DE60129000T2 - Verfahren und Mittel zur Isolierung von Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren und Mittel zur Isolierung von Mikroorganismen Download PDF

Info

Publication number
DE60129000T2
DE60129000T2 DE60129000T DE60129000T DE60129000T2 DE 60129000 T2 DE60129000 T2 DE 60129000T2 DE 60129000 T DE60129000 T DE 60129000T DE 60129000 T DE60129000 T DE 60129000T DE 60129000 T2 DE60129000 T2 DE 60129000T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
added
dilution
well
coated
microorganisms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60129000T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60129000D1 (de
Inventor
Unn Hilde Refseth
Tone Kolpus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genpoint AS
Original Assignee
Genpoint AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genpoint AS filed Critical Genpoint AS
Publication of DE60129000D1 publication Critical patent/DE60129000D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60129000T2 publication Critical patent/DE60129000T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein –Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, insbesondere ein Verfahren zum Isolieren von Bakterien, die in einer Probe vorhanden sind.
  • Die Mehrzahl der gängigen Methoden, die anstreben, Proben qualitativ und quantitativ auf die Anwesenheit von Mikroorganismen zu analysieren, ist auf die Identifizierung eines spezifischen Mikroorganismus gerichtet, z.B. eines Krankheitserregers. Immunomagnetische Trennung von Stämmen von Listerien und Salmonellen aus Nahrungsmittelproben und klinischen Proben ist beschrieben worden (siehe zum Beispiel Skjerve et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 3478–3481). Solche Methoden beruhen auf der Verwendung von Liganden, im allgemeinen Antikörpern, die für den betreffenden Mikroorganismus spezifisch sind. Da sie auf der Verwendung von spezifischen Liganden beruht, ist die immunomagnetische Trennung nur in Situationen anwendbar, in denen ein bestimmter Mikroorganismus identifiziert werden soll, und nicht wenn eine allgemeine Suche nach Mikroorganismen, die anwesend sein können, gewünscht wird. Immunomagnetische Trennung wird nicht leicht nicht vermutete Mikroorganismen erfassen.
  • Es gibt Situationen, z.B. wenn man Proben aus der Umwelt, wie beispielsweise Wasserproben, analysiert, in denen es wünschenswert sein kann, ein umfassendes Bild der verschiedenen Arten von anwesenden Mikroorganismen oder eine Ab schätzung der Gesamtkonzentration der Mikroorganismen zu erhalten. Es können Beschränkungen hinsichtlich der Gesamtmenge der Bakterien gesetzt sein, die in der Wasserversorgung anwesend sein dürfen, was unabhängig von Bedenken hinsichtlich der Anwesenheit bestimmter Bakterien ist. Die Identifizierung von ausgedehnten Klassen von Mikroorganismen z.B. in einem Fluss oder in einem See kann nützliche Informationen über den Zustand dieses Gewässers, der Konzentrationen von Nährstoffen, das Abfließen von in der Landwirtschaft eingesetzten Chemikalien etc. zur Verfügung stellen.
  • Wenn ein allgemeines Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen in einer Probe zur Verfügung gestellt werden kann, kann die Identifizierung der einzelnen anwesenden Mikroorganismen dann bequem in einem nachfolgenden Schritt durchgeführt werden. Auf Nukleinsäuren basierende Assays könnten zweckmäßigerweise verwendet werden, um spezifische Mikroorganismen zu identifizieren.
  • Die WO 91/06007 offenbart ein Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen, das Glykolipide mit Kohlenhydrateinheiten verwendet, die weniger als 13 Monosaccharid-Untereinheiten enthalten. Die US 5 696 000 offenbart ebenfalls Glykolipide, die Mikroorganismen binden. Die Kohlenhydrateinheiten enthalten vier oder weniger Monosaccharid-Untereinheiten. Die US 4 543 328 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Krankheitserregern in Blut, das biokompatible Adsorbentien verwendet, die selektiv den Krankheitserreger binden. Die Adsorbentien werden durch Kopplung mit Heparin und/oder Albumin, die als antithrombotische Mittel wirken, biokompatibel gemacht. Die US 4 935 147 offenbart ein Verfahren zur Förderung einer nicht spezifischen Bindung zwischen magnetischen und nicht magnetischen Teilchen. Die Bindung wird durch ein lösliches polyionisches Reagens herbeigeführt.
  • Verfahren, die derzeit verwendet werden, um Abschätzungen der Gesamtmenge der in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen zu erhalten oder um die Mikroorganismen für eine weitere Analyse aus der Probe zu isolieren, beruhen auf ziemlich groben Trenntechniken, die Filtration und/oder Zentrifugierung und Züchten auf Nährbodenplatten mit einschließen. Die Bestimmung der Gesamtkonzentration der Bakterien kann beispielsweise mittels Durchflusszytometrie oder Filtration und Züchten auf einem allgemeinen Medium in einer Petrischale durchgeführt werden. Diese Verfahren können einige Tage in Anspruch nehmen und sind ziemlich kompliziert und ungenau. Spezielle Probleme sind bei herkömmlichen Verfahren beobachtet worden, die verwendet werden, um Nahrungsmittelproben zu analysieren, da diese eine Menge festes Material enthalten (Klumpen und fetthaltige Teilchen) die dazu neigen, Filter zu verstopfen und nach Zentrifugierung ein Pellet ergeben, in dem die Bakterien komprimiert und nicht verfügbar für die Lyse oder die Bindung an Antikörper sind.
  • Es gibt daher ein Bedürfnis für ein Verfahren, das in der Lage ist, eine Anzahl unterschiedlicher Arten von Mikroorganismen aus einer Probe zu isolieren, vorzugsweise in einem einzigen Schritt, der schnell und bequem durchzuführen ist.
  • Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesen Anforderungen und folglich wird entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen aus einer Probe zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren das Binden besagter Mikroorganismen an einen festen Träger mittels eines nicht spezifischen Liganden umfasst, der auf besagtem festen Träger immobilisiert ist, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt folglich durch Anwendung der Wechselwirkungen zwischen nicht spezifischen Liganden, die an feste Träger gebunden sind und Bindungspartnern für die besagten Liganden (Rezeptoren), die sich auf der Oberfläche von Mikroorganismen finden, ein allgemeines Trennverfahren zur Verfügung, das die Erfassung ausgedehnter Klassen von Mikroorganismen möglich macht. Da das wesentliche der vorliegenden Erfindung die nicht spezifische Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Liganden und den Mikroorganismen ist, ist es beabsichtigt, wenn hierin von „Isolieren von Mikroorganismen" die Rede ist, das Isolieren von Mikroorganismen in einer Weise zu beschreiben, die nicht spezifisch für eine bestimmte Art oder Gattung ist. Mit anderen Worten ist der immobilisierte Ligand in der Lage, an unterschiedliche Gattungen von Mikroorganismen, mindestens 2 unterschiedliche Gattungen, bevorzugt 3 oder mehr, besonders bevorzugt mindestens 5 oder 7 unterschiedliche Gattungen, ganz besonders bevorzugt mindestens 10 oder sogar 14 oder mehr unterschiedliche Gattungen zu binden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein allgemeines Verfahren zum Abtrennen von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, von den anderen Bestandteilen einer Probe zur Verfügung. Das Verfahren ist „allgemein" in dem Sinne, dass nicht auf eine Bakterienart abgezielt wird, sondern ein Grobtrennungssystem ausgeführt wird, um Informationen über die Gesamtpopulation von Mikroorganismen zu erhalten oder einen zweiten Schritt zu erleichtern, durch den für eine Art spezifische Informationen erhalten werden, z.B. auf der Ebene der Nukleinsäuren, indem für eine Art spezifische Sonden verwendet werden.
  • Die Mikroorganismen werden „isoliert" in dem Sinne, dass sie an den festen Träger gebunden werden und dann von dem Rest der Probe abgetrennt werden können, indem man den festen Träger mit den daran gebundenen Mikroorganismen entfernt, oder indem man, z.B. durch Abfließen lassen, den Rest der Probe entfernt. Wenn der feste Träger magnetisch ist, ist die Handhabung des Komplexes aus Träger und Mikroorganismus besonders bequem.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um eine große Vielzahl von Mikroorganismen zu isolieren, einschließlich all jener Mikroorganismen, die an eukaryotische Zellen binden können, einschließlich der Einzeller, Algen, Protozoen und Pilze sowie Mycoplasmen und aller Bakterien und Viren. Die Verfahren der Erfindung können zum Isolieren von eukaryotischen Parasiten verwendet werden, besonders jener, die in der Lage sind, die komplexen Polysaccharide zu binden, die auf menschlichen Zellen (oder anderen Wirtsorganismen) gefunden werden. Solche eukaryotischen Parasiten schließen Cryptosporidium, Entamoeba histolytica und den Malariaparasiten mit ein. Daher sollte der Hinweis hierin auf „Mikroorganismen" so verstanden werden, dass er solche Parasiten mit einschließt.
  • Die Verfahren der Erfindung sind besonders geeignet für das Isolieren von Bakterien. Die Einteilung von Bakterien in Klassen ist eine komplexe und sich ständig ändernde Wissenschaft, aber „echte" Bakterien (Eubakterien) können in eine Anzahl von Klassen („Parts") eingeteilt werden („Bergey's Handbuch der klassifizierenden Biologie” (Bergey's Manual of Determinative Biology)), z.B. phototrope Bakterien, gleitende Bakterien, bescheidete Bakterien und grampositive Kokken. Jede Klasse kann wiederum in eine oder mehrer Ordnungen mit Familien und Gattungen innerhalb dieser Ordnung eingeteilt werden. Bakterien aus mehr als einer Gattung, Familie oder Ordnung oder sogar Klasse können mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Die wirkungsvolle Abtrennung von Bakterien aus einigen der oder allen folgenden Familien und Gattungen von Bakterien aus einer Probe kann mit den vorliegenden Verfahren erreicht werden: Aeromonas, Bacillus, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia (pathogene und nicht pathogene), Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella, Shewanella, Serratia, Shigella, Vibrio, Yersinia, Morganella, Photobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus, Brochothrix.
  • Das Verfahren kann verwendet werden, um Bakterien und andere Arten von Mikroorganismen, z.B. Algen, Protozoen, Pilze oder Viren, gleichzeitig zu isolieren.
  • Unter bestimmten Umständen wird die Probe möglicherweise nur eine begrenzte Anzahl von Bakterienarten enthalten und das Verfahren kann zum Ergebnis haben, dass nur einige Bakterienarten oder sogar nur ein oder zwei Arten gebunden und so aus der Probe isoliert werden. Solch ein Verfahren ist dennoch nicht ein spezifisches Verfahren zum Isolieren, da der immobilisierte Ligand fähig ist, an eine große Vielzahl von Bakterien zu binden, selbst wenn die verfügbaren Bakterienpopulationen eher begrenzt sind.
  • Die Tatsache, dass nicht ein spezifischer Komplex aus festem Träger und Ligand ausgewählt zu werden braucht, um ein gegebenes Verfahren zum Isolieren durchzuführen, stellt einen bedeutenden Vorteil dar in Bezug auf Flexibilität und Kosten, da ein einziger fester Träger mit daran gebundenem Liganden in einer großen Vielzahl von Verfahren zum Isolieren bzw. Abtrennen benutzt werden kann. Es sind folglich die allgemeinen Bindungsfähigkeiten des festen Trägers, die besonders vorteilhaft sind.
  • Vorzugsweise haben die Verfahren der Erfindung das Ergebnis, dass ein großer Anteil der Mikroorganismen (z.B. Bakterien), die in der Probe anwesend sind, isoliert werden, sowohl was den Anteil aller anwesenden Bakterienzellen betrifft als auch was den Anteil der Bakteriensorten betrifft. So werden bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt mindestens 50%, insbesondere bevorzugt mindestens 70 oder 80% der Mikroorganismen in der Probe gebunden werden, um feste Träger zu sein. Selbstverständlich wird der Prozentsatz der Mikroorganismen in der Probe, die gebunden werden, von der Menge des zu der Probe hinzugefügten festen Trägers und dem Verhältnis von Liganden zu Mikroorganismen abhängen. Es wird für die oben genannten Prozentsätze angenommen, dass ein Überschuss des festen Trägers und des Liganden in der Mischung vorhanden ist.
  • Anders betrachtet werden vorzugsweise Repräsentanten von mindestens 20% der unterschiedlichen (z.B. Bakterien-) Arten isoliert werden, besonders bevorzugt werden Repräsentanten von mindestens 30 oder 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50%, insbesondere mindestens 60 oder 70% oder sogar mindestens 80% der anwesenden unterschiedlichen (z.B. Bakterien-) Arten an den festen Träger gebunden werden.
