JP4594577B2 - 細胞単離方法 - Google Patents
細胞単離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4594577B2 JP4594577B2 JP2001553385A JP2001553385A JP4594577B2 JP 4594577 B2 JP4594577 B2 JP 4594577B2 JP 2001553385 A JP2001553385 A JP 2001553385A JP 2001553385 A JP2001553385 A JP 2001553385A JP 4594577 B2 JP4594577 B2 JP 4594577B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dilution
- add
- coated
- well number
- solid support
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、試料中に存在する微生物の単離方法、とりわけ試料中に存在する細菌の単離方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
微生物の存在について試料を定性的および定量的に分析しようとする現在の手法のほとんどは、特定の微生物、例えば病原体の同定に向けられている。食品および臨床試料からのリステリア菌およびサルモネラ菌の菌株の免疫磁気分離が記載されている（例えば、Skjerve et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 3478-3481参照）。そのような手法は、当該微生物に特異的なリガンド、一般的には抗体、の使用に依存している。免疫磁気分離は特異的なリガンドの使用に依存しているので、特定の微生物を同定するために探す状況においてのみ適用可能であって、存在するかもしれない微生物についての全般的な選別が求められる状況では適用できない。免疫磁気分離では、疑われていない微生物をピックアップするのは容易ではないであろう。
【０００３】
例えば、水試料のような環境試料を分析する場合、存在する種々の微生物種の全体像または微生物の総濃度の推定を得ることが望ましい状況がある。上水道中に存在し得る細菌の総量に関して制限が設けられることがあり、これは特定細菌の存在についての問題とは独立している。例えば川または湖における微生物の広範な種類の同定により、その水域の状態、栄養分レベル、農薬流出等のについての有益な情報がもたらされる
【０００４】
もし試料から微生物を単離する一般的な方法が提供できれば、存在する特定微生物の同定は次の段階において都合よく実行できる。核酸に基づく分析は、特定微生物の識別に都合よく使用できるであろう。
【０００５】
試料中に存在する微生物の総量の推定を得るため、またはさらなる分析用に微生物を試料から単離するために現在用いられている方法は、濾過および／または遠心分離ならびに寒天プレート上での培養を伴うかなり荒い分離手法に頼っている。総細菌濃度の決定は、フローサイトメトリーまたは濾過および例えばペトリ皿中の一般培地上での培養により実行し得る。これらの方法には数日を要することがあり、かなり複雑かつ不正確である。食品試料の分析に用いられる従来方法に特有の問題が観察されている。これは食品試料が固形物（集塊および脂肪粒）を多く含み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾向があり、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に利用できないからである。
【０００６】
したがって、実行が迅速かつ便利で、多数の微生物種を試料から、好ましくは一段階で、単離できる方法に対する需要がある。
【０００７】
（発明の開示）
本発明はこれらの要求に対処するものであり、したがって、本発明の１つの局面によれば、試料からの微生物単離方法が提供され、この方法は、前記微生物を固体支持体上に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより、結合する段階を含む。
【０００８】
したがって、本発明は、固体支持体に付着させた非特異的リガンドと、微生物表面に見られる前記リガンドとの結合パートナー（受容体）との間の相互作用の利用により、広い微生物綱の捕獲を可能にする一般的単離方法を提供する。本発明の本質が、固定されたリガンドと微生物との間の非特異的相互作用なので、本明細書中で「微生物単離」に言及する時は、微生物の非種特異的および非属特異的な方法による単離を意味することを意図している。換言すれば、固定されたリガンドは、複数の属、少なくとも２種類の異なる属、好ましくは３種類以上、より好ましくは５ないし７種類の異なる属、最も好ましくは少なくとも１０あるいは１４種類以上の異なる属の微生物と結合することができる。
【０００９】
このように本発明により、微生物、特に細菌を試料中の他の成分から単離する一般的方法が提供される。この方法は、１つの細菌種を標的にするのではなく、微生物集団全体についての情報を得るためまたは例えば種特異的プローブを用いた核酸レベルでの種特異的情報が得られる第２の段階を容易にするために総分離システムが達成されるという意味で「一般的」である。
【００１０】
微生物は、それらが固体支持体に結合され、次いで試料の残部から、微生物を結合させたまま固体支持体を取り去るか試料の残部を例えば流出により取り去ることによって分離し得るという点で「単離される」。固体支持体が磁気を帯びている場合には、支持体／微生物複合体の操作は特に便利である。
【００１１】
本発明の方法は、原生生物、藻類、原虫および菌類ならびにマイコプラズマ、すべての細菌およびウイルスを含む、真核細胞に結合し得るすべての微生物を含む多種多様な微生物の単離に用い得る。本発明の方法は、真核生物寄生生物、特にヒト細胞（または他の宿主生物体）上に見られる複合多糖類に結合できるものの単離に用い得る。そのような真核生物寄生生物には、クリプトスポリジウム、赤痢アメーバおよびマラリア原虫が含まれる。したがって、本明細書における「微生物」への言及は、そのような寄生生物を含むものと解されるべきである。
【００１２】
本発明の方法は、細菌の単離に特に適している。細菌の分類は複雑かつ絶え間なく変わる科学であるが、「真の」細菌（真正細菌）は多数のパート（Bergey’s Manual of Determinative Biology）、例えば光合成細菌、滑走細菌、有鞘細菌およびグラム陽性球菌に分割し得る。個々のパートは次に、１つ以上の目に分割され、その目内に科と属がある。１つ以上の属、科、または目あるいはパートの細菌は、本発明の方法を用いて単離し得る。細菌の以下の科および属のいくつかまたはすべての細菌の試料から効果的な分離を本発明の方法を用いて達成できる。すなわち、アエロモナス、バシラス、カンピロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、エンテロバクター、エシェリキナ（病原菌および非病原菌）、ハフニア、クレブシエラ、リステリア、プロテウス、サルモネラ、シェワネラ、セラチア、シゲラ、ビブリオ、エルシニア、モルガンラ、フォトバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ラクトバシラス、ブロコスリックスである。
【００１３】
この方法は、細菌と他のタイプの微生物、例えば藻類、原虫、菌類またはウイルスを同時に単離するために用い得る。
【００１４】
特定の状況では、試料は限られた数のタイプの細菌のみを含み、この方法により、いくつかの、あるいは１つか２つの細菌種のみが結合されて試料から単離される結果になることがある。それでもやはりそのような方法は特異的な方法ではない。なぜならば、利用可能な細菌群がある程度限定されていても、固定されたリガンドは多種多様な細菌と結合し得るからである。
【００１５】
任意の単離方法を実行するために特定の固体支持体−リガンド複合体を選択する必要がないという事実により、柔軟性およびコストの点で著しい利点がもたらされる。なぜならば、リガンドが付着した１つの固体支持体は、多種多様な単離／分離方法において用い得るからである。したがって、特に有利なのは固体支持体の一般的な結合能力である。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法の結果、試料中に存在する微生物（例えば細菌）が、存在するすべての細菌細胞の割合および細菌のタイプの割合双方について、高い割合で単離される。したがって、好ましくは試料中の微生物の少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは７０〜８０％の微生物が固体支持体に結合されるであろう。当然ながら、結合される試料中の微生物の百分率は、試料に添加される固体支持体の量と微生物に対するリガンドの比率に依存する。上記の百分率については、混合物中に存在する固体支持体とリガンドとが過剰にあるものと見なされる。
【００１７】
別の見方をすると、存在する種々の（例えば細菌の）種の少なくとも２０％の標本が好ましくは単離され、存在する種々の（例えば細菌の）種のより好ましくは少なくとも３０〜４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の、特に少なくとも６０〜７０％の、さらには少なくとも８０％の標本が固体支持体に結合される。
【００１８】
「非特異的」リガンドとは、上で論じたように、１種類以上、好ましくは２〜３種類以上、より好ましくは、５〜７種類以上、例えば１０〜１４種類以上の微生物および／または細菌属と結合できるものである。リガンドと、微生物の表面上にあって結合の原因であるその結合パートナーとの間に相互作用があるのであり、細胞が沈殿により固まる場合のように、細胞と固体支持体との間に一般的な引力または会合が単にあるのではない。リガンドの非特異的特徴は、リガンドが微生物表面の一部と無差別に結合または会合できるということではなく、リガンドの結合パートナーが微生物の特定のタイプまたは種に対して特異的ではないということを指す。したがって、リガンドは、汎用結合リガンドであると見なし得る。
【００１９】
適した結合パートナーは、種々の微生物中に、特に種々の細菌属中に比較的広く見出されるので、かなり一般的、したがって非特異的な単離方法がもたらされる。したがって、リガンドは１つ以上の特異的な結合パートナーを有する一方で、適した結合パートナーを有している多種多様な細菌すべてと結合できるという意味で「非特異的」である。理論により拘束されることを望むのではないが、それ自体が一般に種特異的である多種多様な結合パートナーは同じリガンドと結合することができ、したがって種特異的でない分離方法がもたらされる。種特異的レクチンは、炭水化物ベースのリガンドと共に非種特異的分離システムを提供することができる。
【００２０】
結合パートナーは一般に微生物表面のタンパク質であり、種ごとに変わり得る。結合パートナーについてあまり多くは知られていないが、それにもかかわらず本発明の方法で用いる適切なリガンドを本発明者らは同定することができた。
【００２１】
リガンドは非タンパク質であり、したがって抗体および誘導体ならびにそれらのフラグメントは排除される。本発明の方法の非特異的リガンドと対照的に、そのようなタンパク質リガンドは、例えば細胞上のタンパク質と非常に特異的な（すなわち、属、特に種特異的な）相互作用が可能である。
【００２２】
好ましいリガンドは炭水化物であり、単糖類、オリゴ糖類（二糖類および三糖類を含む）および多糖類が含まれる。適切な単糖類としては、適宜ピラノースおよびフラノースの形のヘキソースおよびペントース、ならびにアルドン酸およびウラオン酸、デオキシ糖またはアミノ糖、硫酸化糖および糖アルコールのような誘導体が含まれる。適切な単糖類の例としては、マンノース（例えばD−マンノース）、ガラクトース（例えばＤ−ガラクトース）、グルコース（例えばＤ−グルコース）、フルクトース、フコース（例えばＬ−フコース）、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ラムノース、ガラクトサミン、グルコサミン（例えばＤ−グルコサミン）、ガラクツロン酸、グルクロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、メチルＤ−マンノピラノシド（マンノシド）、α−メチル−グルコシド、ガラクトシド、リボース、キシロース、アラビノース、サッカラート、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グリセリンおよびこれらモノマーの誘導体が含まれる。これらの中で、マンノース、ガラクトースおよびフコースが好ましい。
【００２３】
特に好ましいのはオリゴ糖類および多糖類であり、これらは、単糖モノマーのポリマー、例えば上で論じた単糖モノマーを含むポリマーである。
【００２４】
オリゴ糖類は、２〜１２個、好ましくは４〜８個の共有結合した単糖単位を含み、これらは同じでも異なってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは分岐状であり、例えば、２〜６単位のマルトース、スクロース、トレハロース、セロビオースおよびサリシン、特にマルトースを有するオリゴマンノシルである。オリゴ糖類の製造方法は、Pan et al. Infection and Immunity (1997), 4199-4206に記載されている。
【００２５】
多糖類は、１３個以上の共有結合した単糖単位を含み、これらは同じでも異なってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは分岐状である。適切な多糖類は、マンノース、ガラクトース、グルコース、フルクトースまたはウロン酸を多く含み、例えばマンノースの直鎖ポリマーであって４番目のマンノースごとに１つのガラクトース側鎖を有するものと考えられているガラクトマンナン多糖（本明細書中ではＧＵＭまたはＧＵＭ１と呼ばれる）（シグマＧ−０７５３）である。
【００２６】
マンノースとガラクトースサブユニットとから構成されている多糖類は、リガンドの好ましいタイプであり、さらなる例はグアーであり、これは１，６α結合のほぼ１つ置きの単位にガラクトース側鎖を有するβ１，４結合されたマンノース主鎖を有している。マンノースとガラクトースの比率は約１．８：１〜約２：１であり、本明細書中説明される実験において用いたグアーはシグマ社製で、カタログ参照番号はＧ１４２９である。
【００２７】
さらなる多糖類には、ガラクトース、ラムノース、arabionseおよびグルクロン酸の側鎖ポリマーと考えられるアラビアゴム（シグマＧ９７５２）、およびガラクトース、ラムノースおよびグルクロン酸の部分アセチル化ポリマーと考えられるカラヤゴム（シグマＧ０５０３）、ならびにマンノース単位で構成されたホモ多糖マンナンが含まれる。
【００２８】
適切なリガンドである糖誘導体としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸およびカラギーナン（様々な形状）が含まれる。硫酸化糖は糖誘導体の好ましい種類である。
【００２９】
炭水化物のような微生物にとっての栄養分である分子をベースとしたリガンドにより、適切な分離手段がもたらされることを本発明者らは見出した。微生物の捕獲を向上させるため、受容体／リガンドの相互作用を利用することはもとより、培地中の栄養分の存在に対する細菌のプロアクティブな反応を利用する単離システムを提供することが本発明の方法の目的であった。本発明の方法による非特異的なリガンドとして用い得る、微生物にとっての栄養分としては、ニコチン酸、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよびコバミドなどのビタミン類、ならびにヘミン、ラクトフェリン、トランスフェリン、ヘモグロビンなどの鉄キレート分子／化合物およびアエロバクチン、フェリクロム（シグマＦ８０１４）、フェリエンテロケリン、エンテロバクチンおよびフェリキサニンンなどのシデロフォアが含まれる。
【００３０】
細胞（例えば微生物）に非特異的に結合し得るリガンドが表面に固定された固体支持体は、したがって、本発明のさらなる局面を構成する。「非特異的」とは上で定義されている（すなわち、細胞タイプまたは種特異的ではなく、結合パートナーとの相互作用に依存する）通りであり、適切なリガンドは、本明細書中では本発明の方法に関して説明される。
【００３１】
細菌ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）のフコース感受性およびマンノース感受性の赤血球凝集の研究において、Ｌ−フコースおよびＤ−マンノースは、アガロースビーズ（Sanchez et al. APMIS (1990) 98 353-357）に共有結合的に結合されており、したがってこれらの固体支持体−リガンド複合体は本発明の範囲には含まれない。この以前の研究は、１種類の細菌種のみを含む非常に特異的な相互作用を調べるものであり、汎用的な細菌単離方法ではない。したがって、本明細書中で定義される方法におけるこれらのビーズ−リガンド複合体の使用は、本発明の局面を含む。
【００３２】
固定化されたリガンドは好ましくは、オリゴ糖もしくは多糖、ビタミン（例えば微生物にとっての栄養分として必要なもの）または鉄キレート化合物でああり、特に好ましくは多糖類である。特に好ましいリガンドの例は、本発明の方法に関して前に論じた。
【００３３】
本明細書中で論じたように汎用的な分離方法が提供されるが、本発明者らは、特定の糖類を含むリガンドが、微生物の特定の非常に広い綱の分離に特に適していることを見出した。したがって、マンノース含有リガンド（リガンドはマンノースモノマーまたはマンノース含有ポリマーとし得る）を用いると、例えば消化管内に存在する細菌種は非常に効率的に単離され、肺を通って入る細菌は、リガンドとして硫酸化糖類を用いることにより非常に効率的に単離され、さらに尿路に感染する細菌は固定化グルコースに結合する（ここでも、モノマーとしてまたはポリマー中に組み入れられた時）。消化管または肺から採取された試料から細菌を分離する方法においてそのようなリガンドを使用することは、したがって、本発明のさらなる好ましい局面を構成する。
【００３４】
微生物が単離され得る試料としては、例えば湖、川、汚水処理施設およびその他の水処理センターからの水試料または土質試料のような環境試料が含まれる。これらの方法は、食品試料の分析ならびに細菌レベルの監視が要求される健康および衛生用途一般、例えば食品が製造されているエリアにおいて特に有用である。ミルク製品は例えば、リステリア菌について分析できる。固定化された抗体を用いる従来の細菌単離手法は、おそらく固定化された抗体の疎水性のため、リステリア菌を単離するために非特異的リガンドを用いる本発明者らの方法よりもずっと効率が悪いことが明らかになっている。試料が水試料である場合には、リガンドは、当該微生物にとっての栄養分であるのが好ましい。
【００３５】
食物試料は、必要であれば（固体試料であれば）最初にホモジナイズし、次に適切な培地（例えばペプトン水）と混合し、３７℃で一晩インキュベートすることにより分析できる。チーズ、アイスクリーム、卵、マーガリン、魚、エビ、チキン、牛肉、ポークリブ、小麦粉、ロールドオート、ボイルした米、コショウ、トマトやブロッコリや豆などの野菜類、ピーナッツおよびマジパンなどの食品はこの方法で分析できる。本発明の方法は、食品試料の分析にとりわけ役立つものである。なぜならば、これらの食品試料は固形物（集塊および脂肪粒）を多く含み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾向があり、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に利用できないからである。
【００３６】
本方法にしたがって微生物を単離できる試料は、人または動物の体から取られた臨床試料とし得る。適切な試料としては、全血および血液由来製品、尿、糞便、脳脊髄液またはその他任意の体液、ならびに組織試料および例えば体腔の拭き取りにより得られた試料が含まれる。
【００３７】
試料には、他の細胞分離工程により得られた半純粋製剤のような比較的純粋または部分精製された出発物質も含まれ得る。
【００３８】
本発明の固体支持体および方法は、試料からの真核細胞の非選択的単離に用い得ることも見出された。この方法は、単離のために、ただ一つの細胞タイプが標的とされるのではないという点で「非選択的」である。少なくとも２つ、好ましくは３つ以上、４つ以上さらには６つ以上の異なるタイプの真核細胞がこれらの方法により単離されるであろう。
【００３９】
したがって、さらなる局面において、試料からの真核細胞の単離方法が本発明によりもたらされ、この方法は、前記真核細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定化された非特異的リガンドにより結合する段階を含む。分離し得る適切な真核細胞は、多糖類に結合するレクチンをその表面に有しているものである。そのような方法は、血液または血液由来試料から、骨髄または白血球を含むどのような組織もしくは体液からでもすべてのタイプの白血球を捕獲することが望ましい場合に、とりわけ有用である。この用途について、特に適したリガンドとしては、カラギーナンおよびその誘導体、デキストラン硫酸のような硫酸化多糖類（グリコサミノグリカン類）、ヘパリンおよびヘパラン硫酸が含まれる。
【００４０】
発明のそのような方法により、少なくともＢ−細胞および単球、好ましくは全タイプの白血球でなくとも大部分が、同じビーズに結合させることにより単離し得る。赤血球は好ましくは捕獲されない。この方法は一般に、試料からのＤＮＡ単離方法の準備段階である。従来技術の方法による血液からのＤＮＡ単離は、試料の直接溶解とＤＮＡ捕獲により達成される。そのような手法では存在するすべての細胞が溶解されるのに対して、本発明の方法では、白血球が結合されて当該細胞の初期濃縮が可能になる。抗体ベースの分離システムでは、白血球の捕獲が一般にできないであろう。同様に、他の細胞グループが真核生物試料から単離できる。
【００４１】
したがって、本発明により、「細胞」が真核細胞または原核細胞とし得る細胞単離方法がもたらされ、用語「細胞」は前に定義したすべての微生物を含む。
【００４２】
本発明で用いる適切な固体支持体は、現在広く使用されているか、または固定、分離等向けに提案されている公知の任意の支持体またはマトリクスとすることができる。これらは、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、ファイバー、毛管、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブ、プレートまたはウエル等の形状を取ることができる
【００４３】
支持体は、ガラス、シリカ、ラテックスまたはポリマー材料で作るのが好都合である。細胞の、続いて核酸の結合用に大きい表面積を有する材料が好まれる。一般にそのような支持体は表面が不規則であり、例えば粒子、ファイバー、ウェブ、焼結物またはふるいなどの多孔性または粒子状である。粒状材料、例えばビーズは、特にポリマー製ビーズは結合能力が大きいので一般に好まれる。
【００４４】
本発明により用いられる粒状固体支持体は、球形ビーズを含むのが好都合である。ビーズのサイズは決定的ではないけれども、例えば、直径が少なくとも１μｍ、好ましくは少なくとも２μｍであり、最大直径がせいぜい１０μｍ、好ましくはせいぜい６μｍとし得る。例えば、直径が２．８μｍおよび４．５μｍのビーズがうまく働くことが示されている。
【００４５】
本発明の方法での使用に適した非磁性ポリマービーズは、Ｄｙｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＳ（リレストローム市、ノルウェー）ならびにＱｉａｇｅｎ社、Ｐａｒｍａｃｉａ社およびＳｅｒｏｔｅｃ社から入手可能である。
【００４６】
しかしながら、操作および単離を助けるには、磁性ビーズが好ましい。本明細書中で用いられる用語「磁性」は、磁場中に置かれた時に支持体が磁気モーメントを有することができ、したがってその磁場の作用下で移動可能であることを意味する。言い換えれば、磁気粒子を含む支持体は磁気凝集により容易に除去でき、これにより、細胞および核酸の結合段階に続く迅速、単純かつ効率的な粒子分離方法がもたらされ、さらにこれは、細胞の分断または核酸の劣化を引き起こし得るせん断力を発生させる遠心分離のような従来手法よりもはるかに過酷ではない方法である。
【００４７】
したがって、本発明の方法を用いることにより、細胞が付着した磁性粒子を、例えば永久磁石を使って磁場をかけることにより、適切な表面上へ取り去ることができる。通常は、試料混合物を収容している容器の側面に磁石を適用して容器壁に粒子を凝集させ、試料の残部を流して捨てれば十分である。
【００４８】
特に好ましいのは、たとえばＥＰ−Ａ−１０６８７３においてＳｉｎｔｅｆにより記載されている超常磁性粒子である。なぜならば、反応の間に粒子が磁性凝集および凝固することが回避でき、これにより均一な核酸抽出が保証されるからである。Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ市、ノルウェー）がダイナビーズ（DYNABEADS）として販売している周知の磁性粒子が本発明での使用に適している。
【００４９】
本発明で用いるために官能基被覆した粒子は、米国特許第４，３３６，１７３号、同４，４５９，３７８号、および同４，６５４，２６７号によりビーズを改質することにより調製できる。したがって、ビーズ、または他の支持体は、例えば正または負に帯電、親水性または疎水性の、種々のタイプの官能基化表面を有するように調製できる。
【００５０】
