CN1395620A - 细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从样品中分离细胞的方法，该方法包括将所述细胞与固相载体通过固定在所述固相载体上的非特异性配体进行结合，具体是一种从样品中分离微生物的方法。优选用于该方法的配体包括糖类及其衍生物。还描述了用于从样品中分离微生物的试剂盒，含有：(a)一种固相载体，在其上面固定化一种配体，该配体能与微生物非特异性结合；(b)将所述微生物与所述固相载体结合的装置；可任选的(c)裂解所述细胞的装置；和可任选的(d)结合将从所述裂解细胞中释放的核酸与固相载体结合的装置。

Description

细胞分离方法
发明领域
本发明涉及一种分离存在于样品中的微生物的方法，特别是一种分离存在于样品中的细菌的方法。
发明背景
大部分旨在定性和定量分析样品中微生物存在的现有技术针对鉴定一种特定的微生物，例如病原体。对用免疫磁性法从食物和临床样品中分离利斯特氏菌和沙门氏菌已有描述(见例如Skjerve等，Appl.Environ.Microbiol.1990，3478-3481)。这些技术依赖于配体的使用，通常是抗体，对所关心的微生物具有特异性。由于它依赖于使用特异性配体，免疫磁性分离法仅能用于要寻找特定的微生物，而不能用于需要通用筛选可能存在的微生物的情况。免疫磁性分离不容易检出未知的微生物。
在一些情况下，例如当分析环境样品，例如水样时，需要获得所存在的不同种类微生物的总体情况，或估测微生物的总浓度。对于供水中可能存在的细菌总量可设定限制，这不需要于对特定微生物存在的关注。鉴定广泛种类的微生物，例如在河或湖中，可提供关于该水体的状态、营养物水平、农用化学物质的排放等的有用信息。
如果可提供一种从样品中分离微生物的通用方法，就可以在一个后续步骤中方便地鉴定特定微生物。基于核酸的测试可方便地用来鉴定特定微生物。
目前用于获得对存在于样品中的微生物总量的估计，或从样品中分离微生物用于进一步分析的方法依赖于粗分离技术，涉及过滤和/或浓缩，并在琼脂平板上培养。确定总细菌浓度可用流式细胞计数或过滤并在培养皿的通用培养基上培养。这些方法可需数天，而且复杂而不精确。用于分析食物样品的常规方法已观察到特定的问题，因为这些含有大量固态物质(碎屑和脂肪颗粒)，它们将堵塞滤器，随后的浓缩产生细菌堆积的团块，不能裂解或与抗体结合。
因此需要一种能从一种样品中分离许多不同种类的微生物，优选是一个步骤的方法，它快速并便于进行。
发明简述
本发明针对这些要求，因此根据本发明的一个方面提供了一种从样品中分离微生物的方法，该方法包括将所述微生物与固相载体通过固定在所述固相载体上的非特异性配体结合。
本发明因此通过利用与固相载体结合的非特异性配体与微生物表面发现的所述配体的结合配对(受体)之间的相互作用，提供了一种通用的分离方法，它能捕获广泛种类的微生物。由于本发明的主旨是固定化配体和微生物之间的相互作用，当本文提到“分离微生物”时是指描述以非种和非属特异性方式分离微生物。换言之，固定化的配体能与几个属的微生物结合，至少2个不同属，优选3或以上，更优选至少5或7个不同属，最优选至少10或甚至14个或以上不同属。
本发明因此提供了一种从样品中的其它成分中分离微生物，尤其是细菌的通用方法。该方法的“通用”在于不针对一种细菌而是实现一个总体的分离系统来获得对于所有微生物群的信息，或进行第二步，例如用种特异性探针在核酸水平上获得种特异性信息。
“分离”微生物，因为它们与固相载体结合，然后可通过取出与其结合的固相载体，或通过除去，例如排出样品的剩余物，从样品的剩余物质中分离。在固态载体是磁性的情况下，操作载体/微生物复合物是尤其方便的。
本发明的方法可用于分离各种各样的微生物，包括所有可与真核细胞结合的微生物，包括原生生物、藻类、原生动物和真菌，以及支原体和所有病菌和病毒。本发明的方法可用于分离真核寄生虫，特别是那些能与在人细胞(或其它宿主生物)上发现的复杂多糖相结合。这些真核寄生虫包括隐孢子虫、痢疾内变形虫(Enamoeba histolytica)和疟原虫。因此，本文所用的“微生物”应包括这些寄生虫。
本发明的方法特别适用于分离细菌。细菌分类是一种复杂和时常变化的科学，但“真实的”细菌(真细菌)可分成许多，门(Bergey的Manual of DeterminativeBiology)，例如光能利用菌、滑行细菌、有鞘细菌和革兰氏阳性菌。各门还可分为一个或多个目，在目中有科和属。来自一个以上的属、科或目或甚至门的细菌可用本发明的方法分离。可用本发明的方法实现对样品中来自下列一些或所有科和属的细菌的有效分离：气单胞菌、杆菌、弯曲杆菌、柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、肠杆菌、埃希氏杆菌(病原性或非病原性)、哈夫尼菌、克雷伯氏菌、利斯特氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、希瓦氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、弧菌、耶尔森氏菌、摩根氏菌、发光杆菌、链球菌。乳球菌、葡萄球菌、肠球菌、明串珠菌、片球菌、乳杆菌、索丝菌。
方法可用于同时分离细菌和其它类型的微生物，例如藻类、原生动物、真菌或病毒。
在某些情况下，样品中可能仅含有数量有限的细菌种类，该方法可仅有几种细菌或甚至仅有一或两种，通过结合并从样品中分离出来。这样的方法仍然不是特异性分离方法，因为固定化的配体能与各种各样的细菌结合，即使可得到的细菌群非常有限。
事实上不需要为了进行特定的分离方法选择固相载体特异性-配体复合物，这提供了灵活性和成本上的显著优点，因为可在各种各样的分离方法中使用结合有配体的一种固相载体。因此固相载体的普遍结合能力是特别有利的。
优选本发明的方法将得到存在于要分离的样品中的很大部分的微生物(例如细菌)，不仅在于存在的所有细菌的比例，还在于细菌种类的比例。因此，优选至少30％，更优选至少50％，最优选至少70％或80％样品中的微生物将与固相载体结合。当然，样品中的微生物百分数将由加到样品中的固相载体量和配体对微生物的比例决定。针对上述百分数的假定是在混合物中存在过量的固相载体和配体。
从另一方面看，优选将分离至少20％存在的不同(例如细菌)物种，更优选至少30-40％的样品，最优选至少50％，特别是至少60或70％或甚至至少80％存在的不同(例如细菌)物种将与固相载体结合。
“非特异性”配体将是如上所述的能与一种以上微生物和/或细菌属，优选大于2或3，更优选大于5或7，甚至多于10或14个不同属结合。在配体及其负责结合的微生物表面上的结合配对之间有相互作用，并不是简单的细胞和固相载体之间的一般吸引或结合，例如当细胞通过沉淀结合的情况。配体的非特异性特征不是指它是不可分辨的与微生物表面上的分子结合或联系，而是其结合配对对于某一类或一种微生物不是特异性的。因此配体可视为普遍结合配体。
由于合适的结合配对可在不同的微生物，具体是细菌的不同属中相对广泛的找到，提供了一种普遍而非特异性的分离方法。因此虽然配体具有一种或多种特异性结合配对，但它由于能与各种全部携带合适的结合配对的细菌结合仍是“非特异性”的。虽然不希望被理论所限，似乎各种不同的结合配对本身通常是物种特异性的，但能够与相同配体结合，从而提供了不是物种特异性的分离方法。物种特异性的植物凝血素与基于糖的配体能提供一种非物种特异性的分离系统。
结合配对通常是微生物表面的蛋白质，在物种和物种之间可能是不同的。关于结合配对知道的不多，但发明人却已能鉴定出合适的配体，用于本发明的方法。
配体是非蛋白质的，这样可排除抗体及其衍生物和片段。与本发明的非特异性配体相反，这些蛋白配体可以与细胞表面的蛋白质非常特异性地(即属，特别是物种特异性)相互作用。
优选的配体是糖类，包括单糖、寡糖(包括二糖和三糖)和多糖。合适的单糖包括己糖和戊糖，其形式是吡喃糖和呋喃糖形式(如果合适)，以及糖类衍生物例如醛糖糖酸和糖醛酸、脱氧或氨基糖、磺化的糖和糖醇。合适的单糖的例子是甘露糖(例如D-甘露糖)、葡萄糖(例如D-葡萄糖)、果糖、岩藻糖(例如L-岩藻糖)、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甲基D-甘露吡喃糖苷(甘露糖苷)、α-甲基-葡糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖质酸盐、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、甘油和这些单体的衍生物。其中甘露糖、半乳糖和果糖是优选的。
特别优选的是寡糖和多糖，它们是单糖单体的聚合物，例如由上述单糖单体组成的聚合物。
寡糖中含有2-12，优选4-8个共价连接的单糖单元，它们可以是相同或不同的，并且可以是线性或分枝的，优选分枝的，例如具有2-6个单元的寡甘露糖酰基，麦芽糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖和水杨苷，尤其是麦芽糖。产生寡糖的方法在Pan等，Infection and Immunity(1997)，4199-4206中有描述。
多糖中含有13个或更多共价连接的单糖单元，它们可以是相同或不同的，可以是线性或分枝的，优选分枝的。合适的多糖将富含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖或糖醛酸，例如半乳糖甘露糖多糖(本文中称为GUM或GUM1)(Sigma G-0753)，据信它们是甘露糖的直链聚合物，在每隔四个甘露糖上有一个半乳糖苷分枝。由甘露糖和半乳糖苷亚基组成的多糖是优选的配体类型，另一个例子是瓜耳胶，它具有β-1，4连接的线性甘露糖骨架链，在约每隔1个单元上有1，6-α连接的半乳糖苷侧链。甘露糖与半乳糖的比例是约1.8∶1-约2∶1；在本文所述的实验中使用的瓜耳胶来自Sigma，目录参考号G1429。
其它多糖包括据信是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸的分枝聚合物的Gum Arabic(Sigma G9752)和据信是半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙酰化的聚合物的卡拉胶(Sigma G 0503)，以及由甘露糖单元组成的同多糖甘露聚糖。
合适的配体糖衍生物包括肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖和角叉菜胶(各种形式)。硫酸化的糖是优选类型的糖衍生物。