  • Der „nicht spezifische" Ligand wird ein Ligand sein, der, wie oben besprochen, in der Lage ist, an mehr als eine Sorte von Mikroorganismus und/oder Bakteriengattung zu binden, vorzugsweise an mehr als 2 oder 3, besonders bevorzugt an mehr als 5 oder 7, z.B. mehr als 10 oder 14 unterschiedliche Gattungen. Es gibt eine Wechselwirkung zwischen dem Liganden und seinem Bindungspartner bzw. seinen Bindungspartnern auf der Oberfläche des Mikroorganismus, die für das Binden verantwortlich ist; es ist nicht der Fall, dass es einfach eine allgemeine Anziehung oder eine Verbindung zwischen den Zellen und dem festen Träger gibt, wie es der Fall sein kann, wenn sich Zellen durch Fällung anlagern. Der nicht spezifische Charakter des Liganden bezieht sich nicht auf die Tatsache, dass er in der Lage ist, sich wahllos mit Resten auf der Oberfläche der Mikroorganismen zu verbinden oder daran anzulagern, sondern darauf, dass sein bzw. seine Bindungspartner nicht für eine bestimmte Sorte oder Art von Mikroorganismen spezifisch ist bzw. sind. Der Ligand kann folglich als ein allgemeiner Bindungsligand betrachtet werden.
  • Da geeignete Bindungspartner unter verschiedenen Mikroorganismen verhältnismäßig weit verbreitet sind, insbesondere unter unterschiedlichen Gattungen von Bakterien, wird ein eher allgemeines und folglich nicht spezifisches Verfahren zum Isolieren zur Verfügung gestellt. Daher ist der Ligand, obwohl er einen oder mehrere spezifische Bindungspartner haben kann, „nicht spezifisch" in dem Sinne, dass er in der Lage ist, an eine Vielzahl unterschiedlicher Bakterien zu binden, die alle einen geeigneten Bindungspartner tragen.
  • Obgleich diese Theorie keine Bindungswirkung haben soll, scheint es, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Bindungspartner, die selbst gewöhnlich artenspezifisch sind, in der Lage sind, den gleichen Liganden zu binden und so ein Trennverfahren zur Verfügung stellen, das nicht artenspezifisch ist. Artenspezifische Lektine sind in der Lage, ein nicht artenspezifisches System zur Abtrennung mit auf Kohlehydraten beruhenden Liganden zur Verfügung zu stellen.
  • Die Bindungspartner sind gewöhnlich Proteine auf der Oberfläche der Mikroorganismen und können von Art zu Art variieren. Es ist nicht sehr viel über die Bindungspartner bekannt, aber die Erfinder sind dennoch in der Lage gewesen, geeignete Liganden zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung zu identifizieren.
  • Der Ligand ist nicht proteinartig und folglich sind Antikörper und Derivate und Fragmente davon ausgeschlossen. Im Gegensatz zu den nicht spezifischen Liganden des vorliegenden Verfahrens sind solche proteinartigen Liganden fähig zu sehr spezifischen (d. h. für Gattungen, insbesondere für Arten spezifischen) Wechselwirkungen, z.B. mit Proteinen auf der Oberfläche von Zellen.
  • Die nicht spezifischen Liganden sind Polysaccharide, die Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfassen, wobei besagte Polysaccharide 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfassen. Besonders bevorzugt sind Polysaccharide, die die im Folgenden besprochenen Monosaccharid-Monomere enthalten. Monosaccharide schließen Hexosen und Pentosen in der Pyranose- oder Furanoseform, wo dies geeignet ist, mit ein, sowie Zuckerderivate wie beispielsweise Aldon- und Uronsäuren, Desoxy- oder Aminozucker, sulfatierte Zucker und Zuckeralkohole. Beispiele für geeignete Monosaccharide sind Mannose (z.B. D-Mannose), Galactose (z.B. D-Galactose), Glucose (z.B. D-Glucose), Fructose, Fucose (z.B. L-Fucose), N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin, Rhamnose, Galactosamin, Glucosamin (z.B. D-Glucosamin), Galacturonsäure, Glucuronsäure, N-Acetylneuraminsäure, Methyl-D-mannopyranosid (Mannosid), α-Methylglucosid, Galactosid, Ribose, Xylose, Arabinose, Saccharate, Mannit, Sorbit, Inosit, Glycerin und Derivate dieser Monomeren. Von diesen sind Mannose, Galactose und Fucose bevorzugt.
  • Polysaccharide umfassen 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten, die gleich oder verschieden sein können und die linear oder verzweigt sein können, vorzugsweise verzweigt. Geeignete Polysaccharide werden reich an Mannose, Galactose, Glucose, Fructose oder Uronsäuren sein, z.B. Galaktomannan-Polysaccharid (hierin als GUM oder GUM 1 bezeichnet) (Sigma G 0753), von dem angenommen wird, dass es ein geradkettiges Polymer von Mannose mit einer Galactoseseitenkette an jeder vierten Mannoseeinheit ist.
  • Polysaccharide, die aus Mannose- und Galactose-Untereinheiten bestehen, sind eine bevorzugte Sorte von Liganden und ein weiteres Beispiel ist Guar, das eine lineare Hauptkette aus β 1,4 verbundenen Mannoseeinheiten mit einer 1,6 α gebundenen Galactoseseiteneinheit an ungefähr jeder zweiten Einheit aufweist. Das Verhältnis von Mannose zu Galactose beträgt ungefähr 1,8:1 bis ungefähr 2:1; das Guar, das in den hierin beschriebenen Experimenten benutzt wird, ist von Sigma, Katalognummer G 1429.
  • Weitere Polysaccharide schließen Gummi arabicum (Sigma G 9752), von dem angenommen wird, dass es ein verzweigtes Polymer von Galactose, Rhamnose, Arabinose und Glucuronsäure ist, und Gummi Karaya (Sigma G 0503), von dem angenommen wird, dass es ein teilweise acetyliertes Polymer von Galactose, Rhamnose und Glucuronsäure ist, sowie das aus Mannoseeinheiten aufgebaute Homopolysaccharid Mannan mit ein.
  • Zuckerderivate, die geeignete Liganden sind, schließen Carrageen (verschiedene Formen) mit ein. Sulfatierte Zucker sind eine bevorzugte Klasse von Zuckerderivaten.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass Liganden, die auf Molekülen basieren, die Nährstoffe für Mikroorganismen sind, geeignete Mittel zum Trennen zur Verfügung stellen. Es war ein Ziel des vorliegenden Verfahrens, ein System zum Isolieren zur Verfügung zu stellen, das neben der Verwendung von Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand auch die proaktive Antwort von Bakterien auf das Vorhandensein von Nährstoffen in den Medien ausnutzte, um die Erfassung von Mikroorganismen zu verbessern.
  • Ein fester Träger, der einen darauf immobilisierten Liganden aufweist, der in der Lage ist, in einer nicht spezifischen Weise an Zellen (z.B. Mikroorganismen) zu binden, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst.
  • Im Zusammenhang mit der Untersuchung der gegenüber Fucose empfindlichen und gegenüber Mannose empfindlichen Hämagglutination der Bakterien Vibrio cholerae sind L-Fucose und D-Mannose kovalent an Agaroseperlen gebunden worden (Sanchez et al. APMIS (1990) 98 353–357) und daher sind diese Komplexe aus festem Träger und Ligand nicht im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Diese frühere Arbeit untersuchte eine sehr spezifische Wechselwirkung, die lediglich eine Bakterienart mit einbezieht und ist nicht ein allgemeines Verfahren zum Isolieren von Bakterien. Daher umfasst die Verwendung dieser Komplexe aus Perlen und Liganden im Kontext der hierin definierten Verfahren einen Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • Obgleich wie hierin besprochen ein allgemeines Trennverfahren zur Verfügung gestellt wird, haben die Erfinder gefunden, dass Liganden, die bestimmte Zucker enthalten, für das Abtrennen bestimmter sehr ausgedehnter Gattungen von Mikro organismen besonders geeignet sind. So werden z.B. Bakterienarten, die im Darm vorhanden sind, sehr effizient isoliert, wenn ein Mannose enthaltender Ligand benutzt wird (der Ligand kann ein Mannose enthaltendes Polymer sein), und Bakterien, die durch die Lunge eindringen, werden sehr effizient isoliert unter Verwendung von sulfatierten Zukkern als Liganden. Die Verwendung von solchen Liganden in Verfahren zum Abtrennen von Bakterien aus einer Probe, die aus dem Darm oder aus der Lunge entnommen wurde, stellt folglich weitere bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
  • Die Probe, aus der Mikroorganismen isoliert werden können, schließt Proben aus der Umwelt wie beispielsweise Wasserproben, z.B. aus Seen, Flüssen, Kläranlagen und anderen Einrichtungen zur Wasserbehandlung oder Bodenproben mit ein. Die Verfahren sind von besonderem Nutzen für die Analyse von Nahrungsmittelproben und im allgemeinen für Anwendungen in den Bereichen Gesundheit und Hygiene, bei denen ein Bedürfnis zur Überwachung von Bakterienkonzentrationen besteht, z.B. in Bereichen, in denen Nahrung zubereitet wird. Zum Beispiel können Milchprodukte auf Listerien untersucht werden. Herkömmliche Methoden für das Isolieren von Bakterien, die immobilisierte Antikörper verwenden, haben sich als viel weniger wirkungsvoll als unsere Verfahren für das Isolieren von Listerien mit nicht spezifischen Liganden erwiesen, vielleicht wegen der hydrophoben Natur des immobilisierten Antikörpers. Wenn die Probe eine Wasserprobe ist, ist der Ligand vorzugsweise ein Nährstoff für die Mikroorganismen von Interesse.
  • Nahrungsmittelproben können analysiert werden, indem zuerst homogenisiert wird, wo dies notwendig ist (wenn eine feste Probe vorliegt), dann mit einem geeigneten Inkubationsmedium (z.B. Peptonwasser) vermischt wird und bei 37°C über Nacht inkubiert wird. Nahrungsmittel wie Käse, Eiscreme, Eier, Margarine, Fisch, Garnelen, Huhn, Rindfleisch, Schweinerippchen, Weizenmehl, Haferflocken, gekochter Reis, Pfeffer bzw. Paprika, Gemüse wie beispielsweise Tomaten, Brokkoli, Bohnen, Erdnüsse und Marzipan können auf diese Weise analysiert werden. Die Verfahren der Erfindung bieten besonderen Nutzen für die Analyse von Nahrungsmittelproben, da diese eine Menge festes Material (Klumpen und fetthaltige Teilchen) enthalten, das dazu neigt, Filter zu verstopfen und nach Zentrifugierung ein Pellet ergeben, in dem die Bakterien komprimiert sind und nicht für eine Lyse oder für die Bindung an Antikörper zur Verfügung stehen.
  • Proben, aus denen Mikroorganismen gemäß dem vorliegenden Verfahren isoliert werden können, können klinische Proben sein, die aus dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurden. Verwendbare Proben schließen Vollblut und von Blut abgeleitete Produkte, Urin, Exkremente, zerebrospinale Flüssigkeit oder alle möglichen anderen Körperflüssigkeiten sowie Gewebeproben und Proben ein, die z.B. durch einen Abstrich eines Körperhohlraums erhalten wurden.
  • Die Probe kann auch verhältnismäßig reine oder teilweise gereinigte Ausgangsmaterialien enthalten, wie beispielsweise halbgereinigte Zubereitungen, die durch andere Prozesse zur Abtrennung von Zellen erhalten wurden.
  • Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete feste Träger können alle wohlbekannten Träger oder Matrices sein, die gegenwärtig weithin für die Immobilisierung, Abtrennung etc. benutzt werden oder dafür vorgeschlagen werden. Diese können die Form von Teilchen, Folien bzw. Blättern, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern, Kapillaren oder Mikrotiterstreifen, Röhren, Platten oder Mulden etc. haben.
  • Zweckmäßigerweise kann der Träger aus Glas, Siliziumdioxid, Latex oder einem polymeren Material hergestellt werden. Bevorzugt sind Materialien, die eine große Oberfläche für die Bindung der Zellen und nachfolgend der Nukleinsäure aufweisen. Solche Träger werden im allgemeinen eine unregelmäßige Oberfläche aufweisen und können zum Beispiel porös oder korpuskular sein, z.B. Teilchen, Fasern, Netze, Sinterkörper oder Siebe. Korpuskulare Materialien, z.B. Perlen, sind im allgemeinen auf Grund ihres größeren Bindungsvermögens bevorzugt, insbesondere Perlen aus Polymeren.