粒子は、好ましくは結合のための大きい表面積を提供し、したがって小さくかつ平滑でなくなる傾向がある。固体支持体の表面は、（リガンド固定の前または後）好ましくは疎水性ではない。
【００５１】
発明の方法における固体支持体として用いるとりわけ好ましい粒子は、内部に磁性コロイドが被包されたＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ベースの球形ポリマー粒子（ビーズ）である。これらのビーズは、ＣＡ２，２２７，６０８に記載されるような、磁性コロイド含有ポリマー相を乳化剤含有植物油相中に懸濁させて製造することができる。粒子は、サイズが１〜８μｍで変わり得、好ましくはＣｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ（ドイツ）から入手可能である。
【００５２】
結合に適した条件を達成するため、適切なバッファ等を単離用媒質として使用できる。適切な電荷、浸透圧等を有するバッファは、固体支持体との接触の前、それと同時に、またはその後に、試料に添加するのが好都合である。ＰＢＳは適切な細胞結合バッファである。
【００５３】
リガンドを固体支持体へ付着させる方法は、技術的に公知である。一般には、固体支持体は最初に活性化され、次にリガンドと反応させられ、リガンド自身は、固体支持体への共有結合的付着用に若干改質しておくことができる。上記で論じたＣｈｅｍａｇｅｎ社製の超常磁性ビーズのケースでは、ポリビニルアルコールマトリクスは、８原子スペーサーを介したイソシアネート官能基の導入により活性化できる。これらの活性化ビーズ（Ｍ−ＰＶＡ Ａ ｋ２ｘ）は次に、アミノ官能基またはヒドロキシ官能基を含んでいる分子の直接カップリング用に用い得る。典型的なカップリング反応は以下の通りである。
【００５４】
Ｃｈｅｍａｇｅｎ社は、カップリングによる同社のビーズの改質に関連した特許を有している。
【００５５】
細胞結合を調べるため、および特定の微生物についての定性的または定量的な情報が必要な場合には、さらなる同定段階を実施し得る。上記で説明した一般的な細胞分離方法を種特異的検出方法と組み合わせることは、本発明の特に好ましい実施形態である。
【００５６】
結合された微生物の同一性は、その微生物の核酸の分析、または特定タイプの微生物に特異的な標識抗体を用いる技術的に公知な他の手法により調べることができる。細胞を固体支持体に結合した後、微生物−ビーズ複合体からの核酸が、例えばＰＣＲにより単離および分析できるのが好都合である。したがって、微生物が前記固体支持体に結合した後、その後の分析用に核酸を微生物から放出する細胞溶解段階が行われる。放出された核酸は溶液中で分析し得るが、これが固体支持体に結合した後に分析するのがより好都合であり、この固体支持体は同じでも異なってもよいが、好ましくは微生物自身が結合した固体支持体と同じである。したがって、さらなる局面では、以下の段階を含む、微生物含有試料の分析方法が本発明により提供される。
（ａ）前記微生物を固体支持体へ、該固体支持体上に固定化された非特異的リガンドにより結合する段階、
（ｂ）前記固体支持体に結合された微生物を同定する段階。
【００５７】
段階（ｂ）は、
（ｃ）微生物を溶解し、さらに任意に
（ｄ）前記溶解された微生物から放出された核酸を固体支持体に結合することにより実行するのが好都合である。
【００５８】
代わりの見方をすると、本発明により、試料中の細胞タイプまたは微生物の検出方法が提供され、該方法は、上記に記載されるような段階（ａ）および（ｂ）を含む。
【００５９】
微生物を溶解し、こうして放出された核酸を結合しそして核酸を分析するのに適した方法は、参照により本明細書に含まれるＷＯ９８／５１６９３に記載されている。したがって、本発明のさらなる局面は、細胞試料から核酸を単離する方法であって、
（ａ）前記試料中の細胞固体支持体へを、該固体支持体に固体された非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、さらに
（ｃ）前記溶解された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階とを含む。
【００６０】
さらなる局面は、試料中の標的細胞の存在または不在を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）前記試料中の細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、
（ｃ）前記溶された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と、
（ｄ）前記結合された核酸中の、前記標的細胞に特徴的な核酸の存在または不在を検出する段階とを含む。好ましい細胞、リガンドおよび固体支持体は上記で論じた通りのものである。
【００６１】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の自然発生物もしくは合成修飾物とし得る。しかしながら好ましくは、核酸はＤＮＡであって、これは一重または二重の撚糸状あるいは任意の形状、例えば直線状または環状とし得る。
【００６２】
結合に続き、単離または支持体結合された微生物が溶解されてそれらの核酸を放出する。細胞溶解方法は技術的に公知かつ文献中に広く記載されており、公知方法のいずれも用い得る。種々の微生物について種々の方法がより適切であり得るが、例えば、以下の方法のうちのいずれも用い得るであろう。すなわち、例えば適切なバッファ中のＳＤＳ、ＬｉＤＳまたはサルコシルを用いた洗浄溶解；塩酸グアニジウム（ＧＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジウム（ＧＴＣ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、過塩素酸塩等のようなカオトロープ剤の利用；フレンチプレス、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いるまたは液体窒素中での磨砕のような機械的破砕；例えばリゾチーム、プロテイナーゼ、プロナーゼまたはセルラーゼあるいは商業的に入手可能な任意のその他の溶解酵素を用いる酵素溶解；バクテリオファージまたはウイルス感染による細胞溶解；凍結乾燥；浸透圧衝撃；マイクロ波処理；例えば加熱もしくは煮沸、またはドライアイスないし液体窒素中での凍結と、解凍による温度処理；アルカリ溶解である。上記で言及したように、そのような方法はすべて標準的な溶解手法であり、かつ技術的に公知であり、そのような方法または方法の組み合わせのいずれも用い得る。
【００６３】
溶解は、本発明にしたがって、カオトロープ剤および／または洗浄剤を用いて達成するのが好都合である。例えば、細菌細胞の場合、カオトロープ剤と洗浄剤との組み合わせは特に効果的であることが見出されている。したがって、典型的な適切な溶解剤としては、ＧＴＣまたはＧＨＣｌのようなカオトロープ剤とＳＤＳまたはサルコシルのような洗浄剤が含まれる。溶解剤は、単なる水溶液として供給するか、バッファ溶液中に入れていわゆる「溶解バッファ」とすることもできる。任意の適切なバッファを用いることができ、例えばＴｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅおよびリン酸塩バッファが含まれる。代わりに、溶解剤を別々に加えることができる。溶解剤の適切な濃度および量は、正確なシステム、ｃａｌｌｓの性質等に応じて変わり、適切に決定し得るが、ＧＴＣ、ＧＨＣｌ、ＮａＩまたは過塩素酸塩のようなカオトロープ剤を２Ｍ〜７Ｍの濃度で、ＮａＯＨのようなアルカリ剤を０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で、洗浄剤を０．１〜５０％（ｗ／ｖ）例、えば０．５〜１５％の濃度で用い得る。したがって、適切な溶解バッファの代表的な例は、４Ｍ ＧＴＣ、サルコシル１％（ｗ／ｖ）の水溶液である。
【００６４】
単離された支持体結合微生物は、試料の残部から好都合に除去または分離でき、その結果、細胞が濃縮または濃化される。したがって、細胞結合段階は、細胞を当初試料よりも小さい体積に濃化または濃縮するのに役立つ。次に、所望の溶解剤を含む適切な溶解バッファを加えるか、単離された分子を所望の溶解条件にかけることにより、溶解は好都合に達成し得る。例えば、適切な溶解剤を含む溶解バッファを単に加える場合、単離された細胞は、溶解バッファの存在下で、溶解を可能にする適切な時間単にインキュベートすることができる。種々のインキュベート条件は種々の溶解システムに適し、技術的に公知である。例えば、洗浄剤および／または溶解バッファ含有カオトロープ剤については、インキュベーションは室温またはより高い温度、例えば３７℃〜６５℃で起こり得る。同様に、インキュベーション時間は、数分、例えば５〜１０分間から数時間、例えば１〜２時間まで変わり得る。ＧＴＣ／サルコシル溶解バッファと細菌細胞との場合には、６５℃で１０〜２０分間のインキュベーションが適切であることが見出されているが、もちろん必要に応じて変え得る。例えばプロテイナーゼＫ等を用いる酵素溶解の場合には、より長い処理時間、例えば一晩、が必要になることがある。
【００６５】
溶解に続いて、放出された核酸は、好ましくは溶解された微生物が結合される固体支持体に共有結合的に結合されるのが好都合である。とはいえ、例えば、ビーズの混合群には、あるものには微生物に結合するための非特異的リガンドが提供され、他のものには核酸を結合するようにし得る。
【００６６】
この核酸結合は、核酸を固体支持体と結合するための技術的に公知のどのような方法ででも達成できる。核酸は支持体に、非特異的に、すなわち配列とは独立して結合され得るのが好都合である。したがって、例えば放出された核酸は、例えばアルコール、アルコール／塩の組合せ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の公知の核酸沈殿剤のいずれかを用いて、支持体上に沈殿させ得る。このようなビーズ上への核酸沈殿は、例えばＷＯ９１／１２０７９中に記載されている。したがって、核酸の沈澱を引き起こすアルコール添加に続いて、溶液中の支持体および放出された核酸に塩を添加し得る。代わりに、塩とアルコールとを一緒に添加することも、塩を省くこともできる。細胞結合段階に関して上記で説明したように、任意の適切なアルコールまたは塩を用いることができ、適切な量または濃度は容易に決定できる。
【００６７】
代わりの非特異的な核酸結合手法には、Ｄｙｎａｌ ＡＳのＷＯ９６／１８７３１中に記載されるような洗浄剤の使用（いわゆる「DNA Direct」法）、およびＡｋｚｏ Ｎ．Ｖ．によりＥＰ−Ａ−０３８９０６３中に記載されているカオトロープ剤と、シリカ粒子のような核酸結合固相との利用が含まれる。
【００６８】
支持体への核酸のイオン性結合は、帯電表面を有する固体支持体、例えばポリアミン被覆した支持体、を用いて達成できる。
【００６９】
本発明の方法において用いられる支持体は、核酸の特定的または非特異的結合を助ける官能基、例えば、ロイシンジッパーやヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質あるいはインターカレーション色素（例えば、臭化エチジウムまたはＨｏｅｃｈｓｔ４２９４５）、を有することもでき、これらは支持体上に被覆し得る。
【００７０】
同様に、核酸の選択的捕獲を助けるため、支持体に結合パートナーを付与することができる。例えば、補足的なＤＮＡないしＲＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質、ウイルス核酸に結合するウイルスタンパク質を用い得る。そのようなタンパク質の固体支持体への付着は、技術的に公知の手法を用いて達成できる。
【００７１】
発明にしたがって核酸を沈殿させる好都合な方法は、沈澱剤、例えばアルコールを、支持体と溶解細胞とを含んでいる混合物へ添加することである。したがって、適切な容量のアルコール、例えば１００％または９６％エタノール、を混合物に単に添加し、さらに放出された核酸が支持体に結合されるのに十分な時間インキュベートされる。この段階のためのインキュベーション条件は決定的ではなく、室温で５〜１０分間のインキュベーションを単に含み得る。しかしながら、選択によっては、時間の長さが変わり、温度が上昇し得る。
【００７２】
必要ではないが、例えば核酸結合段階に続いて、１つ以上の洗浄段階を本発明の単離方法に導入することが好都合なことがある。どのような従来の洗浄バッファまたは他の媒質でも用い得る。概して、イオン強度が低〜中程度のバッファは、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０／１０ｍＭ ＮａＣｌ）で調製できる。必要なら、例えばアルコールを含有する他の標準的な洗浄媒質も用いることができ、例えば７０％エタノールでの洗浄である。
【００７３】
磁性粒子を用いると、粒子を凝集させ、核酸結合媒質を除去し、洗浄媒質を添加し、さらに粒子を必要な回数だけ再凝集させることにより、容易な洗浄段階が可能になる。
【００７４】
核酸単離プロセスおよび必要となることがある任意の洗浄段階に続き、核酸が結合された支持体を、任意の適切な媒質、例えば水または低イオン強度バッファ中に、例えば再懸濁または浸漬することができる。支持体および所望の任意の後続処理の性質に応じ、支持体から核酸を放出させることが望ましいこともあれば望ましくないこともある。
【００７５】
磁性または非磁性ビーズのような粒子状固体支持体のケースでは、これは、多くの場合において、支持体から核酸を溶出することなく、例えばＰＣＲまたは他の増幅において直接用い得る。また、多くのＤＮＡ検出または同定方法については、溶出は必要ではない。なぜならば、ＤＮＡはビーズ表面とランダムに接触し、水素結合またはイオン性もしくは他の力によって多くのポイントにおいて結合され得るが、一般的にオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションおよび増幅に利用可能な十分なＤＮＡの長さがあるからである。
【００７６】
しかしながら、必要であれば、核酸の溶出は、公知の手段を用いて、例えば７０〜９０℃まで５〜１０分間加熱し、それに続いて支持体を媒質から除去して核酸を溶液中に残すことにより容易に達成し得る。そのような加熱は、ＰＣＲにおいて、繰り返しプログラムに先立つＤＮＡ変性段階により自動的に得られる。
【００７７】
もしＤＮＡからＲＮＡを除去する必要があれば、これは、ＤＮＡ単離段階の前に、例えばＲＮＡａｓｅまたはＮａＯＨのようなアルカリを添加することによってＲＮＡを破壊することにより達成し得る。
【００７８】
本発明の利点は、実施が迅速かつ簡単であることであり、この方法の単純さにより試料の高いスループットが可能になる。
【００７９】
本発明は、支持体としてもし粒子、特に磁性粒子が用いられれば、有利に自動化しやすい。
【００８０】
上記で言及したように、本発明の方法は、核酸ベースの検出手順で使用するための核酸を調製する最初の準備段階としてとりわけ有用である。
【００８１】
上記で言及したように、有利に結合された核酸は、検出段階の実行前に支持体から溶出または除去される必要が必要がない。ただし、必要であればこれを行うことができる。核酸が溶出されるかされないかも、核酸結合段階において用いられた特定の方法に依存する。したがって、特定の核酸結合手続は、他のものよりも緊密に核酸を結合する。例えば洗浄剤（例えば、ＤＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ）を用いたＤＮＡ結合の場合には、溶出バッファまたは他の適切な媒体が導入されると、核酸は固体支持体から溶出しようとする。アルコールまたはカオトロープのような沈澱剤によって結合された核酸は、より緊密に結合されたままで残ろうとし、バッファ媒質中に置かれても溶出しようとせず、溶出には加熱を要することがある。
【００８２】
したがって、特に支持体が粒子であれば、支持体結合核酸は、核酸ベースの検出手続において、単に支持体を検出段階に適した媒質中に再懸濁するか、支持体をこの媒質中に添加することによって直接用い得る。核酸が媒体中に溶出しても、または上記で言及したようであっても、核酸が溶出する必要はない。硫酸化糖類がリガンドとして用いられる場合は、溶出が好ましい。
【００８３】
核酸を検出するための多数の種々の技術が公知で文献中に記載されており、これらのいずれであっても本発明にしたがって使用し得る。最も単純には、核酸はプローブへのハイブリダイゼーションにより検出でき、非常に多くのそのようなハイブリダイゼーションプロトコルが記載されている（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照）。最も一般的には、検出は、これについて文献中に記載されている任意の方法を用いて、in situハイブリダイゼーション段階および／またはin vitro増幅段階を伴うであろう。したがって、言及したように、ＬＡＲ、３ＳＲおよびＱ−β−レプリカーゼシステムのような手法が使い得る。しかしながら、ＲＣＲおよびその種々の改良、例えばネステッドプライマーの使用は一般に選択される方法であろう（例えば、核酸増幅技術の総説についての、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47参照）。
【００８４】
他の検出方法は、シーケンシングアプローチ、例えば、Syvanen and Soderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692に記載されているようなミニシーケンシグアプローチに基づくことができる。
【００８５】
ＰＣＲのような増幅手法において、ＤＮＡ二重鎖を溶かす最初の段階において必要な加熱により、結合されたＤＮＡが支持体から放出されることがある。したがって、ＰＣＲのようなその後の検出段階の場合は、支持体に結合された核酸は反応混合物に直接添加することができ、核酸は検出プロセスの最初の段階において溶出する。本発明にしたがって得られた単離された支持体結合核酸試料全体または一部を検出段階において用い得る。
【００８６】
ＰＣＲやその他の検出段階の結果は、多くの方法により検出もしくは視覚化でき、それらの方法は従来技術において記載されている。例えば、ＰＣＲやその他の増幅産物は、電気泳動ゲル、例えば臭化エチジウム染色アガロースゲル上を、公知の手法を用いて走らせることができる。代わりに、ＤＩＡＮＡシステムを用いることができ、これはネステッドプライマー法の改良である。ＤＩＡＮＡ（Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids：固定化された増幅核酸の検出）システム（Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)参照）においては、内側の第２のプライマーペアは、それぞれ、増幅されたＤＮＡの捕獲を可能にする固定化手段と、ラベルすなわち認識を可能にするラベルの付着手段を有している。これにより、バックグラウンド信号の減少と、増幅ＤＮＡの迅速かつ容易な検出手段という二重の利点がもたらされる。リアルタイムＰＣＲ法は、ＤＮＡ検出、例えば５’ヌクレアーゼＰＣＲまたは蛍光プローブを用いる手法において用い得る。
【００８７】
多くの種々のシーケンシング手法、例えば標準シーケンシング、固相シーケンシング、サイクリックシーケンシング、自動シーケンシングおよびミニシーケンシグのいずれかを用いたシーケンシングにより、増幅核酸も検出でき、または結果が確認される。
【００８８】
本発明の方法を実行するために必要な様々な反応物質および構成要素は、キットの形で供給するのが好都合である。そのようなキットは本発明のさらなる局面である。
【００８９】
最も単純には、本発明のこの局面により、
（ａ）微生物に非特異的に結合できるリガンドをその表面に固定した固体支持体と、
（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための方法と、任意に
（ｃ）前記細胞を溶解するための手段と、さらに任意に、
（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手段とを含む、微生物を試料から単離するキットが提供される。
【００９０】
様々な手段（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、本発明の方法に関連して上記で記載および論じられた通りのものとし得る。
【００９１】
典型的なキットは、固体支持体、例えばＧＵＭ１のような多糖類で被覆した粒子と、例えばＰＢＳのような結合バッファと、溶解バッファとを含み得る。
【００９２】
さらなる任意の構成要素は、（ｅ）標的微生物に特有な核酸の存在または不在を検出するための手段である。上記で論じたように、そのような手段には、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づく検出手法において使用される適切なプローブまたはプライマーオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００９３】
任意に、そのようなキットには、バッファ、塩類、ポリマー、酵素等がさらに含まれ得る。
【００９４】
本発明のキットは、ＰＣＲ増幅用の細菌抽出およびＤＮＡ単離において大きな実際的な有用性がある。このキットによる使用に適したプロトコルは以下の通りで、磁性または磁化可能ビーズが固体支持体（ａ）として選択されたものと想定する。
− 結合バッファ（ｂ）とビーズとを組み合わせ、一晩培養した培地からの試料を添加し、例えばエッペンドルフ型チューブ内で混合する。
− 磁石の影響下に置き、細菌／ビーズ複合体をチューブ側面に移動させる。
− 上澄みをピペットで取って捨てる。
− 溶解バッファ（ｃ）を加え、エタノールでインキュベートする。
− 磁石を用いて上澄みからビーズを分離し、上澄みをピペットで取って捨てる。
− ビーズを洗浄して上澄みを除去する。
− ビーズ／ＤＮＡ試料をＰＣＲ用に再懸濁する。
【００９５】
本発明のさらなる局面によれば、試料からの細胞の全体的分離における、本明細書中に記載される固体支持体の使用がもたらされる。この分離は「全体的」である。なぜならば、これは細胞特異的な単離方法ではなく、むしろ試料中に存在する細胞（例えば微生物）を他の構成要素から単離する一般的な方法だからである。すでに、そのような方法は濾過または沈殿により達成されている。対照的に、本明細書中に記載される固体支持体は、リガンド−レセプタ結合の利点を組み合わせるために用いることができるが、種または細胞タイプ特異的なやり方ではない。本明細書中に記載されるように、固体支持体に付着させられたリガンドは、試料中の微生物のタイプ（例えば種々の細菌種）または真核細胞タイプの（大半ではないが）かなりの割合と結合し、試料全体から全体的な分離を達成することができる。
【００９６】
以下、本発明を非限定的な実施例において図面を参照しつつより詳細に説明する。
【００９７】
（発明を実施するための最良の形態）
実施例１
炭水化物被覆粒子の製造と細胞結合特性の試験
化合物は、Ｍ−ＰＶＡ ＯＣＮ−活性化ビーズ（Chemagen AG）上で結合させた。反応は以下の通りである。
【００９８】
改質したビーズを、種々の菌液、すなわち純粋な未希釈菌液（ｏ．ｎ．）あるいは水またはバッファ（ＰＢＳ）中で希釈した菌液と共にインキュベートした。細胞結合を調べるため、ＤＮＡを細菌−ビーズ複合体から単離し、その後にＰＣＲを実施することにより分析した。参考文献：ＷＯ９８／５１６９３。このカップリング反応は、Ｃｈｅｍａｇｅｎ社により実施され、その結果得られた改質ビーズはｍ本明細書中で論じた本発明の単離方法において用いた。
【００９９】
実施例２
ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル
細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３０℃、無撹拌で一晩培養した。ＰＢＳ（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ１０μｌを混合し（１０ｍｇ／ｍｌ）、次に一晩培養した菌液１００μｌを添加し、ピペット操作により穏やかに混合した。チューブを室温で５分間放置した。上澄みを磁気選別機を用いて除去し、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍ guaridineチオシアネート−１％サルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを開けたままで、６５℃で５分間インキュベートした。
【０１００】
次に、９６％エタノール１００μｌを添加し、ふたを閉じたままでインキュベーションを５分間継続した。上澄みを磁気選別機を用いて除去し、ビーズ−ＤＮＡ試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄した。
【０１０１】
ビーズ−ＤＮＡ試料を、Ｈ２Ｏ４５μｌ中に再懸濁し、エタノールのすべての痕跡を除去するため、ふたを開けたままで６５℃で１５分間インキュベートした（代わりに、Ｈ２Ｏ５μｌを加えてビーズを湿らせ、次にこのビーズを６５℃で５分間インキュベートしてもよい）。精製物質２０μｌを１回の５０μｌＰＣＲで用いた。
【０１０２】
単離された細菌を同定するため、種特異的またはグループ特異的プライマー（ＸおよびＹ）を用いたＰＣＲ増幅を実施した。
【０１０３】
下記の表１は種々の細菌についての適切なプライマーを示すものである。
【表１】
ＰＣＲ増幅は５０μｌ容積で実施した：Ｈ２Ｏ−１７．５μｌ；ｄＮＴＰ２ｍＭ−５μｌ；１０ｘバッファＤｙｎａＺｙｍｅ−５μｌ；プライマーｘ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）−１μｌ；プライマーｙ１０ｐｍｏｌ／μｌ−１μｌ；酵素Ｄｙｎａｚｙｍｅ２Ｕ／μｌ−０．５μｌ；テンプレート−２０μｌ。温度プログラム：９４℃−４分間、次に、９６℃−１５秒間；５６℃−３０秒間；７２℃−１分間のパラメーターで３５サイクル；続いて７２℃−７分間。