发明人发现了基于作为微生物营养物，例如糖类的分子的配体提供了合适分离方法。本方法的一个目标是提供一种分离系统，它利用受体/配体相互作用，利用细菌对于介质中营养物存在的激活前反应，来增强对微生物的捕获。也可用作本发明方法的非特异性配体的其它微生物的营养物包括维生素，例如烟酸、维生素B、硫胺素、吡哆醇、泛酸、叶酸、生物素和钴胺素，以及铁螯合分子/化合物，例如高铁红血素、乳铁蛋白、转铁蛋白、血红蛋白和含铁基团，例如产气菌素(aerobactin)、铁色素(Sigma F8014)、铁肠螯合素(ferrienterochelin)、肠菌素和ferrixanine。
在其上固定有能与细胞(例如微生物)以非特异性方式结合的配体的固相载体。“非特异性的”如上定义(即不是细胞类型或物种特异性，但仍然依靠与结合配对的相互作用)，本文根据方法描述了合适的配体。
在本文中在调查霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的海藻糖敏感性和甘露糖敏感性的凝血作用中，L-海藻糖和D-甘露糖与琼脂糖珠(Sanchez等，APMIS(1990)98353-357)共价结合，因此这些固相载体-配体复合物不包括在本发明的范围内。该先前的工作是调查与仅一种细菌有关的非常特异性的相互作用，不是通用的细菌分离方法。因此在本文的方法中使用这些珠-配体复合物是本发明的一个方面。
固定化的配体优选是寡糖或多糖、维生素(例如微生物营养物必需的)或铁螯合化合物，多糖是特别优选的。特别优选的配体的例子先前在与方法有关的讨论中有所描述。
虽然本文中提供了一种通用的分离方法，发明人已发现掺入一些糖的配体特别适用于分离一些非常广泛的微生物类型。因此例如，当使用含有甘露糖的配体时，能非常有效的分离存在于肠道中的微生物菌种(配体可以是甘露糖单体或掺入甘露糖的聚合物)，通过肺进入的细菌能用硫酸化的糖作为配体非常有效的分离，感染尿道的细菌与固定化的葡萄糖(再次，作为单体或掺入聚合物)结合。在从取自肠或肺的样品分离细菌的方法中使用这些配体因此构成了本发明的另一个优选方面。
可从中分离微生物的样品包括环境学样品，例如水样，例如来自湖、河、污水处理站和其它水处理中心的或土壤样品。方法特别适用于分析食物样品，一般在健康和卫生应用中，其中它用于在食品制备的地方监测细菌水平。可分析例如乳制品中的利斯特氏菌。用固定化抗体分离细菌的常规技术已被证明比我们的用非特异性配体分离利斯特氏菌的效果差，可能是由于固定化抗体的疏水性质。当样品是水样时，配体优选是感兴趣的微生物的营养物。
可通过首先如需要(如果是固体样品)匀浆，然后与合适的培养培养基(例如蛋白胨水)在37℃培养过夜分析食物样品。可用该方法分析奶酪、冰淇淋、鸡蛋、人造黄油、鱼、虾、鸡肉、牛肉、猪肋排、小麦面粉、麦片、米饭、辣椒、植物如西红柿、硬花甘蓝、菜豆、花生等和杏仁软糖等食品。本发明的方法对于分析食品样品提供了特别的益处，因为这些含有大量固态物质(碎屑和脂肪颗粒)，它们会堵塞滤器，随后的浓缩将产生沉淀，其中的细菌堆积，不能裂解或与抗体结合。
可根据本发明分离出微生物的样品可以是来自人或动物体的临床样品。合适的样品包括全血和衍生自血液产品、尿、粪便、脑脊液或任何其它体液，以及组织样品和从例如拭刮腔体获得的样品。
样品还可以包括较纯或特别纯化的起始物质，例如从其它细胞分离过程获得的半纯化的制备物。
还已经发现本发明的固相载体和方法可用于从样品非选择性分离真核细胞。方法的“非选择性”在于分离不针对一种细胞类型。根据这些方法可分离至少2种，优选3或多种，4或多种，甚至6或多种不同的真核细胞类型。
因此在另一个方面，本发明提供了一种从样品分离真核细胞的方法，该方法包括使所述真核细胞通过固定在所述固相载体上的非特异性配体与固相载体结合。合适的可分离的真核细胞是在其表面具有植物凝血素，与多糖结合的那些细胞。当用于从血液或血液衍生的样品，从骨髓或事实上含有白血细胞的任何组织或体液捕获所有类型的白血细胞时，这些方法可以具有特别的实用性。为了该应用，特别适合的配体包括角叉菜胶及其衍生物、硫酸化的多糖(糖胺聚糖)例如硫酸葡聚糖、肝素和硫酸肝素。
根据本发明的方法，至少B-细胞和单核细胞，优选大部分(如果不是所有的)类型的白血细胞可通过相同的珠分离。红血细胞优选不被捕获。该方法通常是从样品分离DNA的预备步骤。根据现有技术的方法，从血液中分离DNA是通过直接裂解样品和捕获DNA实现的。这种技术将裂解存在的全部细胞，而根据本发明的方法，白细胞的结合使得感兴趣的细胞被初步浓缩。基于抗体的分离系统不能普遍的捕获白血细胞。以类似方式，其它类型的细胞可从真核样品中分离。
本发明因此提供了细胞分离方法，其中“细胞”可以是真核或原核的，术语“细胞”包括所有之前限定的微生物。
用于本发明的合适固相载体可以是任何熟知的载体或基质，它们目前被广泛使用或用于固定化、分离等。这些可以采用颗粒、片层、凝胶、滤膜、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、平板或孔等形式。
载体可方便的地使用玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制造。优选是提供细胞，然后是核酸结合的高表面积的材料。这些载体通常具有不规则的表面，可以是例如多孔或颗粒状的，例如颗粒、纤维、网、烧结体或筛。颗粒材料例如珠是通常优选的，因为其较大的结合能力，特别是聚合物的珠。
为了方便，本发明所用的颗粒状固相载体是球状珠。珠的大小不是关键的，但它们可以是例如直径至少是1，优选至少2微米数量级的，具有最大直径优选不超过10和更优选不超过6微米。例如，2.8微米和4.5微米直径的珠已显示起到良好的作用。
适用于本发明的方法的非磁性聚合物珠购自Dyno ParticlesAS(lillestrom，Norway)以及来自Qiagen、Pharmacia和Serotec。
然而，为了帮助操作和分离，磁珠是优选的。本文所用的术语“磁珠”意味着当置于磁场中时，载体能具有磁矩，因此能在该场的作用下去除。换言之，作为磁性颗粒的载体不难通过磁力聚集取出，提供了一种在细胞和核酸结合步骤后快速、简单和有效的分离颗粒的方法，而且比常规技术例如离心等方法温和的多，后者产生剪切力，可破坏细胞或降解核酸。
因此用本发明的方法，结合有细胞的磁性颗粒可通过施加磁场(例如用永磁铁)移动到合适的表面上。通常在含有样品混合物的一侧施加磁性足够使颗粒聚集在容器壁上，倒掉样品的剩余物。
尤其优选的是超顺磁性颗粒，例如那些Sintef在EP-A-106873中描述的，因为在反应过程中可避免磁力聚集和颗粒聚丛，从而确保均匀和核酸抽提。熟知的Dynal AS(Oslo，Norway)出售的磁性颗粒，称为DYNABEADS适用于本发明。
用于本发明的官能化包裹的颗粒可通过根据美国专利4,336,173、4,459,378和4,654,267修饰制备。因此，可制备具有不同类型的官能化表面，例如带正电或负电，亲水或疏水的珠或其它载体。
颗粒优选提供结合的大表面积，因此可以是小而不光滑的。固相载体的表面优选(在配体固定化之前或之后)不是疏水的。
在本发明的方法中用作固相载体的特别优选的颗粒是球形聚合物颗粒(珠)，基于PVA(聚乙烯醇)，其中包裹了磁性胶体。这些珠可通过将含有磁性胶体的聚合物相悬浮在含有乳化剂的植物油相中制备，如CA 2,227,608所述。尺寸可在1-8微米之间变化的颗粒优选购自Chemagen AG，Germany。
可用合适的缓冲液等作为分离的介质，来获得适合结合的条件。为了方便，可在样品中在与固相载体接触前，同时或后加入具有合适的电荷、渗透压等的缓冲液。PBS是合适的细胞结合缓冲液。
配体与固相载体结合的方法是本领域熟知的。通常固相载体首先被活化，然后与配体反应，配体本身可稍微修饰，用于与固相载体共价结合。就上述Chemagen的超顺磁性珠而言，可通过8原子间隔臂引入异氰酸酯官能团，活化聚乙烯醇基质。这些活化的珠(M-PVA A k2x)然后可用于直接偶联含有氨基或羟基官能团的分子。典型的偶联反应如下：
    珠-NCO  +   R- OH    →    
    活化的珠   具有羟基的糖类    糖类的氨基甲酸酯
Chemagen拥有关于通过偶联修饰其珠的专利。
为了调查细胞的结合和需要特定微生物的定性或定量信息的情况下，可进行另一个鉴定步骤。如上所述的通用细胞分离法与物种特异性检测法的联合代表了一种特别优选的本发明的实施例。
可通过分析微生物的核酸或用其它本领域已知的其它技术，例如用对于一些类型的微生物特异性的标记的抗体，调查结合的微生物的身份。为了方便，细胞与固相载体结合后，可通过PCR等分离和分析微生物-珠复合物的核酸。因此，在微生物与所述固相载体结合后，将有一个细胞裂解步骤，从微生物中释放出核酸，然后分析。可在溶液中分析释放的核酸，但在它与固相载体结合后更便于分析，该固相载体可以是相同或不同的，但优选与微生物本身结合的固相载体相同。因此，在另一个方面，本发明提供了一种分析含微生物的样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述微生物通过固定在所述固相载体上的非特异性配体与固相载体结合；和
(b)鉴定与所述固相载体结合的微生物。
用
(c)裂解微生物；和可任选的
(d)使所述裂解的微生物释放的核酸与固相载体结合
方便的进行步骤(b)。
从另一方面看，本发明提供了一种检测样品中一种细胞类型或微生物的方法，所述方法包括上述步骤(a)和(b)。
裂解微生物，结合因此释放的核酸和分析核酸的合适方法在WO98/51693中提供，在此引入以供参考。因此本发明的另一个方面是一种从细胞样品分离核酸的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品中的细胞与固相载体通过固定在所述固相载体上的非特异性配体结合；
(b)裂解结合的细胞；和
(c)使从所述裂解的细胞释放的核酸与固相载体结合。
本发明的另一个方面是一种检测样品中靶细胞存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品中的细胞通过固定在所述固相载体上的非特异性配体与固相载体结合；
(b)裂解结合的细胞；
(c)使所述裂解的细胞释放的核酸与固相载体结合；和
(d)在所述结合的核酸中检测所述靶细胞的特征性核酸的存在与否。优选细胞、配体和固相载体如上所述。
核酸可以是DNA、RNA或任何天然存在或其合成的修饰物，及其组合。然而优选核酸是DNA，它可以是单链或双链或任何其它形式，例如线性或环形的。