  • Zweckmäßigerweise wird ein erfindungsgemäß eingesetzter korpuskularer fester Träger sphärische Perlen umfassen. Die Größe der Perlen ist nicht kritisch, aber sie können zum Beispiel einen Durchmesser in der Größenordnung von mindestens 1 und bevorzugt mindestens 2 μm haben, und einen maximalen Durchmesser von vorzugsweise nicht mehr als 10 und besonders bevorzugt nicht mehr als 6 μm aufweisen. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, dass Perlen mit Durchmessern von 2,8 μm und 4,5 μm gut geeignet sind.
  • Nicht magnetische Polymerperlen, die für die Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeignet sind, sind von Dyno Particles AS (Lillestrom, Norwegen) sowie von Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich.
  • Jedoch sind, um die Handhabung und Trennung zu unterstützen, magnetische Perlen bevorzugt. Die Bezeichnung „magnetisch", wie sie hierin verwendet wird, bedeutet, dass der Träger in der Lage ist, ein magnetisches Moment auszubilden, wenn er in ein Magnetfeld gebracht wird, und folglich unter der Einwirkung dieses Feldes beweglich ist. Mit anderen Worten kann ein Träger, der magnetische Teilchen enthält, leicht durch magnetische Aggregation entfernt werden, was einen schnellen, einfachen und leistungsfähigen Weg zur Abtrennung der Partikel nach den Schritten der Bindung von Zellen und Nukleinsäuren darstellt, und ein weit weniger rigoroses Verfahren ist als traditionelle Methoden wie beispielsweise Zentrifugierung, die Scherkräfte erzeugen, die Zellen zerreißen oder Nukleinsäuren abbauen können.
  • Folglich können bei Einsatz des Verfahrens der Erfindung die magnetischen Teilchen mit den daran gebundenen Zellen durch Anwendung eines Magnetfelds, z.B. unter Verwendung eines Dauermagneten, auf eine geeignete Oberfläche übertragen werden. Es ist normalerweise ausreichend, einen Magneten an der Seite des Behälters anzuwenden, der die Probenmischung enthält, um die Partikel an der Wand des Behälters zu aggregieren, und den Rest der Probe abzugießen.
  • Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Teilchen, zum Beispiel diejenigen, die von Sintef in der EP-A 106 873 beschrieben wurden, da eine magnetische Aggregation und ein Verklumpen der Partikel während der Reaktion vermieden werden kann, wodurch eine einheitliche und Extraktion von Nukleinsäuren sicher gestellt wird. Die weithin bekannten magnetischen Teilchen, die durch Dynal AS (Oslo, Norwegen) unter der Bezeichnung DYNABEADS verkauft werden, sind geeignet dafür, in der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden.
  • Funktionalisierte beschichtete Teilchen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch Modifikation der Perlen gemäß den US-Patenten 4 336 173 , 4 459 378 und 4 654 267 hergestellt werden. So können Perlen oder andere Träger hergestellt werden, die unterschiedliche Arten von funktionalisierten Oberflächen aufweisen, z.B. positiv oder negativ geladene, hydrophile oder hydrophobe Oberflächen.
  • Die Teilchen stellen vorzugsweise eine große Oberfläche für die Bindung zur Verfügung und werden folglich in der Regel klein und unter Umständen nicht glatt sein. Die Oberfläche des festen Trägers wird vorzugsweise (entweder vor oder nach der Immobilisierung des Liganden) nicht hydrophob sein.
  • Besonders bevorzugte Teilchen zur Verwendung als feste Träger in den Verfahren der Erfindung sind sphärisch geformte Polymerteilchen (Perlen) basierend auf PVA (Polyvinylalkohol) in denen ein magnetisches Kolloid verkapselt worden ist. Diese Perlen können durch Suspension einer Polymerphase, die magnetische Kolloide enthält, in einer Pflanzenölphase, die einen Emulgator enthält, hergestellt werden, wie in der CA 2 227 608 beschrieben wurde. Die Teilchen, deren Größe zwischen 1 und 8 μm schwanken kann, sind vorzugsweise erhältlich von der Chemagen AG, Deutschland.
  • Geeignete Puffer etc. können als Medien für das Isolieren verwendet werden, um Bedingungen zu erzielen, die für das Binden geeignet sind. Zweckmäßigerweise kann ein Puffer mit der geeigneten Ladung, Osmolarität etc. der Probe vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt mit dem festen Träger hinzugefügt werden. PBS ist ein geeigneter Puffer für das Binden von Zellen.
  • Verfahren für die Anbindung eines Liganden an einen festen Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. Gewöhnlich wird der feste Träger zuerst aktiviert werden und dann mit dem Liganden umgesetzt werden, wobei der Ligand selbst geringfügig modifiziert worden sein kann, um kovalent an den festen Träger zu binden. Im Falle der superparamagnetischen Teilchen von Chemagen, die oben besprochen wurden, kann die Matrix aus Polyvinylalkohol durch die Einführung von Isocyanatgruppen über einen Spacer mit 8 Atomen aktiviert werden.
  • Diese aktivierten Perlen (M-PVA A k2x) können dann für die direkte Ankopplung von Molekülen benutzt werden, die Amino- oder Hydroxylgruppen enthalten. Eine typische Kopplungsreaktion würde die folgende sein:
    Figure 00170001
  • Chemagen hält Patente, die sich auf die Modifikation ihrer Perlen durch Kopplung beziehen.
  • Um die Bindung von Zellen zu untersuchen und wo qualitative oder quantitative Informationen über spezifische Mikroorganismen erforderlich sind, kann ein weiterer Identifizierungsschritt durchgeführt werden. Die Kombination eines allgemeinen Verfahrens zur Abtrennung von Zellen, wie es oben beschrieben ist, mit einem artenspezifischen Nachweisverfahren stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
  • Die Identität der gebundenen Mikroorganismen kann durch Analyse der Nukleinsäure der Mikroorganismen oder durch andere Methoden untersucht werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise durch die Verwendung von markierten Antikörpern, die für bestimmte Typen von Mikroorganismen spezifisch sind. Zweckmäßigerweise kann, nachdem die Zellen an den festen Träger gebunden haben, Nukleinsäure aus dem Komplex von Mikroorganismus und Perle isoliert und analysiert werden, z.B. durch PCR. Daher wird, nachdem die Mikroorganismen an besagten festen Träger gebunden haben, ein Schritt der Zelllyse erfolgen, um die Nukleinsäure aus den Mikroorganismen für eine nachfolgende Analyse freizu setzen. Die freigesetzte Nukleinsäure kann in gelöster Form analysiert werden aber zweckmäßiger wird sie analysiert, nachdem sie an einen festen Träger gebunden hat. Dieser feste Träger kann der gleiche oder ein unterschiedlicher Träger sein, ist aber vorzugsweise der gleiche Träger wie der feste Träger, an den die Mikroorganismen selbst gebunden haben. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Analyse einer Mikroorganismen enthaltenden Probe.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus in einer Probe zur Verfügung, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (a) Binden besagter Mikroorganismen an einen festen Träger mittels eines nicht spezifischen Liganden, der auf besagtem festen Träger immobilisiert ist, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst; und
    • (b) Identifizieren der an besagten festen Träger gebundenen Mikroorganismen. Schritt (b) wird zweckmäßigerweise durchgeführt durch
    • (c) Lysieren der Mikroorganismen; und gegebenenfalls
    • (d) Binden der von besagten lysierten Mikroorganismen freigegebenen Nukleinsäure an einen festen Träger.
  • Geeignete Verfahren für das Lysieren der Mikroorganismen, das Binden der so freigegebenen Nukleinsäure und das Analysieren der Nukleinsäure werden in der WO98/51693 zur Verfügung gestellt. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe von Mikroorganismen, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (a) Binden von Mikroorganismen in besagter Probe an einen festen Träger mittels eines nicht spezifischen Liganden, der auf besagtem festen Träger immobilisiert ist, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst;
    • (b) Lysieren der gebundenen Zellen; und
    • (c) Binden der von besagten lysierten Zellen freigegebenen Nukleinsäure an einen festen Träger.
  • Noch ein weiterer Aspekt ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielmikroorganismus in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (a) Binden von Mikroorganismen in besagter Probe an einen festen Träger mittels eines nicht spezifischen Liganden, der auf besagtem festen Träger immobilisiert ist, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst;
    • (b) Lysieren der gebundenen Mikroorganismen;
    • (c) Binden der von besagten lysierten Mikroorganismen freigegebenen Nukleinsäure an einen festen Träger; und
    • (d) Ermitteln der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure, die charakteristisch für besagten Zielmikroorganismus ist, in besagter gebundener Nukleinsäure. Bevorzugte Mikroorganismen, Liganden und feste Träger entsprechen denen, die oben besprochen wurden.
  • Die Nukleinsäure kann DNA, RNA oder jede natürlich vorkommende oder synthetische Modifikation davon und Kombination davon sein. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure jedoch DNA sein, die einsträngig oder doppelsträngig oder in jeder möglichen anderen Form vorliegen kann, z.B. linear oder ringförmig.
  • Nach dem Binden werden die isolierten oder an den Träger gebundenen Mikroorganismen lysiert, um ihre Nukleinsäure freizusetzen. Verfahren zur Zelllyse sind dem Fachmann wohlbekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben und jedes der bekannten Verfahren kann verwendet werden. Verschiedene Verfahren können für verschiedene Mikroorganismen besser geeignet sein, aber jedes der folgenden Verfahren könnte zum Beispiel verwendet werden: Lyse mit Detergentien, z.B. SDS, LiDS oder Sarcosyl in geeigneten Puffern; die Verwendung von Chaotropen wie beispielsweise Guanidiumhydrochlorid (GHCl), Guanidiumthiocyanat (GTC), Natriumiodid (NaI), Perchlorat usw.; mechanisches Zerreißen, wie beispielweise durch eine Hebelpresse („French Press"), Behandlung mit Ultraschall, Zermahlen mit Glasperlen, Aluminiumoxid oder in flüssigem Stickstoff; enzymatische Lyse, zum Beispiel unter Verwendung von Lysozym, Proteinasen, Pronasen oder Cellulasen oder irgendeinem der anderen kommerziell erhältlichen Lyseenzyme; Lyse der Zellen durch Infektion mit Bacteriophagen oder Viren; Gefriertrocknung; osmotischer Schock; Mikrowellenbehandlung; Temperaturbehandlung; z.B. durch Erhitzen oder Kochen oder Einfrieren z.B. in Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff, und Auftauen; alkalische Lyse. Wie oben erwähnt, sind all diese Verfahren Standardlysemethoden und sind dem Fachmann wohlbekannt, und jedes derartige Verfahren oder jede Kombination von Verfahren können eingesetzt werden.
  • Zweckmäßigerweise kann Lyse gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden, indem man Chaotrope und/oder Detergentien verwendet. Zum Beispiel hat sich für den Fall von Bakterienzellen die Kombination eines Chaotrops mit einem Detergens als besonders wirkungsvoll erwiesen. Ein besonders geeignetes Lysemittel umfasst daher ein Chaotrop wie beispielsweise GTC oder GHCl und ein Detergens wie beispielsweise SDS oder Sarcosyl. Die Lysemittel können in einfacher wässriger Lösung zugeführt werden oder sie können in einer Pufferlösung enthalten sein, um einen sogenannten „Lysepuffer" zu bilden. Jeder geeignete Puffer kann verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Tris, Bicin, Tricin und Phosphatpuffer. Alternativ können die Lysemittel separat zugegeben werden. Geeignete Konzentrationen und Mengen von Lysemitteln werden entsprechend dem genauen System, den Eigenschaften der Zellen etc. variieren und können in geeigneter Weise bestimmt werden, aber Konzentrationen von z.B. 2M bis 7M Chaotropen wie GTC, GHCl, NaI oder Perchlorat können verwendet werden, 0,1M bis 1M alkalische Mittel wie NaOH, und 0,1 bis 50% (Gewicht/Volumen), z.B. 0,5 bis 15% Detergens. So enthält ein Beispiel eines geeigneten repräsentativen Lysepuffers eine wässerige Lösung von 4M GTC, 1% (Gewicht/Volumen) Sarcosyl.