【０１０４】
ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
【０１０５】
実施例３
実施例２のプロトコルを、D−マンノースがカップリングされたＭ−ＰＶＡを用いて実施した。
【０１０６】
このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１０７】
実施例４
実施例２のプロトコルを、マルトースがカップリングされたＭ−ＰＶＡビーズを用いて実施した。
【０１０８】
このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１０９】
実施例５
実施例２のプロトコルを、ガラクトマンナン多糖類（ＧＵＭ１）がカップリングされたＭ−ＰＶＡビーズを用いて実施した。
【０１１０】
このビーズは、とりわけアエロモナス属、バシラス属、カンピロバクター属、シトロバクター属、クロストリジウム属、エンテロバクター属、大腸菌（病原性および非病原性）、ハフニア属、クレブシエラ属、リステリア属、プロテウス属、サルモネラ属、シェワネラ属、セラチア属、シゲラ属、ビブリオ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１１１】
これらの実験の結果は、図３のゲル写真に見ることができる。以下のスキーム計画にしたがって特定の細菌がビーズに結合することを表すＰＣＲ産物のバンドが示してある。
【０１１２】
レーン１、ＤＮＡマーカー（GeneRuler(登録商標)１００ ｂｐ ＤＮＡラダー、Fermentas社製）；
レーン２−３、それぞれKlebsiella pneumoniasおよびK.oxytoca；
レーン４−６、それぞれShigella flexneri、S.sonneiおよびS.boydii；
レーン７−８および１２−１３、Vibrio cholerae（レーン７および１２）、V. vulnificus（レーン８）、およびV. parahaemolyticus；
レーン９、Hafnia alvei；
レーン１０−１１、それぞれAeromonas sobriaおよびA. hydrophila；
レーン１２−１３、Vibrio（上記参照）；
レーン１４、Proteus vulgaris；
レーン１５−１６、それぞれSalmonell enterica ssp typhimuriumおよびS. enterica ssp enteritidis；
レーン１７−１８および４１−４４、Yersinia enterocolitica（レーン１７−１８（血清型不明）、血清型Ｏ：９（レーン４２）、Ｏ：８（レーン４３）、およびＯ：３（レーン４４））、およびY. pseudotuberculosis（レーン４１）；
レーン１９、Escherichia coli；
レーン２０−２１、それぞれListeria innocuaおよびL. monocytogenes；
レーン２２−２３および３８−３９、Bacillus cereus（レーン２２）、B. subtilis（レーン２３）、およびB. simplex（レーン３８−３９）；
レーン２４、Citrobacter freundii；
レーン２５−２６、それぞれClostridium perfringensおよびC. sordelli；
レーン２７−３０、Escherichia coli、病原性
レーン３１−３７、Campylobacter jejuni（レーン３１）およびC. lari（レーン３２−３７）；
レーン３８−３９、Bacillus（上記参照）；
レーン４０、Brochothrix thermosphacta；
レーン４１−４４、Yersinia（上記参照）；
レーン４５−４７、それぞれEnterobacter sakazakii、E. aerogenes、およびE. cloacae；
レーン４８、Morganella morganii；
レーン４９、Serratia marcescens；
レーン５０−５２、Shewanella putrefaciens；
レーン５３−５４、それぞれPhotobacterium phosphoreumおよびP. damsela；
レーン５５、Streptococcus thermophilus；
レーン５６、Lactococcus lactis；
レーン５７、Staphylococcus warneri；
レーン５８、Enterococcus faecalis；
レーン５９−６０、Leuconostoc mesenteroides；
レーン６１−６４、Pediococcus acidilactici（レーン６１−６２）およびP. damnosus（レーン６３−６４）；
レーン６５−６９、Lactobacillus acidophilus（レーン６５、６８および６９）、およびL. plantarum（レーン６６−６７）。
【０１１３】
実施例６
E. coliを、実施例３、４、および５のビーズならびにダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）（未活性化）を用いて、一晩培養菌液から単離した。核酸を放出するための溶解後、約６００ｂｐのE. coli ＤＮＡシーケンスを、プライマーＵ５９／Ｌ６７３を用いて増幅した（表１参照）。
【０１１４】
結果を図１に示す。
レーン２−５、１５μｌテンプレートを用い、レーン７−１０では、５μｌテンプレートを用いた；
レーン１および６、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン２および７、マンノース被覆ビーズ；
レーン３および８、マルトース被覆ビーズ；
レーン４および９、ＧＵＭ１被覆ビーズ；
レーン５および１０、活性化ダイナビーズＭ−２８０。
【０１１５】
実施例７
B. cereus ATCC 14579を、一晩培養菌液（１００mlＴＳＢ、３０℃）２mlから、実施例５のビーズと未被覆ビーズ（参照記号：ＵＮＣ）を用い、以下の希釈に従って単離した。
レーン１、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン２、１００μｇＵＮＣ、未希釈菌液；
レーン３、５０μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン４、１００μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン５、２００μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン６、１００μｇＵＮＣ、１０１希釈菌液；
レーン７、５０μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン８、１００μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン９、２００μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン１０、１００μｇＵＮＣ、１０２希釈菌液；
レーン１１、５０μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１２、１００μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１３、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン１４、２００μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１５、１００μｇＵＮＣ、１０３希釈菌液；
レーン１６、５０μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１７、１００μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１８、２００μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１９、１００μｇＵＮＣ、１０４希釈菌液；
レーン２０、５０μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２１、１００μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２２、２００μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２３、１００μｇＵＮＣ、１０５希釈菌液；
【０１１６】
核酸を放出するための溶解の後、約６００のｂｐのB. cereusシーケンスを、プライマーＵ５５２／Ｌ１２５４を用いて増幅した（表１参照）。結果を図２に示す。１０１希釈の場合の結果はエラーとなるであろう。なぜならば、５０μｇのＧＵＭ１と２００μｇのＧＵＭ１は両方とも、細胞結合を示す、核酸検出についてポジティブな結果を与えるからである。概して、未被覆ビーズの場合よりもＧＵＭ１の場合のほうが、結合が１００−１０００倍良好なことを結果が示している。
【０１１７】
実施例８
他のビーズは、本発明の原理を説明するために使用し、特に適切なビーズタイプはダイナビーズＭ−２７０エポキシ、製品番号１４３．０２（ノルウェー国Ｄｙｎａｌ ＡＳから入手可能）である。
【０１１８】
ビーズの調製
無菌濾過した０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌを乾燥ビーズ３０ｍｇに加えて、１ｍｌ当たりビーズ約１０９個の濃度とした。ビーズを約３０秒間渦攪拌することにより再懸濁し、次に低速チルト回転で１０分間インキュベートした。チューブを磁石上に４分間置き、上澄みをピペットで慎重に取り除いた。
【０１１９】
０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌをチューブに再度加え、ビーズを渦攪拌により適切に混合した。チューブを磁石上に４分間置き、上澄みを除去した。
【０１２０】
洗浄したビーズを、０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）６００μｌ中に再懸濁して、リガンド溶液添加後に推奨ビーズ濃度と硫酸アンモニウム濃度になるようにした。このビーズ溶液を被覆手順において用いた。
【０１２１】
被覆手順
リガンドをＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、無菌濾過した。
【０１２２】
Ｄｙａｎａｌ社の推奨に従い、リガンド６００μｌを、ビーズ溶液６００μｌと無菌濾過３Ｍ硫酸アンモニウム６００μｌと混合した。チューブを、室温で低速回転により一晩インキュベートした。
【０１２３】
インキュベーション後、チューブを磁石上に４分間置き、上澄みを除去した。被覆ビーズを、２ｍｌＰＢＳで合計４回洗浄した。最後にビーズを３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁し、４℃で保管した。
【０１２４】
実施例９
ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル
細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３７℃で一晩培養した。ＰＢＳ（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ（１０ｍｌ／ｍｌ）２０μｌとを混合し、次に一晩培養菌液１００μｌを加え、ピペット操作により穏やかに混合した。チューブを室温に５分間放置した。上澄みを磁気分離機により除去し、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍグアニジンチオシアネート−１％サルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを閉じた状態で、８０℃で５分間インキュベートした。
【０１２５】
次に、９６％エタノール１５０μｌを加え、インキュベーションを５分間継続した。磁気分離機により上澄みを除去し、ビーズ−ＤＮＡ試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄した。
【０１２６】
ビーズ−ＤＮＡ試料をＨ２Ｏ３０μｌ中に再懸濁し、エタノールの痕跡をすべて除去するためにふたを開けたままで、８０℃で１０分間インキュベートした。精製物質３０μｌ全部を１回の５０μｌＰＣＲにおいて用いた。
【０１２７】
実施例１０
実施例９のプロトコルを用いて細菌を単離し、この単離した細菌を同定するため、以下のプライマー用いたＰＣＲ増幅を実施した。
【０１２８】
実験Ａ−Ｅ
表１の通り。
【０１２９】
実験Ｆ
ＵＰＰＥＲ：５’ TGCTTTACACATGCAAGTCG ３’
ＬＯＷＥＲ：５’ CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG ３’
【０１３０】
以下の実験で用いたビーズは、Ｄｙｎａｌ ＡＳ製ダイナビーズM−２７０またはＣｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ製Ｍ−ＰＶＡ ＯＣＮ−活性化ビーズである。
【０１３１】
以下の実験Ａ−Ｇで用いた細菌は次の通りである。
Aeromonas hydrophila CCUG ２５９４２
Bacillus cereus ATCC １１７７８
Bacillus cereus NVH ００７５−９５
Campylobacter jejuni CCUG ２５９０３
Clostridium perfringens ATCC １３１２４
Escherichia coli ATCC ２５９２２
Escherichia coli CCUG ３８０８１
Helicobacter pylori CCUG ３８７７１
Listeria monocytogenes ATCC ３５１５２
Listeria monocytogenes CCUG １５５２７
Neisseria gonorrhoeae ATCC ４９２２６
Salmonell typhimurium ATCC １４０２８
Salmonella typhimurium CCUG ３１９６９
Shigella flexneri CCUG ３８９４７
Streptococcus pyogenes CCUG ３０９１７
Streptococcus pneumoniae CCUG ３３０６２
Vibrio cholerae CCUG ４２５３４
Yersinia enterocolitica Noma ref １０２、Y８４２
【０１３２】
以下の実験においては、一般に増幅はＤＮＡ−ビーズ複合体に直接実行した。しかしながら、増幅手法を用いる細菌種の同定は、上澄みに実行することができる。ヘパリン、デキストラン硫酸およびカラギーナンのような特定の結合リガンドについては、硫酸基がＰＣＲ反応を阻害することがあるので、これが好ましいことがある。以下の実験においては、特に指示されていなければ、カラギーナン被覆が用いられる場合は、ビーズを８０℃でインキュベートしてすべてのＤＮＡをビーズから放出した後に、ＰＣＲを上澄みに対して実施する。
【０１３３】
この実施例においては、「カラギーナン」は、イオタカラギーナン（シグマ、Ｃ−３８８９）を意味する。ヘパリンおよびデキストラン硫酸はシグマ社から入手し、カタログ参照番号はそれぞれＨ３１４９およびＤ６９２４である。
【０１３４】
Ａ．ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたVibrio choleraeからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図４のゲル写真に示してある。
【０１３５】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー（弱）
ウエル番号２＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１３６】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝ネガティブコントロール
【０１３７】
Ｂ．ゴム、マンノース、カラギーナンを用いたShigella flexaneriからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図５のゲル写真に示してある。
【０１３８】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１３９】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４０】
Ｃ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたE. coliからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図６のゲル写真に示してある。
【０１４１】
ゲル上には６本のラインがあり、すべてE. coliを示す。
【０１４２】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝ネガティブコントロール
【０１４３】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４４】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４５】
ライン４：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４６】
ライン５：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４７】
ライン６：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４８】
Ｄ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたSalmonella typhimuriumからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図７のゲル写真に示してある。
【０１４９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝ネガティブコントロール
【０１５０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５１】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５２】
ライン４：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１５３】
ライン５：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１５４】
ライン６：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
Salmonella typhimuriumからのＤＮＡ単離
【０１５５】
Ｅ．グアー、ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたCampylobacer jejuniからのＤＮＡ単離
増幅の結果は図８のゲル写真に示してある。
【０１５６】
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１６＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１７＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１８＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１９＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２０＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２１＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２２＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２３＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２４＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２５＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２６＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２７＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２８＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２９＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３０＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３１＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３２＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３３＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３４＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３５＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３６＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３７＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５７】
Ｆ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたStreptococcus pyrogenesからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図９のゲル写真に示してある。
【０１５８】
ライン１：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５９】
ライン２：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６０】
ライン３：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６１】
ライン４：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後ビーズの残部にＰＣＲを実施
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６２】
Ｇ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたNeisseria gonorrhoeaeからのゲノムＤＮＡ単離
増幅の結果は図１０のゲル写真に示してある。
【０１６３】
ライン１：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６４】
ライン２：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６５】
ライン３：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６６】
ライン４：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６７】
実施例１１
実験は、Ｊ５５８Ｌと呼ばれるがんＢ−細胞ラインの純培養液について実施した。用いたプライマーは下記の通りである。
ＵＰＰＥＲ：5’ CCCGCCCCTTGCCTCTC 3’
ＬＯＷＥＲ：5’ TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3’
【０１６８】
増幅の結果は図１１のゲル写真に示してある。磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施。
【０１６９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１７０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７１】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７２】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７３】
用いた種々のタイプのカラギーナンは以下の通り（シグマ社カタログ中の製品番号を付す）：
タイプＩカラギーナン − 大部分がカッパカラギーナン：Ｃ１０１３
タイプＩＩカラギーナン − 大部分がイオタカラギーナン：Ｃ１１３８
タイプＶカラギーナン − イオタカラギーナン：Ｃ−３８８９
【０１７４】
実施例１２