结合后，裂解分离的或载体结合的微生物，释放其核酸。细胞裂解的方法是本领域熟知的，并且在文献中广泛描述，可使用任何已知的方法。不同的方法可对于不同的微生物更适用，但是可使用任何下列的方法：用SDS、LiDS或十二烷基肌氨酸钠在合适的缓冲液中去污剂裂解；用扰动试剂，例如盐酸胍(GHCl)、硫氰酸胍GTC)、碘化钠(NaI)、过氯酸盐等；机械破坏，例如用弗式压碎器、超声、用玻璃珠、氧化铝或在液氮中研磨；酶裂解，例如用溶菌酶、蛋白酶、链霉蛋白酶或纤维素酶或任何其它市售的裂解酶；用噬菌体或病毒感染裂解细胞；冻干；渗透压休克；微波处理；温度处理；如用热或煮沸，或在干冰中或液氮中冷冻等，和融化；碱裂解。如上所述，所有这些方法是标准裂解技术和本领域熟知的，可使用任何这些方法和方法的组合。
为了方便，可根据本发明通过使用扰动试剂和/或去污剂实现裂解。例如，在细菌细胞中，发现用去污剂和扰动试剂的组合特别有效。因此示范性合适的裂解剂包括GTC或GHCl等扰动试剂和SDS或十二烷基肌氨酸钠等去污剂。裂解剂可以简单的水溶液提供，或它们可包含在缓冲溶液中形成所谓的“裂解缓冲液”。可使用任何合适的缓冲液，包括例如Tris、Bicine、Tricine和磷酸缓冲液。还可分别加入裂解剂。裂解剂的合适浓度和量将根据精确的系统、要求的性质变化，可以合适的测定，但可使用例如2-7M的扰动试剂，例如GTC、GHCl、NaI或过氯酸盐，和0.1M-1M碱性剂例如NaOH，和0.1-50％(w/v)，例如0.5-15％去污剂。因此，合适的代表性裂解缓冲液的例子包括4M GTC，1％(w/v)的十二烷基肌氨酸钠的水溶液。
分离的，载体结合的微生物，可以方便地从样品的剩余部分中取出或分离，从而浓缩或富集细胞。因此细胞结合步骤用于富集细胞或浓缩成比最初样品小的体积。然后加入含有所需裂解剂的合适裂解缓冲液或将分离的细胞置于所需的裂解条件下，方便的实现裂解。例如，就简单加入含有合适裂解剂的裂解缓冲液而言，分离的细胞可简单的在裂解缓冲液存在下保温合适的时间，使得裂解发生。不同的保温条件适合不同的裂解系统，是本领域已知的。例如对于含去污剂和/或扰动试剂的裂解缓冲液，可在室温或在更高的温度下，例如37℃-65℃进行保温。类似的，保温时间可从几分钟，例如5或10分钟到几小时，例如1-2小时变化。就GTC/十二烷基肌氨酸钠裂解缓冲液和细菌细胞而言，在例如65℃培养10-20分钟被发现是适合的，但这当然可以根据需要变化。对于酶裂解，例如用蛋白酶K等，需要更长的处理时间，例如过夜。
裂解后，方便地将释放的核酸与固相载体结合，优选结合了裂解的微生物的载体。虽然可提供例如混合的珠群，其中一些具有与微生物非特异性结合的配体，其它适合结合核酸。
可用本领域已知的用于将核酸与固相载体结合的任何方法实现对该核酸的结合。为了方便，核酸非特异性的结合于载体，即不依赖于序列。因此，例如释放的核酸可用任何已知的核酸沉淀剂，例如醇、醇/盐组合、聚乙二醇(PEG)等沉淀在载体上。核酸以该方式在珠上的沉淀在WO91/12079上有所描述。因此，可在载体上加入盐，在溶液中释放核酸，然后加入醇，它导致核酸沉淀。另外，可一起加入盐和醇，或省略盐。如上所述关于细胞结合步骤，可使用任何合适的醇或盐，不难确定合适的量或浓度。
其它非特异性核酸结合技术包括使用Dynal AS的WO96/18731所述的去污剂(所谓的“DNA针对性”方法)和用扰动试剂和核酸结合固相，例如二氧化硅颗粒，如Akzo，N.V.在EP-A-0389063中所述。
核酸与载体的离子结合可通过使用具有带电表面的固相载体实现，例如用聚胺包裹的载体。
用于本发明的方法的载体还可以携带官能团，它帮助核酸的特异性或非特异性结合，例如DNA结合蛋白，如亮氨酸拉链或组蛋白或插入染料(如溴乙锭或Hoechst 42945)它们能包裹在载体上。
类似的，可提供具有结合配对的载体，来帮助选择性捕获核酸。例如，可使用互补的DNA或RNA序列，或DNA结合蛋白，或与病毒核酸结合的病毒蛋白。这些蛋白质与固相载体的结合可以用本领域熟知的技术实现。
本发明的沉淀核酸的简便方法是通过在含有载体和裂解细胞的混合物中加入沉淀剂，例如醇。因此可简单的将合适体积的醇，例如100％或96％乙醇加到混合物中，保温足够的时间，使释放的核酸与载体结合。该步骤的保温条件不是关键的，可简单的在室温下保温5-10分钟。然而时间的长短可以变化，温度根据选择提高。
虽然不必要，可方便地在本发明的分离方法中，例如在核酸结合步骤后引入一个或多个洗涤步骤。可使用任何常规的洗涤缓冲液或其它基质。一般说，优选低至温和离子强度的缓冲液，例如pH8.0的10mM Tris-HCl/10mM NaCl。可使用其它标准洗涤介质，例如含醇的，如需要例如用70％乙醇洗涤。
使用磁性颗粒可简化洗涤步骤，简单地通过聚集颗粒，取出结合核酸的介质，加入洗涤介质，重新聚集颗粒如需要的许多次数。
在核酸分离步骤和任何可能需要的任选洗涤步骤后，将携带结合的核酸的载体转移，例如重悬浮或浸入任何合适的介质，例如水或低离子强度缓冲液中。由载体和任何所需的随后加工的性质决定，可能或不可能需要从载体上释放核酸。
在颗粒状固相载体例如磁性或非磁性珠的情况下，这可以在许多情况下直接使用，例如在PCR或其它扩增中，不用从载体洗脱核酸。另外对于许多DNA检测或鉴定方法，洗脱不是必需的，虽然DNA可能随机与珠表面接触，并在许多点通过氢键或离子或其它力键合，但是通常足够长度的DNA能与寡核苷酸杂交和扩增。
然而如需要，可用已知方法，例如加热到例如70-90℃5-10分钟，然后可从介质中取出载体，核酸留在溶液中。该加热可自动在PCR中通过循环程序前的DNA变性步骤获得的。
如果需要从DNA中除去RNA，这可以通过在DNA分离步骤前破坏RNA，例如通过加入RNAase或碱，例如NaOH实现。
本发明的一个优点是它能快速和简单地进行，该方法的简便实现样品的高通量。
本发明有利的适合自动化，特别是如果颗粒尤其是磁性颗粒用作载体。
如上所述，本发明的方法作为制备核酸，用于基于核酸的检测方法的预先第一步有特别的实用性。
如上所述，在进行检测步骤前，有利结合的核酸不需要被洗脱或从载体上除去，虽然如需要这可以进行。核酸是否被洗脱还可以由在核酸结合步骤中使用的特定方法决定。因此某些核酸结合的步骤将与核酸的结合比其它更紧密。在使用例如去污剂(例如DNA Direct)的DNA结合情况下，当引入洗脱缓冲液或其它合适的介质时，从固相载体上洗脱核酸。通过沉淀剂，例如醇或扰动试剂结合的核酸将维持更紧密的结合，当置于缓冲介质中时，可不洗脱，也可需要加热洗脱。
因此，可直接在基于核酸的检测过程中使用载体结合的核酸，尤其是如果载体是颗粒状的，简单的通过将载体悬浮在，或加入到适合检测步骤的介质中。不论核酸是洗脱入介质或如上所述，它都不是必需洗脱的。当用硫酸化的糖作为配体时，洗脱是优选的。
检测核酸的许多不同技术是已知的，在文献中有所描述，可根据本发明使用任何这些方法。在最简单的情况下可通过与探针杂交检测核酸，已描述了许多这样的杂交方案(见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。最常用的，检测涉及原位杂交步骤，和/或用任何文献所述的方法体外扩增的步骤。因此如提到的，可使用LAR、3SR和Q-β-复制酶系统等技术。然而，PCR及其各种变化，例如用嵌套引物，一般是选择的方法(见例如Abramon和Myers，1993，CurrentOpinion in Biotechnology，4：41-47，对于核酸扩增技术的综述)。
其它检测方法可基于测序法，例如小测序法，如Syvnen和Sderlund，1990，Genomics，8：684-692所述。
在扩增技术例如PCR中，在第一步解开DNA双链所需的加热可从载体上释放出所结合的DNA。因此就随后的检测步骤，例如PCR而言，可直接将载体结合的核酸加到反应混合物中，核酸可在检测步骤的第一步洗脱。根据本发明获得的整个分离的载体结合的核酸样品，可用于检测步骤或等份。
可用许多本领域描述的方法检测或可视化PCR或其它检测步骤的结果。例如PCR或其它扩增产物可用已知技术走电泳胶，如溴乙锭染色的琼脂糖凝胶。另外，可用DIANA系统，它是嵌套引物技术的修改。在DIANA(固定化的扩增的核酸的检测)系统(见Wahlberg等，Mol.Cell Probes 4：285(1990))中，内部的第二对引物分别携带固定化能捕获扩增的DNA的序列和一种标记或结合标记，实现识别的分子。这提供了减少背景信号和迅速和方便的检测扩增DNA的双重优点。实时PCR分析可用于DNA检测，例如5’核酸PCR法或使用荧光探针的技术。
还可用测序，用任意的许多不同的现有的测序技术，例如标准测序、固相测序、循环测序、自动测序和小测序检测扩增的核酸或确定结果。
进行本发明的方法所需的各种反应剂和成分可以方便的以试剂盒形式提供。该试剂盒代表了本发明的另一个方面。
以最简单的形式，本发明的该方面提供了从样品分离微生物的试剂盒，包括：
(a)具有在其上固定有配体的固相载体，所述配体能与微生物非特异性结合；
(b)将微生物与所述固相载体结合的工具；可任选的
(c)裂解所述细胞的工具；和可任选的
(d)使从所述裂解的细胞上释放的核酸与固相载体结合的工具。
各种方法(b)、(c)和(d)可以如所述和如上关于本发明的方法讨论的。
典型的试剂盒可含有固相载体，例如用多糖，例如GUM1和缓冲剂，例如PBS和裂解缓冲液包裹的颗粒。
另一种可任选的成分是(e)，用于检测靶微生物特征性核酸存在或不存在的工具。如上所述，这些工具可包括合适的探针或引物寡核苷酸序列，用于基于杂交和/或扩增的检测技术。
可任选的还包括在这些试剂盒中的有缓冲剂、盐、聚合物、酶等。
本发明的试剂盒在抽提细菌和分离DNA用于PCR扩增中具有很大是实际利用性。使用该试剂盒的合适方案如下，假定选择磁性或可磁化的珠作为固相载体(a)：
-合并结合缓冲液(b)和珠，加入来自过夜培养物的样品并在例如Eppendorf管中混合，
-置于磁力的影响下，使细菌/珠混合物移动到管子一侧，
-吹干并丢弃上清液，
-加入裂解缓冲液(c)并在乙醇中保温，
-用磁力从上清液中分离珠，吹干并丢弃上清液，
-洗涤珠并除去上清液，
-重悬浮珠/DNA用于PCR。
根据本发明的另一个方面提供了用本文所述的固相载体从样品中粗分离细胞。分离是“粗的”，因为它不是细胞特异性分离方法，而是一种从样品中的其它组分中分离细胞的通用方法。先前用过滤或沉淀实现了这些方法。相反，本文所述的固相载体可用于合并配体-受体结合的优点，但不是以物种或细胞类型特异性方式。如本文所述，与固相载体结合的配体能与样品中的显著部分，如果不是全部的微生物类型(例如不同的细菌物种)或真核细胞类型结合，以实现从总样品中粗分离。
附图简述
本发明现在将以下列非限制性实施例参考附图作更详细描述，其中：
图1是凝胶照片，显示与包裹有甘露糖、麦芽糖和GUM1的珠结合的细菌(大肠杆菌)的核酸的PCR产物；
图2是凝胶照片，显示与包裹和未包裹的珠结合的细菌(蜡状芽孢杆菌(B.cereus))的核酸的PCR产物；
图3是凝胶照片，表明各种各样细菌与GUM1包裹的珠的结合；
图4是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的霍乱弧菌的核酸的PCR产物；
图5是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的弗式志贺氏菌(Shigellaflexneri)的核酸的PCR产物；
图6是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的大肠杆菌的核酸的PCR产物；
图7是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的核酸的PCR产物；
图8是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)的核酸的PCR产物；
图9是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的核酸的PCR产物；
图10是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrheae)的核酸的PCR产物；
图11是凝胶照片，显示与各种包裹的珠结合的人白血细胞的核酸的PCR产物；
图12是凝胶照片，显示与各种包裹或未包裹的Dynabeads结合的大肠杆菌的核酸的PCR产物；
图13是凝胶照片，显示与各种GUM1包裹的Dynabeads结合的各种细菌的核酸的PCR产物；
实施例
实施例1
糖类包裹的颗粒的制备和细胞结合性质的测试
将化合物偶联在M-PVA OCN-活化的珠(Chemagen AG)上。反应：
       珠-NCO  +   R- OH        →  
Figure A0180390200191
       活化的珠  具有羟基的糖类       糖类的氨基甲酸酯(urethar)
修饰的珠与不同细菌培养物，与纯的未稀释培养物(o.n.)或稀释在水中或缓冲液(PBS)中的培养物一起保温。为了调查细胞结合，从细菌-珠复合物中分离出DNA，然后进行PCR分析。参考：WO98/51693。用Chemagen进行该偶联反应，得到的修饰的珠用于本文所述的本发明的分离方法。
实施例2
在珠上分离细菌和鉴定特定细菌的方法
在100毫升胰蛋白胨大豆肉汤中30℃不搅拌培养细菌过夜。混合800微升PBS(结合缓冲液)和10微升本发明的珠(10毫克/毫升)，然后加入100毫升过夜培养物，用滴管吹打，温和搅拌。用磁性分离器除去上清液，将珠-细菌复合物重新悬浮在50微升裂解缓冲液(4M硫氰酸胍-1％十二烷基肌氨酸钠)中。样品开盖在65℃保温5分钟。
然后加入100微升96％乙醇，继续闭盖保温5分钟。用磁性分离器除去上清液，用1毫升70％乙醇洗涤DNA样品两次。
将珠-DNA样品重悬浮在45微升水中，在65℃开盖保温15分钟，除去所有痕量乙醇(或者加入5微升水来湿润珠，然后在65℃保温5分钟)。用50微升PCR纯化20微升纯化的物质。
为了鉴定分离的细菌，进行具有物种或组特异性引物(X和Y)PCR扩增。
下文的表1提供了用于不同细菌的合适的引物。
                                  表1
    属     引物序列   产物大小(bp)
沙门氏菌埃希氏杆菌志贺氏菌 上游：5’AAG TCG AAC GGT AAC AGG A 3’下游：5’CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3’     614
埃希氏杆菌，病原体 上游：5’ACT GAG ATT AAG GCT GAT AA 3’下游：5’ACA TTA ACC CCA GGA AGA G 3’     782
耶尔森氏菌气单胞菌弧菌 上游：5’CAC ATG CAA GTC GAG CGG C 3’下游：5’CAC CGC TAC ACC TG(GA)AAT 3’     620
利斯特氏菌杆菌 上游：5’G(AT)T CCT GAA ACC GTG TGC C 3’下游：5’CCT TCC GGT CTG ACT TCA 3’     702
弯曲杆菌 上游1：5’5’AAT CAC AGC AGT CAG GCG 3’上游2：5’5’CGT AAT AGC TCA CTG GTC T 3’下游：5’GTC GGT TTA CGG TAC GGG 3’     921761
芽孢梭菌 上游：5’CGA AGG CGG CTT TCT GGA 3’下游：5’GCG ATT ACT AGC AAC TCC 3’     609
柠檬酸菌哈夫尼菌克雷伯氏菌肠杆菌 上游：5’AAG TCG AAC GGT AGC ACA G 3’下游：5’CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3’     634
变形杆菌摩根氏菌发光杆菌沙雷氏菌希瓦氏菌 上游：5’CTA ACA CAT GCA AGT CGA G 3’下游：5’CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3’     625
链球菌乳球菌葡萄球菌肠球菌明串珠菌片球菌乳杆菌索丝菌 上游：5’TGC CTT TTG TAG AAT GAC C 3’下游：5’CGG CAT TCT CAC TTC TAA GC 3’     680
在50微升体积中进行PCR扩增：水-17.5微升；dNTP2mM-5微升；10x缓冲液DynaZyme-5微升；引物x(10pmol/微升)-1微升；引物y10pmol/微升-1微升；酶Dynazyme 2U/微升-0.5微升；模板-20微升。温度程序是：94℃-4分钟，然后35个循环，温度为96℃-15秒；56℃-30秒；72℃-1分钟；然后72℃-7分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳可视化PCR产物。
实施例3
用其上偶联有D-甘露糖的M-PVA珠进行实施例2的方案。
显示珠与杆菌、大肠杆菌(病原体和非病原体)、利斯特氏菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌结合。
实施例4
用其上偶联有麦芽糖的M-PVA珠进行实施例2的方案。
显示珠与杆菌、大肠杆菌(病原体和非病原体)、利斯特氏菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌结合。
实施例5
用其上偶联有半乳糖甘露聚糖多糖(GUM1)的M-PVA珠进行实施例2的方案。
显示珠特别与气单胞菌、杆菌、弯曲杆菌、柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、肠杆菌、大肠杆菌(病原体和非病原体)、哈夫尼菌、克雷伯氏菌、利斯特氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、希瓦氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、弧菌、耶尔森氏菌结合。
这些实验的结果可在图3的凝胶照片中可见。显示了PCR产物的条带，表明根据下列图表特定细菌与珠结合。
泳道1，DNA标记(GeneRulerTM 100bp DNA序列梯，Fermetas)；
泳道2-3，分别是肺炎克雷伯氏菌(Klebesiella pneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)；
泳道4-6，分别是弗式志贺氏菌、索氏志贺氏菌(S.sonnei)和鲍氏志贺氏菌(S.boydii)；
泳道7-8和12-13，霍乱弧菌(泳道7和12)、创伤弧菌(V.vulnificus)(泳道8)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)；
泳道9，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；
泳道10-11，分别是温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)；
泳道12-13，弧菌，见上；
泳道14，普通变形菌(Proteus vulgaris)；
泳道15-16，分别是鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种(S.enterica ssp enteritidis)；
泳道17-18和41-44，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolotica)(泳道17-18血清型未知)，血清型0：9(泳道42)、0：8(泳道43)、和0：3(泳道44)和假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)泳道41；
泳道19，大肠杆菌；
泳道20-21，分别是无害利斯特氏菌(Listeria innocua)和单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；
泳道22-23和38-39，蜡状芽孢杆菌(泳道22)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(泳道23)和简单芽孢杆菌(B.simplex)(泳道38-39)；
泳道24，弗式柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)；
泳道25-26，分别是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和索氏芽孢梭菌(C.sordelli)；
泳道27-30，大肠杆菌，病原性；
泳道31-37，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(泳道31)和红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)(泳道32-37)；
泳道38-39，杆菌，见上；
泳道40，热杀索丝菌(Bronchothrix thermosphacta)；
泳道41-44，耶尔森氏菌，见上；
泳道45-47，分别是阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、产气肠杆菌(E.aerogenes)和阴沟肠杆菌(E.cloacae)；
泳道48，摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)；
泳道49，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；
泳道50-52，腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)；
泳道53-54，分别是明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)和美人鱼发光杆菌(P.damsela)；
泳道55，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)；
泳道56，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；
泳道57，沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)；
泳道58，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；
泳道59-60，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；
泳道61-64，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)(泳道61-62)和有害片球菌(P.damnosus)(泳道63-64)；
泳道65-69，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(泳道65、68和69)和植物乳杆菌(L.plantarum)(泳道66-67)。
实施例6
用实施例3、4和5的珠和Dynabeads M-280(dynal，Norway)(未激活)从过夜培养物中分离大肠杆菌。在裂解释放核酸后，用引物U59/L673(见表1)扩增约600bp的大肠杆菌DNA序列。
图1显示了结果，其中：
泳道2-5，使用15微升模板，在泳道7-10中，用5微升模板；
泳道1和6，DNA标记φx174/HaeIII；
泳道2和7，甘露糖包裹的珠；
泳道3和8，麦芽糖包裹的珠；
泳道4和9，GUM1包裹的珠；
泳道5和10，DynabeadsM-280已活化。
实施例7
用实施例5的珠和未包裹的珠(称为UNC)分离来自2毫升过夜培养物(100微升TSB，30℃)分离蜡状芽孢杆菌ATCC14579，根据下列稀释：
泳道1，DNA标记φx174/HaeIII；
泳道2，100微克UNC，未稀释的培养物；
泳道3，50微克GUM1，101稀释的培养物；
泳道4，100微克GUM1，101稀释的培养物；
泳道5，200微克GUM1，101稀释的培养物；
泳道6，100微克UNC，101稀释的培养物；
泳道7，50微克GUM1，102稀释的培养物；
泳道8，100微克GUM1，102稀释的培养物；
泳道9，200微克GUM1，102稀释的培养物；
泳道10，100微克UNC，103稀释的培养物；
泳道11，50微克GUM1，103稀释的培养物；
泳道12，100微克GUM1，103稀释的培养物；
泳道13，DNA标记φx174/HaeIII；
泳道14，200微克GUM1，103稀释的培养物；
泳道15，100微克UNC，103稀释的培养物；
泳道16，50微克GUM1，104稀释的培养物；
泳道17，100微克GUM1，104稀释的培养物；
泳道18，200微克GUM1，104稀释的培养物；
泳道19，100微克UNC，104稀释的培养物；
泳道20，50微克GUM1，105稀释的培养物；
泳道21，100微克GUM1，105稀释的培养物；
泳道22，200微克GUM1，105稀释的培养物；
泳道23，100微克UNC，105稀释的培养物。
裂解释放核酸后，用引物U552/L1254(见表1)扩增约600bp的蜡状芽孢杆菌序列。结果如图2所示。101稀释的结果将作为错误出现，因为50微克GUM1和200微克GUM1在检测核酸中都得到了阳性的结果，表明细胞结合。总的说，结果显示GUM1的结合比未包裹的珠高100-1000倍。
实施例8
已用其它珠说明了本发明的原理，特别合适的珠类型是Dynabeads M-270Epoxy，Prod.No.143.02(购自Dynal AS，Norway)。
珠的制备
将2毫升除菌过滤的0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4加到30毫克干珠中，得到浓度约109个珠/毫升。搅拌重悬浮珠30秒，然后缓慢倾斜旋转保温10分钟。将管置于磁铁上4分钟，小心的用吸管吸去上清液。
在管中再次加入2毫升0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4，通过搅拌充分混合珠。将管置于磁铁上4分钟，除去上清液。
将洗过的珠重悬浮在600微升0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4中，得到推荐的珠浓度，加入配体溶液后得到硫酸铵浓度。该珠溶液用于包裹过程。
包裹过程
将配体溶于PBS至1mg/ml的浓度，并除菌过滤。将600微升配体与600微升珠溶液和600微升无菌过滤的3M硫酸铵按Dynal的推荐混合。管在室温下缓慢旋转保温过夜。
在保温后，将管置于磁铁上4分钟，除去上清液。用2毫升洗涤包裹的珠总共4次。最终将珠悬浮在1毫升PBS中，浓度为30mg/ml，储藏在4℃。
实施例9
细菌在珠上的分离方案和特定细菌的鉴定
细菌在37℃100毫升胰蛋白胨大豆肉汤中培养过夜。根据本发明混合800微升(结合缓冲液)和20微升珠，然后加入100微升过夜培养物并用滴管温和混合。管在室温下放置5分钟。用磁性分离器除去上清液，将珠-细菌复合物重悬浮在50微升裂解缓冲液(4M异氰酸胍-1％十二烷基肌氨酸钠)。样品在80℃闭盖培养5分钟。
然后加入150微升96％乙醇，继续培养5分钟。用磁性分离器除去上清液，珠-DNA样品用1毫升70％洗涤两次。
珠-DNA样品重悬浮30微升H20，80℃开盖10分钟除去所有痕量的乙醇。在1次50微升PCR中使用所有30微升纯化材料。
实施例10
用实施例9的方案分离细菌，并鉴定分离的细菌，用下列引物进行PCR扩增：
实验A-E
如表1
实验F
上游：5’TGCTTTACACATGCAAGTCG3’
下游：5’CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG 3’
在下列实验中使用的是来自Dynal的M-270 Dynabeads或Chemagen AG的经M-PVA OCN-活化的珠。
下面的实验A-G中所用的细菌如下：
嗜水气单胞菌 CCUG 25942
蜡状芽孢杆菌 ATCC 11778
蜡状芽孢杆菌 NVH 0075-95
空肠弯曲杆菌 CCUG 25903
产气荚膜梭菌 ATCC 13124
大肠杆菌 ATCC 25922
大肠杆菌 CCUG 38081
幽门螺杆菌(Heliobacter pylori) CCUG 38771
单核细胞增生利斯特氏菌 ATCC 35152
单核细胞增生利斯特氏菌 CCUG 15527
淋病奈瑟氏菌 ATCC 49226
鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028
鼠伤寒沙门氏菌 CCUG 31969
弗式志贺氏菌 CCUG 38947
酿脓链球菌 CCUG 30917
肺炎链球菌 CCUG 33062
霍乱弧菌 CCUG 42534
小肠结肠炎耶尔森氏菌 Noma ref 102，Y842
在下列实验中，通常直接在DNA-珠复合物上进行扩增。然而用扩增技术鉴定细菌物种可在上清液中进行。对于某些结合配体例如肝素、硫酸葡聚糖和角叉菜胶，这可能是优选的，因为硫酸基团可抑制PCR反应。在下列实验中，除非另外说明，当用角叉菜胶包裹时，PCR在80℃保温珠，从珠上释放所有DNA后在上清液中进行。
在该实施例中“角叉菜胶”指ι角叉菜胶(Sigma C-3889)。从sigma获得了肝素和硫酸葡聚糖，分别具有目录参考号H3149和D6924。
A.从霍乱弧菌用Gum、甘露糖和角叉菜胶分离基因组DNA。
扩增的结果在图4的凝胶照片中显示。
从凝胶顶端左侧开始阅读：
第1列：
1号孔＝HaeIII标记(弱)。
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的霍乱弧菌稀释液。
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的霍乱弧菌稀释液。
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的霍乱弧菌稀释液。
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的霍乱弧菌稀释液。
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的霍乱弧菌稀释液。
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的霍乱弧菌稀释液。
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的霍乱弧菌稀释液。
9号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的霍乱弧菌稀释液。
10号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍乱弧菌稀释液。
11号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍乱弧菌稀释液。
12号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍乱弧菌稀释液。
13号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍乱弧菌稀释液。
泳道2：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍乱弧菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍乱弧菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍乱弧菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍乱弧菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍乱弧菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍乱弧菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍乱弧菌稀释液
9号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍乱弧菌稀释液
10号孔＝阴性对照
B.用Gum、甘露糖、角叉菜胶从弗式志贺氏菌分离的基因组DNA
在图5的凝胶照片中显示了扩增结果。
从凝胶的左上角读：
泳道1：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的弗式志贺氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的弗式志贺氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的弗式志贺氏菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的弗式志贺氏菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的弗式志贺氏菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的弗式志贺氏菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的弗式志贺氏菌稀释液
9号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的弗式志贺氏菌稀释液
10号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100 ul 10-2的弗式志贺氏菌稀释液
11号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志贺氏菌稀释液
12号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的弗式志贺氏菌稀释液
13号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志贺氏菌稀释液
泳道2：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的弗式志贺氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志贺氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100ul 10-4的弗式志贺氏菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志贺氏菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的弗式志贺氏菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志贺氏菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的弗式志贺氏菌稀释液
9号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志贺氏菌稀释液
C.用角叉菜胶、甘露糖、Gum、甘露聚糖从大肠杆菌分离的基因组DNA
图6的凝胶照片中显示了扩增结果。
凝胶上有6条代表大肠杆菌的泳道。
从凝胶的左上角读：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100ul 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
9号孔＝阴性对照
泳道2：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
泳道3：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
泳道4：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
泳道5：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的l00μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
泳道6：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
D.用角叉菜胶、甘露糖、Gum、甘露聚糖从鼠伤寒沙门氏菌分离的基因组DNA
图7的凝胶照片上显示了扩增的结果。
从凝胶的左上角读：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
9号孔＝阴性对照
泳道2：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
泳道3：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
泳道4：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
泳道5：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
泳道6：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
鼠伤寒沙门氏菌的DNA分离物
E.用瓜耳胶(Guar)、Gum、甘露糖和角叉菜胶从空肠弯曲杆菌分离的DNA
图8的凝胶照片显示了扩增结果。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空肠弯曲杆菌稀释液
3号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空肠弯曲杆菌稀释液
4号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空肠弯曲杆菌稀释液
5号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空肠弯曲杆菌稀释液
6号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空肠弯曲杆菌稀释液
7号孔＝添加到瓜耳胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空肠弯曲杆菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空肠弯曲杆菌稀释液
9号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空肠弯曲杆菌稀释液
10号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空肠弯曲杆菌稀释液
11号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空肠弯曲杆菌稀释液
12号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空肠弯曲杆菌稀释液
13号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空肠弯曲杆菌稀释液
14号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空肠弯曲杆菌稀释液
15号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空肠弯曲杆菌稀释液
16号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空肠弯曲杆菌稀释液
17号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空肠弯曲杆菌稀释液
18号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空肠弯曲杆菌稀释液
19号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空肠弯曲杆菌稀释液
20号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的空肠弯曲杆菌稀释液
21号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的空肠弯曲杆菌稀释液
22号孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的空肠弯曲杆菌稀释液
F.用Gum、肝素、角叉菜胶和硫酸葡聚糖从酿脓链球菌中分离基因组DNA。
扩增的结果在图9的凝胶照片中显示。
第1列：
在上清液中进行PCR，在90℃保温5分钟后用磁铁从珠分离。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
9号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
10号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
11号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
12号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
13号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
14号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
15号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
第2列
在90℃培养5分钟后，在用磁铁把珠分离的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
3号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
4号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
5号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
6号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
7号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
8号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
9号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
10号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
11号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
12号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
13号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
14号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
15号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
第3列
在90℃培养5分钟后，在用磁铁与珠分开的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
3号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
4号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
5号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
6号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
7号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
8号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
9号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
10号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
11号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
12号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
13号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
14号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
15号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
第4列
在90℃培养5分钟，在用磁铁将珠分离的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
3号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
4号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
5号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
6号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
7号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
8号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
9号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
10号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的酿脓链球菌稀释液
11号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的酿脓链球菌稀释液
12号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的酿脓链球菌稀释液
13号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的酿脓链球菌稀释液
14号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的酿脓链球菌稀释液
15号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的酿脓链球菌稀释液
G.用Gum、肝素、角叉菜胶和硫酸葡聚糖从淋病奈瑟氏菌中分离基因组DNA。
扩增的结果在图10的凝胶照片中显示。
第1列：
在上清液中进行PCR，在90℃保温5分钟后用磁铁将珠分离。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
9号孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
第2列：
在90℃培养5分钟后，在用磁铁将珠分离的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀释液
3号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀释液
4号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀释液
5号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
6号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀释液
7号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
8号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
9号孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
第3列
在90℃培养5分钟，在用磁铁将珠分离的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀释液
3号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀释液
4号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀释液
5号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
6号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀释液
7号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
8号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
9号孔＝添加到角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
第4列
在90℃培养5分钟后，在用磁铁将珠分离的上清液中进行PCR。
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀释液
3号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀释液
4号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀释液
5号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀释液
在重新悬浮在水中后，在剩余的珠上进行PCR。
6号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀释液
7号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
8号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
9号孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀释液
实施例11
在称为J558L的B-癌细胞系纯的培养物上进行实验。所用的引物是：
上游：5’CCCGCCCCTTGCTCTC 3’
下游：5’TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3’
扩增的结果如图11的凝胶照片所示。在90℃保温5分钟后用磁铁将珠分离的上清液上进行PCR。
第1列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-细胞稀释液
3号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-细胞稀释液
4号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-细胞稀释液
5号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-细胞稀释液
第2列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到I型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-细胞稀释液
3号孔＝添加到I型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-细胞稀释液
4号孔＝添加到I型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-细胞稀释液
5号孔＝添加到I型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-细胞稀释液
第3列
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到II型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-细胞稀释液
3号孔＝添加到II型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-细胞稀释液
4号孔＝添加到II型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-细胞稀释液
5号孔＝添加到II型角叉菜胶包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-细胞稀释液
第4列
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-0的B-细胞稀释液
3号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的B-细胞稀释液
4号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的B-细胞稀释液
5号孔＝添加到V型角叉菜胶包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的B-细胞稀释液
使用的各种类型的角叉菜胶(其在Sigma目录中的产品号)：
I型角叉菜胶-大部分是κ角叉菜胶：C1013
II型角叉菜胶-大部分是ι角叉菜胶：C1138
V型角叉菜胶-ι角叉菜胶：C-3889
实施例12
根据实施例8的方案从包裹了GUM的珠上分离大肠杆菌。未包裹的珠与包裹的珠进行相同的包裹过程，但不加入糖。根据下列稀释度进行实施例9的分离方案：
第1列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大肠杆菌稀释液
6号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
9号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大肠杆菌稀释液
第2列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大肠杆菌稀释液
4号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大肠杆菌稀释液
7号孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大肠杆菌稀释液
扩增的结果如图12的凝胶照片所示。
实施例13
根据实施例8的方案从包裹了GUM的珠上分离各种细菌。根据实施例9的分离方案，扩增结果如图13的凝胶照片所示：
第1列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的弗式志贺氏菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的弗式志贺氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的嗜水气单胞菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的肺炎链球菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的酿脓链球菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的鼠伤寒沙门氏菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的小肠结肠炎耶尔森氏菌稀释液
第2列：
1号孔＝HaeIII标记
2号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的大肠杆菌稀释液
3号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的单核细胞增生利斯特氏菌稀释液
4号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的产气荚膜梭菌稀释液
5号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的蜡状芽孢杆菌稀释液
6号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的空肠弯曲杆菌稀释液
7号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的淋病奈瑟氏菌稀释液
8号孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀释的百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)稀释液
博德氏菌的引物与奈瑟氏菌的相同(见表1)。

Claims (26)

1.一种从样品中分离细胞的方法，其特征在于，该方法包括将所述细胞通过固定在固相载体上的非特异性配体与所述固相载体结合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是微生物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物是细菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，样品中存在的不同细菌物种至少30％的代表与所述固相载体结合。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，样品中存在的不同细菌物种至少60％的代表与所述固相载体结合。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，配体是营养物。
7.如任一前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述配体是糖类或糖类衍生物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述配体选自单糖、寡糖、多糖或硫酸化的多糖。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述配体选自甘露糖、Gum、瓜耳胶、肝素、硫酸肝素、角叉菜胶、硫酸葡聚糖和甘露聚糖。
10.如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述固相载体是颗粒状的。
11.如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，该方法还包括鉴定与所述固相载体结合的一种或多种细胞的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，用细胞类型特异性核酸探针鉴定细胞。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，裂解所述结合的细胞，释放其核酸。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述释放的核酸与固相载体结合。
15.一种检测样品中的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将所述微生物通过固定在固相载体上的非特异性配体与所述固相载体结合；和
(b)鉴定与所述固相载体结合的微生物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括裂解微生物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，从所述裂解微生物中释放的核酸与固相载体结合。
18.一种固相载体，其特征在于，该固相载体上固定有能与细胞以非特异方式结合的配体。
19.如权利要求18所述的固相载体，其特征在于，所述配体是糖类或糖类衍生物。
20.权利要求18或19所述的固相载体在从样品中粗分离细胞的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述细胞是微生物。
22.一种从细胞样品中分离核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将所述样品中的细胞通过固定在固相载体上的非特异性配体与所述固相载体结合；
(b)裂解结合的细胞；和
(c)将所述裂解的细胞释放的核酸与固相载体结合。
23.一种检测样品中靶细胞存在与否的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将所述样品中的细胞通过固定在固相载体上的非特异性配体与所述固相载体结合；
(b)裂解结合的细胞；
(c)将所述裂解的细胞释放的核酸与固相载体结合；和
(d)在所述结合的核酸中检测所述靶细胞特征性核酸的存在与否。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述核酸与细胞结合于相同的固相载体。
25.如权利要求22-24任一所述的方法，其特征在于，所述细胞是微生物。
26.一种用于从样品中分离微生物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：
(a)在其上固定有与微生物非特异性结合配体的固相载体；
(b)将微生物与所述固相载体结合的装置；可任选的
(c)裂解所述细胞的装置；和可任选的
(d)使从所述裂解的细胞上释放的核酸与固相载体结合的装置。
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