  • Die isolierten, an den Träger gebundenen Mikroorganismen können von dem Rest der Probe bequem entfernt oder abgetrennt werden, wodurch die Zellen konzentriert oder angereichert werden. So dient der die Zellen bindende Schritt dazu, die Zellen anzureichern oder sie in einem kleineren Volumen als dem der Ausgangsprobe zu konzentrieren. Lyse kann dann bequem erreicht werden, indem man einen passenden Lysepuffer zugibt, der die gewünschten Lysemittel enthält, oder indem man die isolierten Zellen den gewünschten Lysebedingungen unterwirft. Zum Beispiel können in dem Fall, bei dem einfach ein Lysepuffer zugegeben wird, der geeignete Lysemittel enthält, die isolierten Zellen einfach in Anwesenheit des Lysepuffers über einen geeigneten Zeitraum inkubiert werden, um die Lyse stattfinden zu lassen. Unter schiedliche Inkubationsbedingungen können für unterschiedliche Lysesysteme angebracht sein und sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann für einen Lysepuffer, der ein Detergens und/oder ein Chaotrop enthält, die Inkubation bei Zimmertemperatur oder bei höheren Temperaturen, z.B. 37 °C oder 65°C stattfinden. Ebenso kann die Inkubationszeit variiert werden zwischen einigen Minuten z.B. 5 oder 10 Minuten bis zu Stunden, z.B. 1 bis 2 Stunden. Für den Fall von GTC/Sarcosyl-Lysepuffern und Bakterienzellen, hat sich z.B. eine 10 bis 20 Minuten dauernde Inkubation bei 65°C als geeignet erwiesen, aber dies kann selbstverständlich nach Bedarf verändert werden. Für eine enzymatische Lyse, z.B. mit Proteinase K etc., können längere Behandlungszeiten erforderlich sein, z.B. über Nacht.
  • Nach der Lyse wird die freigegebene Nukleinsäure zweckmäßigerweise an einen festen Träger gebunden, vorzugsweise an den, an den die lysierten Mikroorganismen gebunden sind. Trotzdem kann z.B. ein gemischter Bestand von Perlen zur Verfügung gestellt werden, einige mit einem nicht spezifischen Liganden für das Binden an Mikroorganismen und andere, die dafür angepasst sind, Nukleinsäure zu binden.
  • Dieses Binden von Nukleinsäure kann auf jede dem Fachmann für das Binden von Nukleinsäure an einen festen Träger bekannte Weise erreicht werden. Zweckmäßigerweise wird die Nukleinsäure unspezifisch an den Träger gebunden, d. h. unabhängig von der Sequenz. So kann z.B. die freigegebene Nukleinsäure unter Verwendung irgendeines der bekannten Fällungsmittel für Nukleinsäure, z.B. Alkohol, Kombinationen aus Alkohol und Salz, Polyethylenglykole (PEGs) etc. auf den Träger ausgefällt werden. Die Fällung von Nukleinsäuren auf Perlen in dieser Weise wird zum Beispiel in WO 91/12079 beschrieben. So kann Salz dem Träger und der freigegebenen Nukleinsäure in gelöster Form hinzugefügt werden, gefolgt von der Zugabe von Alkohol, der die Nukleinsäure veranlasst, auszufallen. Alternativ können das Salz und der Alkohol zusammen zugegeben werden, oder das Salz kann weggelassen werden. Wie oben in Bezug auf den Zellen bindenden Schritt beschrieben wurde, können jeder geeignete Alkohol oder jedes geeignete Salz verwendet werden, und geeignete Mengen oder Konzentrationen können leicht bestimmt werden.
  • Alternative nicht spezifische Methoden zum Binden von Nukleinsäure schließen die Verwendung von Detergentien ein wie beschrieben in der WO 96/18731 von Dynal AS (das sogenannte „DNA Direkt" Verfahren) und die Verwendung von Chaotropen und einer Nukleinsäure bindenden Festphase wie beispielsweise Kieselgelteilchen, wie von Akzo N.V. in der EP-A 0 389 063 beschrieben.
  • Eine ionische Bindung der Nukleinsäure an den Träger kann erzielt werden, indem man einen festen Träger verwendet, der eine geladene Oberfläche aufweist, z.B. einen mit Polyaminen beschichteten Träger.
  • Der Träger, der in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt wird, kann auch funktionelle Gruppen tragen, die die spezifische oder nicht spezifische Bindung von Nukleinsäuren unterstützen, z.B. DNA bindende Proteine, z.B. Leucin-Zipper oder Histone oder interkalierende Färbemittel (z.B. Ethidiumbromid oder Hoechst 42945), mit denen der Träger beschichtet werden kann.
  • Ebenso kann der Träger mit Bindungspartnern ausgestattet werden, um die selektive Erfassung von Nukleinsäuren zu unterstützen. Zum Beispiel können komplementäre DNA- oder RNA-Sequenzen oder DNA bindende Proteine benutzt werden oder virale Proteine, die an virale Nukleinsäure binden. Die Befestigung solcher Proteine an dem festen Träger kann mit Methoden erreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
  • Ein geeignetes Verfahren zum Ausfällen der Nukleinsäure gemäß der Erfindung ist das Hinzufügen eines Fällungsmittels, z.B. Alkohol, zu der Mischung, die den Träger und die lysierten Zellen enthält. So kann ein angemessenes Volumen Alkohol, z.B. 100%iges oder 96%iges Ethanol, einfach der Mischung hinzugefügt werden und über eine Zeitdauer inkubiert werden, die ausreichend ist, um der freigegebenen Nukleinsäure zu ermöglichen, an den Träger gebunden zu werden. Die Inkubationsbedingungen für diesen Schritt sind nicht kritisch und können einfach 5 bis 10 Minuten dauernde Inkubation bei Zimmertemperatur umfassen. Jedoch kann die Zeitspanne variiert werden und die Temperatur nach Wahl erhöht werden.
  • Obgleich es nicht notwendig ist, kann es zweckmäßig sein, einen oder mehrere Waschschritte in das erfindungsgemäße Verfahren zum Isolieren einzuführen, z.B. im Anschluss an den Schritt des Bindens der Nukleinsäure. Alle herkömmlichen Waschpuffer oder andere Medien können verwendet werden. Allgemein gesprochen sind Puffer mit niedriger bis mäßiger Innenstärke bevorzugt, z.B. 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0/10 mM NaCl. Andere gängige Waschmedien, z.B. Alkohol enthaltende, können auch verwendet werden, wenn dies gewünscht ist, z.B. Waschen mit 70%igem Ethanol.
  • Der Verwendung von magnetischen Teilchen ermöglicht einfache Waschschritte einfach durch Aggregation der Teilchen, Entfernung des Nukleinsäure bindenden Mediums, Zugabe des Waschmediums und erneute Aggregation der Teilchen, so viele Male, wie dies erforderlich ist.
  • Nach dem Prozess des Isolierens der Nukleinsäure und jeglichen optionalen Waschschritten, die gewünscht sein können, kann der Träger, der die gebundene Nukleinsäure trägt, transferiert werden, z.B. erneut suspendiert oder in irgendein geeignetes Medium, z.B. Wasser oder einen Puffer mit niedriger Innenstärke, eingetaucht werden. Abhängig von dem Träger und der Art irgendeiner gewünschten Weiterverarbeitung kann es wünschenswert sein, die Nukleinsäure aus dem Träger freizusetzen, oder auch nicht.
  • Im Falle eines korpuskularen festen Trägers wie beispielsweise magnetischer oder nicht magnetischer Perlen kann dieser in vielen Fällen direkt verwendet werden, z.B. in PCR oder in anderen Amplifikationsverfahren, ohne die Nukleinsäure aus dem Träger zu eluieren. Auch ist für viele Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung von DNA eine Elution nicht erforderlich, da, obwohl die DNA wahllos Kontakt mit der Oberfläche der Perle haben kann und an einer Reihe von Punkten durch Wasserstoffbrückenbindungen oder ionische oder andere Kräfte gebunden sein kann, im allgemeinen genügend lange Abschnitte von DNA für eine Hybridisierung mit Oligonukleotiden und für eine Amplifikation zur Verfügung stehen werden.
  • Jedoch kann, wenn dies gewünscht wird, die Flution der Nukleinsäure mit bekannten Mitteln leicht erreicht werden, zum Beispiel durch Erhitzen z.B. 5 bis 10 Minuten lang auf 70 bis 90°C, wonach der Träger aus dem Medium entfernt werden kann und die Nukleinsäure in gelöster Form hinterlässt. Solch ein Erhitzen wird in PCR automatisch durch den DNA Denaturierungsschritt erreicht, der dem Zyklusprogramm vorausgeht.
  • Wenn es gewünscht ist, RNA von DNA zu entfernen, kann dies erreicht werden, indem man die RNA vor dem Schritt der Ab trennung der DNA zerstört, z.B. durch Zugabe einer RNase oder einer Lauge wie beispielsweise NaOH.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie schnell und einfach auszuführen ist, und die Einfachheit des Verfahrens erlaubt einen hohen Durchsatz von Proben.
  • Die Erfindung ist einer Automatisierung vorteilhaft zugänglich, besonders wenn Teilchen und insbesondere magnetische Teilchen als Träger benutzt werden.
  • Wie voranstehend erwähnt, ist das Verfahren der Erfindung besonders geeignet als ein einleitender erster Schritt zur Herstellung von Nukleinsäure für die Verwendung in auf Nukleinsäure beruhenden Nachweisverfahren.
  • Wie oben erwähnt, braucht gebundene Nukleinsäure vorteilhafter Weise nicht vor dem Durchführen des Nachweisschrittes von dem Träger eluiert oder entfernt zu werden, obgleich dies durchgeführt werden kann, wenn es gewünscht ist. Ob die Nukleinsäure eluiert wird oder nicht, kann auch von dem jeweiligen Verfahren abhängen, das in dem Schritt des Bindens der Nukleinsäure verwendet wurde. So werden bestimmte Nukleinsäure bindende Verfahren die Nukleinsäure fester binden als andere. Zum Beispiel wird im Fall des Bindens von DNA unter Verwendung von Detergentien (z.B. durch „DNA Direkt") die Nukleinsäure von dem festen Träger eluiert werden, wenn ein Elutionspuffer oder ein anderes geeignetes Medium eingeführt wird. Nukleinsäure, die mittels eines Fällungsmittels wie beispielsweise eines Alkohols oder eines Chaotrops gebunden wurde, wird fester gebunden bleiben und wird möglicherweise nicht, eluiert, wenn sie in ein Puffermedium eingebracht wird, und kann ein Erhitzen erforderlich machen, um eluiert zu werden.
  • Folglich kann die an den Träger gebundene Nukleinsäure direkt in einem auf Nukleinsäure beruhenden Nachweisverfahren verwendet werden, insbesondere wenn der Träger aus Teilchen besteht, einfach indem der Träger in einem für den Nachweisschritt geeigneten Medium resuspendiert wird oder dieses dem Träger hinzufügt wird. Entweder kann die Nukleinsäure in das Medium eluieren oder, wie oben erwähnt, es ist nicht notwendig, dass sie eluiert. Wenn sulfatierte Zucker als Liganden benutzt werden, ist Flution bevorzugt.
  • Es ist eine Anzahl unterschiedlicher Methoden für den Nachweis von Nukleinsäuren bekannt und in der Literatur beschrieben und jede davon kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Am einfachsten kann die Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden und sehr viele solche Hybridisierungsprotokolle sind beschrieben worden (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, „Molekulares Klonen: Ein Laborhandbuch" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). In den allermeisten Fällen wird der Nachweis einen in situ Hybridisierungsschritt und/oder einen in vitro Amplifikationsschritt unter Verwendung irgendeines der Verfahren, die in der Literatur hierfür beschrieben werden, mit einschließen. So können wie erwähnt Methoden wie beispielsweise LAR, 3SR und das Q-Beta-Replikase-System benutzt werden. Jedoch werden PCR und ihre verschiedenen Modifikationen, z.B. die Verwendung von verschachtelten Primern („Nested Primers"), im allgemeinen die Verfahren der Wahl sein (siehe z.B. Abramson und Myers, 1993, „Aktuelle Ansichten in der Biotechnologie" (Current Opinion in Biotechnology), 4: 41-47 für eine Übersicht über die Methoden der Nukleinsäureamplifikation).
  • Andere Nachweisverfahren können auf einem Sequenzierungsansatz beruhen, z.B. auf dem Minisequenzierungsansatz, wie er von Syvänen und Söderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692 beschrieben wurde.
  • In Amplifikationsmethoden wie PCR kann das Erhitzen, das im ersten Schritt erforderlich ist, um den DNA Doppelstrang aufzulösen, die gebundene DNA von dem Träger freisetzen. Daher kann im Fall eines nachfolgenden Nachweisschrittes wie beispielsweise PCR die an den Träger gebundene Nukleinsäure direkt zu der Reaktionsmischung hinzugefügt werden, und die Nukleinsäure wird im ersten Schritt des Nachweisverfahrens eluieren. Es kann die gesamte isolierte an den Träger gebundene Nukleinsäureprobe, die erfindungsgemäß erhalten wird, im Nachweisschritt verwendet werden oder eine Teilmenge davon.
  • Die Ergebnisse der PCR oder eines anderen Nachweisschrittes können mit vielen Mitteln ermittelt oder sichtbar gemacht werden, die in der Fachliteratur beschrieben werden. Zum Beispiel kann man die PCR oder andere Amplifikationsprodukte auf einem Elektrophoresegel, z.B. einem mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegel, unter Verwendung bekannter Methoden wandern lassen. Alternativ kann das DIANA System benutzt werden, das eine Modifikation der Nested Primer Methode ist. In dem DIANA (Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids (Nachweis von immobilisierten amplifizierten Nukleinsäuren)) System (siehe Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)), trägt das innere, zweite Paar von Primern jeweils Mittel zur Immobilisierung, um die Erfassung der amplifizierten DNA zu ermöglichen, und ein Label oder Mittel für die Verknüpfung mit einem Label, um die Erkennung zu ermöglichen. Dies bringt den doppelten Vorteil eines verringerten Hintergrundsignals und eines schnellen und einfachen Mittels für den Nachweis der amplifizierten DNA. Echtzeit-PCR-Verfahren können für den DNA Nachweis verwendet werden, z.B. 5'-Nuklease-PCR oder Methoden, die fluoreszierende Sonden verwenden.
  • Die amplifizierte Nukleinsäure kann auch durch Sequenzierung nachgewiesen werden oder es kann das Resultat bestätigt werden unter Verwendung irgendeiner der vielen verschiedenen Sequenzierungstechnologien, die heutzutage verfügbar sind, z.B. standardmäßige Sequenzierung, Festphasen-Sequenzierung, zyklische Sequenzierung, automatische Sequenzierung und Mini-Sequenzierung.
  • Die verschiedenen Reaktanden und Komponenten, die erforderlich sind, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen, können zweckmäßig in Form eines Kits bzw. Baukastens geliefert werden. Solche Kits stellen einen zusätzlichen Aspekt der Erfindung dar.
  • An seiner einfachsten Form stellt dieser Aspekt der Erfindung ein Kit zum Isolieren von Mikroorganismen aus einer Probe zur Verfügung, mit:
    • (a) einem festen Träger mit einem darauf immobilisierten Ligand, der in der Lage ist, nicht-spezifisch an Mikroorganismen zu binden, wobei besagter Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei besagtes Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst;
    • (b) Mitteln für das Binden von Mikroorganismen an besagten festen Träger; gegebenenfalls
    • (c) Mitteln für das Lysieren besagter Mikroorganismen; und gegebenenfalls
    • (d) Mitteln für das Binden von Nukleinsäure, die von besagten lysierten Mikroorganismen freigegeben wird, an einen festen Träger.
  • Die verschiedenen Mittel (b), (c) und (d) können wie oben im Hinblick auf das Verfahren der Erfindung beschrieben und besprochen ausgeprägt sein.
  • Ein typisches Kit kann einen festen Träger, z.B. mit einem Polysaccharid wie GUM1 beschichtete Teilchen, einen Bindungspuffer, z.B. PBS und einen Lysepuffer umfassen.
  • Eine weitere optionale Komponente ist (e), Mittel zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure, die für einen Zielmikroorganismus charakteristisch ist. Wie oben dargestellt wurde, können solche Mittel geeignete Sonden- oder Primer-Oligonukleotidsequenzen für eine Verwendung in Nachweismethoden, die auf Hybridisierung und/oder Amplifikation beruhen, mit einschließen.
  • Optional zusätzlich in einem solchen Kit enthalten sein können Puffer, Salze, Polymere, Enzyme etc.
  • Die erfindungsgemäßen Kits sind von großem praktischem Nutzen bei der Extraktion von Bakterien und dem Isolieren von DNA für PCR Amplifikation. Ein geeignetes Protokoll zur Verwendung mit dem Kit würde wie folgt aussehen, wenn angenommen wird, dass magnetische oder magnetisierbare Perlen als fester Träger (a) ausgewählt worden sind:
    • – kombiniere Bindungspuffer (b) und Perlen, füge eine Probe von einer Übernachtkultur hinzu und mische, z.B. in einem Eppendorf Röhrchen,
    • – bringe es unter den Einfluss eines Magneten und lasse den Komplex aus Bakterien und Perlen sich auf die Seite des Röhrchens bewegen,
    • – pipettiere ab und verwirf den Überstand,
    • – gib den Lysepuffer (c) hinzu und inkubiere mit Ethanol,
    • – benutze den Magneten, um die Perlen von dem Überstand abzutrennen und pipettiere ab und verwirf den Überstand,
    • – wasche die Perlen und entferne den Überstand,
    • – suspendiere die Perlen und DNA enthaltende Probe erneut für die PCR.
  • Die Erfindung sieht die Verwendung eines festen Trägers, wie er hierin beschrieben ist, zur groben Abtrennung von Zellen aus einer Probe vor. Die Abtrennung ist „grob", weil es nicht ein für bestimmte Zellen spezifisches Abtrennverfahren ist, sondern vielmehr ein allgemeines Verfahren zum Isolieren von in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen von den anderen Bestandteilen. Vorher waren solche Maßnahmen durch Filtration oder Fällung erreicht worden. Im Gegensatz dazu können die festen Träger, die hierin beschrieben werden, benutzt werden, um die Vorteile der Ligand-Rezeptor-Bindung zu verbinden, aber nicht in einer für eine Spezies oder einen Zelltyp spezifischen Weise. Wie hierin beschrieben wird, sind die an die festen Träger gebundenen Liganden in der Lage, an einen signifikanten Anteil, wenn nicht die meisten, der Sorten von Mikroorganismen (z.B. verschiedene Bakterienarten) in der Probe zu binden, um eine grobe Abtrennung von diesen aus der Gesamtprobe zu erreichen.
  • Die Erfindung wird nun ausführlicher in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen beschrieben werden, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, in denen:
  • 1 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Bakterien (E. coli) zeigt, die an Perlen gebunden wurden, die mit Mannose, Maltose und GUM1 beschichtet sind;
  • 2 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Bakterien (B. cereus) zeigt, die an mit GUM1 beschichtete Perlen und unbeschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 3 eine Reihe von Gelphotographien zeigt, die das Binden einer großen Vielzahl von Bakterien an mit GUM1 beschichtete Perlen anzeigen;
  • 4 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Vibrio cholerae zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 5 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Shigella flexneri zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 6 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von E. coli zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 7 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Salmonella typhimurium zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 8 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Campylobacter jejuni zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 9 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Streptococcus pyogenes zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 10 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von Neisseria gonorrhoeae zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 11 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von menschlichen weißen Blutzellen zeigt, die an verschiedene beschichtete Perlen gebunden wurden;
  • 12 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von E. coli zeigt, die an beschichtete und unbeschichtete Dynabeads gebunden wurden;
  • 13 eine Photographie eines Gels ist, das PCR Produkte aus der Nukleinsäure von verschiedenen Bakterien zeigt, die an mit GUM beschichtete Dynabeads gebunden wurden.
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung von mit Kohlenhydraten beschichteten Teilchen und Prüfung der Zellen bindenden Eigenschaften
  • Die Verbindungen wurden mit M-PVA OCN-aktivierten Perlen (Chemagen AG) verknüpft. Reaktion:
    Figure 00330001
  • Die modifizierten Perlen wurden inkubiert mit verschiedenen Bakterienkulturen, entweder mit reinen unverdünnten Kulturen (über Nacht) oder mit Kulturen, die mit Wasser oder einem Puffer (PBS) verdünnt waren. Um die Bindung der Zellen zu untersuchen, wurde DNA aus dem Komplex aus Bakterien und Perlen isoliert und anschließend mittels PCR analysiert.
  • Literatur: WO 98/51693 . Diese Kopplungsreaktion wurde von Chemagen durchgeführt und die resultierenden modifizierten Perlen wurden in den hierin besprochenen erfindungsgemäßen Verfahren zum Isolieren eingesetzt.
  • BEISPIEL 2
  • Protokoll für das Isolieren von Bakterien auf Perlen und Identifizieren spezifischer Bakterien
  • Die Bakterien wurden über Nacht in 100 ml Trypton Soja Bouillon gezüchtet bei 30°C ohne Rühren bzw. Schütteln. 800 μl PBS (Bindungspuffer) und 10 μl erfindungsgemäße Perlen (10 mg/ml) wurden vermischt, dann wurden 100 μl der Übernachtkultur hinzugefügt und durch Pipettieren vorsichtig vermischt. Das Röhrchen wurde 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der Überstand wurde unter Verwendung eines magnetischen Separators entfernt und der Komplex aus Perlen und Bakterien wurde in 50 μl Lysepuffer erneut suspendiert (4M Guanidinthiocyanat – 1% Sarcosyl). Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert bei geöffneten Deckeln.
  • Dann wurden 100 μl 96%iges Ethanol zugegeben und die Inkubation wurde bei geschlossenen Deckeln 5 Minuten lang fortgesetzt. Der Überstand wurde unter Verwendung des magnetischen Separators entfernt und die Perlen und DNA enthaltende Probe wurde zweimal mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen.
  • Die Perlen und DNA enthaltende Probe wurde in 45 μl H2O erneut suspendiert und 15 Minuten lang bei 65°C bei geöffneten Deckeln inkubiert, um alle Spuren von Ethanol zu entfernen (als Alternative können 5 μl H2O hinzugefügt werden, um die Perlen anzufeuchten, die dann 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert werden). 20 μl des gereinigten Materials wurde in einer 50 μl PCR verwendet.
  • Um die isolierten Bakterien zu identifizieren, wurde PCR Amplifikation mit arten- oder gruppenspezifischen Primern (X und Y) durchgeführt.
  • Die nachfolgende Tabelle 1 gibt geeignete Primer für unterschiedliche Bakterien an. TABELLE 1
    Gattung Sequenz des Primers Produktgröße (bp)
    Salmonella Escherichia Shigella OBERER: 5' AAG TCG AAC GGT AAC AGG A 3' UNTERER: 5' CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3' 614
    Escherichia, pathogen OBERER: 5' ACT GAG ATT AAG GCT GAT AA 3' UNTERER: 5' ACA TTA ACC CCA GGA AGA G 3' 782
    Yersinia Aeromonas Vibrio OBERER: 5' CAC ATG CAA GTC GAG CGG C 3' UNTERER: 5' CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3' 620
    Listeria Bacillus OBERER: 5'G(AT)T CCT GAA ACC GTG TGC C 3' UNTERER: 5' CCT TCC GGT CTG ACT TCA 3' 702
    Campylobacter OBERER1: 5' AAT CAC AGC AGT CAG GCG 3' OBERER2: 5' CGT AAT AGC TCA CTG GTC T 3' UNTERER: 5' GTC GGT TTA CGG TAC GGG 3' 921 761
    Clostridium OBERER: 5' CGA AGG CGG CTT TCT GGA 3' UNTERER: 5' GCG ATT ACT AGC AAC TCC 3' 609
    Citrobacter Hafnia Klebsiella Enterobacter OBERER: 5' AAG TCG AAC GGT AGC ACA G 3' UNTERER: 5' CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3' 634
    Proteus Morganella Photobacterium Serratia Shewanella OBERER:5' CTA ACA CAT GCA AGT CGA G 3' UNTERER: 5' CAC CGC TAC ACC TG(G/A)AAT 3' 625
    TABELLE 1 (Forts.)
    Gattung Sequenz des Primers Produktgröße (bp)
    Streptococcus Lactococcus Staphylococcus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Brochotrix OBERER: 5' TGC CTT TTG TAG AAT GAC C 3' UNTERER: 5' CGG CAT TCT CAC TTC TAA GC 3' 680
  • PCR Amplifikation wurde in 50 μl Volumen durchgeführt: H2O – 17,5 μl; dNTP 2 mM – 5 μl; 10 × Puffer DynaZyme – 5 μl; Primer × (10 pmol/μl) – 1 μl; Primer y 10 pmol/μl – 1 μl; Enzym DynaZyme 2U/μl – 0,5 μl; Template – 20 μl. Das Temperaturprogramm war: 94°C – 4 Minuten, dann 35 Zyklen mit den Parametern 96°C – 15 Sekunden; 56°C – 30 Sekunden; 72 °C – 1 Minute; gefolgt von 72°C – 7 Minuten.
  • Die PCR Produkte wurden durch Gelelektrophorese auf Agarose sichtbar gemacht.
  • BEISPIEL 3
  • Das Protokoll von Beispiel 2 wurde mit M-PVA Perlen durchgeführt, an die D-Mannose gebunden worden war.
  • Es wurde gezeigt, dass die Perlen an Bacillus, E. Coli (pathogen und nicht pathogen), Listeria, Salmonella, Yersinia binden.
  • BEISPIEL 4
  • Das Protokoll von Beispiel 2 wurde mit M-PVA Perlen durchgeführt, an die Maltose gebunden worden war.
  • Es wurde gezeigt, dass die Perlen an Bacillus, E. Coli (pathogen und nicht pathogen), Listeria, Salmonella, Yersinia binden.
  • BEISPIEL 5
  • Das Protokoll von Beispiel 2 wurde mit M-PVA Perlen durchgeführt, an die Galactomannan-Polysaccharid (GUM1) gebunden worden war.
  • Es wurde gezeigt, dass die Perlen unter anderem an Aeromonas, Bacillus, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, E. Coli (pathogen und nicht pathogen), Hafnia, Klebsiella, Listeria, Proteus, Salmonella, Shewanella, Serratia, Shigella, Vibrio, Yersinia binden.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente kann man in den Gelphotographien der 3 sehen. Es sind Bänder des PCR Produkts gezeigt, die die Bindung spezifischer Bakterien an die Perlen entsprechend dem folgenden Schema anzeigen.
    Bahn 1, DNA Marker (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder, Fermentas);
    Bahnen 2–3, Klebsiella pneumoniae bzw. K. oxytoca;
    Bahnen 4–6, Shigella flexneri, S. sonnei, bzw. S. boydii;
    Bahnen 7–8 und 12–13, Vibrio cholerae (Bahnen 7 und 12), V. vulnificus (Bahn 8) und V. parahaemolyticus; Bahn 9, Hafnia alvei;
    Bahnen 10–11, Aerornonas sobria bzw. A. hydrophila;
    Bahnen 12–13, Vibrio, siehe oben;
    Bahn 14, Proteus vulgaris;
    Bahnen 15–16, Salmonella enterica ssp typhimurium bzw. S. enterica ssp enteritidis;
    Bahnen 17–18 und 41–44, Yersinia enterocolitica (Bahnen 17–18 (Serotyp unbekannt), Serotypen 0:9 (Bahn 42), 0:8 (Bahn 43) und 0:3 (Bahn 44))und Y. pseudotuberculosis (Bahn 41);
    Bahn 19, Escherichia coli;
    Bahnen 20–21, Listeria innocua bzw. L. monocytogenes;
    Bahnen 22–23 und 38–39, Bacillus cereus (Bahn 22), B. subtilis (Bahn 23) und 6. simplex (Bahnen 38–39);
    Bahn 24, Citrobacter freundii;
    Bahnen 25–26, Clostridium perfringens bzw. C. sordelli;
    Bahnen 27–30, Escherichia coli, pathogen;
    Bahnen 31–37, Campylobacter jejuni (Bahn 31) und C. lari (Bahnen 32–37);
    Bahnen 38–39, Bacillus, siehe oben;
    Bahn 40, Brochothrix thermosphacta;
    Bahnen 41–44, Yersinia, siehe oben;
    Bahnen 45–47, Enterobacter sakazakii, E. aerogenes, bzw. E. cloacae;
    Bahn 48, Morganella morganii;
    Bahn 49, Serratia marcescens;
    Bahnen 50–52, Shewanella putrefaciens;
    Bahnen 53–54, Photobacterium phosphoreum bzw. P. damsela;
    Bahn 55, Streptococcus thermophilus;
    Bahn 56, Lactococcus lactis;
    Bahn 57, Staphylococcus warneri;
    Bahn 58, Enterococcus faecalis;
    Bahnen 59–60, Leuconostoc mesenteroides;
    Bahnen 61–64, Pediococcus acidilactici (Bahnen 61–62) und P. damnosus (Bahnen 63–64);
    Bahnen 65–69, Lactobacillus acidophilus (Bahnen 65, 68 und 69) und L. plantarum (Bahnen 66–67).
  • BEISPIEL 6
  • E. Coli wurde aus einer Übernachtkultur isoliert unter Verwendung von Perlen aus den Beispielen 3, 4 und 5 und von Dynabeads M-280 (Dynal, Norwegen) (nicht aktiviert). Nach der Lyse zur Freisetzung von Nukleinsäure wurde eine DNA Sequenz aus E. coli von ungefähr 600 bp mit den Primern U59/L673 amplifiziert (siehe Tabelle 1).
  • Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, in der
    Bahnen 2–5 wurde 15 μl Template verwendet und in den Bahnen 7–10 wurde 5 μl Template verwendet;
    Bahn 1 und 6, DNA Marker Φ×174/HaeIII;
    Bahn 2 und 7, mit Mannose beschichtete Perlen;
    Bahn 3 und 8, mit Maltose beschichtete Perlen;
    Bahn 4 und 9, mit GUM1 beschichtete Perlen;
    Bahn 5 und 10, Dynabeads M-280 aktiviert.
  • BEISPIEL 7
  • B. cereus ATCC 14579 wurde isoliert unter Verwendung von Perlen aus Beispiel 5 und von unbeschichteten Perlen, die mit UNC bezeichnet wurden, aus 2 ml einer Übernachtkultur (100 ml TSB bei 30°C) entsprechend den folgenden Verdünnungen:
    Bahn 1, DNA Marker Φ × 174/HaeIII;
    Bahn 2, 100 μg UNC, unverdünnte Kultur;
    Bahn 3, 50 μg GUM1, 101 verdünnte Kultur;
    Bahn 4, 100 μg GUM1, 101 verdünnte Kultur;
    Bahn 5, 200 μg GUM1, 101 verdünnte Kultur;
    Bahn 6, 100 μg UNC, 101 verdünnte Kultur;
    Bahn 7, 50 μg GUM1, 102 verdünnte Kultur;
    Bahn 8, 100 μg GUM1, 102 verdünnte Kultur;
    Bahn 9, 200 μg GUM1, 102 verdünnte Kultur;
    Bahn 10, 100 μg UNC, 102 verdünnte Kultur;
    Bahn 11, 50 μg GUM1, 103 verdünnte Kultur;
    Bahn 12, 100 μg GUM1, 103 verdünnte Kultur;
    Bahn 13, DNA Marker Φx174/HaeIII;
    Bahn 14, 200 μg GUM1, 103 verdünnte Kultur;
    Bahn 15, 100 μg UNC, 103 verdünnte Kultur;
    Bahn 16, 50 μg GUM1, 104 verdünnte Kultur;
    Bahn 17, 100 μg GUM1, 104 verdünnte Kultur;
    Bahn 18, 200 μg GUM1, 104 verdünnte Kultur;
    Bahn 19, 100 μg UNC, 104 verdünnte Kultur;
    Bahn 20, 50 μg GUM1, 105 verdünnte Kultur;
    Bahn 21, 100 μg GUM1, 105 verdünnte Kultur;
    Bahn 22, 200 μg GUM1, 105 verdünnte Kultur;
    Bahn 23, 100 μg UNC, 105 verdünnte Kultur.
  • Nach der Lyse zur Freisetzung von Nukleinsäure wurde eine DNA Sequenz aus B. cereus von ungefähr 600 bp mit den Primern U552/L1254 amplifiziert (siehe Tabelle 1). Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Das Ergebnis für eine 101 Verdünnung scheint ein Fehler zu sein, da sowohl 50 μg GUM1 als auch 200 μg GUM1 positive Ergebnisse für den Nachweis von Nukleinsäure ergaben, was auf Bindung von Zellen hinweist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die Bindung für GUM1 100–1000 Mal besser ist als für die unbeschichteten Perlen.
  • BEISPIEL 8
  • Andere Perlen sind benutzt worden, um die Prinzipien der Erfindung zu veranschaulichen; eine besonders geeignete Art von Perlen sind Dynabeads M-270 Epoxy, Prod. Nr. 143.02 (erhältlich von Dynal AS, Norwegen)
  • Herstellung von Perlen
  • 2 ml sterilen filtrierten 0,1 M Natriumphosphatpuffers, pH 7,4, wurden zu 30 mg trockenen Perlen hinzugegeben, um eine Konzentration von ungefähr 109 Perlen pro ml zu ergeben. Die Perlen wurden durch 30 Sekunden dauerndes Vortexen resuspendiert und dann 10 Minuten lang unter langsamer Kipprotation inkubiert. Das Röhrchen wurde für 4 Minuten auf einen Magneten gesetzt und der Überstand wurde sorgfältig abpipettiert.
  • Es wurden erneut 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, dem Röhrchen zugegeben und die Perlen wurden durch Vortexen gründlich gemischt. Das Röhrchen wurde für 4 Minuten auf einen Magneten gesetzt und der Überstand wurde entfernt.
  • Die gewaschenen Perlen wurden in 600 μl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, erneut suspendiert, um die empfohlene Konzentration von Perlen und Konzentration von Ammoniumsulfat nach Hinzufügen der Lösung des Liganden zu ergeben. Diese Perlen enthaltende Lösung wurde in dem Beschichtungsschritt verwendet.
  • Beschichtungsschritt
  • Der Ligand wurde in PBS in einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst und steril filtriert.
  • Entsprechend der Empfehlung von Dynal wurden 600 μl des Liganden mit 600 μl Perlen enthaltender Lösung und 600 μl steril filtriertem 3M Ammoniumsulfat vermischt. Das Röhrchen wurde unter langsamer Rotation über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurde das Röhrchen für 4 Minuten auf einen Magneten gesetzt und der Überstand wurde entfernt. Die beschichteten Perlen wurden insgesamt viermal mit 2 ml PBS gewaschen. Die Perlen wurden schließlich in 1 ml PBS erneut suspendiert, um eine Konzentration von 30 mg/ml zu ergeben, und bei 4°C gelagert.
  • BEISPIEL 9
  • Protokoll für das Isolieren von Bakterien auf Perlen und das Identifizieren von spezifischen Bakterien
  • Die Bakterien wurden bei 37°C über Nacht in 100 ml Trypton Soja Bouillon gezüchtet. 800 μl PBS (Bindungspuffer) und 20 μl erfindungsgemäße Perlen (10mg/ml) wurden vermischt, dann wurden 100 μl der Übernachtkultur hinzugefügt und durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Das Röhrchen wurde 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der Überstand wurde unter Verwendung eines magnetischen Separators entfernt und der Komplex aus Perlen und Bakterien wurde in 50 μl Lysepuffer (4M Guanidinthiocyanat – 1% Sarcosyl) erneut suspendiert. Die Proben wurden mit geschlossenen Deckeln 5 Minuten lang bei 80°C inkubiert.
  • Dann wurden 150 μl 96%iges Ethanol hinzugegeben und die Inkubation wurde 5 Minuten lang fortgesetzt. Der Überstand wurde unter Verwendung des magnetischen Separators ent fernt, und die Perlen und DNA enthaltende Probe wurde zweimal mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen.
  • Die Perlen und DNA enthaltende Probe wurde in 30 μl H2O erneut suspendiert und 10 Minuten lang bei 80°C inkubiert, bei geöffneten Deckeln, um alle Spuren von Ethanol zu entfernen. Die gesamten 30 μl des gereinigten Materials wurden in einer 50 μl PCR eingesetzt.
  • BEISPIEL 10
  • Bakterien wurden gemäß dem Protokoll von Beispiel 9 isoliert, und um die isolierten Bakterien zu identifizieren, wurde PCR Amplifikation mit den folgenden Primern durchgeführt:
  • Experimente A–E
  • Wie in Tabelle 1
  • Experiment F
    • OBERER: 5' TGCTTTACACATGCAAGTCG 3'
    • UNTERER: 5' CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG 3'
  • Die Perlen, die in den folgenden Experimenten benutzt wurden, sind M-270 Dynabeads von Dynal AS oder M-PVA OCNaktivierte Perlen von der Chemagen AG.
  • Die Bakterien, die in den folgenden Experimenten A–G benutzt werden, sind die folgenden:
    Aeromonas hydrophila CCUG 25942
    Bacillus cereus ATCC 11778
    Bacillus cereus NVH 0075-95
    Campylobacter jejuni CCUG 25903
    Clostridium perfringens ATCC 13124
    Escherichia coli ATCC 25922
    Escherichia coli CCUG 38081
    Helicobacter pylori CCUG 38771
    Listeria monocytogenes ATCC 35152
    Listeria monocytogenes CCUG 15527
    Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
    Salmonella typhimurium ATCC 14028
    Salmonella typhimurium CCUG 31969
    Shigella flexneri CCUG 38947
    Streptococcus pyogenes CCUG 30917
    Streptococcus pneumoniae CCUG 33062
    Vibrio cholerae CCUG 42534
    Yersinia enterocolitica Noma Referenz 102, Y842
  • In den folgenden Experimenten wurde die Amplifikation im allgemeinen direkt an dem Komplex aus DNA und Perlen durchgeführt. Jedoch kann die Identifizierung von Bakterienarten unter Verwendung von Amplifikationsmethoden am Überstand durchgeführt werden. Für bestimmte Bindungsliganden wie beispielsweise Heparin, Dextransulfat und Carrageen kann dies bevorzugt sein, da die Sulfatgruppe die PCR Reaktion hemmen kann. In den folgenden Experimenten wird, falls nicht anders angegeben, wenn eine Carrageenbeschichtung verwendet wird, die PCR am Überstand durchgeführt, im Anschluss an Inkubation der Perlen bei 80°C, um die gesamte DNA aus den Perlen freizusetzen.
  • In diesem Beispiel bezieht sich „Carrageen" auf iota-Carrageen (Sigma, C-3889). Heparin und Dextransulfat wurden von Sigma bezogen, Katalognummern H3149 bzw. D6924.
  • A. Isolieren von DNA aus dem Genom von Vibrio unter Verwendung von GUM, Mannose und Carrageen
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 4 gezeigt.
  • Beginnend oben auf der linken Seite auf dem Gel:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker (schwach)
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–2 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–3 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–9 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–5 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–2 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–3 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–4 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–5 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–2 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–3 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–4 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–5 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–2 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–3 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–4 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–5 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–2 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–3 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–4 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–5 Verdünnung von V. cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 10 = negative Kontrollprobe
  • B. Isolieren von DNA aus dem Genom von Shigella flexneri unter Verwendung von GUM, Mannose, Carrageen
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 5 gezeigt.
  • Beginnend oben auf der linken Seite auf dem Gel:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10-4 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10-5 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen
  • C. Isolieren von DNA aus dem Genom von E. coli unter Verwendung von Carrageen, Mannose, GUM, Mannan
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 6 gezeigt.
  • Es befinden sich sechs Reihen auf dem Gel, die alle E. coli darstellen
  • Beginnend oben auf der linken Seite auf dem Gel:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7' Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = negative Kontrollprobe
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 3:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 4:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
  • Reihe 5:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10 von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
  • Reihe 6:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • D. Isolieren von DNA aus dem Genom von Salmonella typhimurium unter Verwendung von Carrageen, Mannose, GUM, Mannan Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 7 gezeigt.
  • Beginnend oben auf der linken Seite auf dem Gel:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = negative Kontrollprobe
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 3:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 4:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannan beschichteten Dynabeads
  • Reihe 5:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–7 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
  • Reihe 6:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10 von S. typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • Isolieren von DNA aus Salmonella typhimurium
  • E. Isolieren von DNA aus Campylobacter jejuni unter Verwendung von Guar, GUM, Mannose und Carrageen
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 8 gezeigt.
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Guar beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni zu 200 μg mit Guar beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Guar beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10-4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Guar beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Guar beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Guar beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–3 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 14 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 15 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 16 = 100 μl 10–3 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 17 = 100 μl 10–4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 18 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 19 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 20 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 21 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 22 = 100 μl 10–3 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 23 = 100 μl 10-4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 24 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 25 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Mannose beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 26 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 27 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 28 = 100 μl 10–3 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 29 = 100 μl 10–4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 30 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 31 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 32 = 100 μl 10–1 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 33 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 34 = 100 μl 10–2 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 35 = 100 μl 10–4 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 36 = 100 μl 10–5 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 37 = 100 μl 10–6 Verdünnung von C. jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
  • F. Isolieren von DNA aus dem Genom von Streptococcus pyogenes unter Verwendung von GUM, Heparin, Carrageen und Dextransulfat
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 9 gezeigt.
  • Reihe 1:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 14 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 15 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 2:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 14 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 15 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 3:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10 von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 14 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 15 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 4:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 10 = 100 μl 10–1 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 11 = 100 μl 10–2 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 12 = 100 μl 10–3 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 13 = 100 μl 10–4 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 14 = 100 μl 10–5 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 15 = 100 μl 10–6 Verdünnung von S. pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
  • G. Isolieren von DNA aus dem Genom von Neisseria gonorrhoeae unter Verwendung von GUM, Heparin, Carrageen und Dextransulfat
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 10 gezeigt.
  • Reihe 1:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 2:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Heparin beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 3:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 4:
  • Mit dem von den Perlen nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten abgetrennten Überstand ausgeführte PCR
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–2 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–3 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–4 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
  • PCR Lauf mit dem Rest der Perlen nach erneutem Suspendieren in Wasser
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–5 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–6 Verdünnung von N. gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit Dextransulfat beschichteten Chemagen Perlen
  • BEISPIEL 11
  • Das Experiment wurde mit einer Reinkultur einer Krebs B-Zellinie mit der Bezeichnung J558L durchgeführt. Die verwendeten Primer waren:
    OBERER: 5' CCCGCCCCTTGCCTCTC 3'
    UNTERER: 5' TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3'
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 11 gezeigt. PCR wurde an dem Überstand durchgeführt, der nach 5 Minuten dauernder Inkubation bei 90°C mit einem Magneten von den Perlen abgetrennt worden war.
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–0 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–1 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Chemagen Perlen
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–3 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Chemagen Perlen
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–0 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ I beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–1 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ I beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ I beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–3 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ I beschichteten Dynabeads
  • Reihe 3:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–0 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ II beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–1 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ II beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ II beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–3 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ II beschichteten Dynabeads
  • Reihe 4:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–0 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–1 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–3 Verdünnung von B-Zellen hinzugefügt zu 200 μg mit Carrageen Typ V beschichteten Dynabeads
  • Die verschiedenen Typen von Carrageen, die verwendet wurden (mit ihren Produktnummern im Sigma Katalog):
    Carrageen Typ I – überwiegend kappa-Carrageen: C1013
    Carrageen Typ II – überwiegend iota-Carrageen: C1138
    Carrageen Typ V – iota-Carrageen: C-3889
  • BEISPIEL 12
  • E. Coli wurde entsprechend dem Protokoll von Beispiel 8 aus mit GUM beschichteten Perlen isoliert. Die unbeschichteten Perlen durchliefen den gleichen Beschichtungsschritt wie die beschichteten Perlen, aber es wurde kein Zucker hinzugegeben. Es wurde dem Protokoll von Beispiel 9 zum Isolieren gefolgt, entsprechend den folgenden Verdünnungen:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–1 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–2 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–3 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl 10–4 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 9 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads beschichtet
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl 10–5 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads beschichtet
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl 10–6 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl 10–7 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg unbeschichteten Dynabeads beschichtet
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl 10–7 Verdünnung von E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • Die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 12 gezeigt.
  • BEISPIEL 13
  • Verschiedene Bakterienarten wurden entsprechend dem Protokoll von Beispiel 8 aus mit GUM beschichteten Perlen isoliert. Es wurde dem Protokoll von Beispiel 9 zum Isolieren gefolgt und die Ergebnisse der Amplifikation sind in der Gelphotographie der 13 gezeigt, worin:
  • Reihe 1:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl unverdünnte Shigella flexneri hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl unverdünnte Vibrio cholerae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl unverdünnte Aeromonas hydrophila hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl unverdünnte Streptococcus pneumonia hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl unverdünnte Streptococcus pyogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl unverdünnte Salmonella typhimurium hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl unverdünnte Yersinia enterocolitica hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • Reihe 2:
    • Mulde Nr. 1 = Hae III Marker
    • Mulde Nr. 2 = 100 μl unverdünnte E. coli hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 3 = 100 μl unverdünnte Listeria monocytogenes hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 4 = 100 μl unverdünnte Clostridium perfringens hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 5 = 100 μl unverdünnte Bacillus cereus hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 6 = 100 μl unverdünnte Campylobacter jejuni hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 7 = 100 μl unverdünnte Neisseria gonorrhoeae hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
    • Mulde Nr. 8 = 100 μl unverdünnte Bordetella Pertussis hinzugefügt zu 200 μg mit GUM beschichteten Dynabeads
  • Die Primer für Bordetella waren die gleichen wie für Nesseria (siehe Tabelle 1).
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001

Claims (21)

  1. Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen aus einer Probe, wobei das Verfahren das Binden der Mikroorganismen an einen festen Träger mittels eines auf dem festen Träger immobilisierten nicht-spezifischen Liganden umfasst, wobei der Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei das Polysaccharid 13 oder mehr kovalent verknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen Bakterien sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Derivate aus der Gruppe bestehend aus Aldonsäure, Uronsäure, Desoxy-, Amino-, Sulfat- und Alkoholderivaten von Galactose oder Mannose ausgewählt sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Ligand aus der Gruppe bestehend aus Gummi, Uran, Karrageen (Irisches Moos) und Mannan ausgewählt ist.
  5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei der feste Träger dispers ist.
  6. Verfahren nach einem der voranstehend Ansprüche, das zusätzlich einen Schritt des Identifizierens eines oder mehrerer der an den festen Träger gebundenen Mikroorganismen umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem die Mikroorganismen unter Verwendung einer zelltypspezifischen Nukleinsäurensonde identifiziert werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, in dem die gebundenen Mikroorganismen lysiert bzw. gelyst werden, um ihre Nukleinsäure freizugeben.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die freigegebene Nukleinsäure an einen festen Träger gebunden ist.
  10. Verfahren zum Detektieren eines Mikroorganismus in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Durchführen eines Verfahrens zum Isolieren von Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, (b) Identifizieren des an den festen Träger gebundenen Mirkoorganismus.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, in dem Schritt (b) das Lysieren der Mikroorganismen umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem die freigegebene Nukleinsäure der lysierten Mikroorganismen an einen festen Träger gebunden ist.
  13. Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe von Mikroorganismen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Durchführen eines Verfahrens zum Isolieren von Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, (b) Lysieren der gebundenen Mikroorganismen, und (c) Binden der von den lysierten Mikroorganismen freigegebenen Nukleinsäure an einen festen Träger.
  14. Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielmikroorganismus in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Durchführen eines Verfahrens zum Isolieren von Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, (b) Lysieren der gebundenen Mikroorganismen, (c) Binden der von den lysierten Mikroorganismen freigegebenen Nukleinsäure an einen festen Träger und (d) Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure, die charakteristisch für den Zielmikroorganismus ist, in der gebundenen Nukleinsäure.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, in dem die Nukleinsäure an den gleichen festen Träger gebunden ist wie die Mikroorganismen.
  16. Kit zum Isolieren von Mikroorganismen aus einer Probe mit: (a) einem festen Träger mit einem darauf immobilisierten Liganden, der in der Lage ist, nicht-spezifisch an Mikroorganismen zu binden, wobei der Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galactose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei das Polysaccharid 13 oder mehr kovalentverknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst, und (b) einem Puffer, der dazu geeignet ist, Mikroorganismen an den festen Träger zu binden.
  17. Kit nach Anspruch 16, wobei die Derivate aus der Gruppe bestehend aus Aldonsäure, Uronsäure, Desoxy-, Amino-, Sulfat- und Alkoholderivaten von Galactose oder Mannose ausgewählt sind.
  18. Kit nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, das des weiteren Mittel zum Lysieren der Mikroorganismen umfasst.
  19. Kit nach Anspruch 18, das des weiteren Mittel zum Binden von aus den lysierten Mikroorganismen freigegebener Nukleinsäure an einen festen Träger umfasst.
  20. Fester Träger mit einem darauf immobilisierten Liganden, der in der Lage ist, nicht-spezifisch an Mikroorganismen zu binden, wobei der Ligand ein Polysaccharid ist, das Mannose und/oder Galaktose und/oder Derivate davon, einschließlich Sulfatderivate, umfasst, wobei das Polysaccharid 13 oder mehr kovalentverknüpfte Monosaccharideinheiten umfasst.
  21. Fester Träger nach Anspruch 20, wobei die Derivate aus der Gruppe bestehend aus Aldonsäure, Uronsäure, Desoxy-, Amino-, Sulfat- und Alkoholderivaten von Galactose oder Mannose ausgewählt sind.
DE60129000T 2000-01-21 2001-01-22 Verfahren und Mittel zur Isolierung von Mikroorganismen Expired - Lifetime DE60129000T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0001450 2000-01-21
GBGB0001450.6A GB0001450D0 (en) 2000-01-21 2000-01-21 Cell isolation method
PCT/GB2001/000240 WO2001053525A2 (en) 2000-01-21 2001-01-22 Cell isolation method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60129000D1 DE60129000D1 (de) 2007-08-02
DE60129000T2 true DE60129000T2 (de) 2008-04-10

Family

ID=9884139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60129000T Expired - Lifetime DE60129000T2 (de) 2000-01-21 2001-01-22 Verfahren und Mittel zur Isolierung von Mikroorganismen

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7964364B2 (de)
EP (2) EP1252328B1 (de)
JP (1) JP4594577B2 (de)
CN (2) CN101560545B (de)
AT (2) ATE549414T1 (de)
AU (2) AU785041B2 (de)
CA (1) CA2397067C (de)
DE (1) DE60129000T2 (de)
DK (1) DK1252328T3 (de)
ES (1) ES2288925T3 (de)
GB (1) GB0001450D0 (de)
NO (1) NO332049B1 (de)
WO (1) WO2001053525A2 (de)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69941441D1 (de) * 1998-04-23 2009-10-29 Takara Bio Inc Methode für DNA synthese
DE10129815A1 (de) 2001-06-24 2003-01-09 Profos Ag Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen
DE10230147A1 (de) 2001-10-09 2004-01-15 Profos Ag Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Bakterienzellen
AU2003208933A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-02 California Institute Of Technology Methods and apparatus for assays of bacterial spores
US7419798B2 (en) * 2004-10-19 2008-09-02 Zybac Llc Rapid and sensitive detection of bacteria in blood products, urine, and other fluids
US7439062B2 (en) * 2004-12-23 2008-10-21 Biocept, Inc. Beads for capturing target cells from bodily fluid
US20060252087A1 (en) * 2005-01-18 2006-11-09 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
DE102005002342A1 (de) * 2005-01-18 2006-07-20 GEN-Institut für Angewandte Laboranalysen GmbH Verfahren sowie Kit zur Sterilisierung von Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeiten
WO2006078470A2 (en) 2005-01-18 2006-07-27 Biocept, Inc. Cell separation using microchannel having patterned posts
US8158410B2 (en) 2005-01-18 2012-04-17 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
US20090136982A1 (en) 2005-01-18 2009-05-28 Biocept, Inc. Cell separation using microchannel having patterned posts
KR101157174B1 (ko) * 2005-11-24 2012-06-20 삼성전자주식회사 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치
GB0525231D0 (en) * 2005-12-12 2006-01-18 Genpoint As Method
KR101397386B1 (ko) 2005-12-13 2014-05-26 엑스테라 메디컬 코퍼레이션 혈액으로부터 병원성 미생물, 염증 세포 또는 염증단백질의 체외 제거를 위한 방법
US7695956B2 (en) * 2006-01-12 2010-04-13 Biocept, Inc. Device for cell separation and analysis and method of using
GB0601302D0 (en) * 2006-01-23 2006-03-01 Semikhodskii Andrei Diagnostic methods and apparatus
US9328326B2 (en) * 2006-08-10 2016-05-03 Merck Patent Gmbh Method for isolating cells
US20080044880A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-21 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of and apparatus for separating microorganisms from sample using electrodialysis and microorganism capturing means
JP2008167722A (ja) * 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
EP2140003A2 (de) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Reagenzienzusammensetzungen, verfahren und vorrichtungen zur probenverarbeitung
WO2008131554A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Apparatus and process for immunomagnetic isolation of microorganisms
FR2945819B1 (fr) 2009-05-19 2011-06-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques
GB2475226A (en) 2009-11-03 2011-05-18 Genetic Analysis As Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair
US8758286B2 (en) 2009-12-01 2014-06-24 Exthera Medical Corporation Method for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides
EP2377920A1 (de) * 2010-04-15 2011-10-19 Qiagen GmbH Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Mikroorganismen
GB201011152D0 (en) * 2010-07-02 2010-08-18 Microsens Medtech Ltd Capture of micro-organisms
WO2012016107A1 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Sdix Methods and kits for detection of salmonella enteritidis and related serovars
GB201021399D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling
GB201021397D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Diagnosis of Crohn's disease
GB201102693D0 (en) 2011-02-16 2011-03-30 Genetic Analysis As Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis
WO2012168003A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Biocartis S.A. Selective lysis of cells by ionic surfactants
WO2013188073A1 (en) 2012-06-13 2013-12-19 Exthera Medical, Llc Use of heparin and carbohydrates to treat cancer
MX360384B (es) 2013-01-22 2018-10-31 Imicroq S L Metodo rapido para la deteccion de patogenos.
JP6648009B2 (ja) 2013-06-24 2020-02-14 エクステラ・メディカル・コーポレーション マンノース被覆基材を含有する血液濾過システム
WO2015062699A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Merck Patent Gmbh Method for isolating microorganisms from a complex sample
ES2799398T3 (es) 2013-11-08 2020-12-17 Exthera Medical Corp Métodos para diagnosticar enfermedades infecciosas usando medios de adsorción
MX2016013873A (es) 2014-04-24 2017-03-09 Exthera Medical Corp Metodo para eliminar bacterias de la sangre usando alta velocidad de flujo.
CN106714669B (zh) 2014-09-22 2021-05-14 艾克塞拉医疗公司 可穿戴的血液灌流装置
US9594377B1 (en) * 2015-05-12 2017-03-14 Google Inc. Auto-height swing adjustment
US11911551B2 (en) 2016-03-02 2024-02-27 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
US10786615B2 (en) 2016-03-02 2020-09-29 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
GB201617519D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Genetic Analysis As A companion diagnostic method for use in the treatment of irritable bowel syndrome with dietary interventions or faecal microbiota transplant
DE102017204267B4 (de) * 2017-03-14 2021-05-27 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen
JP7317821B2 (ja) 2017-07-17 2023-07-31 スマートディーエヌエー ピーティーワイ エルティーディー ディスバイオシスを診断する方法
GB201712459D0 (en) 2017-08-02 2017-09-13 Norges Miljø-Og Biovitenskapelige Univ Treatment or prevention of gastrointestinal dysbiosis
WO2019173264A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Wireless detection of electrically or magnetically labeled analytes
GB201805479D0 (en) * 2018-04-03 2018-05-16 Momentum Bioscience Ltd Microorganism separation and detection
CN111705052B (zh) * 2020-07-15 2022-02-22 同济大学 一种厌氧固定化菌剂、制备方法及其应用
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4111838A (en) * 1977-09-09 1978-09-05 Eastman Kodak Company Composition for chromatography
AU530410B2 (en) 1978-02-21 1983-07-14 Sintef Preparing aqueous emulsions
SE452336B (sv) 1978-06-16 1987-11-23 Boehringer Mannheim Gmbh Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
US4791063A (en) * 1983-02-14 1988-12-13 Cuno Incorporated Polyionene transformed modified polysaccharide supports
US4689294A (en) * 1984-11-19 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Enhancement of hybridization of nucleic acids by anionic polymers
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
US4719182A (en) * 1985-03-18 1988-01-12 Eastman Kodak Company Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations
US4935147A (en) * 1985-12-20 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle separation method
US5034314A (en) * 1986-12-22 1991-07-23 Olin Corporation Method and kit for separating double-stranded nucleic acid from a single-stranded/double-stranded mixture of nucleic acids
US4929452A (en) * 1987-09-30 1990-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for rapidly fermenting alcoholic beverages
SE8704158L (sv) * 1987-10-26 1989-04-27 Carbomatrix Ab C O Ulf Schroed Mikrosfaerer, foerfarande foer framstaellning daerav och anvaendning daerav
US5225330A (en) * 1988-08-01 1993-07-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic kit and diagnostic method utilizing carbohydrate receptors
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
GB9003253D0 (en) 1990-02-13 1990-04-11 Amersham Int Plc Precipitating polymers
US5270189A (en) * 1990-07-03 1993-12-14 Martin Marietta Energy Systems, Inc. Biparticle fluidized bed reactor
EP0553113B1 (de) * 1990-08-02 1998-11-25 Antex Biologics, Inc. Adhäsionsrezeptoren für pathogene oder opportunistische mikroorganismen
US5486457A (en) * 1993-08-25 1996-01-23 Children's Medical Center Corporation Method and system for measurement of mechanical properties of molecules and cells
US5773223A (en) * 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5965457A (en) * 1995-06-06 1999-10-12 Magnani; John L. Methods of screening for a candidate compound able to bind to CD34+ cells
DE19528029B4 (de) 1995-07-31 2008-01-10 Chemagen Biopolymer-Technologie Aktiengesellschaft Magnetische Polymerpartikel auf der Basis von Polyvinylalkohol, Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung
GB9709728D0 (en) 1997-05-13 1997-07-02 Dynal As Single step method
EP1118676A2 (de) 2000-01-21 2001-07-25 Chemagen AG Zelleisolierung-Verfahren

Also Published As

Publication number Publication date
CN1395620A (zh) 2003-02-05
CN101560545A (zh) 2009-10-21
DK1252328T3 (da) 2007-10-15
CA2397067A1 (en) 2001-07-26
ATE365225T1 (de) 2007-07-15
AU2695901A (en) 2001-07-31
CA2397067C (en) 2012-02-28
NO20023474D0 (no) 2002-07-19
US20030153028A1 (en) 2003-08-14
AU785041B2 (en) 2006-08-31
EP1865068B1 (de) 2012-03-14
NO332049B1 (no) 2012-06-11
EP1865068A2 (de) 2007-12-12
EP1252328A2 (de) 2002-10-30
GB0001450D0 (en) 2000-03-08
DE60129000D1 (de) 2007-08-02
EP1865068A3 (de) 2010-04-07
CN101560545B (zh) 2012-07-18
AU2006246478B2 (en) 2010-09-30
EP1252328B1 (de) 2007-06-20
AU2006246478A1 (en) 2006-12-21
ES2288925T3 (es) 2008-02-01
NO20023474L (no) 2002-09-20
WO2001053525A2 (en) 2001-07-26
US7964364B2 (en) 2011-06-21
CN100507001C (zh) 2009-07-01
JP2003520048A (ja) 2003-07-02
ATE549414T1 (de) 2012-03-15
WO2001053525A3 (en) 2001-12-27
JP4594577B2 (ja) 2010-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60129000T2 (de) Verfahren und Mittel zur Isolierung von Mikroorganismen
EP1861495B1 (de) Verwendung von nukleasen zum abbau von nukleinsäure in gegenwart von chaotropen agenzien und/oder tensiden
DE3486467T3 (de) Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren
EP2304028B1 (de) Methoden und material zur extraktion von dna
DE69031237T3 (de) Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE69730974T2 (de) Verfahren zur isolierung von nukleinsäuren unter anwendung von alkaliner phosphatase
Feng et al. Direct identification of Yersinia enterocolitica in blood by polymerase chain reaction amplification
DE69533317T2 (de) Isolierung von nukleinsäuren
DE69434255T2 (de) Nukleinsäuresonde zum nachweis von lactobacillus
JP3213911B2 (ja) ミコバクテリアをプロセッシングする方法
EP1346037B1 (de) Zusammensetzungen und verfahren zur extraktion einer nukleinsäure
DE60221126T2 (de) Verbessertes verfahren zum nachweis und zur identifizierung eines eine infektion verursachenden mikroorganismus
US20090186346A1 (en) Method for Detecting the Presence or Absence of a Target Cell in a Sample
EP1118676A2 (de) Zelleisolierung-Verfahren
DE69817000T2 (de) Verfahren zur schnellen isolierung von rns
DE602004003163T2 (de) Verfahren zur Bereitstellung von Proben zum Nachweis
Mattsson et al. Rapid identification of Renibacterium salmoninarum using an oligonucleotide probe complementary to 16S rRNA
DE69635025T2 (de) Neues verfahren zum nachweis von cryptosporidium
DE60207036T2 (de) Detektionsverfahren für Escherichia coli
Stevens The role of molecular methods in the detection of pathogens in food
DE2014200C3 (de) Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten und ihre Verwendung
DE102020103971A1 (de) Verfahren zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen und ein fluidisches Kanalsystem

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: KUDLEK & GRUNERT PATENTANWAELTE PARTNERSCHAFT, 803

R082 Change of representative

Ref document number: 1252328

Country of ref document: EP

Representative=s name: KUDLEK & GRUNERT PATENTANWAELTE PARTNERSCHAFT, 803