ＧＵＭ被覆ビーズからE. coliを実施例８のプロトコルに従って単離した。未被覆ビーズを被覆ビーズと同じ被覆手順に通したが、糖は加えなかった。実施例９の単離プロトコルに続いて下記の希釈を行った。
【０１７５】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７６】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７７】
増幅の結果は図１２のゲル写真に示してある。
【０１７８】
実施例１３
種々の細菌種を、実施例８のプロトコルに従ってＧＵＭ被覆ビーズから単離した。実施例９の単離プロトコルに続き下記の操作を行い、増幅の結果は図１３のゲル写真に示してある。
【０１７９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝未希釈のShigella flexneri１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝未希釈のVibrio cholerae１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝未希釈のAeromonas hydrophila１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝未希釈のStreptococcus pneumonia１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝未希釈のStreptococcus pyogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝未希釈のSalmonella typhimurium１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝未希釈のYersinia enterocolitica１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１８０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝未希釈のE. coli１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝未希釈のListeria monocytogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝未希釈のClostridium perfringens１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝未希釈のBacillus cereus１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝未希釈のCampylobacter jejuni１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝未希釈のNeissseria gonorrhoeae１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝未希釈のBordetella pertussis１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１８１】
bordetella用プライマーは、Nesseria用のものと同じであった（表１参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マンノース、マルトースおよびＧＵＭ１で被覆したビーズと結合された細菌（E. coli）の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図２】 ＧＩＭ１被覆ビーズと、未被覆ビーズと結合された細菌（B. cereus）の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図３】 ＧＵＭ１被覆ビーズへの多様な細菌の結合を示す一連のゲル写真を示す。
【図４】 種々の被覆ビーズに結合されたVibrio choleraeの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図５】 種々の被覆ビーズに結合されたShigella flexneri の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図６】 種々の被覆ビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図７】 種々の被覆ビーズに結合されたSalmonella typhimuriumの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図８】 種々の被覆ビーズに結合されたCampylobacter jejuniの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図９】 種々の被覆ビーズに結合されたSteptococcus pyogenesの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１０】 種々の被覆ビーズに結合されたNeisseria gonorrheaeの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１１】 種々の被覆ビーズに結合されたヒト白血球細胞の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１２】 被覆および未被覆ダイナビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１３】 ＧＵＭ被覆ダイナビーズに結合された種々の細菌の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
（技術分野）
本発明は、試料中に存在する微生物の単離方法、とりわけ試料中に存在する細菌の単離方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
微生物の存在について試料を定性的および定量的に分析しようとする現在の手法のほとんどは、特定の微生物、例えば病原体の同定に向けられている。食品および臨床試料からのリステリア菌およびサルモネラ菌の菌株の免疫磁気分離が記載されている（例えば、Skjerve et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 3478-3481参照）。そのような手法は、当該微生物に特異的なリガンド、一般的には抗体、の使用に依存している。免疫磁気分離は特異的なリガンドの使用に依存しているので、特定の微生物を同定するために探す状況においてのみ適用可能であって、存在するかもしれない微生物についての全般的な選別が求められる状況では適用できない。免疫磁気分離では、疑われていない微生物をピックアップするのは容易ではないであろう。
【０００３】
例えば、水試料のような環境試料を分析する場合、存在する種々の微生物種の全体像または微生物の総濃度の推定を得ることが望ましい状況がある。上水道中に存在し得る細菌の総量に関して制限が設けられることがあり、これは特定細菌の存在についての問題とは独立している。例えば川または湖における微生物の広範な種類の同定により、その水域の状態、栄養分レベル、農薬流出等のについての有益な情報がもたらされる
【０００４】
もし試料から微生物を単離する一般的な方法が提供できれば、存在する特定微生物の同定は次の段階において都合よく実行できる。核酸に基づく分析は、特定微生物の識別に都合よく使用できるであろう。
【０００５】
試料中に存在する微生物の総量の推定を得るため、またはさらなる分析用に微生物を試料から単離するために現在用いられている方法は、濾過および／または遠心分離ならびに寒天プレート上での培養を伴うかなり荒い分離手法に頼っている。総細菌濃度の決定は、フローサイトメトリーまたは濾過および例えばペトリ皿中の一般培地上での培養により実行し得る。これらの方法には数日を要することがあり、かなり複雑かつ不正確である。食品試料の分析に用いられる従来方法に特有の問題が観察されている。これは食品試料が固形物（集塊および脂肪粒）を多く含み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾向があり、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に利用できないからである。
【０００６】
したがって、実行が迅速かつ便利で、多数の微生物種を試料から、好ましくは一段階で、単離できる方法に対する需要がある。
【０００７】
（発明の開示）
本発明はこれらの要求に対処するものであり、したがって、本発明の１つの局面によれば、試料からの微生物単離方法が提供され、この方法は、前記微生物を固体支持体上に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより、結合する段階を含む。
【０００８】
したがって、本発明は、固体支持体に付着させた非特異的リガンドと、微生物表面に見られる前記リガンドとの結合パートナー（受容体）との間の相互作用の利用により、広い微生物綱の捕獲を可能にする一般的単離方法を提供する。本発明の本質が、固定されたリガンドと微生物との間の非特異的相互作用なので、本明細書中で「微生物単離」に言及する時は、微生物の非種特異的および非属特異的な方法による単離を意味することを意図している。換言すれば、固定されたリガンドは、複数の属、少なくとも２種類の異なる属、好ましくは３種類以上、より好ましくは５ないし７種類の異なる属、最も好ましくは少なくとも１０あるいは１４種類以上の異なる属の微生物と結合することができる。
【０００９】
このように本発明により、微生物、特に細菌を試料中の他の成分から単離する一般的方法が提供される。この方法は、１つの細菌種を標的にするのではなく、微生物集団全体についての情報を得るためまたは例えば種特異的プローブを用いた核酸レベルでの種特異的情報が得られる第２の段階を容易にするために総分離システムが達成されるという意味で「一般的」である。
【００１０】
微生物は、それらが固体支持体に結合され、次いで試料の残部から、微生物を結合させたまま固体支持体を取り去るか試料の残部を例えば流出により取り去ることによって分離し得るという点で「単離される」。固体支持体が磁気を帯びている場合には、支持体／微生物複合体の操作は特に便利である。
【００１１】
本発明の方法は、原生生物、藻類、原虫および菌類ならびにマイコプラズマ、すべての細菌およびウイルスを含む、真核細胞に結合し得るすべての微生物を含む多種多様な微生物の単離に用い得る。本発明の方法は、真核生物寄生生物、特にヒト細胞（または他の宿主生物体）上に見られる複合多糖類に結合できるものの単離に用い得る。そのような真核生物寄生生物には、クリプトスポリジウム、赤痢アメーバおよびマラリア原虫が含まれる。したがって、本明細書における「微生物」への言及は、そのような寄生生物を含むものと解されるべきである。
【００１２】
本発明の方法は、細菌の単離に特に適している。細菌の分類は複雑かつ絶え間なく変わる科学であるが、「真の」細菌（真正細菌）は多数のパート（Bergey’s Manual of Determinative Biology）、例えば光合成細菌、滑走細菌、有鞘細菌およびグラム陽性球菌に分割し得る。個々のパートは次に、１つ以上の目に分割され、その目内に科と属がある。１つ以上の属、科、または目あるいはパートの細菌は、本発明の方法を用いて単離し得る。細菌の以下の科および属のいくつかまたはすべての細菌の試料から効果的な分離を本発明の方法を用いて達成できる。すなわち、アエロモナス、バシラス、カンピロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、エンテロバクター、エシェリキナ（病原菌および非病原菌）、ハフニア、クレブシエラ、リステリア、プロテウス、サルモネラ、シェワネラ、セラチア、シゲラ、ビブリオ、エルシニア、モルガンラ、フォトバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ラクトバシラス、ブロコスリックスである。
【００１３】
この方法は、細菌と他のタイプの微生物、例えば藻類、原虫、菌類またはウイルスを同時に単離するために用い得る。
【００１４】
特定の状況では、試料は限られた数のタイプの細菌のみを含み、この方法により、いくつかの、あるいは１つか２つの細菌種のみが結合されて試料から単離される結果になることがある。それでもやはりそのような方法は特異的な方法ではない。なぜならば、利用可能な細菌群がある程度限定されていても、固定されたリガンドは多種多様な細菌と結合し得るからである。
【００１５】
任意の単離方法を実行するために特定の固体支持体−リガンド複合体を選択する必要がないという事実により、柔軟性およびコストの点で著しい利点がもたらされる。なぜならば、リガンドが付着した１つの固体支持体は、多種多様な単離／分離方法において用い得るからである。したがって、特に有利なのは固体支持体の一般的な結合能力である。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法の結果、試料中に存在する微生物（例えば細菌）が、存在するすべての細菌細胞の割合および細菌のタイプの割合双方について、高い割合で単離される。したがって、好ましくは試料中の微生物の少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは７０〜８０％の微生物が固体支持体に結合されるであろう。当然ながら、結合される試料中の微生物の百分率は、試料に添加される固体支持体の量と微生物に対するリガンドの比率に依存する。上記の百分率については、混合物中に存在する固体支持体とリガンドとが過剰にあるものと見なされる。
【００１７】
別の見方をすると、存在する種々の（例えば細菌の）種の少なくとも２０％の標本が好ましくは単離され、存在する種々の（例えば細菌の）種のより好ましくは少なくとも３０〜４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の、特に少なくとも６０〜７０％の、さらには少なくとも８０％の標本が固体支持体に結合される。
【００１８】
「非特異的」リガンドとは、上で論じたように、１種類以上、好ましくは２〜３種類以上、より好ましくは、５〜７種類以上、例えば１０〜１４種類以上の微生物および／または細菌属と結合できるものである。リガンドと、微生物の表面上にあって結合の原因であるその結合パートナーとの間に相互作用があるのであり、細胞が沈殿により固まる場合のように、細胞と固体支持体との間に一般的な引力または会合が単にあるのではない。リガンドの非特異的特徴は、リガンドが微生物表面の一部と無差別に結合または会合できるということではなく、リガンドの結合パートナーが微生物の特定のタイプまたは種に対して特異的ではないということを指す。したがって、リガンドは、汎用結合リガンドであると見なし得る。
【００１９】
適した結合パートナーは、種々の微生物中に、特に種々の細菌属中に比較的広く見出されるので、かなり一般的、したがって非特異的な単離方法がもたらされる。したがって、リガンドは１つ以上の特異的な結合パートナーを有する一方で、適した結合パートナーを有している多種多様な細菌すべてと結合できるという意味で「非特異的」である。理論により拘束されることを望むのではないが、それ自体が一般に種特異的である多種多様な結合パートナーは同じリガンドと結合することができ、したがって種特異的でない分離方法がもたらされる。種特異的レクチンは、炭水化物ベースのリガンドと共に非種特異的分離システムを提供することができる。
【００２０】
結合パートナーは一般に微生物表面のタンパク質であり、種ごとに変わり得る。結合パートナーについてあまり多くは知られていないが、それにもかかわらず本発明の方法で用いる適切なリガンドを本発明者らは同定することができた。
【００２１】
リガンドは非タンパク質であり、したがって抗体および誘導体ならびにそれらのフラグメントは排除される。本発明の方法の非特異的リガンドと対照的に、そのようなタンパク質リガンドは、例えば細胞上のタンパク質と非常に特異的な（すなわち、属、特に種特異的な）相互作用が可能である。
【００２２】
好ましいリガンドは炭水化物であり、単糖類、オリゴ糖類（二糖類および三糖類を含む）および多糖類が含まれる。適切な単糖類としては、適宜ピラノースおよびフラノースの形のヘキソースおよびペントース、ならびにアルドン酸およびウラオン酸、デオキシ糖またはアミノ糖、硫酸化糖および糖アルコールのような誘導体が含まれる。適切な単糖類の例としては、マンノース（例えばD−マンノース）、ガラクトース（例えばＤ−ガラクトース）、グルコース（例えばＤ−グルコース）、フルクトース、フコース（例えばＬ−フコース）、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ラムノース、ガラクトサミン、グルコサミン（例えばＤ−グルコサミン）、ガラクツロン酸、グルクロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、メチルＤ−マンノピラノシド（マンノシド）、α−メチル−グルコシド、ガラクトシド、リボース、キシロース、アラビノース、サッカラート、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グリセリンおよびこれらモノマーの誘導体が含まれる。これらの中で、マンノース、ガラクトースおよびフコースが好ましい。
【００２３】
特に好ましいのはオリゴ糖類および多糖類であり、これらは、単糖モノマーのポリマー、例えば上で論じた単糖モノマーを含むポリマーである。
【００２４】
オリゴ糖類は、２〜１２個、好ましくは４〜８個の共有結合した単糖単位を含み、これらは同じでも異なってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは分岐状であり、例えば、２〜６単位のマルトース、スクロース、トレハロース、セロビオースおよびサリシン、特にマルトースを有するオリゴマンノシルである。オリゴ糖類の製造方法は、Pan et al. Infection and Immunity (1997), 4199-4206に記載されている。
【００２５】
多糖類は、１３個以上の共有結合した単糖単位を含み、これらは同じでも異なってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは分岐状である。適切な多糖類は、マンノース、ガラクトース、グルコース、フルクトースまたはウロン酸を多く含み、例えばマンノースの直鎖ポリマーであって４番目のマンノースごとに１つのガラクトース側鎖を有するものと考えられているガラクトマンナン多糖（本明細書中ではＧＵＭまたはＧＵＭ１と呼ばれる）（シグマＧ−０７５３）である。
【００２６】
マンノースとガラクトースサブユニットとから構成されている多糖類は、リガンドの好ましいタイプであり、さらなる例はグアーであり、これは１，６α結合のほぼ１つ置きの単位にガラクトース側鎖を有するβ１，４結合されたマンノース主鎖を有している。マンノースとガラクトースの比率は約１．８：１〜約２：１であり、本明細書中説明される実験において用いたグアーはシグマ社製で、カタログ参照番号はＧ１４２９である。
【００２７】
さらなる多糖類には、ガラクトース、ラムノース、arabionseおよびグルクロン酸の側鎖ポリマーと考えられるアラビアゴム（シグマＧ９７５２）、およびガラクトース、ラムノースおよびグルクロン酸の部分アセチル化ポリマーと考えられるカラヤゴム（シグマＧ０５０３）、ならびにマンノース単位で構成されたホモ多糖マンナンが含まれる。
【００２８】
適切なリガンドである糖誘導体としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸およびカラギーナン（様々な形状）が含まれる。硫酸化糖は糖誘導体の好ましい種類である。
【００２９】
炭水化物のような微生物にとっての栄養分である分子をベースとしたリガンドにより、適切な分離手段がもたらされることを本発明者らは見出した。微生物の捕獲を向上させるため、受容体／リガンドの相互作用を利用することはもとより、培地中の栄養分の存在に対する細菌のプロアクティブな反応を利用する単離システムを提供することが本発明の方法の目的であった。本発明の方法による非特異的なリガンドとして用い得る、微生物にとっての栄養分としては、ニコチン酸、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよびコバミドなどのビタミン類、ならびにヘミン、ラクトフェリン、トランスフェリン、ヘモグロビンなどの鉄キレート分子／化合物およびアエロバクチン、フェリクロム（シグマＦ８０１４）、フェリエンテロケリン、エンテロバクチンおよびフェリキサニンンなどのシデロフォアが含まれる。
【００３０】
細胞（例えば微生物）に非特異的に結合し得るリガンドが表面に固定された固体支持体は、したがって、本発明のさらなる局面を構成する。「非特異的」とは上で定義されている（すなわち、細胞タイプまたは種特異的ではなく、結合パートナーとの相互作用に依存する）通りであり、適切なリガンドは、本明細書中では本発明の方法に関して説明される。
【００３１】
細菌ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）のフコース感受性およびマンノース感受性の赤血球凝集の研究において、Ｌ−フコースおよびＤ−マンノースは、アガロースビーズ（Sanchez et al. APMIS (1990) 98 353-357）に共有結合的に結合されており、したがってこれらの固体支持体−リガンド複合体は本発明の範囲には含まれない。この以前の研究は、１種類の細菌種のみを含む非常に特異的な相互作用を調べるものであり、汎用的な細菌単離方法ではない。したがって、本明細書中で定義される方法におけるこれらのビーズ−リガンド複合体の使用は、本発明の局面を含む。
【００３２】
固定化されたリガンドは好ましくは、オリゴ糖もしくは多糖、ビタミン（例えば微生物にとっての栄養分として必要なもの）または鉄キレート化合物でああり、特に好ましくは多糖類である。特に好ましいリガンドの例は、本発明の方法に関して前に論じた。
【００３３】
本明細書中で論じたように汎用的な分離方法が提供されるが、本発明者らは、特定の糖類を含むリガンドが、微生物の特定の非常に広い綱の分離に特に適していることを見出した。したがって、マンノース含有リガンド（リガンドはマンノースモノマーまたはマンノース含有ポリマーとし得る）を用いると、例えば消化管内に存在する細菌種は非常に効率的に単離され、肺を通って入る細菌は、リガンドとして硫酸化糖類を用いることにより非常に効率的に単離され、さらに尿路に感染する細菌は固定化グルコースに結合する（ここでも、モノマーとしてまたはポリマー中に組み入れられた時）。消化管または肺から採取された試料から細菌を分離する方法においてそのようなリガンドを使用することは、したがって、本発明のさらなる好ましい局面を構成する。
【００３４】
微生物が単離され得る試料としては、例えば湖、川、汚水処理施設およびその他の水処理センターからの水試料または土質試料のような環境試料が含まれる。これらの方法は、食品試料の分析ならびに細菌レベルの監視が要求される健康および衛生用途一般、例えば食品が製造されているエリアにおいて特に有用である。ミルク製品は例えば、リステリア菌について分析できる。固定化された抗体を用いる従来の細菌単離手法は、おそらく固定化された抗体の疎水性のため、リステリア菌を単離するために非特異的リガンドを用いる本発明者らの方法よりもずっと効率が悪いことが明らかになっている。試料が水試料である場合には、リガンドは、当該微生物にとっての栄養分であるのが好ましい。
【００３５】
食物試料は、必要であれば（固体試料であれば）最初にホモジナイズし、次に適切な培地（例えばペプトン水）と混合し、３７℃で一晩インキュベートすることにより分析できる。チーズ、アイスクリーム、卵、マーガリン、魚、エビ、チキン、牛肉、ポークリブ、小麦粉、ロールドオート、ボイルした米、コショウ、トマトやブロッコリや豆などの野菜類、ピーナッツおよびマジパンなどの食品はこの方法で分析できる。本発明の方法は、食品試料の分析にとりわけ役立つものである。なぜならば、これらの食品試料は固形物（集塊および脂肪粒）を多く含み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾向があり、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に利用できないからである。
【００３６】
本方法にしたがって微生物を単離できる試料は、人または動物の体から取られた臨床試料とし得る。適切な試料としては、全血および血液由来製品、尿、糞便、脳脊髄液またはその他任意の体液、ならびに組織試料および例えば体腔の拭き取りにより得られた試料が含まれる。
【００３７】
試料には、他の細胞分離工程により得られた半純粋製剤のような比較的純粋または部分精製された出発物質も含まれ得る。
【００３８】
本発明の固体支持体および方法は、試料からの真核細胞の非選択的単離に用い得ることも見出された。この方法は、単離のために、ただ一つの細胞タイプが標的とされるのではないという点で「非選択的」である。少なくとも２つ、好ましくは３つ以上、４つ以上さらには６つ以上の異なるタイプの真核細胞がこれらの方法により単離されるであろう。
【００３９】
したがって、さらなる局面において、試料からの真核細胞の単離方法が本発明によりもたらされ、この方法は、前記真核細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定化された非特異的リガンドにより結合する段階を含む。分離し得る適切な真核細胞は、多糖類に結合するレクチンをその表面に有しているものである。そのような方法は、血液または血液由来試料から、骨髄または白血球を含むどのような組織もしくは体液からでもすべてのタイプの白血球を捕獲することが望ましい場合に、とりわけ有用である。この用途について、特に適したリガンドとしては、カラギーナンおよびその誘導体、デキストラン硫酸のような硫酸化多糖類（グリコサミノグリカン類）、ヘパリンおよびヘパラン硫酸が含まれる。
【００４０】
発明のそのような方法により、少なくともＢ−細胞および単球、好ましくは全タイプの白血球でなくとも大部分が、同じビーズに結合させることにより単離し得る。赤血球は好ましくは捕獲されない。この方法は一般に、試料からのＤＮＡ単離方法の準備段階である。従来技術の方法による血液からのＤＮＡ単離は、試料の直接溶解とＤＮＡ捕獲により達成される。そのような手法では存在するすべての細胞が溶解されるのに対して、本発明の方法では、白血球が結合されて当該細胞の初期濃縮が可能になる。抗体ベースの分離システムでは、白血球の捕獲が一般にできないであろう。同様に、他の細胞グループが真核生物試料から単離できる。
【００４１】
したがって、本発明により、「細胞」が真核細胞または原核細胞とし得る細胞単離方法がもたらされ、用語「細胞」は前に定義したすべての微生物を含む。
【００４２】
本発明で用いる適切な固体支持体は、現在広く使用されているか、または固定、分離等向けに提案されている公知の任意の支持体またはマトリクスとすることができる。これらは、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、ファイバー、毛管、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブ、プレートまたはウエル等の形状を取ることができる
【００４３】
支持体は、ガラス、シリカ、ラテックスまたはポリマー材料で作るのが好都合である。細胞の、続いて核酸の結合用に大きい表面積を有する材料が好まれる。一般にそのような支持体は表面が不規則であり、例えば粒子、ファイバー、ウェブ、焼結物またはふるいなどの多孔性または粒子状である。粒状材料、例えばビーズは、特にポリマー製ビーズは結合能力が大きいので一般に好まれる。
【００４４】
本発明により用いられる粒状固体支持体は、球形ビーズを含むのが好都合である。ビーズのサイズは決定的ではないけれども、例えば、直径が少なくとも１μｍ、好ましくは少なくとも２μｍであり、最大直径がせいぜい１０μｍ、好ましくはせいぜい６μｍとし得る。例えば、直径が２．８μｍおよび４．５μｍのビーズがうまく働くことが示されている。
【００４５】
本発明の方法での使用に適した非磁性ポリマービーズは、Ｄｙｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＳ（リレストローム市、ノルウェー）ならびにＱｉａｇｅｎ社、Ｐａｒｍａｃｉａ社およびＳｅｒｏｔｅｃ社から入手可能である。
【００４６】
しかしながら、操作および単離を助けるには、磁性ビーズが好ましい。本明細書中で用いられる用語「磁性」は、磁場中に置かれた時に支持体が磁気モーメントを有することができ、したがってその磁場の作用下で移動可能であることを意味する。言い換えれば、磁気粒子を含む支持体は磁気凝集により容易に除去でき、これにより、細胞および核酸の結合段階に続く迅速、単純かつ効率的な粒子分離方法がもたらされ、さらにこれは、細胞の分断または核酸の劣化を引き起こし得るせん断力を発生させる遠心分離のような従来手法よりもはるかに過酷ではない方法である。
【００４７】
したがって、本発明の方法を用いることにより、細胞が付着した磁性粒子を、例えば永久磁石を使って磁場をかけることにより、適切な表面上へ取り去ることができる。通常は、試料混合物を収容している容器の側面に磁石を適用して容器壁に粒子を凝集させ、試料の残部を流して捨てれば十分である。
【００４８】
特に好ましいのは、たとえばＥＰ−Ａ−１０６８７３においてＳｉｎｔｅｆにより記載されている超常磁性粒子である。なぜならば、反応の間に粒子が磁性凝集および凝固することが回避でき、これにより均一な核酸抽出が保証されるからである。Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ市、ノルウェー）がダイナビーズ（DYNABEADS）として販売している周知の磁性粒子が本発明での使用に適している。
【００４９】
本発明で用いるために官能基被覆した粒子は、米国特許第４，３３６，１７３号、同４，４５９，３７８号、および同４，６５４，２６７号によりビーズを改質することにより調製できる。したがって、ビーズ、または他の支持体は、例えば正または負に帯電、親水性または疎水性の、種々のタイプの官能基化表面を有するように調製できる。
【００５０】
粒子は、好ましくは結合のための大きい表面積を提供し、したがって小さくかつ平滑でなくなる傾向がある。固体支持体の表面は、（リガンド固定の前または後）好ましくは疎水性ではない。
【００５１】
発明の方法における固体支持体として用いるとりわけ好ましい粒子は、内部に磁性コロイドが被包されたＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ベースの球形ポリマー粒子（ビーズ）である。これらのビーズは、ＣＡ２，２２７，６０８に記載されるような、磁性コロイド含有ポリマー相を乳化剤含有植物油相中に懸濁させて製造することができる。粒子は、サイズが１〜８μｍで変わり得、好ましくはＣｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ（ドイツ）から入手可能である。
【００５２】
結合に適した条件を達成するため、適切なバッファ等を単離用媒質として使用できる。適切な電荷、浸透圧等を有するバッファは、固体支持体との接触の前、それと同時に、またはその後に、試料に添加するのが好都合である。ＰＢＳは適切な細胞結合バッファである。
【００５３】
リガンドを固体支持体へ付着させる方法は、技術的に公知である。一般には、固体支持体は最初に活性化され、次にリガンドと反応させられ、リガンド自身は、固体支持体への共有結合的付着用に若干改質しておくことができる。上記で論じたＣｈｅｍａｇｅｎ社製の超常磁性ビーズのケースでは、ポリビニルアルコールマトリクスは、８原子スペーサーを介したイソシアネート官能基の導入により活性化できる。これらの活性化ビーズ（Ｍ−ＰＶＡ Ａ ｋ２ｘ）は次に、アミノ官能基またはヒドロキシ官能基を含んでいる分子の直接カップリング用に用い得る。典型的なカップリング反応は以下の通りである。
Ｃｈｅｍａｇｅｎ社は、カップリングによる同社のビーズの改質に関連した特許を有している。
【００５５】
細胞結合を調べるため、および特定の微生物についての定性的または定量的な情報が必要な場合には、さらなる同定段階を実施し得る。上記で説明した一般的な細胞分離方法を種特異的検出方法と組み合わせることは、本発明の特に好ましい実施形態である。
【００５６】
結合された微生物の同一性は、その微生物の核酸の分析、または特定タイプの微生物に特異的な標識抗体を用いる技術的に公知な他の手法により調べることができる。細胞を固体支持体に結合した後、微生物−ビーズ複合体からの核酸が、例えばＰＣＲにより単離および分析できるのが好都合である。したがって、微生物が前記固体支持体に結合した後、その後の分析用に核酸を微生物から放出する細胞溶解段階が行われる。放出された核酸は溶液中で分析し得るが、これが固体支持体に結合した後に分析するのがより好都合であり、この固体支持体は同じでも異なってもよいが、好ましくは微生物自身が結合した固体支持体と同じである。したがって、さらなる局面では、以下の段階を含む、微生物含有試料の分析方法が本発明により提供される。
（ａ）前記微生物を固体支持体へ、該固体支持体上に固定化された非特異的リガンドにより結合する段階、
（ｂ）前記固体支持体に結合された微生物を同定する段階。
【００５７】
段階（ｂ）は、
（ｃ）微生物を溶解し、さらに任意に
（ｄ）前記溶解された微生物から放出された核酸を固体支持体に結合することにより実行するのが好都合である。
【００５８】
代わりの見方をすると、本発明により、試料中の細胞タイプまたは微生物の検出方法が提供され、該方法は、上記に記載されるような段階（ａ）および（ｂ）を含む。
【００５９】
微生物を溶解し、こうして放出された核酸を結合しそして核酸を分析するのに適した方法は、参照により本明細書に含まれるＷＯ９８／５１６９３に記載されている。したがって、本発明のさらなる局面は、細胞試料から核酸を単離する方法であって、
（ａ）前記試料中の細胞固体支持体へを、該固体支持体に固体された非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、さらに
（ｃ）前記溶解された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階とを含む。
【００６０】
さらなる局面は、試料中の標的細胞の存在または不在を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）前記試料中の細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、
（ｃ）前記溶された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と、
（ｄ）前記結合された核酸中の、前記標的細胞に特徴的な核酸の存在または不在を検出する段階とを含む。好ましい細胞、リガンドおよび固体支持体は上記で論じた通りのものである。
【００６１】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の自然発生物もしくは合成修飾物とし得る。しかしながら好ましくは、核酸はＤＮＡであって、これは一重または二重の撚糸状あるいは任意の形状、例えば直線状または環状とし得る。
【００６２】
結合に続き、単離または支持体結合された微生物が溶解されてそれらの核酸を放出する。細胞溶解方法は技術的に公知かつ文献中に広く記載されており、公知方法のいずれも用い得る。種々の微生物について種々の方法がより適切であり得るが、例えば、以下の方法のうちのいずれも用い得るであろう。すなわち、例えば適切なバッファ中のＳＤＳ、ＬｉＤＳまたはサルコシルを用いた洗浄溶解；塩酸グアニジウム（ＧＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジウム（ＧＴＣ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、過塩素酸塩等のようなカオトロープ剤の利用；フレンチプレス、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いるまたは液体窒素中での磨砕のような機械的破砕；例えばリゾチーム、プロテイナーゼ、プロナーゼまたはセルラーゼあるいは商業的に入手可能な任意のその他の溶解酵素を用いる酵素溶解；バクテリオファージまたはウイルス感染による細胞溶解；凍結乾燥；浸透圧衝撃；マイクロ波処理；例えば加熱もしくは煮沸、またはドライアイスないし液体窒素中での凍結と、解凍による温度処理；アルカリ溶解である。上記で言及したように、そのような方法はすべて標準的な溶解手法であり、かつ技術的に公知であり、そのような方法または方法の組み合わせのいずれも用い得る。
【００６３】
溶解は、本発明にしたがって、カオトロープ剤および／または洗浄剤を用いて達成するのが好都合である。例えば、細菌細胞の場合、カオトロープ剤と洗浄剤との組み合わせは特に効果的であることが見出されている。したがって、典型的な適切な溶解剤としては、ＧＴＣまたはＧＨＣｌのようなカオトロープ剤とＳＤＳまたはサルコシルのような洗浄剤が含まれる。溶解剤は、単なる水溶液として供給するか、バッファ溶液中に入れていわゆる「溶解バッファ」とすることもできる。任意の適切なバッファを用いることができ、例えばＴｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅおよびリン酸塩バッファが含まれる。代わりに、溶解剤を別々に加えることができる。溶解剤の適切な濃度および量は、正確なシステム、ｃａｌｌｓの性質等に応じて変わり、適切に決定し得るが、ＧＴＣ、ＧＨＣｌ、ＮａＩまたは過塩素酸塩のようなカオトロープ剤を２Ｍ〜７Ｍの濃度で、ＮａＯＨのようなアルカリ剤を０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で、洗浄剤を０．１〜５０％（ｗ／ｖ）例、えば０．５〜１５％の濃度で用い得る。したがって、適切な溶解バッファの代表的な例は、４Ｍ ＧＴＣ、サルコシル１％（ｗ／ｖ）の水溶液である。
【００６４】
単離された支持体結合微生物は、試料の残部から好都合に除去または分離でき、その結果、細胞が濃縮または濃化される。したがって、細胞結合段階は、細胞を当初試料よりも小さい体積に濃化または濃縮するのに役立つ。次に、所望の溶解剤を含む適切な溶解バッファを加えるか、単離された分子を所望の溶解条件にかけることにより、溶解は好都合に達成し得る。例えば、適切な溶解剤を含む溶解バッファを単に加える場合、単離された細胞は、溶解バッファの存在下で、溶解を可能にする適切な時間単にインキュベートすることができる。種々のインキュベート条件は種々の溶解システムに適し、技術的に公知である。例えば、洗浄剤および／または溶解バッファ含有カオトロープ剤については、インキュベーションは室温またはより高い温度、例えば３７℃〜６５℃で起こり得る。同様に、インキュベーション時間は、数分、例えば５〜１０分間から数時間、例えば１〜２時間まで変わり得る。ＧＴＣ／サルコシル溶解バッファと細菌細胞との場合には、６５℃で１０〜２０分間のインキュベーションが適切であることが見出されているが、もちろん必要に応じて変え得る。例えばプロテイナーゼＫ等を用いる酵素溶解の場合には、より長い処理時間、例えば一晩、が必要になることがある。
【００６５】
溶解に続いて、放出された核酸は、好ましくは溶解された微生物が結合される固体支持体に共有結合的に結合されるのが好都合である。とはいえ、例えば、ビーズの混合群には、あるものには微生物に結合するための非特異的リガンドが提供され、他のものには核酸を結合するようにし得る。
【００６６】
この核酸結合は、核酸を固体支持体と結合するための技術的に公知のどのような方法ででも達成できる。核酸は支持体に、非特異的に、すなわち配列とは独立して結合され得るのが好都合である。したがって、例えば放出された核酸は、例えばアルコール、アルコール／塩の組合せ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の公知の核酸沈殿剤のいずれかを用いて、支持体上に沈殿させ得る。このようなビーズ上への核酸沈殿は、例えばＷＯ９１／１２０７９中に記載されている。したがって、核酸の沈澱を引き起こすアルコール添加に続いて、溶液中の支持体および放出された核酸に塩を添加し得る。代わりに、塩とアルコールとを一緒に添加することも、塩を省くこともできる。細胞結合段階に関して上記で説明したように、任意の適切なアルコールまたは塩を用いることができ、適切な量または濃度は容易に決定できる。
【００６７】
代わりの非特異的な核酸結合手法には、Ｄｙｎａｌ ＡＳのＷＯ９６／１８７３１中に記載されるような洗浄剤の使用（いわゆる「DNA Direct」法）、およびＡｋｚｏ Ｎ．Ｖ．によりＥＰ−Ａ−０３８９０６３中に記載されているカオトロープ剤と、シリカ粒子のような核酸結合固相との利用が含まれる。
【００６８】
支持体への核酸のイオン性結合は、帯電表面を有する固体支持体、例えばポリアミン被覆した支持体、を用いて達成できる。
【００６９】
本発明の方法において用いられる支持体は、核酸の特定的または非特異的結合を助ける官能基、例えば、ロイシンジッパーやヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質あるいはインターカレーション色素（例えば、臭化エチジウムまたはＨｏｅｃｈｓｔ４２９４５）、を有することもでき、これらは支持体上に被覆し得る。
【００７０】
同様に、核酸の選択的捕獲を助けるため、支持体に結合パートナーを付与することができる。例えば、補足的なＤＮＡないしＲＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質、ウイルス核酸に結合するウイルスタンパク質を用い得る。そのようなタンパク質の固体支持体への付着は、技術的に公知の手法を用いて達成できる。
【００７１】
発明にしたがって核酸を沈殿させる好都合な方法は、沈澱剤、例えばアルコールを、支持体と溶解細胞とを含んでいる混合物へ添加することである。したがって、適切な容量のアルコール、例えば１００％または９６％エタノール、を混合物に単に添加し、さらに放出された核酸が支持体に結合されるのに十分な時間インキュベートされる。この段階のためのインキュベーション条件は決定的ではなく、室温で５〜１０分間のインキュベーションを単に含み得る。しかしながら、選択によっては、時間の長さが変わり、温度が上昇し得る。
【００７２】
必要ではないが、例えば核酸結合段階に続いて、１つ以上の洗浄段階を本発明の単離方法に導入することが好都合なことがある。どのような従来の洗浄バッファまたは他の媒質でも用い得る。概して、イオン強度が低〜中程度のバッファは、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０／１０ｍＭ ＮａＣｌ）で調製できる。必要なら、例えばアルコールを含有する他の標準的な洗浄媒質も用いることができ、例えば７０％エタノールでの洗浄である。
【００７３】
磁性粒子を用いると、粒子を凝集させ、核酸結合媒質を除去し、洗浄媒質を添加し、さらに粒子を必要な回数だけ再凝集させることにより、容易な洗浄段階が可能になる。
【００７４】
核酸単離プロセスおよび必要となることがある任意の洗浄段階に続き、核酸が結合された支持体を、任意の適切な媒質、例えば水または低イオン強度バッファ中に、例えば再懸濁または浸漬することができる。支持体および所望の任意の後続処理の性質に応じ、支持体から核酸を放出させることが望ましいこともあれば望ましくないこともある。
【００７５】
磁性または非磁性ビーズのような粒子状固体支持体のケースでは、これは、多くの場合において、支持体から核酸を溶出することなく、例えばＰＣＲまたは他の増幅において直接用い得る。また、多くのＤＮＡ検出または同定方法については、溶出は必要ではない。なぜならば、ＤＮＡはビーズ表面とランダムに接触し、水素結合またはイオン性もしくは他の力によって多くのポイントにおいて結合され得るが、一般的にオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションおよび増幅に利用可能な十分なＤＮＡの長さがあるからである。
【００７６】
しかしながら、必要であれば、核酸の溶出は、公知の手段を用いて、例えば７０〜９０℃まで５〜１０分間加熱し、それに続いて支持体を媒質から除去して核酸を溶液中に残すことにより容易に達成し得る。そのような加熱は、ＰＣＲにおいて、繰り返しプログラムに先立つＤＮＡ変性段階により自動的に得られる。
【００７７】
もしＤＮＡからＲＮＡを除去する必要があれば、これは、ＤＮＡ単離段階の前に、例えばＲＮＡａｓｅまたはＮａＯＨのようなアルカリを添加することによってＲＮＡを破壊することにより達成し得る。
【００７８】
本発明の利点は、実施が迅速かつ簡単であることであり、この方法の単純さにより試料の高いスループットが可能になる。
【００７９】
本発明は、支持体としてもし粒子、特に磁性粒子が用いられれば、有利に自動化しやすい。
【００８０】
上記で言及したように、本発明の方法は、核酸ベースの検出手順で使用するための核酸を調製する最初の準備段階としてとりわけ有用である。
【００８１】
上記で言及したように、有利に結合された核酸は、検出段階の実行前に支持体から溶出または除去される必要が必要がない。ただし、必要であればこれを行うことができる。核酸が溶出されるかされないかも、核酸結合段階において用いられた特定の方法に依存する。したがって、特定の核酸結合手続は、他のものよりも緊密に核酸を結合する。例えば洗浄剤（例えば、ＤＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ）を用いたＤＮＡ結合の場合には、溶出バッファまたは他の適切な媒体が導入されると、核酸は固体支持体から溶出しようとする。アルコールまたはカオトロープのような沈澱剤によって結合された核酸は、より緊密に結合されたままで残ろうとし、バッファ媒質中に置かれても溶出しようとせず、溶出には加熱を要することがある。
【００８２】
したがって、特に支持体が粒子であれば、支持体結合核酸は、核酸ベースの検出手続において、単に支持体を検出段階に適した媒質中に再懸濁するか、支持体をこの媒質中に添加することによって直接用い得る。核酸が媒体中に溶出しても、または上記で言及したようであっても、核酸が溶出する必要はない。硫酸化糖類がリガンドとして用いられる場合は、溶出が好ましい。
【００８３】
核酸を検出するための多数の種々の技術が公知で文献中に記載されており、これらのいずれであっても本発明にしたがって使用し得る。最も単純には、核酸はプローブへのハイブリダイゼーションにより検出でき、非常に多くのそのようなハイブリダイゼーションプロトコルが記載されている（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照）。最も一般的には、検出は、これについて文献中に記載されている任意の方法を用いて、in situハイブリダイゼーション段階および／またはin vitro増幅段階を伴うであろう。したがって、言及したように、ＬＡＲ、３ＳＲおよびＱ−β−レプリカーゼシステムのような手法が使い得る。しかしながら、ＲＣＲおよびその種々の改良、例えばネステッドプライマーの使用は一般に選択される方法であろう（例えば、核酸増幅技術の総説についての、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47参照）。
【００８４】
他の検出方法は、シーケンシングアプローチ、例えば、Syvanen and Soderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692に記載されているようなミニシーケンシグアプローチに基づくことができる。
【００８５】
ＰＣＲのような増幅手法において、ＤＮＡ二重鎖を溶かす最初の段階において必要な加熱により、結合されたＤＮＡが支持体から放出されることがある。したがって、ＰＣＲのようなその後の検出段階の場合は、支持体に結合された核酸は反応混合物に直接添加することができ、核酸は検出プロセスの最初の段階において溶出する。本発明にしたがって得られた単離された支持体結合核酸試料全体または一部を検出段階において用い得る。
【００８６】
ＰＣＲやその他の検出段階の結果は、多くの方法により検出もしくは視覚化でき、それらの方法は従来技術において記載されている。例えば、ＰＣＲやその他の増幅産物は、電気泳動ゲル、例えば臭化エチジウム染色アガロースゲル上を、公知の手法を用いて走らせることができる。代わりに、ＤＩＡＮＡシステムを用いることができ、これはネステッドプライマー法の改良である。ＤＩＡＮＡ（Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids：固定化された増幅核酸の検出）システム（Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)参照）においては、内側の第２のプライマーペアは、それぞれ、増幅されたＤＮＡの捕獲を可能にする固定化手段と、ラベルすなわち認識を可能にするラベルの付着手段を有している。これにより、バックグラウンド信号の減少と、増幅ＤＮＡの迅速かつ容易な検出手段という二重の利点がもたらされる。リアルタイムＰＣＲ法は、ＤＮＡ検出、例えば５’ヌクレアーゼＰＣＲまたは蛍光プローブを用いる手法において用い得る。
【００８７】
多くの種々のシーケンシング手法、例えば標準シーケンシング、固相シーケンシング、サイクリックシーケンシング、自動シーケンシングおよびミニシーケンシグのいずれかを用いたシーケンシングにより、増幅核酸も検出でき、または結果が確認される。
【００８８】
本発明の方法を実行するために必要な様々な反応物質および構成要素は、キットの形で供給するのが好都合である。そのようなキットは本発明のさらなる局面である。
【００８９】
最も単純には、本発明のこの局面により、
（ａ）微生物に非特異的に結合できるリガンドをその表面に固定した固体支持体と、
（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための方法と、任意に
（ｃ）前記細胞を溶解するための手段と、さらに任意に、
（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手段とを含む、微生物を試料から単離するキットが提供される。
【００９０】
様々な手段（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、本発明の方法に関連して上記で記載および論じられた通りのものとし得る。
【００９１】
典型的なキットは、固体支持体、例えばＧＵＭ１のような多糖類で被覆した粒子と、例えばＰＢＳのような結合バッファと、溶解バッファとを含み得る。
【００９２】
さらなる任意の構成要素は、（ｅ）標的微生物に特有な核酸の存在または不在を検出するための手段である。上記で論じたように、そのような手段には、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づく検出手法において使用される適切なプローブまたはプライマーオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００９３】
任意に、そのようなキットには、バッファ、塩類、ポリマー、酵素等がさらに含まれ得る。
【００９４】
本発明のキットは、ＰＣＲ増幅用の細菌抽出およびＤＮＡ単離において大きな実際的な有用性がある。このキットによる使用に適したプロトコルは以下の通りで、磁性または磁化可能ビーズが固体支持体（ａ）として選択されたものと想定する。
− 結合バッファ（ｂ）とビーズとを組み合わせ、一晩培養した培地からの試料を添加し、例えばエッペンドルフ型チューブ内で混合する。
− 磁石の影響下に置き、細菌／ビーズ複合体をチューブ側面に移動させる。
− 上澄みをピペットで取って捨てる。
− 溶解バッファ（ｃ）を加え、エタノールでインキュベートする。
− 磁石を用いて上澄みからビーズを分離し、上澄みをピペットで取って捨てる。
− ビーズを洗浄して上澄みを除去する。
− ビーズ／ＤＮＡ試料をＰＣＲ用に再懸濁する。
【００９５】
本発明のさらなる局面によれば、試料からの細胞の全体的分離における、本明細書中に記載される固体支持体の使用がもたらされる。この分離は「全体的」である。なぜならば、これは細胞特異的な単離方法ではなく、むしろ試料中に存在する細胞（例えば微生物）を他の構成要素から単離する一般的な方法だからである。すでに、そのような方法は濾過または沈殿により達成されている。対照的に、本明細書中に記載される固体支持体は、リガンド−レセプタ結合の利点を組み合わせるために用いることができるが、種または細胞タイプ特異的なやり方ではない。本明細書中に記載されるように、固体支持体に付着させられたリガンドは、試料中の微生物のタイプ（例えば種々の細菌種）または真核細胞タイプの（大半ではないが）かなりの割合と結合し、試料全体から全体的な分離を達成することができる。
【００９６】
以下、本発明を非限定的な実施例において図面を参照しつつより詳細に説明する。
【００９７】
（発明を実施するための最良の形態）
実施例１
炭水化物被覆粒子の製造と細胞結合特性の試験
化合物は、Ｍ−ＰＶＡ ＯＣＮ−活性化ビーズ（Chemagen AG）上で結合させた。反応は以下の通りである。
改質したビーズを、種々の菌液、すなわち純粋な未希釈菌液（ｏ．ｎ．）あるいは水またはバッファ（ＰＢＳ）中で希釈した菌液と共にインキュベートした。細胞結合を調べるため、ＤＮＡを細菌−ビーズ複合体から単離し、その後にＰＣＲを実施することにより分析した。参考文献：ＷＯ９８／５１６９３。このカップリング反応は、Ｃｈｅｍａｇｅｎ社により実施され、その結果得られた改質ビーズはｍ本明細書中で論じた本発明の単離方法において用いた。
【００９９】
実施例２
ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル
細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３０℃、無撹拌で一晩培養した。ＰＢＳ（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ１０μｌを混合し（１０ｍｇ／ｍｌ）、次に一晩培養した菌液１００μｌを添加し、ピペット操作により穏やかに混合した。チューブを室温で５分間放置した。上澄みを磁気選別機を用いて除去し、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍ guaridineチオシアネート−１％サルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを開けたままで、６５℃で５分間インキュベートした。
【０１００】
次に、９６％エタノール１００μｌを添加し、ふたを閉じたままでインキュベーションを５分間継続した。上澄みを磁気選別機を用いて除去し、ビーズ−ＤＮＡ試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄した。
【０１０１】
ビーズ−ＤＮＡ試料を、Ｈ２Ｏ４５μｌ中に再懸濁し、エタノールのすべての痕跡を除去するため、ふたを開けたままで６５℃で１５分間インキュベートした（代わりに、Ｈ２Ｏ５μｌを加えてビーズを湿らせ、次にこのビーズを６５℃で５分間インキュベートしてもよい）。精製物質２０μｌを１回の５０μｌＰＣＲで用いた。
【０１０２】
単離された細菌を同定するため、種特異的またはグループ特異的プライマー（ＸおよびＹ）を用いたＰＣＲ増幅を実施した。
【０１０３】
下記の表１は種々の細菌についての適切なプライマーを示すものである。
【表１】
【０１０４】
ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
【０１０５】
実施例３
実施例２のプロトコルを、D−マンノースがカップリングされたＭ−ＰＶＡを用いて実施した。
【０１０６】
このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１０７】
実施例４
実施例２のプロトコルを、マルトースがカップリングされたＭ−ＰＶＡビーズを用いて実施した。
【０１０８】
このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１０９】
実施例５
実施例２のプロトコルを、ガラクトマンナン多糖類（ＧＵＭ１）がカップリングされたＭ−ＰＶＡビーズを用いて実施した。
【０１１０】
このビーズは、とりわけアエロモナス属、バシラス属、カンピロバクター属、シトロバクター属、クロストリジウム属、エンテロバクター属、大腸菌（病原性および非病原性）、ハフニア属、クレブシエラ属、リステリア属、プロテウス属、サルモネラ属、シェワネラ属、セラチア属、シゲラ属、ビブリオ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。
【０１１１】
これらの実験の結果は、図３のゲル写真に見ることができる。以下のスキーム計画にしたがって特定の細菌がビーズに結合することを表すＰＣＲ産物のバンドが示してある。
【０１１２】
レーン１、ＤＮＡマーカー（GeneRuler(登録商標)１００ ｂｐ ＤＮＡラダー、Fermentas社製）；
レーン２−３、それぞれKlebsiella pneumoniasおよびK.oxytoca；
レーン４−６、それぞれShigella flexneri、S.sonneiおよびS.boydii；
レーン７−８および１２−１３、Vibrio cholerae（レーン７および１２）、V. vulnificus（レーン８）、およびV. parahaemolyticus；
レーン９、Hafnia alvei；
レーン１０−１１、それぞれAeromonas sobriaおよびA. hydrophila；
レーン１２−１３、Vibrio（上記参照）；
レーン１４、Proteus vulgaris；
レーン１５−１６、それぞれSalmonell enterica ssp typhimuriumおよびS. enterica ssp enteritidis；
レーン１７−１８および４１−４４、Yersinia enterocolitica（レーン１７−１８（血清型不明）、血清型Ｏ：９（レーン４２）、Ｏ：８（レーン４３）、およびＯ：３（レーン４４））、およびY. pseudotuberculosis（レーン４１）；
レーン１９、Escherichia coli；
レーン２０−２１、それぞれListeria innocuaおよびL. monocytogenes；
レーン２２−２３および３８−３９、Bacillus cereus（レーン２２）、B. subtilis（レーン２３）、およびB. simplex（レーン３８−３９）；
レーン２４、Citrobacter freundii；
レーン２５−２６、それぞれClostridium perfringensおよびC. sordelli；
レーン２７−３０、Escherichia coli、病原性
レーン３１−３７、Campylobacter jejuni（レーン３１）およびC. lari（レーン３２−３７）；
レーン３８−３９、Bacillus（上記参照）；
レーン４０、Brochothrix thermosphacta；
レーン４１−４４、Yersinia（上記参照）；
レーン４５−４７、それぞれEnterobacter sakazakii、E. aerogenes、およびE. cloacae；
レーン４８、Morganella morganii；
レーン４９、Serratia marcescens；
レーン５０−５２、Shewanella putrefaciens；
レーン５３−５４、それぞれPhotobacterium phosphoreumおよびP. damsela；
レーン５５、Streptococcus thermophilus；
レーン５６、Lactococcus lactis；
レーン５７、Staphylococcus warneri；
レーン５８、Enterococcus faecalis；
レーン５９−６０、Leuconostoc mesenteroides；
レーン６１−６４、Pediococcus acidilactici（レーン６１−６２）およびP. damnosus（レーン６３−６４）；
レーン６５−６９、Lactobacillus acidophilus（レーン６５、６８および６９）、およびL. plantarum（レーン６６−６７）。
【０１１３】
実施例６
E. coliを、実施例３、４、および５のビーズならびにダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）（未活性化）を用いて、一晩培養菌液から単離した。核酸を放出するための溶解後、約６００ｂｐのE. coli ＤＮＡシーケンスを、プライマーＵ５９／Ｌ６７３を用いて増幅した（表１参照）。
【０１１４】
結果を図１に示す。
レーン２−５、１５μｌテンプレートを用い、レーン７−１０では、５μｌテンプレートを用いた；
レーン１および６、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン２および７、マンノース被覆ビーズ；
レーン３および８、マルトース被覆ビーズ；
レーン４および９、ＧＵＭ１被覆ビーズ；
レーン５および１０、活性化ダイナビーズＭ−２８０。
【０１１５】
実施例７
B. cereus ATCC 14579を、一晩培養菌液（１００mlＴＳＢ、３０℃）２mlから、実施例５のビーズと未被覆ビーズ（参照記号：ＵＮＣ）を用い、以下の希釈に従って単離した。
レーン１、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン２、１００μｇＵＮＣ、未希釈菌液；
レーン３、５０μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン４、１００μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン５、２００μｇＧＵＭ１、１０１希釈菌液；
レーン６、１００μｇＵＮＣ、１０１希釈菌液；
レーン７、５０μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン８、１００μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン９、２００μｇＧＵＭ１、１０２希釈菌液；
レーン１０、１００μｇＵＮＣ、１０２希釈菌液；
レーン１１、５０μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１２、１００μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１３、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；
レーン１４、２００μｇＧＵＭ１、１０３希釈菌液；
レーン１５、１００μｇＵＮＣ、１０３希釈菌液；
レーン１６、５０μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１７、１００μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１８、２００μｇＧＵＭ１、１０４希釈菌液；
レーン１９、１００μｇＵＮＣ、１０４希釈菌液；
レーン２０、５０μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２１、１００μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２２、２００μｇＧＵＭ１、１０５希釈菌液；
レーン２３、１００μｇＵＮＣ、１０５希釈菌液；
【０１１６】
核酸を放出するための溶解の後、約６００のｂｐのB. cereusシーケンスを、プライマーＵ５５２／Ｌ１２５４を用いて増幅した（表１参照）。結果を図２に示す。１０１希釈の場合の結果はエラーとなるであろう。なぜならば、５０μｇのＧＵＭ１と２００μｇのＧＵＭ１は両方とも、細胞結合を示す、核酸検出についてポジティブな結果を与えるからである。概して、未被覆ビーズの場合よりもＧＵＭ１の場合のほうが、結合が１００−１０００倍良好なことを結果が示している。
【０１１７】
実施例８
他のビーズは、本発明の原理を説明するために使用し、特に適切なビーズタイプはダイナビーズＭ−２７０エポキシ、製品番号１４３．０２（ノルウェー国Ｄｙｎａｌ ＡＳから入手可能）である。
【０１１８】
ビーズの調製
無菌濾過した０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌを乾燥ビーズ３０ｍｇに加えて、１ｍｌ当たりビーズ約１０９個の濃度とした。ビーズを約３０秒間渦攪拌することにより再懸濁し、次に低速チルト回転で１０分間インキュベートした。チューブを磁石上に４分間置き、上澄みをピペットで慎重に取り除いた。
【０１１９】
０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌをチューブに再度加え、ビーズを渦攪拌により適切に混合した。チューブを磁石上に４分間置き、上澄みを除去した。
【０１２０】
洗浄したビーズを、０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）６００μｌ中に再懸濁して、リガンド溶液添加後に推奨ビーズ濃度と硫酸アンモニウム濃度になるようにした。このビーズ溶液を被覆手順において用いた。
【０１２１】
被覆手順
リガンドをＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、無菌濾過した。
【０１２２】
Ｄｙａｎａｌ社の推奨に従い、リガンド６００μｌを、ビーズ溶液６００μｌと無菌濾過３Ｍ硫酸アンモニウム６００μｌと混合した。チューブを、室温で低速回転により一晩インキュベートした。
【０１２３】
インキュベーション後、チューブを磁石上に４分間置き、上澄みを除去した。被覆ビーズを、２ｍｌＰＢＳで合計４回洗浄した。最後にビーズを３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁し、４℃で保管した。
【０１２４】
実施例９
ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル
細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３７℃で一晩培養した。ＰＢＳ（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ（１０ｍｌ／ｍｌ）２０μｌとを混合し、次に一晩培養菌液１００μｌを加え、ピペット操作により穏やかに混合した。チューブを室温に５分間放置した。上澄みを磁気分離機により除去し、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍグアニジンチオシアネート−１％サルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを閉じた状態で、８０℃で５分間インキュベートした。
【０１２５】
次に、９６％エタノール１５０μｌを加え、インキュベーションを５分間継続した。磁気分離機により上澄みを除去し、ビーズ−ＤＮＡ試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄した。
【０１２６】
ビーズ−ＤＮＡ試料をＨ２Ｏ３０μｌ中に再懸濁し、エタノールの痕跡をすべて除去するためにふたを開けたままで、８０℃で１０分間インキュベートした。精製物質３０μｌ全部を１回の５０μｌＰＣＲにおいて用いた。
【０１２７】
実施例１０
実施例９のプロトコルを用いて細菌を単離し、この単離した細菌を同定するため、以下のプライマー用いたＰＣＲ増幅を実施した。
【０１２８】
実験Ａ−Ｅ
表１の通り。
【０１２９】
実験Ｆ
ＵＰＰＥＲ：５’ TGCTTTACACATGCAAGTCG ３’
ＬＯＷＥＲ：５’ CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG ３’
【０１３０】
以下の実験で用いたビーズは、Ｄｙｎａｌ ＡＳ製ダイナビーズM−２７０またはＣｈｅｍａｇｅｎ ＡＧ製Ｍ−ＰＶＡ ＯＣＮ−活性化ビーズである。
【０１３１】
以下の実験Ａ−Ｇで用いた細菌は次の通りである。
Aeromonas hydrophila CCUG ２５９４２
Bacillus cereus ATCC １１７７８
Bacillus cereus NVH ００７５−９５
Campylobacter jejuni CCUG ２５９０３
Clostridium perfringens ATCC １３１２４
Escherichia coli ATCC ２５９２２
Escherichia coli CCUG ３８０８１
Helicobacter pylori CCUG ３８７７１
Listeria monocytogenes ATCC ３５１５２
Listeria monocytogenes CCUG １５５２７
Neisseria gonorrhoeae ATCC ４９２２６
Salmonell typhimurium ATCC １４０２８
Salmonella typhimurium CCUG ３１９６９
Shigella flexneri CCUG ３８９４７
Streptococcus pyogenes CCUG ３０９１７
Streptococcus pneumoniae CCUG ３３０６２
Vibrio cholerae CCUG ４２５３４
Yersinia enterocolitica Noma ref １０２、Y８４２
【０１３２】
以下の実験においては、一般に増幅はＤＮＡ−ビーズ複合体に直接実行した。しかしながら、増幅手法を用いる細菌種の同定は、上澄みに実行することができる。ヘパリン、デキストラン硫酸およびカラギーナンのような特定の結合リガンドについては、硫酸基がＰＣＲ反応を阻害することがあるので、これが好ましいことがある。以下の実験においては、特に指示されていなければ、カラギーナン被覆が用いられる場合は、ビーズを８０℃でインキュベートしてすべてのＤＮＡをビーズから放出した後に、ＰＣＲを上澄みに対して実施する。
【０１３３】
この実施例においては、「カラギーナン」は、イオタカラギーナン（シグマ、Ｃ−３８８９）を意味する。ヘパリンおよびデキストラン硫酸はシグマ社から入手し、カタログ参照番号はそれぞれＨ３１４９およびＤ６９２４である。
【０１３４】
Ａ．ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたVibrio choleraeからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図４のゲル写真に示してある。
【０１３５】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー（弱）
ウエル番号２＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１３６】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝V. choleraeの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝V. choleraeの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝V. choleraeの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝V. choleraeの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝ネガティブコントロール
【０１３７】
Ｂ．ゴム、マンノース、カラギーナンを用いたShigella flexaneriからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図５のゲル写真に示してある。
【０１３８】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１３９】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. flexaneriの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. flexaneriの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. flexaneriの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. flexaneriの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４０】
Ｃ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたE. coliからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図６のゲル写真に示してある。
【０１４１】
ゲル上には６本のラインがあり、すべてE. coliを示す。
【０１４２】
ゲルの左上から読む：
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号９＝ネガティブコントロール
【０１４３】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４４】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加
【０１４５】
ライン４：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４６】
ライン５：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４７】
ライン６：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１４８】
Ｄ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたSalmonella typhimuriumからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図７のゲル写真に示してある。
【０１４９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝ネガティブコントロール
【０１５０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５１】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５２】
ライン４：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１５３】
ライン５：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１５４】
ライン６：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. typhimuriumの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
Salmonella typhimuriumからのＤＮＡ単離
【０１５５】
Ｅ．グアー、ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたCampylobacer jejuniからのＤＮＡ単離
増幅の結果は図８のゲル写真に示してある。
【０１５６】
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１０＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１６＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１７＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１８＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１９＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２０＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２１＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２２＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２３＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２４＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２５＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２６＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２７＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２８＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号２９＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３０＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３１＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３２＝C. jejuniの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３３＝C. jejuniの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３４＝C. jejuniの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３５＝C. jejuniの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３６＝C. jejuniの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３７＝C. jejuniの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５７】
Ｆ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたStreptococcus pyrogenesからのゲノムＤＮＡの単離
増幅の結果は図９のゲル写真に示してある。
【０１５８】
ライン１：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１５９】
ライン２：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６０】
ライン３：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６１】
ライン４：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後ビーズの残部にＰＣＲを実施
ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６２】
Ｇ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたNeisseria gonorrhoeaeからのゲノムＤＮＡ単離
増幅の結果は図１０のゲル写真に示してある。
【０１６３】
ライン１：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６４】
ライン２：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６５】
ライン３：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６６】
ライン４：
磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行
ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１６７】
実施例１１
実験は、Ｊ５５８Ｌと呼ばれるがんＢ−細胞ラインの純培養液について実施した。用いたプライマーは下記の通りである。
ＵＰＰＥＲ：5’ CCCGCCCCTTGCCTCTC 3’
ＬＯＷＥＲ：5’ TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3’
【０１６８】
増幅の結果は図１１のゲル写真に示してある。磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施。
【０１６９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加
【０１７０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７１】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７２】
ライン３：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７３】
用いた種々のタイプのカラギーナンは以下の通り（シグマ社カタログ中の製品番号を付す）：
タイプＩカラギーナン − 大部分がカッパカラギーナン：Ｃ１０１３
タイプＩＩカラギーナン − 大部分がイオタカラギーナン：Ｃ１１３８
タイプＶカラギーナン − イオタカラギーナン：Ｃ−３８８９
【０１７４】
実施例１２
ＧＵＭ被覆ビーズからE. coliを実施例８のプロトコルに従って単離した。未被覆ビーズを被覆ビーズと同じ被覆手順に通したが、糖は加えなかった。実施例９の単離プロトコルに続いて下記の希釈を行った。
【０１７５】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号９＝E. coliの１０−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７６】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝E. coliの１０−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝E. coliの１０−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝E. coliの１０−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１７７】
増幅の結果は図１２のゲル写真に示してある。
【０１７８】
実施例１３
種々の細菌種を、実施例８のプロトコルに従ってＧＵＭ被覆ビーズから単離した。実施例９の単離プロトコルに続き下記の操作を行い、増幅の結果は図１３のゲル写真に示してある。
【０１７９】
ライン１：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝未希釈のShigella flexneri１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝未希釈のVibrio cholerae１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝未希釈のAeromonas hydrophila１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝未希釈のStreptococcus pneumonia１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝未希釈のStreptococcus pyogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝未希釈のSalmonella typhimurium１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝未希釈のYersinia enterocolitica１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１８０】
ライン２：
ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー
ウエル番号２＝未希釈のE. coli１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号３＝未希釈のListeria monocytogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号４＝未希釈のClostridium perfringens１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号５＝未希釈のBacillus cereus１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号６＝未希釈のCampylobacter jejuni１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号７＝未希釈のNeissseria gonorrhoeae１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
ウエル番号８＝未希釈のBordetella pertussis１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μｇに添加
【０１８１】
bordetella用プライマーは、Nesseria用のものと同じであった（表１参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マンノース、マルトースおよびＧＵＭ１で被覆したビーズと結合された細菌（E. coli）の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図２】 ＧＩＭ１被覆ビーズと、未被覆ビーズと結合された細菌（B. cereus）の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図３】 ＧＵＭ１被覆ビーズへの多様な細菌の結合を示す一連のゲル写真を示す。
【図４】 種々の被覆ビーズに結合されたVibrio choleraeの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図５】 種々の被覆ビーズに結合されたShigella flexneri の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図６】 種々の被覆ビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図７】 種々の被覆ビーズに結合されたSalmonella typhimuriumの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図８】 種々の被覆ビーズに結合されたCampylobacter jejuniの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図９】 種々の被覆ビーズに結合されたSteptococcus pyogenesの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１０】 種々の被覆ビーズに結合されたNeisseria gonorrheaeの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１１】 種々の被覆ビーズに結合されたヒト白血球細胞の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１２】 被覆および未被覆ダイナビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
【図１３】 ＧＵＭ被覆ダイナビーズに結合された種々の細菌の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。
Claims (33)
- 試料から細胞を単離する方法であって、前記細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより結合する段階を含み、該非特異的リガンドは単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる方法。
- 前記細胞は微生物である、請求項１に記載の方法。
- 前記微生物は細菌である、請求項２に記載の方法。
- 前記試料中に存在する種々の細菌種の少なくとも３０％の代表が前記固体支持体に結合される、請求項３に記載の方法。
- 前記試料中に存在する種々の細菌種の少なくとも６０％の代表が前記固体支持体に結合される、請求項３に記載の方法。
- 前記リガンドは栄養分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リガンドは、ゴム、グアー、カラギーン、およびマンナンから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体支持体は粒状である、請求項１〜７のいずれか1項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体に結合された１種以上の細胞を同定する段階をさらに含む、請求項１〜８のいずれか1項のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞は細胞タイプ特異的核酸プローブを用いて同定される、請求項９に記載の方法。
- 前記結合された細胞が溶解されてその核酸を放出する、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記放出された核酸は固体支持体に結合される、請求項１１に記載の方法。
- 試料中の細胞を検出する方法であって、
（ａ）前記細胞を、単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる非特異的リガンドが固定された固体支持体に、該固体支持体上に固定された該非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）前記固体支持体に結合された前記細胞を同定する段階とを含む方法。 - 段階（ｂ）は、前記細胞の溶解を含む、請求項１３に記載の方法。
- 溶解された前記細胞から放出された核酸は、固体支持体に結合される、請求項１４に記載の方法。
- 細胞に非特異的に結合し得るリガンドがその表面に固定された固体支持体であって、該非特異的に結合し得るリガンドが単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる固体支持体。
- 試料からの細胞の単離における、細胞に非特異的に結合し得るリガンドがその表面に固定された請求項１６に記載の固体支持体の使用。
- 前記細胞は微生物である、請求項１７に記載の使用。
- 細胞試料から核酸を単離する方法であって、
（ａ）前記試料中の細胞を、単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる非特異的リガンドが固定された固体支持体に、該固体支持体上に固定された該非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された前記細胞を溶解する段階と、
（ｃ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と
を含む方法。 - 試料中における標的細胞の存在または不在を検出する方法であって、
（ａ）前記試料中の細胞を、単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる非特異的リガンドが固定された固体支持体に、該固体支持体上に固定された該非特異的リガンドにより結合する段階と、
（ｂ）結合された前記細胞を溶解する段階と、
（ｃ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と、
（ｄ）結合された前記核酸内の、前記標的細胞に特徴的な核酸の存在または不在を検出する段階と
を含む方法。 - 前記核酸は、前記細胞と同じ固体支持体に結合される、請求項１９または２０に記載の方法。
- 前記細胞は微生物である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
- 試料から微生物を単離するためのキットであって、
（ａ）微生物に非特異的に結合可能なリガンドがその表面に固定された固体支持体であって、該非特異的に結合可能なリガンドが単糖モノマー類のポリマーである多糖類であり、該単糖モノマー類の少なくとも1種はマンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、及びガラクトース誘導体から選ばれる、固体支持体と、
（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための手段と、
を含むキット。 - 前記キットが更に、（ｃ）前記細胞を溶解するための手段を含む、請求項２３に記載のキット。
- 前記キットが更に、（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手段を含む、請求項２３又は２４に記載のキット。
- 前記マンノース誘導体及びガラクトース誘導体が、マンノース又はガラクトースのアルドン酸、ウラオン酸、デオキシ、アミノ、硫酸化及びアルコール誘導体である、請求項１〜６、８〜１２、１３〜１５、１９及び２０〜２２のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マンノース誘導体及びガラクトース誘導体が、マンノース及びガラクトースのアルドン酸、ウラオン酸、デオキシ、アミノ、硫酸化及びアルコール誘導体である、請求項１６に記載の固体支持体。
- 前記マンノース誘導体及びガラクトース誘導体が、マンノース及びガラクトースのアルドン酸、ウラオン酸、デオキシ、アミノ、硫酸化及びアルコール誘導体である、請求項１７又は１８に記載の使用。
- 前記マンノース誘導体及びガラクトース誘導体が、マンノース及びガラクトースのアルドン酸、ウラオン酸、デオキシ、アミノ、硫酸化及びアルコール誘導体である、請求項２３〜２５のいずれか1項に記載のキット。
- 前記多糖類が、１３個以上の共有結合した単糖単位を含む、請求項１〜６、８〜１２、１３〜１５、１９、２０〜２２及び２６のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多糖類が、１３個以上の共有結合した単糖単位を含む、請求項１６又は２７に記載の固体支持体。
- 前記多糖類が、１３個以上の共有結合した単糖単位を含む、請求項１７、１８又は２８に記載の使用。
- 前記多糖類が、１３個以上の共有結合した単糖単位を含む、請求項２３〜２５及び２９のいずれか1項に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0001450.6 | 2000-01-21 | ||
| GBGB0001450.6A GB0001450D0 (en) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Cell isolation method |
| PCT/GB2001/000240 WO2001053525A2 (en) | 2000-01-21 | 2001-01-22 | Cell isolation method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003520048A JP2003520048A (ja) | 2003-07-02 |
| JP4594577B2 true JP4594577B2 (ja) | 2010-12-08 |
Family
ID=9884139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001553385A Expired - Fee Related JP4594577B2 (ja) | 2000-01-21 | 2001-01-22 | 細胞単離方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7964364B2 (ja) |
| EP (2) | EP1252328B1 (ja) |
| JP (1) | JP4594577B2 (ja) |
| CN (2) | CN101560545B (ja) |
| AT (2) | ATE549414T1 (ja) |
| AU (2) | AU785041B2 (ja) |
| CA (1) | CA2397067C (ja) |
| DE (1) | DE60129000T2 (ja) |
| DK (1) | DK1252328T3 (ja) |
| ES (1) | ES2288925T3 (ja) |
| GB (1) | GB0001450D0 (ja) |
| NO (1) | NO332049B1 (ja) |
| WO (1) | WO2001053525A2 (ja) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69941441D1 (de) * | 1998-04-23 | 2009-10-29 | Takara Bio Inc | Methode für DNA synthese |
| DE10129815A1 (de) | 2001-06-24 | 2003-01-09 | Profos Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen |
| DE10230147A1 (de) | 2001-10-09 | 2004-01-15 | Profos Ag | Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen |
| AU2003208933A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-09-02 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for assays of bacterial spores |
| US7419798B2 (en) * | 2004-10-19 | 2008-09-02 | Zybac Llc | Rapid and sensitive detection of bacteria in blood products, urine, and other fluids |
| US7439062B2 (en) * | 2004-12-23 | 2008-10-21 | Biocept, Inc. | Beads for capturing target cells from bodily fluid |
| US20060252087A1 (en) * | 2005-01-18 | 2006-11-09 | Biocept, Inc. | Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts |
| DE102005002342A1 (de) * | 2005-01-18 | 2006-07-20 | GEN-Institut für Angewandte Laboranalysen GmbH | Verfahren sowie Kit zur Sterilisierung von Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeiten |
| WO2006078470A2 (en) | 2005-01-18 | 2006-07-27 | Biocept, Inc. | Cell separation using microchannel having patterned posts |
| US8158410B2 (en) | 2005-01-18 | 2012-04-17 | Biocept, Inc. | Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts |
| US20090136982A1 (en) | 2005-01-18 | 2009-05-28 | Biocept, Inc. | Cell separation using microchannel having patterned posts |
| KR101157174B1 (ko) * | 2005-11-24 | 2012-06-20 | 삼성전자주식회사 | 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치 |
| GB0525231D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Genpoint As | Method |
| KR101397386B1 (ko) | 2005-12-13 | 2014-05-26 | 엑스테라 메디컬 코퍼레이션 | 혈액으로부터 병원성 미생물, 염증 세포 또는 염증단백질의 체외 제거를 위한 방법 |
| US7695956B2 (en) * | 2006-01-12 | 2010-04-13 | Biocept, Inc. | Device for cell separation and analysis and method of using |
| GB0601302D0 (en) * | 2006-01-23 | 2006-03-01 | Semikhodskii Andrei | Diagnostic methods and apparatus |
| US9328326B2 (en) * | 2006-08-10 | 2016-05-03 | Merck Patent Gmbh | Method for isolating cells |
| US20080044880A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-21 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means |
| JP2008167722A (ja) * | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法 |
| EP2140003A2 (en) * | 2007-04-25 | 2010-01-06 | 3M Innovative Properties Company | Sample-processing reagent compositions, methods, and devices |
| WO2008131554A1 (en) * | 2007-04-26 | 2008-11-06 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health | Apparatus and process for immunomagnetic isolation of microorganisms |
| FR2945819B1 (fr) | 2009-05-19 | 2011-06-17 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques |
| GB2475226A (en) | 2009-11-03 | 2011-05-18 | Genetic Analysis As | Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair |
| US8758286B2 (en) | 2009-12-01 | 2014-06-24 | Exthera Medical Corporation | Method for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides |
| EP2377920A1 (de) * | 2010-04-15 | 2011-10-19 | Qiagen GmbH | Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Mikroorganismen |
| GB201011152D0 (en) * | 2010-07-02 | 2010-08-18 | Microsens Medtech Ltd | Capture of micro-organisms |
| WO2012016107A1 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Sdix | Methods and kits for detection of salmonella enteritidis and related serovars |
| GB201021399D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling |
| GB201021397D0 (en) | 2010-12-16 | 2011-01-26 | Genetic Analysis As | Diagnosis of Crohn's disease |
| GB201102693D0 (en) | 2011-02-16 | 2011-03-30 | Genetic Analysis As | Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis |
| WO2012168003A1 (en) * | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Biocartis S.A. | Selective lysis of cells by ionic surfactants |
| WO2013188073A1 (en) | 2012-06-13 | 2013-12-19 | Exthera Medical, Llc | Use of heparin and carbohydrates to treat cancer |
| MX360384B (es) | 2013-01-22 | 2018-10-31 | Imicroq S L | Metodo rapido para la deteccion de patogenos. |
| JP6648009B2 (ja) | 2013-06-24 | 2020-02-14 | エクステラ・メディカル・コーポレーション | マンノース被覆基材を含有する血液濾過システム |
| WO2015062699A1 (en) * | 2013-10-30 | 2015-05-07 | Merck Patent Gmbh | Method for isolating microorganisms from a complex sample |
| ES2799398T3 (es) | 2013-11-08 | 2020-12-17 | Exthera Medical Corp | Métodos para diagnosticar enfermedades infecciosas usando medios de adsorción |
| MX2016013873A (es) | 2014-04-24 | 2017-03-09 | Exthera Medical Corp | Metodo para eliminar bacterias de la sangre usando alta velocidad de flujo. |
| CN106714669B (zh) | 2014-09-22 | 2021-05-14 | 艾克塞拉医疗公司 | 可穿戴的血液灌流装置 |
| US9594377B1 (en) * | 2015-05-12 | 2017-03-14 | Google Inc. | Auto-height swing adjustment |
| US11911551B2 (en) | 2016-03-02 | 2024-02-27 | Exthera Medical Corporation | Method for treating drug intoxication |
| US10786615B2 (en) | 2016-03-02 | 2020-09-29 | Exthera Medical Corporation | Method for treating drug intoxication |
| GB201617519D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Genetic Analysis As | A companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant |
| DE102017204267B4 (de) * | 2017-03-14 | 2021-05-27 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen |
| JP7317821B2 (ja) | 2017-07-17 | 2023-07-31 | スマートディーエヌエー ピーティーワイ エルティーディー | ディスバイオシスを診断する方法 |
| GB201712459D0 (en) | 2017-08-02 | 2017-09-13 | Norges Miljø-Og Biovitenskapelige Univ | Treatment or prevention of gastrointestinal dysbiosis |
| WO2019173264A1 (en) * | 2018-03-05 | 2019-09-12 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Wireless detection of electrically or magnetically labeled analytes |
| GB201805479D0 (en) * | 2018-04-03 | 2018-05-16 | Momentum Bioscience Ltd | Microorganism separation and detection |
| CN111705052B (zh) * | 2020-07-15 | 2022-02-22 | 同济大学 | 一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用 |
| GB201914538D0 (en) | 2019-10-08 | 2019-11-20 | Momentum Bioscience Ltd | Microorganism capture from antimicrobial-containing solution |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4111838A (en) * | 1977-09-09 | 1978-09-05 | Eastman Kodak Company | Composition for chromatography |
| AU530410B2 (en) | 1978-02-21 | 1983-07-14 | Sintef | Preparing aqueous emulsions |
| SE452336B (sv) | 1978-06-16 | 1987-11-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent |
| NO155316C (no) | 1982-04-23 | 1987-03-11 | Sintef | Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler. |
| US4791063A (en) * | 1983-02-14 | 1988-12-13 | Cuno Incorporated | Polyionene transformed modified polysaccharide supports |
| US4689294A (en) * | 1984-11-19 | 1987-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Enhancement of hybridization of nucleic acids by anionic polymers |
| US4978616A (en) * | 1985-02-28 | 1990-12-18 | Verax Corporation | Fluidized cell cultivation process |
| US4719182A (en) * | 1985-03-18 | 1988-01-12 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations |
| US4935147A (en) * | 1985-12-20 | 1990-06-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Particle separation method |
| US5034314A (en) * | 1986-12-22 | 1991-07-23 | Olin Corporation | Method and kit for separating double-stranded nucleic acid from a single-stranded/double-stranded mixture of nucleic acids |
| US4929452A (en) * | 1987-09-30 | 1990-05-29 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Method for rapidly fermenting alcoholic beverages |
| SE8704158L (sv) * | 1987-10-26 | 1989-04-27 | Carbomatrix Ab C O Ulf Schroed | Mikrosfaerer, foerfarande foer framstaellning daerav och anvaendning daerav |
| US5225330A (en) * | 1988-08-01 | 1993-07-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Diagnostic kit and diagnostic method utilizing carbohydrate receptors |
| NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
| US5270189A (en) * | 1990-07-03 | 1993-12-14 | Martin Marietta Energy Systems, Inc. | Biparticle fluidized bed reactor |
| EP0553113B1 (en) * | 1990-08-02 | 1998-11-25 | Antex Biologics, Inc. | Adhesion receptors for pathogenic or opportunistic microorganisms |
| US5486457A (en) * | 1993-08-25 | 1996-01-23 | Children's Medical Center Corporation | Method and system for measurement of mechanical properties of molecules and cells |
| US5773223A (en) * | 1993-09-02 | 1998-06-30 | Chiron Corporation | Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof |
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| US5965457A (en) * | 1995-06-06 | 1999-10-12 | Magnani; John L. | Methods of screening for a candidate compound able to bind to CD34+ cells |
| DE19528029B4 (de) | 1995-07-31 | 2008-01-10 | Chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft | Magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol, Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung |
| GB9709728D0 (en) | 1997-05-13 | 1997-07-02 | Dynal As | Single step method |
| EP1118676A2 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-25 | Chemagen AG | Cell isolation method |
-
2000
- 2000-01-21 GB GBGB0001450.6A patent/GB0001450D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-01-22 EP EP01901300A patent/EP1252328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 ES ES01901300T patent/ES2288925T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 DK DK01901300T patent/DK1252328T3/da active
- 2001-01-22 US US10/169,898 patent/US7964364B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 DE DE60129000T patent/DE60129000T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 EP EP07011726A patent/EP1865068B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 AT AT07011726T patent/ATE549414T1/de active
- 2001-01-22 CN CN2009100044066A patent/CN101560545B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 WO PCT/GB2001/000240 patent/WO2001053525A2/en active IP Right Grant
- 2001-01-22 JP JP2001553385A patent/JP4594577B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 AU AU26959/01A patent/AU785041B2/en not_active Ceased
- 2001-01-22 AT AT01901300T patent/ATE365225T1/de active
- 2001-01-22 CA CA2397067A patent/CA2397067C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 CN CNB018039022A patent/CN100507001C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-19 NO NO20023474A patent/NO332049B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-11-30 AU AU2006246478A patent/AU2006246478B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1395620A (zh) | 2003-02-05 |
| CN101560545A (zh) | 2009-10-21 |
| DK1252328T3 (da) | 2007-10-15 |
| CA2397067A1 (en) | 2001-07-26 |
| ATE365225T1 (de) | 2007-07-15 |
| AU2695901A (en) | 2001-07-31 |
| CA2397067C (en) | 2012-02-28 |
| NO20023474D0 (no) | 2002-07-19 |
| US20030153028A1 (en) | 2003-08-14 |
| AU785041B2 (en) | 2006-08-31 |
| EP1865068B1 (en) | 2012-03-14 |
| NO332049B1 (no) | 2012-06-11 |
| EP1865068A2 (en) | 2007-12-12 |
| EP1252328A2 (en) | 2002-10-30 |
| GB0001450D0 (en) | 2000-03-08 |
| DE60129000D1 (de) | 2007-08-02 |
| DE60129000T2 (de) | 2008-04-10 |
| EP1865068A3 (en) | 2010-04-07 |
| CN101560545B (zh) | 2012-07-18 |
| AU2006246478B2 (en) | 2010-09-30 |
| EP1252328B1 (en) | 2007-06-20 |
| AU2006246478A1 (en) | 2006-12-21 |
| ES2288925T3 (es) | 2008-02-01 |
| NO20023474L (no) | 2002-09-20 |
| WO2001053525A2 (en) | 2001-07-26 |
| US7964364B2 (en) | 2011-06-21 |
| CN100507001C (zh) | 2009-07-01 |
| JP2003520048A (ja) | 2003-07-02 |
| ATE549414T1 (de) | 2012-03-15 |
| WO2001053525A3 (en) | 2001-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4594577B2 (ja) | 細胞単離方法 | |
| JP7408229B2 (ja) | ポリヌクレオチド捕捉材料およびその使用方法 | |
| Stevens et al. | Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review | |
| JP4175670B2 (ja) | 固体相核酸の単離 | |
| JP2011509083A (ja) | 微生物捕捉用組成物及び微生物を捕捉する方法 | |
| US20090186346A1 (en) | Method for Detecting the Presence or Absence of a Target Cell in a Sample | |
| WO2016024263A1 (en) | Methods for isolating microbial dna from a blood sample | |
| EP1118676A2 (en) | Cell isolation method | |
| Stevens | The role of molecular methods in the detection of pathogens in food | |
| JPH0994098A (ja) | 微生物の選択的濃縮方法およびこれを用いた微生物検査法 | |
| Lucore | Methods used to separate and concentrate bacteria from foods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060616 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090701 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090924 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091001 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091030 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091109 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091130 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100104 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100129 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20100329 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100427 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100510 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100527 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100603 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100728 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100826 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100917 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130924 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |