
AU2011273142A1 (en) 2013-02-21
WO2012001407A1 (en) 2012-01-05
US8603771B2 (en) 2013-12-10
CN103189747B (zh) 2015-03-11
AU2011273142B2 (en) 2015-09-17
ZA201300826B (en) 2014-04-30
CA2806468C (en) 2018-12-04
GB201011152D0 (en) 2010-08-18
RU2573921C2 (ru) 2016-01-27
RU2013104370A (ru) 2014-08-10
CA2806468A1 (en) 2012-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103189747B (zh) 微生物的捕获
Stevens et al. Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review
US9645057B2 (en) Method for improving analysis of microorganisms in complex matrices
JPH0767693A (ja) 生物体の検出方法
WO2009086343A2 (en) Microorganism-capturing compositions and methods
WO2016024263A1 (en) Methods for isolating microbial dna from a blood sample
US9766237B2 (en) Method of capturing bacteria on polylysine-coated microspheres
US20160122797A1 (en) Magnetic separation process using carboxyl-functionalized superparamagnetic nanoclusters
WO2012095369A1 (en) Methods of capturing bindable targets from liquids
EP3347485A1 (en) Methods for isolating microbial cells from a blood sample
JP5543694B2 (ja) 生体関連物質の分離回収方法
Singh et al. Mycobacteriophage lysin-mediated capture of cells for the PCR detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
Rossmanith et al. Sample preparation for the detection of foodborne pathogens by molecular biological methods
Kretzer et al. Sample preparation–an essential prerequisite for high-quality bacteria detection
JPWO2020085420A1 (ja) 集菌方法
US20200101470A1 (en) Magnetic bar capture device
US20230366878A1 (en) Methods of isolating and detecting viruses from liquid with possibility of containing viruses
Porter et al. Magnetic particle-based separation techniques for monitoring bacteria from natural environments
AT501194A1 (de) Verfahren zur isolierung von zellen und viren
WO2011117202A1 (en) Capture of mycobacteria
JP2013226149A (ja) 生体関連物質の分離回収方法
PATEL A review of analytical separation, concentration and segregation techniques in microbiology
WO2018062573A1 (ja) 細胞の回収方法
CA2905651C (en) A method for improving analysis of microorganisms in complex matrices
Wellington et al. Indirect approaches based on cell extraction and culturing

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: MICK ROOSENS DIAGNOSIS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: MICROSENS MEDTECH LTD.

Effective date: 20140320

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140320

Address after: London, England

Applicant after: MICROSENS MEDTECH LTD.

Address before: London, England

Applicant before: Microsens Medtech Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant