DE60221126T2

DE60221126T2 - Verbessertes verfahren zum nachweis und zur identifizierung eines eine infektion verursachenden mikroorganismus

Info

Publication number: DE60221126T2
Application number: DE60221126T
Authority: DE
Inventors: Tsuneya Ohno; Akio Osaka-shi MATSUHISA
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2022-05-28
Also published as: CA2447750A1; EP1403381A4; AU2002256921B2; WO2002099133A1; EP1403381A1; CA2447750C; JP3934605B2; US7651837B2; ATE366824T1; DE60221126D1; JPWO2002099133A1; EP1403381B1; US20060234219A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung Infektionskrankheiten verursachender Mikroorganismen.
STAND DER TECHNIK
Obgleich die Methoden der Blutkultur allgemein herkömmlich als ein Mittel verwendet worden sind, um die Anwesenheit von Bakterien im Blut zu überprüfen, haben sie, da diese Verfahren etwa 3 bis 14 Tage benötigen, um die untersuchten Bakterien zu züchten und zu isolieren, und die mit diesen Verfahren erzielten Nachweisraten niedrig sind, bis hinunter zu etwa 10 %, keinen großen Beitrag in der Diagnose für die Behandlung von ernsten Krankheiten wie Sepsis geliefert.
Um solche Probleme zu lösen, hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung exogener Mikroorganismen, die mit Phagozyten verdaut wurden, erfunden, das einen Schritt des Nachweises von Genen solcher exogener Mikroorganismen in den Phagozyten durch in situ Hybridisierung enthielt, in dem eine Sonde eingesetzt wird, die spezifisch mit den Genen hybridisieren kann ( Japanische Offenlegungsschrift Nr. 7-40 ).
Das Verfahren der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 7-40 stand im Mittelpunkt des Interesses auf dem Gebiet der In fektionskrankheiten, weil, im Vergleich mit den herkömmlichen Verfahren der Blutkultur, das Verfahren einen etwa viermal schnelleren Nachweis der untersuchten Bakterien im Blut von Patienten erlaubte, bei denen Sepsis vermutet wird, und Untersuchungsergebnisse innerhalb von 24 Stunden erhalten wurden.
Ein Verfahren, Zusammensetzungen und Testkits für den Nachweis von Mycobakterien in einer Probe sind in US 5 582 985 offenbart.
Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind eine Verbesserung der Nachweiseffekte und der Nachweisempfindlichkeit, die von dem Verfahren gemäß der japanischem Offenlegungsschrift Nr. 7-40 geboten werden, für den Nachweis und/oder die Identifizierung von Infektionenskrankheiten verursachenden Mikroorganismen, bei dem Phagozyten aus den klinischen Proben entnommen werden, die aktive Phagozyten enthalten, die so entnommenen Phagozyten immobilisiert werden, die Phagozyten behandelt werden, um die Durchlässigkeit ihrer Zellmembranen zu verbessern, die Phagozyten weiter behandelt werden, um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen, die in den Phagozyten vorhanden sein können, die so freigelegte DNA mit einer oder mehreren markierten DNA-Sonde(n), die mit der so freigelegten DNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren können, in situ hybridisiert, und die Erreger-Mikroorganismen auf der Grundlage so nachgewiesener Signale nachgewiesen und/oder identifiziert werden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die zuvor beschriebenen Probleme durchgeführt worden und ihre Leistungen sind wie folgt. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Identifizierung von Infektionskrankhei ten verursachenden Mikroorganismen bereit, umfassend die Schritte:

(a) Entnahme von Phagozyten aus einer klinischen Probe, die aktive Phagozyten enthält;
(b) Befestigung der so entnommenen Phagozyten auf einer Unterlage;
(c) Behandlung der Phagozyten, um die Durchlässigkeit von deren Zellmembranen zu erhöhen;
(d) weitere Behandlung der Phagozyten mit einem lytischen Enzym und einem Proteaseinhibitor, um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen, die in den Phagozyten vorhanden sein können;
(e) in situ Hybridisierung der so freigelegten DNA mit einer oder mehreren markierten DNA-Sonde(n), die mit der so freigelegten DNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren können, wobei in dem Schritt der in situ Hybridisierung Tensid eingesetzt wird; und
(f) Nachweis und/oder Identifizierung der Erreger-Mikroorganismen auf der Basis der so detektierten Hybridisierungssignale.

Die Patentanmeldung offenbart auch ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Identifizierung von Infektionskrankheiten verursachenden Mikroorganismen, in dem Phagozyten aus den klinischen Proben, die aktive Phagozyten enthalten, entnommen werden, die so entnommenen Phagozyten immobilisiert werden, die Phagozyten behandelt werden, um die Durchlässigkeit ihrer Zellmembranen zu verbessern, die Phagozyten weiter behandelt werden, um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen, die in den Phagozyten vorhanden sein können, die so freigelegte DNA mit einer oder mehreren markierten DNA-Sonde(n), die mit der so freigelegten DNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren können, in situ hybridisiert, und die Erreger-Mikroorganismen auf der Grundlage so nachgewiesener Signale nachgewiesen und/oder iden tifiziert werden, wobei das Verfahren mindestens eine aus den folgenden Bedingungen (1)-(8) auszuwählende Bedingung erfüllt;

(1) Die Zellendichte (x Zellen/ml) der zu immobilisierenden Phagozyten beträgt 5 × 10⁶ Zellen/ml < x Zellen/ml < 1 × 10⁸ Zellen/ml,
(2) Lysostaphin wird in dem Schritt zur Freilegung von DNA in einem Titer von 1 Einheit/ml bis 1.000 Einheiten/ml eingesetzt,
(3) Lysozym wird in dem Schritt zur Freilegung von DNA in einem Titer von 1.000 Einheiten/ml bis 1.000.000 Einheiten/ml eingesetzt,
(4) N-Acetylmuramidase wird in dem Schritt zur Freilegung von DNA in einem Titer von 10 Einheiten/ml bis 10.000 Einheiten/ml eingesetzt,
(5) Zymolyase wird in dem Schritt zur Freilegung von DNA in einem Titer von 50 Einheiten/ml bis 500 Einheiten/ml eingesetzt,
(6) in dem Schritt der in situ Hybridisierung wird Tensid eingesetzt,
(7) solche DNA Sonde(n) ist/sind eine oder mehrere zu bestimmende DNA Sonde(n) mit einer Kettenlänge von 350 Basen bis 600 Basen, und
(8) die Konzentration solcher DNA Sonde(n) beträgt von 0,1 ng/μl bis 2,2 ng/μl.

Der Schritt zur Freilegung von DNA setzt vorzugsweise ein oder mehrere Enzym(e) ein, die ausgewählt sind aus Lysostaphin in einem Titer von etwa 10 bis etwa 100 Einheiten/ml, Lysozym in einem Titer von etwa 10.000 bis etwa 100.000 Einheiten/ml, N-Acetylmuramidase in einem Titer von etwa 100 bis etwa 1.000 Einheiten/ml und Zymolyase in einem Titer von etwa 100 bis etwa 500 Einheiten/ml.
Der Schritt zur Freilegung von DNA setzt vorzugsweise Enzym(e) ein, und das Enzym bzw. die Enzyme werden einer Reaktion unterworfen, die bei einer Temperatur von etwa 26°C bis etwa 59°C für eine Zeitdauer von etwa 15 bis etwa 120 Minuten durchgeführt wird.
Der Schritt zur Freilegung von DNA setzt weiterhin einen Proteaseinhibitor, insbesondere Phenylmethylsulfonylfluorid, unter einer Konzentration von vorzugsweise etwa 10 μmol/l bis etwa 10 mmol/l ein, um eine Form der Phagozyten zu erhalten.
Der Proteaseinhibitor wird vorzugsweise in Dimethylsulfoxid gelöst. Der in Dimethylsulfoxid gelöste Proteaseinhibitor wird eingesetzt, um die Form der Phagozyten zu bewahren. Die Konzentration des Dimethylsulfoxids in einer Lösung, die in dem Schritt zur Freilegung von DNA verwendet werden soll, kann auf weniger als 5 % eingestellt werden.
Der in situ Hybridisierungsschritt wird durchgeführt, indem DNA mit einer oder mehreren DNA-Sonde(n) in Gegenwart von Tensid(en), insbesondere eines anionischen Tensids, vorzugsweise Natriumdodecylsulfat (SDS), hybridisiert wird.
Die Hybridisierungsreaktion in dem in situ Hybridisierungsschritt kann bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 50°C und über eine Zeitdauer von etwa 30 bis etwa 900 Minuten durchgeführt werden.
Das Verfahren kann weiterhin vor dem Fixierungsschritt einen Schritt umfassen, bei dem die so entnommenen Phagozyten auf die feste Unterlage aufgebracht werden, und ein mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichteter Objektträger wird als solche feste Unterlage eingesetzt.
Beim Nachweis des Signals kann auch ein Pigment bzw. Pigmente eingesetzt werden, um den Kontrast zwischen Signalen und Zellen hervorzuheben bzw. zu verstärken. Vorzugsweise wird Blut als klinische Probe eingesetzt.
Die Patentanmeldung offenbart auch ein Verfahren für die Überwachung eines Gens von exogenen Mikroorganismen, die mit den Phagozyten in den klinischen Proben, welche aktive Phagozyten enthalten, verdaut werden, das den Schritt des Nachweises des Gens mit dem in situ Hybridisierungsverfahren, das in dem vorher genannten Verfahren eingesetzt wird, umfasst, worin das Gen von exogenen Mikroorganismen in den klinischen Proben überwacht wird.
Die Patentanmeldung offenbart weiterhin ein Verfahren für die Diagnose von Sepsis oder Bakteriämie, das den Schritt der Identifizierung eines Gens von potentiellen Erreger-Mikroorganismen mit dem in situ Hybridisierungverfahren, das in dem vorher genannten Verfahren eingesetzt wird, umfasst, worin die Sepsis oder Bakteriämie verursachenden Mikroorganismen auf der Grundlage der Ergebnisse der Identifizierung bestimmt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Ansicht der Veranschaulichung von Resultaten der in situ Hybridisierung, durchgeführt (a) in Abwesenheit von Tensid (SDS) und (b) in Gegenwart von Tensid (SDS).
2 ist eine Ansicht der Veranschaulichung einer Art von Leukozyten, die bei verschiedenen Zellendichten immobilisiert wurden.
3 ist eine Ansicht der Veranschaulichung einer Veränderung der lytischen Enzymaktivität über die Zeit gegen (a) Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis, (b) Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, und (c) Enterococcus faecalis.
4 ist eine Ansicht der Veranschaulichung von konzentrationsabhängigen Effekten der Zugabe von DMSO auf die lytische Aktivität, die durch (a) 300 Einheiten/ml N-Acetylmuramidase, (b) 10.000 Einheiten/ml Lysozym und (c) 50 Einheiten/ml Lysostaphin bewirkt wird.
5 ist eine Ansicht der Veranschaulichung von Auswirkungen der Zugabe von (a) nur 0,2 Einheiten/ml Protease, (b) 1 μmol/ml PMSF, (c) 10 μmol/ml PMSF, (d) 0,1 mmol/ml PMSF und (e) 1 mmol/ml PMSF, um den Effekt von PMSF, das zur Suppression der Funktion der Protease, die eine morphologische Form von Leukozyten verändert, verwendet werden soll, zu studieren.
6 ist eine Ansicht der Veranschaulichung, dass in den erfindungsgemäß hergestellten Phagozytoseproben Phagozyten Bakterien verdauten und die morphologischen Formen solcher verdauten Bakterien verändert wurden.
7 ist eine Ansicht der Veranschaulichung von Effekten der Enzymbehandlung in den Phagozytoseproben und der Art der Phagozytoseproben, die (a) Staphylococcus aureus vor der Behandlung, (b) Enterococcus faecalis vor der Behandlung, (c) Staphylococcus aureus aus (a) mit der Behandlung und (d) Enterococcus faecalis aus (b) mit der Behandlung enthalten.
8 ist eine schematische Ansicht des Objektträgers, auf den die Phagozytoseproben geschmiert wurden, um die optimale Konzentration der Sonde bei der in situ Hybridisierung zu untersuchen.
9 ist eine schematische Ansicht des Objektträgers, auf dem die Phagozytoseproben geschmiert wurden, um die optimale Temperatur für die in situ Hybridisierung zu untersuchen.
10 ist eine Ansicht der Veranschaulichung der Signale, die in den Resultaten von Southern Blot (die obere Reihe) und Elektrophorese (die untere Reihe) sichtbar gemacht wurden, zusammen mit der Länge der markierten Nachweissonden, die hergestellt wurden, indem Digoxigenin-Label auf (a) Sonden für SA und (b) Sonden für PA aufgebracht wurden.
11 ist eine Ansicht der Veranschaulichung der Signale, die durch in situ Hybridisierung der verdauten Escherichia coli mit markierten Sonden von (a) EC-24, (b) EC-34, (c) EC-39 und (d) einer Mischung (MIX) der vorher genannten Sonden (a)-(c) nachgewiesen wurden.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Jede klinische Probe, die aktive Phagozyten enthält, kann als Probe verwendet werden, um in der vorliegenden Ausführungsform eingesetzt zu werden, und kann Flüssigkeiten wie Blut, Gewebeflüssigkeit, Lymphe, Neurolymphe, Eiter, Pituita, Nasenschleim oder Sputum enthalten. Außerdem sind bei Störungen wie Diabetes, Nephropathie oder Hepatopathie aktive Phagozyten in Urin, Bauchhöhlenflüssigkeit oder Dialysat enthalten und verbleiben auch in der Lotion, die benutzt wird, um Nasenwege, Bronchus, Haut, verschiedene Organe oder Knochen zu waschen, sie können daher ebenfalls als Proben in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Außerdem können Gewebe, die aus der Haut, der Lunge, der Niere, aus Schleimhäuten oder dergleichen entnommen werden, auch als klinische Proben in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Dies liegt daran, dass der Makrophage, der einer der Phagozyten ist, in verschiedenen Formen auftritt, einschließlich Monozyten, alveolarer Makrophage, abdominaler Makrophage, fixierter Makrophage, freier Makrophage, Hansemann-Makrophage, inflammatorisch aktivierter Makrophage, Kupfferzellen der Leber und Mikrogliazellen des Gehirns. Daher können neben Blut auch Gewebe, die diese enthalten, als klinische Proben in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel können Nephritis verursachende Mikroorganismen nachgewiesen und identifiziert werden, indem man Nierengewebe durch Biopsie von Patienten entnimmt, bei denen Verdacht auf Nephritis besteht, durch Verdauung des Gewebes mit Enzymen wie Trypsin, um die Zellen abzuschälen, Phagozyten in den Geweben gewinnt und die so gewonnenen Phagozyten verwendet.
Die Bezeichnung 'Phagozyten', die hierin benutzt wird, bezieht sich auf jede Zelle, die sich Fremdkörper wie exogene Mikroorganismen einverleiben kann und kann zum Beispiel Makrophagen, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile einschließen. Phagozyten-Zellinien wie U937 Zellen, HL60 Zellen oder dergleichen sind ebenfalls verfügbar. Exogene Mikroorganismen, die ansteckende Krankheiten verursachen können, sind mit Phagozyten zu verdauende Mikroorganismen, und können zum Beispiel Bakterien, Pilze, Viren, Protozoen, Parasiten oder dergleichen umfassen. Bakterien können zum Beispiel Staphylococcus, Pseudomonas, Enterococcus, Colibacillus, Streptococcus, Pneumococcus, Tuberkelbazillus, Helicobacter pylori, Listeria, Yersinia, Brucella oder dergleichen mit einschließen. Pilze können zum Beispiel Candida, Aspergillus, Actinomyces, Coccidioides, Blastomyces oder dergleichen mit einschließen. Viren können Grippevirus, Poliovirus, Herpesvirus, Hepatitisvirus und AIDS-Virus mit einschließen. Protozoen können zum Beispiel Karyamoebina falcata, Trichomonas vaginalis, Malaria, Toxoplasma oder dergleichen mit einschließen. Parasiten können zum Beispiel Trypanosoma oder dergleichen mit einschließen. Insbesondere können die Mikroorganismen, die Sepsis oder Bakteriämie verursachen zum Beispiel grampositive Bakterien aus der Klasse der Staphylokokken (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) und der Klasse der Enterokokken (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae), gramnegative Bakterien wie die mit dem Kolibazillus verwandte Familie der Enterobacteriaceae mit Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae (Klebsiella oxytoca, Serratia marcesens, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii), den aerophilen Ast der Klasse Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa), Anaerobier der Klasse Clostridium (Clostridium perfringens), der Klasse Bacteroides (Bacteroides fragilis) oder dergleichen mit einschließen. Auch Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophilia, Flavobacterium meningosepticum, Bacillus cereus können in seltenen Fällen unter die Erreger-Mikroorganismen einzuordnen sein.
Fraktionen mit Phagozyten (Leukozyten) können nach dem herkömmlichen Verfahren aus der klinischen Probe gewonnen werden. Zum Beispiel wurden etwa 5 ml (oder 10 ml mit wenigen Leukozyten) heparinisierten venösen Bluts gewonnen und das Blut wurde im Verhältnis von 4:1 mit dem die Blutbestandteile abtrennenden Reagens (mit sterilisiertem gereinigtem Wasser aufgefüllt auf 25 ml Endvolumen, das 225 mg Natriumchlorid und 1,5 g Dextran (Molekulargewicht: 200.000-300.000) enthielt) gemischt. Leukozytenfraktionen (die obere Schicht) wurden dann erhalten, indem man sie etwa 15 Minuten bis etwa 120 Minuten lang bei etwa 10°C bis etwa 40 °C, vorzugsweise etwa 30 Minuten lang bei etwa 37°C stehen ließ. Die Leukozyten wurden erhalten, indem man die so erhaltenen Leukozytenfraktionen bei 0°C bis etwa 20°C etwa 3 Minuten bis etwa 60 Minuten lang bei etwa 100 × g bis etwa 500 × g, vorzugsweise bei etwa 4°C für etwa 10 Minuten bei etwa 140 × g bis etwa 180 × g zentrifugierte. Hämolyse ist vorteilhaft, wenn in diesen Schritt Erythroblasten eingebracht werden. Die so erhaltenen pelletisierten Leukozyten wurden zum Beispiel mit 1 ml sterilisiertem gereinigtem Wasser suspendiert und die Suspension wurde sofort in einen isotonischen Zustand überführt, indem man Überschussmengen von PBS zusetzte (hergestellt, indem die Rohlösung (PBS Rohlösung; im Folgenden einfach als 'PBS Rohlösung' bezeichnet) zwanzigfach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnt wird) die mit sterilisiertem gereinigtem Wasser auf 120 ml Endvolumen aufgefüllt werden waren, das 18,24 g Natriumchlorid, 6,012 g Natriummonohydrogenphosphat-Dodekahydrat und 1,123g Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat enthielt) und diese Suspension wurde nochmals etwa 10 Minuten lang bei 4°C bei 140 × g bis etwa 180 × g zentrifugiert. Andererseits können solche verdauten Phagozyten auch ohne irgendeine Zentrifugierung wie die voranstehend beschriebene durch ihr natürliches Adhäsionsvermögen an den im Folgenden beschriebenen Objektträgern anhaften.
Die Methodik zur Befestigung bzw. Fixierung der Leukozyten kann zum Beispiel Carnoy-Fixierung einschließen. Speziell werden Leukozyten auf eine Unterlage (ein unterstützendes Mittel) aufgebracht, das die Leukozyten festhalten kann und werden 20 Minuten lang in Carnoy-Fixierlösung (hergestellt durch Mischen von Ethanol, Chloroform und Essigsäure im Volumenverhältnis von 6:3:1) eingetaucht und wurden für fünf Minuten in eine etwa 50 % bis etwa 90 %, vorzugsweise etwa 75% Ethanol enthaltende Lösung eingetaucht. Schließlich wurden sie an der Luft vollständig getrocknet.
Unlösliche Materialien sind für die Unterlage bevorzugt und können zum Beispiel Glas, Metall, synthetisches Harz (zum Beispiel Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyacrylester, Nylon, Polyacetal und fluorhaltige Harze) und Polysaccharid (z. B. Zellulose und Agarose) mit einschließen.
Die Form der unlöslichen Unterlage kann nach Belieben geändert werden und kann zum Beispiel die einer Platte, die einer Schale, die einer Kugel, die einer Faser, die eines Stabs, die einer Scheibe, die eines Behälter, die einer Zelle oder die eines Rohrs mit einschließen.
Besonders bevorzugte Unterlagen in der vorliegenden Ausführungsform sind Objektträger. Solche Objektträger können zum Beispiel den Objektträger (PRODUKT ID. S311BL) von JAPAN AR BRAUNE CO., LTD. einschließen. Dieser Objektträger (PRODUKT ID. S311BL) hat 14 kreisförmige Vertiefungen mit 5 mm Durchmesser. Um das Haftvermögen der untersuchten Zellen während des eigentlichen Gebrauchs zu verbessern, werden mit APS beschichtete Objektträger empfohlen, die hergestellt werden können, indem man eine Schicht von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS, SIGMA) auf die Objektträger aufbringt. Andere Objektträger, die hergestellt werden, indem man eine Schicht von Poly-L-lysin oder Gelatine aufbringt, sind auch verfügbar.
Mit APS beschichtete Objektträger werden hergestellt, indem man die Objektträger (PRODUKT ID. S311BL) auf einen Halter setzt, sie 30 Minuten lang oder länger in ein verdünntes neutrales Reinigungsmittel eintaucht, das Reinigungsmittel mit Leitungswasser gut entfernt, die Objektträger dann mit gereinigtem Wasser wäscht und dieselben dann bei höherer Temperatur (100°C oder mehr) gut trocknet und sie anschließend bei Raumtemperatur stehen lässt. Danach werden diese Objektträger eine Minute lang in Aceton getaucht, das 2 % APS enthält und sofort vorsichtig mit Aceton und dann mit sterilisiertem gereinigtem Wasser abgespült. Diese Objektträger wurden dann an der Luft getrocknet. Diese Objektträger werden dann nochmals eine Minute lang in Aceton, das etwa 1 % bis etwa 10 % APS enthält, eingetaucht und sofort vorsichtig mit Aceton und dann mit sterilisiertem gereinigtem Wasser abgespült und werden an der Luft getrocknet. Schließlich werden diese Objektträger bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 60°C, bevorzugt von 42°C, getrocknet, um die mit APS beschichteten Objektträger zu erzeugen.
Leukozyten werden vorzugsweise auf die mit APS beschichteten Objektträger aufgebracht, indem man die Leukozyten aufschmiert, um eine ausgedehnte einlagige Schicht davon zu erzeugen, und denselben trocknet. Die Zellpopulation (x Zellen/ml) der immobilisierten Phagozyten sollte auf einen Wert von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml < x Zellen/ml < etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml, vorzugsweise etwa 1 × 10⁷ Zellen/ml ≤ x Zellen/ml ≤ etwa 5 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt werden.
Dann wird entsprechend der Änderung der Phagozytenpopulation pro 1 ml die Leukozytenpopulation, die in einer einzelnen Vertiefung des mit APS beschichteten Objektträgers immobilisiert werden soll (y Zellen/Vertiefung (Durchmesser: 5 mm)) auf einen Wert von etwa 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung < y Zellen/Vertiefung < etwa 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung, vorzugsweise etwa < 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung ≤ y Zellen/Vertiefung ≤ etwa 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung eingestellt. Insbesondere werden pelletisierte Leukozyten hergestellt, indem man Leukozytenfraktionen 10 Minuten lang bei 4°C bei etwa 140 × g bis etwa 180 × g zentrifugiert, den pelletisierten Leukozyten eine kleine Menge PBS hinzufügt, dieselben suspendiert, und die Population mit einer Neubauer-Zählkammer zählt. Leukozyten wurden ordnungsgemäß auf die mit APS beschichteten Objektträger aufgebracht, indem man 5 μl der Leukozytensuspension in jede Vertiefung des Objektträgers schmierte, die mit PBS eingestellt wurde, um eine Zellpopulation von etwa 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung bis etwa 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung zu ergeben, dann die einlagige Schicht der Leukozyten ausbreitete und dieselbe an der Luft vollständig trocknete.
Um die Durchlässigkeit der Phagozytenmembran zu erhöhen, wurden sie etwa 3 Minuten lang bis etwa 30 Minuten lang in PBS eingetaucht, dann in einer Lösung, die erhalten wurde, indem man ein Vorbehandlungreagens (hergestellt durch Mischen von 1,25 g Saponin, 1,25 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (spezifisches Gewicht von 1,068-1,075 (20/4°C), pH-Wert 5,5-7,5 (5 % Gewicht/Volumen)) und 25 ml PBS Rohlösung und Auffüllen mit sterilisiertem gereinigtem Wasser auf 50 ml Endvolumen) etwa 2-fach bis etwa 50-fach verdünnte, eingetaucht und etwa 3 Minuten lang bis etwa 30 Minuten lang zentrifugiert.
Um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen wurde eine Enzymlösung hergestellt durch Zugabe, pro einzelnem Objektträger, von 1 ml eines Reagenslösungsmittels (erhalten durch etwa 100-faches Verdünnen von 0,1 mol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthaltendem Dimethylsulfoxid (DMSO) mit PBS) zu einem Enzymreagens (N-Acetylmuramidase, Lysozym und/oder Lysostaphin), von der dann 1 ml bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 37 °C bis etwa 42°C in der feuchten Kammer auf den Bereich getropft wurde, in dem die Leukozyten aufgeschmiert worden waren und etwa 10 Minuten lang bis etwa 60 Minuten lang stehen gelassen wurde. Dann wurden sie in 0,2 mol/l Salzsäure enthaltende PBS (hergestellt durch Zugabe der Salzsäure zu PBS Rohlösung, 20-faches Verdünnen derselben mit sterilisiertem gereinigtem Wasser und Einstellen der Endkonzentration an Salzsäure auf 0,2 mol/l) eingetaucht und wurden 3-30 Minuten lang zentrifugiert, um ihre Durchlässigkeit zu erhöhen. Eine DMSO Konzentration von 5 oder mehr kann die Aktivitäten von Lysozym und Lysostaphin verringern, daher ist eine DMSO Konzentration von weniger als 5 % bevorzugt. Neben PMSF können auch die bekannten Proteaseinhibitoren wie Tosyllysinchlormethylketon (TLCK) und eine Kombination davon eingesetzt werden, um die Form der Phagozyten zu bewahren. Lösungsmittel wie DMSO können gegebenenfalls durch andere ersetzt werden, um solche bekannten Proteaseinhibitoren einzusetzen.
Im Hinblick auf den bevorzugten Bereich des Titers von jedem im Enzymreagens eingesetzten Enzym wurde gefunden, dass obgleich Lysostaphin einen erheblichen Effekt bei einem Titer von 1 Einheit/ml bei der Lyse von Staphylococcus aureus bewirkt, ein Titer von 10 Einheiten/ml oder mehr für die Lyse von Staphylococcus epidermidis notwendig war. Der optimale Titer von Lysostaphin sollte daher auf etwa 1 Einheit/ml bis etwa 1.000 Einheiten/ml, vorzugsweise von etwa 10 Einheiten/ml bis etwa 100 Einheiten/ml eingestellt werden. Wenn der Titer von Lysozym etwa 10.000 Einheiten/ml betrug, trat keine Lyse von Enterococcus faecalis mit N-Acetylmuramidase bei einem Titer von etwa 10 Einheiten/ml oder weniger auf. Genauso trat, wenn der Titer von N-Acetylmuramidase etwa 100 Einheiten/ml betrug, keine Lyse mit Lysozym bei einem Titer von etwa 1.000 Einheiten/ml oder weniger auf. Dementsprechend sollte der optimale Titer von N-Acetylmuramidase auf etwa 10 Einheiten/ml bis etwa 10.000 Einheiten/ml, vorzugsweise auf etwa 100 Einheiten/ml bis etwa 1.000 Einheiten/ml eingestellt werden, während der Titer von Lysozym Acetylmuramidase auf etwa 1.000 Einheiten/ml bis etwa 1.000.000 Einheiten/ml, vorzugsweise auf etwa 10.000 Einheiten/ml bis etwa 100.000 Einheiten/ml eingestellt werden sollte. Wenn die Erreger-Mikroorganismen Pilze wie Candida albicans sind, sollte der Titer von Zymolase auf etwa 50 Einheiten/ml bis etwa 500 Einheiten/ml, vorzugsweise von etwa 100 Einheiten/ml bis etwa 500 Einheiten/ml eingestellt werden. Insbesondere sind PMSF oder die bekannten Proteaseinhibitoren in Kombination mit Zymolase nützlich.
Ein Enzym bzw. Enzyme könnten ausgewählt werden auf der Grundlage der Unterschiede der Bestandteile zwischen grampositiven Bakterien und gramnegativen Bakterien, nämlich dem Unterschied von Peptidoglykan oder von Lipopolysacchariden. Zwei oder mehr Arten von Enzymen sind besonders bevorzugt, um grampositive Bakterien und gramnegative Bakterien effektiv zu lysieren. Es wurde in der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die von einer Mischung der Enzyme Lysozym, Lysostaphin und N-Acetylmuramidase gezeigte Lyseaktivität im Vergleich zu den Aktivitäten der einzelnen Enzyme erhöht war.
Die Temperatur bei der Behandlung von Staphylococcus aureus mit Enzymen sollte vorzugsweise auf etwa 40°C bis etwa 60°C eingestellt werden, die bei der Behandlung von Staphylococcus epidermidis sollte auf etwa 25°C oder mehr eingestellt werden, vorzugsweise auf etwa 37°C oder mehr, und die bei der Behandlung von Enterococcus faecalis sollte auf etwa 25°C bis weniger als etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 37°C bis etwa 42°C eingestellt werden. Dementsprechend ist es am meisten bevorzugt, den Temperaturbereich von etwa 37°C bis etwa 42°C als optimale Behandlungstemperatur festzulegen. Weiterhin wird erwartet, dass der kritische Temperaturbereich, den die drei Bakterienarten gemein haben, den Bereich von etwa 26°C bis etwa 59°C umfasst.
Weiterhin beträgt die Behandlungsdauer jeder möglichen verdauten Probe von Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis mit Enzymen 20 Minuten oder mehr (sowohl null Minuten als auch 10 Minuten waren nicht angemessen), dann, da keine Leukozyten in den Bakterien vorhanden waren, sollte die Behandlungsdauer auf mindestens etwa 15 Minuten oder mehr eingestellt werden, vorzugsweise auf etwa 20 Minuten oder mehr, und ein Zeitraum im Bereich von etwa 30 Minuten bis etwa 60 Minuten sollte als die optimale Behandlungsdauer festgelegt werden. Behandlungsdauern von etwa 15 Minuten bis etwa 120 Minuten können auch geeignet sein.
Weiter ist N-Acetylmuramidase ein Enzym, das im Verlauf einer 5 Minuten lang bei 37°C durchgeführten Reaktion von N-Acetylmuramidase mit wärmebehandeltem Trockenpulver von Enterococcus faecalis in 2 mmol/l Magnesiumchlorid enthaltender 5 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 6,0) eine Absorption bei 600 nm verringert. Wenn 1 Maßeinheit Enzymaktivität definiert wird als eine Aktivität, die ein μg wärmebehandeltes Trockenpulver von Streptococcus salivarius (IFO 3350) in einer Minute lysiert, was daran bei 37°C und pH 7,0 festgestellt wurde, dann ist eine Enzymkonzentration von 2.000 Einheiten/mg oder mehr bevorzugt.
Lysozym ist ein Enzym, das bei einer 5 Minuten lang bei 37 °C durchgeführten Reaktion von Micrococcus luteus mit Lysozym in PBS eine Absorption bei 600 nm verringert. Wenn 1 Maßeinheit Enzymaktivität definiert wird als eine Aktivität, die 0,001 einer Absorption bei 540 nm in einer Minute zu verringern, was an Micrococcus luteus bei 35°C und pH 6,2 festgestellt wurde, dann ist eine Enzymkonzentration von 50.000 Einheiten/mg oder mehr bevorzugt.
Lysostaphin ist ein Enzym, das bei einer 5 Minuten lang bei 37°C durchgeführten Reaktion von Staphylococcus epidermidis mit Lysostaphin in PBS eine Absorption bei 600 nm verringert. Wenn 1 Maßeinheit Enzymaktivität definiert wird als eine Aktivität, die eine Absorption bei 620 nm in 10 Minuten von 0,240 auf 0,125 verringert, was an Staphylococcus aureus bei 37°C und pH 7,5 festgestellt wurde, dann ist eine Enzymkonzentration von 500 Einheiten/mg oder mehr bevorzugt.
Zymolase (Produktname: Zymolyase (SEIKAGAKU CORPORATION)) ist ein Enzym, das aus dem flüssigen Kulturmedium von Arthrobacter lutesul gewonnen wird und eine stark abbauende Wirkung auf die Zellwände der aktiven Hefezellen hat. Das wesentliche Enzym, das in Zymolase enthalten sind und am Abbau der Zellwand beteiligt ist, ist β-1,3-Glukanlaminaripentaohydrolase, das auf Glukosepolymere mit β-1,3-Bindungen wirkt und Laminaripentaose als Hauptprodukt produziert. Zymolyase-100T wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung, dann durch Affinitätschromatographie gereinigt (Kitamura, K. et al., J. Ferment. Technol., 60, 257, 1982) und weist eine Aktivität von 100.000 Einheiten/g auf. Jedoch ist es weithin bekannt, daß sich die Aktivität des untersuchten Enzyms entsprechend der Art der als Substrat vorgesehenen Hefe, den Kulturbedingungen und der Wachstumsphase davon verändert (Kitamura, K. et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 20, 323, 1974; Kitamura, K. et al., Agric. Biol. Chem., 45, 1761, 1981; Kitamura, K. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 553, 1982). Zymolyase-100T enthält etwa 1,0 × 10⁷ Einheiten/g β-1,3-Glukanase, etwa 1,7 × 10⁴ Einheiten/g Protease und etwa 6,0 × 10⁴ Einheiten/g Mannase, aber es enthält keinerlei DNAse und RNase (Kitamura, K. et al.; J. Gen. Appl. Micro-biol., 18, 57, 1972). Der optimale pH-Wert von Zymolyase beträgt von etwa 5,5 bis etwa 8,5, vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 7,5, während die optimale Temperatur davon etwa 25°C bis etwa 55°C, vorzugsweise etwa 35°C bis etwa 45°C beträgt. Weiterhin kann das lytische Spektrum (Klasse) von Hefen (Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase) Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremotheci um, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Helschkowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes, Schwanniomyces oder dergleichen mit einschließen.
Insbesondere kann die Klasse Candida Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parasilosis, Candida galacta, Candida guilliermondii, Candida krusei, Cryptococcus neoformans mit einschließen. Verbindungen mit SH-Gruppen, zum Beispiel Cystein, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol können als Aktivatoren für diese Enzyme eingesetzt werden.
Bakterien, die zu diesen Klassen gehören, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. 1 Maßeinheit Enzymaktivität wird definiert als eine Aktivität, die eine Absorption der Reaktionslösung (hergestellt durch Auffüllen mit 1 ml sterilisiertem gereinigtem Wasser auf 10 ml Endvolumen, das 1 ml Enzymlösung mit einem Gehalt von 0,05 bis etwa 0,1 mg/ml, 3 ml einer Suspension von Bierhefe (2 mg Trockengewicht/ml) als Substrat und 5 ml einer M/15 Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7.5) enthält) bei 800 nm innerhalb von zwei Stunden um etwa 30% verringert, was an einer Suspension von Bierhefe als Substrat bei etwa 25°C festgestellt wurde. Zymolyase-100T weist eine Aktivität von 100.000 Einheiten/g auf.
Was die Konzentration von PMSF (das zugesetzt wird, um die Form der Leukozyten zu bewahren, indem sie vor Protease geschützt werden) als zu verwendendes Reagenslösungsmittel anbelangt, so sollte, da eine Konzentration an PMSF von 10 μmol/l oder mehr wirksam war und eine Form von Leukozyten bei einer Konzentration an PMSF von 0,1 mmol/l oder mehr vollständig erhalten blieb, die Konzentration von PMSF in einem Bereich von etwa 10 μmol/l bis etwa 10 mmol/l, vorzugsweise dem Bereich von etwa 0,1 mmol/l bis etwa 1 mmol/l eingestellt werden. In ähnlicher Weise sollte auch die Konzentration an DMSO auf weniger als 5 %, bevorzugt 2% oder weniger, und besonders bevorzugt etwa 1 % eingestellt werden. Dementsprechend sollte das Reagenslösungsmittel vorzugsweise zubereitet werden, indem man 0,1 mol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthaltendes Dimethylsulfoxid (DMSO) 100 bis 1.000-fach mit PBS verdünnt.
Weiterhin kann nach dem Schritt zur Freilegung von DNA in den Erreger-Mikroorganismen eine Acetylierung von Proteinen der Zellmembran durchgeführt werden. Insbesondere werden Objektträger in das Acetylierungsreagens eingetaucht, das zubereitet wird, indem man Acetanhydrid dem rohen Acetylierungsreagens (mit einer ausreichenden Menge von sterilisiertem gereinigtem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ml aufgefüllt, das 7,46 g Triethanolamin und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) hinzufügt und etwa zweifach bis etwa 50-fach, bevorzugt etwa 10-fach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnt und die Endkonzentration von Acetanhydrid auf von 0,1 % bis 3,0 %, vorzugsweise 0,8 %, einstellt, eingetaucht und werden von 5 bis 30 Minuten lang zentrifugiert. Danach werden sie an der Luft vollständig getrocknet, indem man sie nacheinander jeweils von zwei bis fünf Minuten lang in 75 %iges, 85 %iges und 98 %iges Ethanol eintaucht.
Weiterhin kann eine Alkalisierung von DNA in den Erreger-Mikroorganismen durchgeführt werden, um sie nach dem Schritt der Acetylierung von Proteinen der Zellmembran in DNA Einzelstränge zu überführen. Insbesondere werden Objektträger von etwa zwei Minuten bis etwa fünf Minuten lang in PBS eingetaucht, das etwa 10 mmol/l bis etwa 300 mmol/l Natriumhydroxid, vorzugsweise etwa 70 mmol/l Natriumhydroxid, enthält (hergestellt durch Zugabe von Natriumhydroxid zu PBS Rohlösung, 20-faches Verdünnen mit sterilisiertem gereinigtem Wasser und Einstellen der Endkonzentration von Natriumhydroxid auf 70 mmol/l). Danach wurden sie an der Luft vollständig getrocknet, indem man sie nacheinander jeweils von zwei bis fünf Minuten lang in 75 %iges, 85 %iges und 98 %iges Ethanol eintauchte.
Um die in situ Hybridisierung mit markierten DNA-Sonden durchzuführen, die unter stringenten Bedingungen mit der nackten DNA aus den Erreger-Mikroorganismen hybridisieren können, wird eine Sondenlösung (eine Lösung, welche die markierte DNA Sonde enthält, zubereitet mit Sondenverdünnung) auf den zu beschmierenden Bereich aufgetragen und etwa eine Stunde lang bis etwa drei Stunden lang, vorzugsweise etwa zwei Stunden lang bei etwa 25°C bis etwa 50°C, vorzugsweise bei etwa 37°C bis etwa 42°C in der feuchten Kammer stehen gelassen.
Dann werden drei angefärbte Flaschen, die das Hybridisierungstensid enthalten (zubereitet durch Mischen der Hybridisierungs-Rohlösung (hergestellt mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 75 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 13,15 g Natriumchlorid, 6,615 g Trinatriumcitrat-Dihydrat enthält) im Verhältnis von Hybridisierungs-Rohlösung:sterilisiertem gereinigtem Wasser:Formamid = 5:45:50) zur Verfügung gestellt und sie werden mehrmals hintereinander bei etwa 35 bis etwa 45°C, vorzugsweise bei etwa 42°C jeweils 10 Minuten lang darin eingetaucht. Sie werden dann in PBS eingetaucht und danach in einer Zentrifuge etwa fünf bis etwa 30 Minuten lang zentrifugiert. Insbesondere enthält die verdünnte Lösung der Sonde 600 μl DNA aus Lachssperma, 50 μl 100 × Denhurt-Lösung, 500 μl Hybridisierungs-Rohlösung, 2250 μl Formamid und 1000 μl 50 %iges Dextransulfat. Die Lösung der Sonde enthält vorzugsweise 15 ng von jeder der markierten DNA Sonden und kann mit der Sondenver dünnungsmittel auf ein Gesamtvolumen von 50 μl aufgefüllt werden.
Die Konzentration der Sonden für SA, SE, PA, EF, EK wird eingestellt auf von etwa 0,6 ng/μl bis etwa 1,8 ng/μl, vorzugsweise auf von etwa 0,6 ng/μl bis etwa 1,2 ng/μl. Da das Ergebnis bei 0,06 ng/μl nicht annehmbar war, während das Ergebnis bei 0,6 ng/μl annehmbar war, ist es bevorzugt, die Konzentration auf mindestens 0,1 ng/μl oder mehr einzustellen. Dann, da das Ergebnis bei 2,4 ng/μl nicht annehmbar war, während das Ergebnis bei 1,8 ng/μl annehmbar war, ist es bevorzugt, die Konzentration auf 2,2 ng/μl oder weniger einzustellen. Weiterhin werden die optimalen Konzentrationen der positiven Kontrollprobe und der negativen Kontrollprobe jeweils auf Konzentrationen von 0,4 ng/μl bis 2,0 ng/μl bzw. von 0,6 ng/μl bis 2.0 ng/μl eingestellt, vorzugsweise auf von 0,6 ng/μl bis 1,0 ng/μl für beide Kontrollproben.
Die zur Durchführung der Hybridisierung erforderliche Zeitdauer beträgt mindestens 30 Minuten oder mehr, vorzugsweise 60 Minuten oder mehr und besonders bevorzugt 90 Minuten oder mehr. Eine Zeitdauer von etwa 120 Minuten bis etwa 900 Minuten kann als optimale Hybridisierungzeitdauer festgelegt werden.
Es ist bevorzugt, Tenside wie Natriumdodecylsulfat (SDS) in dem Schritt der in situ Hybridisierung zu benutzen, weil dies eine Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit ermöglichen kann. Die Konzentration von SDS beträgt vorzugsweise 1 % oder weniger, besonders bevorzugt etwa 0,1 % bis etwa 0,5 %, ganz besonders bevorzugt etwa 0,25 %. SDS wird der Lösung hinzugefügt, die für die Hybridisierung eingesetzt werden soll, andernfalls kann es schon vorher dem Verdün nungsmittel für die Sonde oder der Lösung der Sonde hinzugefügt werden.
Es wird empfohlen, als markierte DNA Sonden eine oder mehrere Art(en) von DNA Sonden einzusetzen, die eine Länge von etwa 350 bis etwa 600 Basen, vorzugsweise eine Länge von etwa 350 bis etwa 550 Basen haben, weil die Sonden dadurch glatt in die Phagozyten eingebaut werden und sie leicht und genau mit Genen der exogenen Mikroorganismen in Kontakt gebracht werden können, in die solche Sonden eingebracht werden. Es ist nicht notwendig, dass die Basenlänge (Anzahl der Basen) der Untersuchten in den vorher beschriebenen Bereich der Basenlängen fällt, aber es wird einfach empfohlen, Sonden einzusetzen, die eine Verteilung der Basenlängen aufweisen, welche mindestens teilweise mit dem vorher beschriebenen Bereich der Basenlängen überlappt. Diese Sonden werden aus einzelnen Sonden oder mehreren (einer oder mehr) Arten von Sonden gebildet. Eine oder mehrere Sonde(n) können mehrere Arten von Sonden sein, die mit einer einzelnen bakteriellen Spezies hybridisiert werden sollen, oder sie können mehrere Arten von Sonden sein, die mit mehreren bakteriellen Spezies eins zu eins hybridisiert werden sollen, aber es soll keine Beschränkung auferlegt werden, ob eine oder mehrere Art(en) von Sonden verwendet wird bzw. werden.
Diese Sonden weisen vorzugsweise DNA Fragmente auf, die eine Sequenz enthalten, die ohnehin nicht mit den Phagozyten selbst hybridisiert werden soll, und die überhaupt nicht mit irgendeinem Gen einer nicht relevanten Spezies von Bakterien kreuzhybridisieren würde. Spezifische Sonden können in kurzer Zeit zum Beispiel mit einer Subtraktionsmethode hergestellt werden. Diese Sonden können hergestellt und markiert werden durch die herkömmliche Nick-Translationsmethode mit nicht auf Radioisotopen beruhenden Markierungssubstanzen wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Biotin, Digoxigenin (Digoxigenin(DIG)-11-dUTP) oder dergleichen. Die Stranglänge der Sonden kann am effektivsten durch Veränderung des Verhältnisses der Mengen von DNAse I und DNA-Polymerase I, die jeweils bei der Nick-Translationsreaktion hinzugefügt werden sollen, eingestellt werden. Zum Beispiel wird, um 2 μg der DNA Sonde (SA 24) effektiv zu markieren und deren Stranglänge einzustellen (auf eine Länge von etwa 350 bis etwa 600 Basen) was es den Sonden ermöglicht, effektiv in situ mit der DNA von exogenen Mikroorganismen hybridisiert zu werden, in der Reaktionslösung mit 100 μl Gesamtvolumen auf 2 μl 10U/μl DNA-Polymerase I 6 μl DNAse I dem Gesamtvolumen von 100 μl zugesetzt mit einer Aktivität von etwa 10 mU bis etwa 350 mU, vorzugsweise von etwa 25 mU bis etwa 200 mU und besonders bevorzugt von etwa 50 mU bis etwa 150 mU. Solange das Volumenverhältnis bei den voranstehend beschriebenen wesentlichen optimalen Reaktionsbedingungen auf einem bestimmten Niveau gehalten wird, können das Volumen jedes Enzyms und das Gesamtvolumen der Reaktionslösung nach Belieben geändert werden. Mit anderen Worten kann das Volumen von DNAse I, bezogen auf 20 U DNA-Polymerase I im Gesamtvolumen von 100 μl, auf von etwa 10 mU bis etwa 350 mU, vorzugsweise von etwa 25 mU bis etwa 200 mU und besonders bevorzugt von etwa 50 mU bis etwa 150 mU eingestellt werden. Wendet man sich dem anderen Aspekt zu, so wird empfohlen, die Nick-Translationsreaktion durchzuführen, indem man das Volumen von DNAse I, bezogen auf 1 Einheit DNA-Polymerase I, auf von etwa 0,5/1.000 U bis etwa 17,5/1.000 U, vorzugsweise von etwa 1,25/1.000 U bis etwa 10/1.000 U und besonders bevorzugt von etwa 2,5/1.000 U bis etwa 7,5/1.000 U einstellt. Dann wird, bezogen auf 1 μg DNA, das Volumen von DNA-Polymerase I auf etwa 10 U eingestellt, während das Volumen von DNAse I auf von etwa 5 mU bis etwa 175 mU, vorzugsweise von etwa 12,5 mU bis etwa 100 mU und besonders bevorzugt von etwa 25 mU bis etwa 75 mU eingestellt wird. Was die anderen Sonden betrifft, so werden eine Menge DNA sowie optimale Reaktionsbedingungen für DNA-Polymerase und DNAse I bestimmt, indem man sich auf die optimalen Reaktionsbedingungen bezieht, die voranstehend beschrieben wurden, dann wird ebenfalls die Länge der Sonde (die Länge von etwa 350 Basen bis etwa 600 Basen) bestimmt, bei der die Länge es erlaubt, die Sonden effektiv zu markieren und die es ermöglicht, dass die Sonden effektiv mit der DNA der exogenen Mikroorganismen in situ hybridisiert werden können.
Stringente Bedingungen, die bei der in situ Hybridisierung eingesetzt werden, sind zum Beispiel Bedingungen, bei denen in Gegenwart von etwa 30 %igem bis etwa 60 %igem, vorzugsweise etwa 50 %igem Formamid bei etwa 30°C bis etwa 50°C, vorzugsweise bei etwa 38°C bis etwa 42°C inkubiert und anschließend abgespült wird.
Nach der in situ Hybridisierung kann auch ein Blockierungsschritt durchgeführt werden. Speziell wird 1 ml Blockierungsreagens (zubereitet mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 10 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 2 ml Kaninchen-Normalserum und 0,5 ml PBS Rohlösung enthält) pro einzelnem Objektträger auf den beschmierten Bereich davon getropft und die Objektträger wurden 15 bis 60 Minuten lang stehen gelassen. Dann wird das Blockierungsreagens entfernt.
Um die Signale nachzuweisen, die aus der Hybridisierung mit dem bakteriellen Gen (DNA des Genoms oder RNA) resultieren, kann jede Färbungsreaktion, welche die herkömmliche Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet oder dergleichen eingesetzt werden. Nämlich werden die so hybridisierten Proben vollständig gewaschen, dann werden sie einem Blockierungs schritt unterworfen und werden mit Komplexen wie anti-FITC Antikörpern, anti-Digoxigenin Antikörpern, zum Beispiel Komplexen der alkalischen Phosphatase, behandelt, gefolgt von der Auswertung der Hybridisierungresultate durch Signale, die durch die farberzeugenden Substrate in den Komplexen gebildet werden. Wenn zum Beispiel eine Sonde mit Digoxigenin-11-dUTP markiert wird, wie oben beschrieben, werden Komplexe von anti-Digoxigenin mit alkalischer Phosphatase eingesetzt, und die Sonde kann mit einem Substrat (Nitroblau Tetrazolium, 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat oder dergleichen) nachgewiesen werden, das normalerweise auf die alkalische Phosphatase angewendet wird. Dann werden die Schmierproben, die nach der Färbungsreaktion gewaschen werden, einer Kontrastfärbung mit Naphthol-Schwarz, Fast Green (20 mg/50 ml, Wako Chemicals) oder dergleichen unterzogen und die Signale in den Zellen werden durch optische Mikroskopie ermittelt.
Insbesondere um Signale bei der Hybridisierung zu erhalten, indem man zum Beispiel als markierte DNA Sonden DNA Sonden einsetzt, die mit Digoxigenin markiert sind, wird eine markierte Antikörperlösung hergestellt, indem man den markierten Antikörper (hergestellt mit 12,6 μl Puffer A (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 100 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 746 mg Triethanolamin, 17,5 mg Natriumchlorid, 20,3 mg Magnesiumchlorid Hexahydrat, 1,36 mg Zinkchlorid, 1000 mg Rinderserum-Albumin und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) auf ein Gesamtvolumen von 14 μl verdünnt, das 1,05 Einheiten mit alkalischer Phosphatase markierter anti-Digoxigenin Antikörperlösung enthält) 10- bis 200-fach, vorzugsweise 50-fach mit der Antikörperverdünnung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge von sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 0,7 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 8,48 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 6,14 mg Natriumchlorid und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) verdünnt, dann werden 10 μl der markierten Antikörperlösung auf jeden der beschmierten Bereiche getropft, und sie können 15 bis 60 Minuten lang stehen gelassen werden. Danach werden sie in eine zweifach bis fünfzigfach verdünnte Lösung, vorzugsweise eine zehnfach verdünnte Lösung der Tensid enthaltenden Lösung des markierten Antikörpers (zubereitet mit sterili siertem gereinigtem Wasser, um 100 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 1 ml Polysolvate 20 und 50 ml PBS Rohlösung enthält) eingetaucht und werden fünf bis 30 Minuten lang zentrifugiert, während sie in der Tensidlösung eingetaucht sind. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, dann werden die Proben in die Behandlunglösung eingetaucht, die zubereitet wurde, indem man die Lösung 1 für die einleitende Behandlung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 6,06 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2,92 g Natriumchlorid und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) mit der gleichen Menge der Lösung 2 für die einleitende Behandlung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 5,08 g Magnesiumchlorid Hexahydrat enthält) mischt und dann etwa 5-fach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnt, und werden fünf bis 30 Minuten lang zentrifugiert, während sie in der Tensidlösung eingetaucht sind. 1 ml Färbemittel (Nitroblau Tetrazolium (NBT)/5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)) pro einzelnem Objektträger wird auf den beschmierten Bereich des Objektträgers getropft, wobei man mit einer Wegwerfspritze filtriert, die mit einem 0,2 μm Spritzen-Filteraufsatz ausgerüstet ist, und wird im Dunkeln gehalten und etwa 15 Minuten bis etwa 60 Minuten lang bei etwa 10°C bis etwa 45°C, vorzugsweise bei 37°C, in einer feuchten Kammer stehen gelassen. Dann werden sie etwa zwei bis etwa 10 Minuten lang in der Lösung eingetaucht, die man erhält, indem man das Reinigungsmittel für das Färbemittel (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 606 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan, eine ausreichende Menge Salzsäure und 186 mg Dinatriumethylendiaminetetraessigsäure-Dihydrat enthält) zweifach bis etwa 50-fach, vorzugsweise etwa zehnfach verdünnt, und werden an der Luft getrocknet. Dann werden sie in die Lösung eingetaucht, die man erhält, indem man die Lösung für die Kontrastfärbung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 50 mg Fast Green FCF (Lebensmittelfarbe Grün Nr. 3 (Edible Dye Green No. 3)) zweifach bis 50-fach, vorzugsweise 10-fach verdünnt, und in eine Essigsäurelösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 % bis etwa 5 %, vorzugsweise etwa 1 %. Danach können sie nochmals in die Lösung eingetaucht werden, die erhalten wird, indem das vorher beschriebene Reinigungsmittel etwa zweifach bis etwa 50-fach, vorzugsweise 10-fach verdünnt wird, um überschüssige Lösung für die Kontrastfärbung zu entfernen, und werden an der Luft vollständig getrocknet. Jedes solcher Färbemittel kann einzeln vorbereitet werden.
Bevorzugt kann eine Lösung der mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxigenin-Antikörper eine Lösung enthalten, die den geblotteten Bereich anfärbt, der erhalten wird, indem man ein ng mit Digoxigenin markierter DNA auf eine Blotting-Membrane blottet, dieselbe blockiert, und diese dann mit einer 10.000-fach verdünnten Lösung des mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxigenin-Antikörpers behandelt und diese mit farberzeugenden Substraten (NBT/BCIP) reagieren lässt, während dasselbe Verfahren keine Farbe hervorruft, wenn man DNA ohne Digoxigenin-Label einsetzt. Anti-Digoxigenin-Antikörper, die aus Schafen gewonnen werden, sind bevorzugt. Insbesondere wird es empfohlen, solche Antikörper zu gewinnen, indem man das immuni sierte Schafserum durch eine Ionenaustauschchromatographie und eine Antikörper-Säulenchromatographie reinigt.
Das Färbemittel (NBT/BCIP Lösung, pH 9,0-10,0) ist ein Mittel, das vorzugsweise mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser zubereitet wird, um 10 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 3,3 mg Nitroblau Tetrazolium (NBT), 1,65 mg 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP), 99 μg N,N-Dimethylformamid, 121 mg Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, eine ausreichende Menge Salzsäure, 58,4 mg Natriumchlorid, 101,6 mg Magnesiumchlorid Hexahydrat enthält.
Bevorzugte Färbemittel können ein Mittel mit einschließen, das violette Signale im geblotteten Bereich hervorruft, der erhalten wird durch Blotten von mit alkalischer Phosphatase markierten Proteinen auf eine Blotting-Membran und Behandlung derselben mit solchen Färbemitteln im Dunkeln bei Zimmertemperatur.
Bei der oben beschriebenen Kontrastfärbung können Lebensmittelfarbstoffe, zum Beispiel Gelb Nr. 4 (Tartrazin) verwendet werden, um den Kontrast zwischen Signalen und Zellen hervorzuheben bzw. zu verstärken. Faktoren für einen solch schlechten Kontrast können die Ähnlichkeit der zu bildenden Farben, nämlich zwischen der violetten Farbe, die das Substrat aufweist und der von Naphtolschwarz hervorgerufenen blauen Farbe umfassen. Als diese Methode in der vorliegenden Erfindung angewendet wurde, wurde entdeckt, dass solch eine Methode bei der Kontrastfärbung nützlich ist. Kein herkömmliches Verfahren hat bisher jemals einen Lebensmittelfarbstoff eingesetzt.
Das Verfahren der Nick-Translation ist als Verfahren zur Markierung des Digoxigenins anwendbar. Andere Verfahren können zum Beispiel PCR-Verfahren, Zufallsprimer-Markie rungsverfahren, in-vitro Transkription Markierungsverfahren, Terminal-Transferase Markierungsverfahren oder dergleichen mit einschließen.
Wenn mindestens ein exprimiertes violettes Signal durch die optische Mikroskopie (× 1.000) an den untersuchten Zellen in der einzelnen Vertiefung, die mit der vorher beschriebenen Kontrastfärbungslösung angefärbt wird, bestätigt wird, kann die Probe als positiv gekennzeichnet werden.
Für die Herstellung der markierten Sonden kann auf die japanischen Patente Nr. 2 558 420 , 2 798 499 , 2 965 543 , 2 965 544 und 3 0267 89 verwiesen werden.
Um zum Beispiel Bakterien zu züchten, die aus Working Cell Banken entnommen wurden, werden die Working Cell Banken (SA-24) mit einer Platinschleife, einer Wegwerf-Plastikschleife oder dergleichen in Streifen auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendes festes L-Broth Medium geschmiert, das auf sterilisierte Laborschalen aufgebracht wurde (Screening).
Nachdem diese über Nacht kultiviert wurden, wird eine so gezüchtete einzelne Kolonie in 5 ml des 50 μg/ml Ampicillin enthaltenden L-Broth Mediums inokuliert und wird unter Schütteln bei 37°C über Nacht gezüchtet (Vorkultivierung).
2,5 ml der Kulturlösung werden einzeln in 400 ml des Mediums in einer Flasche geimpft und werden unter Schütteln bei etwa 37°C über Nacht gezüchtet (Hauptkultivierung).
Dann wird, um die SA-24 enthaltende Plasmid DNA zu extrahieren, die durch die Hauptkultivierung erhaltene Kulturlösung 10 Minuten lang bei 4°C bei 4.000 × g zentrifugiert, um die Bakterien zu gewinnen. Der Überstand wird entfernt, 20 ml STE (10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/l Dinatrium- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 mmol/l Natriumchlorid) werden den verbliebenen Bakterien hinzugefügt, um sie zu resupendieren, und sie werden 10 Minuten lang bei 4 °C bei 4,000 × g zentrifugiert, um die Bakterien zu erhalten. Die Bakterien werden in 5 ml Lösung 1 (50 mmol/l Glukose, 25 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 10 mmol/l EDTA), die 10 mg/ml Lysozym enthält, suspendiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach werden 10 ml Lösung 2 (0,2 mmol/l Natriumhydroxid, 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)) hinzugefügt, dann wird gerührt, um sie zu vermischen und sie werden 10 Minuten lang auf Eis stehen gelassen. 7,5 ml eisgekühlte Lösung 3 (3 mol/l Kaliumacetat (pH 4,8)) wird hinzugefügt, dann wird gerührt, um sie zu vermischen und die Lösung wird 10 Minuten lang auf Eis stehen gelassen.
Nach 30 Minuten dauernder Zentrifugierung mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 4°C bei 45.000 × g wird der Überstand abgetrennt und zur Abkühlung auf Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Stehen lassen werden 0,6 Volumina Isopropanol (etwa 24 ml) dazugegeben, durch auf den Kopf stellen vermischt und es wird 5 Minuten lang oder länger bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 30 Minuten dauernder Zentrifugierung mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 25°C bei 28.000 × g wird der Überstand verworfen und das so erhaltene Pellet wird mit 70 %igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen an der Luft werden 8 ml TE (10 mmol/l Tris-Salzsäure (pH 8.0), 1 mmol/l EDTA) dazugegeben, um das Pellet aufzulösen (Extraktion von Plasmid DNA).
Als Nächstes werden für die Reinigung der SA-24 enthaltenden Plasmid DNA 800 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid und 8,6 g Cäsiumchlorid der resultierenden Plasmid DNA hinzugefügt, gefolgt von Mischen durch auf den Kopf stellen, um das Plasmid aufzulösen. Die Lösung wird in ein Zentrifugenröhrchen gebracht, das dann mit einer Kappe verschlossen oder versiegelt wird. Nach 5 Stunden langer Zentrifugierung bei 20°C bei 500.000 × g in einem vertikalen Rotor wird ein Band der Plasmid DNA mit einer Glasspritze oder einer Injektionsnadel unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht fraktioniert. Zu der Lösung der fraktionierten Plasmid DNA wird eine äquivalente Menge mit TE gesättigtes 1-Butanol zugegeben, gefolgt von Mischen durch auf den Kopf stellen und 5 Minuten dauernder Zentrifugierung bei 15.000 × g in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge, um den Überstand zu entfernen. Dieser Vorgang wird wiederholt, um Ethidiumbromid aus Lösung der Plasmid DNA zu entfernen. Als Nächstes wird TE dazugegeben, um ein Volumen von 1,5 ml zu erhalten, gefolgt von der Entsalzung auf einer Demineralisationssäule (NAP-10). Zu der entsalzten Lösung der Plasmid DNA werden 30 μl einer 3 mol/l Natriumacetatlösung gegeben, gefolgt von Mischen, dann wird die 3-fache Menge 99,5 %iges Ethanol dazugegeben, gefolgt von Mischen durch auf den Kopf stellen und 30 Minuten oder länger dauerndem Stehen lassen bei –20°C. Nach dem Stehen lassen wird mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge 20 Minuten lang eine Zentrifugierung bei 4°C bei 15.000 × g durchgeführt, um den Überstand zu entfernen. Danach wird kaltes 70 %iges Ethanol dazugegeben, um es darin zu suspendieren, und es wird noch einmal 20 Minuten lang eine Zentrifugierung mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge bei 4°C bei 15.000 × g durchgeführt, um den Überstand zu entfernen. Der daraus resultierende Niederschlag von Plasmid DNA wird unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingeengt. TE in einer Menge von 100 μl wird der Plasmid DNA hinzugefügt, um sie vollständig aufzulösen, und die Konzentration wird auf der Grundlage der Absorption bei 260 nm gemessen (Reinigung von SA-24 enthaltender Plasmid DNA). Dann wird die Überprüfung der Länge der SA-24 enthaltenden Plasmid DNA durch eine Behandlung mit einem Restriktionsenzym und Agaroseelektrophorese durchgeführt.
Um SA-24 durch das Verdauen der SA-24 enthaltenden Plasmid DNA mit Restriktionsenzym(en) und anschließender Anwendung von Agaroseelektrophorese zu reinigen, wird 1 mg der SA-24 enthaltenden Plasmid DNA, deren Molekulargewicht festgestellt worden war, verdaut durch eine eineinhalb Stunden oder länger dauernde Reaktion bei 37°C in Gegenwart des Restriktionsenzyms Hind III allein oder einer Kombination von Hind III und anderen Restriktionsenzymen. Nachdem die Plasmid DNA verdaut wurde, wird die Vollständigkeit der Verdauung bestätigt, indem man einen Teil der Reaktionslösung durch Elektrophorese an 0,8 % Agarose untersucht. Dann wird, nach der Bestätigung der Verdauung, das SA-24 Band gewonnen, indem man die Lösung einer Elektrophorese mit 0,8 % Agarose als Fraktionator unterwirft. Das so gewonnene SA-24 wird aus dem Agarosegel extrahiert und wird gereinigt, dann wird die Konzentration davon mit einem Absorptionsmessgerät festgestellt. Ein Teil des gereinigten SA-24 wird einer Elektrophorese mit 0,8% Agarosegel unterworfen und erscheint als einzelnes Band.

SA-24 kann vorzugsweise mit Digoxigenin markiert werden mit der Reaktionslösung, die die in der folgenden Tabelle 1 angegebene Zusammensetzung hat und 2 μg des gereinigten SA-24 enthält. TABELLE 1 Zusammensetzung der Reaktionslösung für die Markierung

	Menge (μl)
DNA Sonde	X
10 × L. B.⁽ ^a ⁾	10
100 mmol/l Dithiothreitol	10
dNTPs⁽ ^b) (A, G, C 0,5 mmol/l)	4
Digoxigenin-dUTP^(c ⁾ (0,4 mmol/l)	5
DNAse I^(d)	6
10 U/μl DNA-Polymerase I	2
Sterilisiertes gereinigtes Wasser	Y
Gesamt	100

[ANMERKUNGEN]

(a) 10 × L. B.: 0,5 mol/l Tris-HCl (pH 7,5), 50 mmol/l Magnesiumchlorid, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin
(b) dNTPs: 0,5 mmol/l 2'-Dioxyadenosin-5'-triphosphat, 0,5 mmol/l 2'-Dioxyguanosin-5'-triphosphat, 0,5 mmol/l 2'-Dioxycytidin-5'-triphosphat
(c) Digoxigenin-dUTP: 0,4 mmol/l Digoxigenin-11-2'-Dioxyuridin-5'-triphosphat
(d) DNAse I: Desoxyribonuklease I wird verdünnt mit 25 mmol/l Tris-HCl (pH 7,5), 50 %ige Glycerinlösung, um in einer Menge von 50-150 mU pro Gesamtmenge von 100 μl verwendet zu werden, und wird auf die vorher beschriebene Menge eingestellt.

Das Volumen X in Tabelle 1 ist einstellbar, um die vorher beschriebene bevorzugte Konzentration der Sonde zu erreichen, in Abhängigkeit von der Konzentration der Rohlösung der Sonde, dann wird das Endvolumen eingestellt durch die Bestimmung des Volumens Y von sterilisiertem gereinigtem Wassers, basierend auf dem Volumen X. Nachdem man die Label angebracht hat, wird die Reaktion beendet, indem man der Reaktionslösung 100 μl TE hinzufügt. Freie Nukleotide werden dann entfernt, indem man die Lösung zur Beendigung der Reaktion in die Drehsäule gibt und diese 10 Minuten lang bei 4°C bei 380 × g zentrifugiert. Danach wird die Konzentration der eluierten Lösung mit einem Absorptionsmessgerät bestimmt und mit TE auf die Einheitskonzentration von ng/μl eingestellt.
Um die markierten Proben zu bestätigen, werden 0,5 μl des markierten SA-24 auf eine Membrane getropft und an der Luft getrocknet. Die Membran wird in das Blockierungsreagens eingetaucht und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Membrane wird dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in die Lösung des mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxigenin-Antikörpers eingetaucht, die hergestellt wird, indem man 5.000-fach mit einer Lösung, die 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 0,15 mol/l Natriumchlorid enthält, verdünnt. Die Membran wird in eine Lösung eingetaucht, die 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 0,15 mol/l Natriumchlorid enthält, wird dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt und zweimal abgespült. Dann wird die Membran 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Lösung eingetaucht, die 0,5 mol/l Tris-HCl (pH 9,5), 0,15 mol/l Natriumchlorid und 50 mmol/l Magnesiumchlorid enthält. Die Membran wird dann 10 Minuten lang im Dunklen bei Raumtemperatur in Färbemittel eingetaucht. Markierte Proben werden dadurch bestätigt, dass an der getüpfelten Position violette Farbe erscheint.
Die Drehsäule wird hergestellt, indem man eine kleine Menge sterilisierte Graswolle in 1 ml Volumen einer Wegwerfspritze einfüllt. Mit 1 mmol/l Tris-HCl (pH 7,5), 1 mmol/l EDTA und 0,1 % SDS gequollenes Sephadex G-50 wird dann in die Spritze gefüllt. Die Spritze wird dann in 15 ml Volumen eines konischen Einwegröhrchens eingesetzt und 10 Minuten lang bei 4°C bei 320 × g zentrifugiert, um die überschüssige Pufferlösung zu entfernen. Die Spritze wird dann aus dem konischen Einwegröhrchen entnommen und die überschüssige Pufferlösung wird verworfen. Danach wird die Drehsäule zusammengebaut, indem man 1,5 ml Volumen eines Eppendolfröhrchens auf den Boden des konischen Einwegröhrchens montiert und die Spritze in das konische Röhrchen einführt.
Dot Blot Hybridisierung entsprechend dem folgenden Verfahren wird empfohlen, um die Spezifität der Sonden zu bestätigen.

Zuerst werden, um die jeweils getüpfelte DNA aus dem Genom entsprechend dem Standardverfahren zu denaturieren, 100 ng der verschiedenen so hergestellten bakteriellen Genome auf Nylonmembranen getüpfelt (Pall BioDine Type B; Nihon Pall Ltd.) und an der Luft getrocknete Membranen werden 10 Minuten lang auf Filterpapieren (3mm: Wattman) gehalten, die mit einer Lösung, die 0,5 mol/l Natriumhydroxid und 1,5 mol/l Natriumchlorid enthält, gesättigt wurden. Die denaturierten DNA-Proben werden dann neutralisiert, indem man sie 10 Minuten lang auf den vorher beschriebenen Filterpapieren belässt, die mit einer Lösung gesättigt wurden, die 0,5 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5 mol/l Natriumchlorid enthält. Sie werden weitere fünf Minuten lang auf den vorher beschriebenen Filterpapieren belassen, die mit 2 × SSC (Standard-Salz-Citrat) Lösung gesättigt wurden und werden dann abgespült. Danach werden solche Membranen an der Luft getrocknet und fünf Minuten lang in 2 × SSC Lösung eingetaucht. Gemäß dem Standardverfahren werden die Membranen in Prähybridisierungs-Lösung in Plastikbeuteln eingetaucht und 60 Minuten lang bei 42°C gehalten. In dem Plastikbeutel werden die Membranen in 15 ml einer Hybridisierungslösung, die 400 ng der Sonden enthalten, eingetaucht und man lässt über Nacht bei 42°C reagieren. Als Nächstes werden die Membranen in eine Lösung eingetaucht, die 2 × SSC und 0,1 SDS (Natriumdodecylsulfat) enthält und fünf Minuten lang abgespült (dies wird zweimal wiederholt). Die Membranen werden dann in eine Lösung eingetaucht, die 0,1 × SSC, 0,1 SDS enthält und werden 10 Minuten lang abgespült (dies wird dreimal wiederholt). Die Membranen werden in 2 × SSC Lösung eingetaucht und fünf Minuten lang abgespült. Die Membranen werden in eine Lösung eingetaucht, die 3 Rinderserumalbumin, 1 % Blockierungspuffer (Boehringer), 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 0,15 mol/l Natriumchlorid enthält und werden 30 Minuten lang vorsichtig geschüttelt. Die Membranen werden in eine Lösung eingetaucht, die zubereitet wird, indem man den mit alkalischer Phosphatase markierten anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer) 5.000-fach verdünnt mit einer Lösung, die 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 0,15 mol/l Natriumchlorid enthält, und werden 30 Minuten lang vorsichtig geschüttelt. Als Nächstes werden die Membranen in eine Lösung eingetaucht, die 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 7,5) und 0,15 mol/l Natriumchlorid enthält und werden 15 Minuten lang geschüttelt (zweimal). Die Membranen werden in eine Lösung eingetaucht, die 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 9,5), 0,1 mol/l Natriumchlorid und 5 mmol/l Magnesiumchlorid enthält und werden 5 Minuten lang geschüttelt. Die Membranen werden in NBT-BCIP Lösung (GIBCO BRL) eingetaucht und werden im Dunkeln einer Färbereaktion unterworfen. Die Membranen werden dann in TE (10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/l EDTA) eingetaucht, um die Färbereaktion zu beenden und werden an der Luft getrocknet. Einzelheiten der Prähybridisierungs-Lösung und der Hybridisierung-Lösung sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

		[Maßeinheit: ml]
	Prähybridisierungs-Lösung	Hybridisierungs-Lösung
Formamid	7,5	6,75
20 × SSC Lösung	3,75	3,75
100 × Denhart Lösung	0,75	0,15
0,5 mol/l Phosphatpufferlösung	0,75	0,6
Sterilisiertes destilliertes Wasser	1,5	1,95
10 mg/ml DNA aus Lachssperma	0,75	0,3
50 %iges Dextransulfat	–	1,5
Gesamte Flüssigkeitsmenge	15,0	15,0

Als im Schritt der in situ Hybridisierung zu verwendende Tenside können herkömmliche Tenside eingesetzt werden. Gewöhnlich werden die Tenside grob aufgeteilt in anionische Tenside, nichtionische Tenside, kationische Tenside und amphotere Tenside.
Anionentenside werden auch als anionische Tenside bezeichnet, die nach Ionisierung in Wasser ein organisches Anion freisetzen. Wenn eine lipophile Gruppe im Molekül des Tensids durch R dargestellt wird, schließen Beispiele für Anionentenside RCOONa, RSO₃Na, RSO₄Na und dergleichen mit ein. Eine wässrige Lösung eines Tensids, das eine schwach saure Gruppe wie RCOONa enthält, ist anfällig dafür, hydrolysiert zu werden und ist schwach alkalisch. Dagegen ist eine wässrige Lösung eines Tensids, das eine stark saure Gruppe wie RSO₃Na, RSO₄Na oder dergleichen enthält, gegen Hydrolyse beständig, und sollte neutral sein. Weil es anionisch ist, kann es seine Oberflächenaktivität in Anwesenheit einer großen Menge einer kationischen Substanz verlieren und kann unter stark sauren Bedingungen deaktiviert werden.
Nichtionische Tenside bezeichnen diejenigen, die eine hydrophile Gruppe aufweisen, die nicht ionisch ist. Eine Ethylenoxidgruppe (-CH₂CH₂O-) wird oft als hydrophile Gruppe eingesetzt. Wenn die Anzahl dieser Gruppen erhöht wird, wird die Hydrophilie größer. Im Gegensatz dazu wird die Lipophilie erhöht, wenn die Anzahl der lipophilen Gruppen erhöht wird. Folglich wird es dadurch gekennzeichnet, dass Tenside mit unterschiedlich geänderter Hydrophilie und Lipophilie erhalten werden können. Weil ein nichtionisches Tensid in Wasser keine Ionen bildet und kaum durch anorganische Salze beeinflusst wird, übt es auch weniger Einfluss auf einen lebenden Körper aus. Zusätzlich ist seine Oberflächenaktivität stark bei vergleichsweise geringer Schaumbildung, folglich wird es in großem Umfang nicht nur als Reinigungsmittel, sondern auch in pharmazeutischen Produkten, Kosmetika, Nahrungsmitteln und dergleichen verwendet. Wasserlösliches nichtionisches Tensid wird bei einer bestimmten Temperatur in Wasser unlöslich, wenn die Temperatur steigt, und dann beginnt die wässrige Lösung trüb zu werden. Diese Trübung resultiert aus der Spaltung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den hydrophilen Gruppen und dem Wasser.
Kationentenside werden auch als kationische Tenside bezeichnet, die nach Ionisierung im Wasser ein organisches Kation freisetzen. Obgleich Kationentenside im Allgemeinen keine starke Wirkung auf die Oberflächenspannung haben, binden sie stark an anionische Substanzen wie beispielsweise Bakterien und entfalten eine starke bakterizide Wirkung. Außerdem haben sie auch eine antistatische Wirkung auf Fasern und Kunststoffe. Obgleich Dodecyltrimethylchlorid [C₁₂H₂₅(CH₃)₃N]Cl als typisches Beispiel für ein Kationenten sid wasserlöslich ist, ist Didodecyldimethylammoniumchlorid [(C₁₂H₂₅)₂(CH₃)₂N]Cl in Wasser unlöslich, es bildet ein Vesikel in Form eines bimolekularen Films in Wasser, und ist in Benzol löslich.
Amphotere Tenside sind Tenside, die sowohl eine anionische Gruppe als auch eine kationische Gruppe im Molekül aufweisen. Deren Ionisierungszustand in Wasser ist dem der Aminosäuren ähnlich, und folglich sind viele amphotere Tenside Aminosäurederivate. Demzufolge haben sie ähnlich wie Aminosäuren einen isoelektrischen Punkt, die in einem Bereich, der alkalischer ist als der isoelektrische Punkt, als Anionentensid wirken, während sie in einem Bereich, der saurer ist, als Kationtensid wirken. Die Wasserlöslichkeit wird am isoelektrischen Punkt am niedrigsten, und die Oberflächenspannung wird auch verringert. Amphotere Tenside werden als Bakterizide, antistatische Mittel oder dergleichen benutzt.
Außerdem werden Anionentenside in die Klassen Carbonsäuretyp, Sulfonsäuretyp, Sulfatestertyp und Phosphatestertyp eingeteilt, während nichtionische Tenside in Estertyp, Ethertyp, Esterethertyp und Alkanolamidtyp eingeteilt werden. Kationentenside werden in Alkylaminsalztyp und quaternären Ammoniumsalztyp eingeteilt, während amphotere Tenside in Carboxybetaintyp, 2-Alkylimidazolinderivattyp und Glycintyp eingeteilt werden.
Außerdem werden die Anionentenside vom Carbonsäuretyp weiter unterteilt in Fettsäuremonocarboxylatsalze, N-Acylsarkosinsalze und N-Acylglutamatsalze. Jeweils repräsentative Beispiele davon schließen ein: Natriumlaurat und medizinische Seife als Fettsäuremonocarboxylatsalze; Natrium-N-lauroylsarkosin als ein N-Acylsarkosinsalz; und Dinatrium-N-lauroylglutamat als ein N-Acylglutamat. Weiterhin wird der Sulfonsäuretyp weiter unterteilt in Dialkylsulfosuccinat salze, Alkansulfonatsalze, alpha-Olefinsulfonatsalze, Alkylbenzolsulfonatsalze mit unverzweigten Ketten, Alkylbenzolsulfonatsalze (verzweigte Ketten), Alkylnaphthalinsulfonatsalze, Naphthalinsulfonatsalz-Formaldehyd-Kondensate und N-Methyl-N-Acyltaurinsalze. Repräsentative Beispiele umfassen: Natriumdioctylsulfosuccinat als ein Dialkylsulfosuccinatsalz; Natriumdodecansulfonat als ein Alkansulfonat; Natriumdodecylbenzolsulfonat mit unverzweigten Ketten als ein Alkylbenzolsulfonatsalz mit unverzweigten Ketten; Natriumdodecylbenzolsulfonat als ein Alkylbenzolsulfonatsalz mit verzweigten Ketten; Natriumbutylnaphthalinsulfonat als ein Alkylnaphthalinsulfonatsalz; und Natrium N-Methyl-N-stearoyltaurin als ein N-Methyl-N-acyltaurinsalz. Außerdem wird der Sulfatestertyp weiter unterteilt in Alkylsulfatsalze, Polyoxyethylenalkylethersulfatsalze und Öl- und Fettsulfatestersalze. Repräsentative Beispiele umfassen Natriumdodecylsulfat, Natriumlaurylsulfat und Natriumcetylsulfat als Alkylsulfatsalze; und Polyoxyethylenlaurylethersulfat-Triethanolamin als ein Polyoxyethylenalkylethersulfatsalz. Weiterhin wird der Phosphatestertyp weiter unterteilt in Alkylphosphatsalze, Polyoxyethylenalkyletherphosphatsalze und Polyoxyethylenalkylphenyletherphosphatsalze. Repräsentative Beispiele umfassen Dinatriummonolaurylphosphat als ein Alkylphosphatsalz; und Natriumpolyoxyethylenlauryletherphosphat und Polyoxyethylenoleyletherphosphat (8MOL) als Polyoxyethylenalkyletherphosphatsalze.
Der Estertyp der nichtionischen Tenside wird weiter unterteilt in Fettsäureglycerin-, Fettsäuresorbitan- und Fettsäuresaccharoseester. Jeweils repräsentative Beispiele umfassen: Glycerinmonostearat als ein Fettsäureglycerin; Sorbitanmonostearat, Sorbitantrioleat, Sorbitansesquioleat, Sorbitanmonolaurat, Polysorbat 20 (Fettsäureester des Polyoxyethylensorbitans), Polysorbat 60 und Polysorbat 80 als Fettsäuresorbitane; und Stearinsäuresaccharoseester als ein Fettsäuresaccharoseester. Weiterhin wird der Ethertyp weiter unterteilt in Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyethylenalkylphenylether und Polyoxyethylenpolyoxypropylenglykol. Repräsentative Beispiele umfassen: Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylenstearylether und Polyoxyethylencetylether als Polyoxyethylenalkylether; und Polyoxyethylennonylphenylether und Polyoxyethylenoctylphenylether als Polyoxyethylenalkylphenylether. Weiterhin wird der Esterethertyp weiter unterteilt in Fettsäurepolyethylenglykol und Fettsäurepolyoxyethylensorbitan. Jeweils repräsentative Beispiele davon umfassen Ölsäurepolethylenglykol als ein Fettsäurepolyethylenglykol; und Polyoxyethylensorbitanpalmitat und Polyoxyethylensorbitanmonolaurat als Fettsäurepolyoxyethylensorbitane. Weiterhin umfasst der Alkanolamidtyp nur Fettsäurealkanolamid allein. Ein repräsentatives Beispiel ist Lauryldiethanolamid.
Der Alkylaminsalztyp des Kationentensids schließt Monoalkylaminsalze, Dialkylaminsalze und Trialkylaminsalze mit ein. Repräsentative Beispiele davon schließen Monostearylaminhydrochlorid mit ein. Außerdem wird der quaternäre Ammoniumsalztyp weiter unterteilt in Alkyltrimethylammoniumchlorid (oder -bromid oder -iodid), Dialkyldimethylammoniumchlorid (oder -bromid oder -iodid) und Alkylbenzalkoniumchlorid. Jeweils repräsentative Beispiele umfassen: Stearyltrimethylammoniumchlorid als ein Alkyltrimethylammoniumchlorid (oder -bromid oder -iodid); Distearyldimethylammoniumchlorid als ein Dialkyldimethylammoniumchlorid (oder -bromid oder -iodid); und Laurylbenzalkoniumchlorid als ein Alkylbenzalkoniumchlorid.
Der Carboxybetaintyp der amphoteren Tenside ist nur Alkylbetain allein. Ein repräsentatives Beispiel ist Laurylbetain. Zusätzlich ist der 2-Alkylimidazolinderivattyp nur 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-Hydroxyethylimidazoliniumbetain al lein. Repräsentative Beispiele schließen 2-Undecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain mit ein. Zusätzlich kann der Glycintyp Alkyl-(oder Dialkyl-)diethylentriaminoessigsäure sein, und die repräsentativen Beispiele schließen Dioctyldiethylentriaminoessigsäure mit ein.
Außerdem sind zusätzlich zu den oben beschriebenen repräsentativen Beispielen Triton X-100, Laurylsarkosin, Saponin, BRIJ35, Alkylallylpolyetheralkohol, Sulfate höherer Alkohole, N-Cocoyl-L-argininethylester-DL-pyrrolidoncarboxylatsalz, Natrium-N-cocoyl-N-methyl-aminoethylsulfonat, Cholesterin, selbstemulgierende Typen von Glycerinmonostearat, Squalan, Stearylalkohol, Stearinsäure Polyoxyl 40, Cetylalkohol, Cetomacrogol 1000, Diethylsebacat, Nonylphenoxypolyoxyethylenethansulfatester-Ammonium, Polyoxyethylen oleylamin, Polyoxyethylensorbit gelbes Bienenwachs, Polyoxyl 35 Rizinusöl, Macrogol 400, N-Kokosnussöl Fettsäureacyl-L-Argininethyl-DL-pyrrolidon-Carboxylatsalz, Lauryldimethylaminoxidlösung, Lauromacrogol, Methylcellulose, CMC (Carboxymethylcellulose), Polyoxyethylen gehärtetes Rizinusöl 20 und Polyoxyethylen gehärtetes Rizinusöl 60, CHAPS, Desoxycholsäure, Digitonin, n-Dodecylmaltosid, Nonidet P40, N-Octylglukosid, Octylthioglukosid, Lauratsaccharose, Dodecylpoly(ethylenglykolether)n,n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat und dergleichen auch mit eingeschlossen.
Es ist wichtig, die verschiedenen oben beschriebenen Tenside im in situ Hybridisierungschritt anzuwenden, während die Ausführungsform der Anwendung davon nicht in irgendeiner Weise beschränkt ist. Zum Beispiel würde der Fachmann die Tenside vorher in eine Lösung der Sonde oder das Verdünnungsmittel der Sonde mischen, andererseits kann der Fachmann eine separate Lösung vorbereiten, die Tenside enthält, und diese vor, gleichzeitig mit oder nach der Anwendung der Lösung der Sonde auf den zu beschmierenden Bereich hinzufügen.
Wenn irgendeine positive Kontrollsonde in der vorliegenden Erfindung notwendig ist, kann solch eine Sonde wie folgt hergestellt werden. Um zum Beispiel die Extraktion und die Reinigung der DNA des Genoms der U937 Zellen (ATCC CRL-1593.2) durchzuführen, werden die U937 Zellen zuerst in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxidgas bei 37°C unter Verwendung eines RPMI1640 Mediums (25 ml) in einer Zellkulturflasche (175 cm²) gezüchtet. Die U937 Kulturlösung wird in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt und 10 Minuten lang bei 4°C bei 220 × g zentrifugiert, um die U937 Zellen zu erhalten. Die Zellen werden suspendiert und in 10 ml PBS gewaschen und wieder 10 Minuten lang bei 4°C bei 180 × g zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Danach wird der Überstand verworfen und die Zellen werden in 1 ml einer TE Lösung suspendiert, die 200 μg/ml Proteinase K enthält und 1% SDS enthält, gefolgt von 30 Minuten langem Stehen lassen bei 37°C. Phenolextraktion wird drei- bis viermal wiederholt, um die Deproteinisierung durchzuführen. Das durch die Ethanolfällung abgeschiedene Genom wird gewonnen, aufgelöst in 500 μl sterilem gereinigtem Wasser, das 2,5 μg Ribonuclease enthält, und 30 Minuten lang bei 42°C stehen gelassen. Die Phenolextraktion wird zwei- bis dreimal wiederholt, um die Deproteinisierung durchzuführen. Das durch die Ethanolfällung abgeschiedene Genom wird gewonnen und in 500 μl TE aufgelöst. Danach kann eine positive Kontrollsonde hergestellt werden, indem man die Konzentration mit einem Absorptionsmessgerät misst, und Markierung mit Digoxigenin anwendet. Außerdem ist die positive Kontrollsonde, die vorzugsweise verwendet wird, eine Sonde, die es ermöglicht, die Hybridbildung nachzuweisen, wenn die positive Kontrollsonde einer Punkthybridisierung auf einer Membrane, auf der 100 ng des U937 Genoms aufgetüpfelt wurden, unterzogen wird. Wenn eine negative Kontrollsonde erforderlich ist, kann sie durch jedes bekannte Verfahren hergestellt werden.
Außerdem offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwachung des Gens eines fremden Mikroorganismus, der durch einen Phagozyt verdaut wird, der in einer klinischen Probe enthalten ist, die einen Phagozyten enthält, der aus einem lebenden Körper gewonnen wurde. Außerdem offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung des Gens eines Mikroorganismus, der ein Kandidat für einen Erreger-Mikroorganismus wird, der ein Sepsis verursachender Mikroorganismus oder ein Bakteriämie verursachender Mikroorganismus ist und auf der Grundlage der identifizierten Resultate spezifiziert wird.
Es wurde gefunden, dass, als dieser Prozeß in der Praxis für Diagnosen an Blut einer Vielzahl von Patienten angewendet wurde, von denen vermutet wurden, dass sie unter Sepsis leiden, Erreger-Mikroorganismen mit etwa viermal höherer Empfindlichkeit nachgewiesen werden konnten als mit dem Blutkulturverfahren, ohne einen Einfluss des verabreichten antibiotischen Mittels, und die Identität der nachgewiesenen Stämme von Mikroorganismen war vorteilhaft. Außerdem kann, im Vergleich zur Blutkultur, die drei Tage oder länger und etwa 14 Tage für die Prüfung erfordert, ein genaues Resultat durch einen einfachen Arbeitsvorgang innerhalb eines kurzen Zeitraums, d. h. etwa 8 Stunden bis zur Beendigung des gesamten Arbeitsvorgangs, erzielt werden. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann daher ein nützlicher Marker für die Überwachung und dergleichen in der Prognose oder der Diagnose einer ansteckenden Krankheit wie beispielsweise Sepsis, Bakteriämie oder dergleichen verwirklicht werden, in denen eine schnelle und vorteilhafte Behandlung besonders notwendig ist.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird im Detail zusammen mit den folgenden Beispielen beschrieben werden, aber sie ist selbstverständlich nicht auf Grund der folgenden Offenbarung auf die Beispiele beschränkt.
BEISPIEL 1
Blutentnahme und Vorbereitung von Blutproben
Zwölf Blutproben (Proben A-L) wurden als klinische Proben von den Patienten erhalten, bei denen Verdacht auf Sepsis besteht. 10 ml hepariniertes venöses Blut wurden jedem Patienten entnommen und wurden mit dem Reagens zur Abtrennung der Blutbestandteile (eingestellt mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 25 ml Endvolumen zu erhalten, das 225 mg Natriumchlorid und 1,5 g Dextran (Molekulargewicht: 200.000-300.000) enthält) im Verhältnis von 4:1 gemischt. Die Leukozytenfraktionen (die obere Schicht) wurden dann erhalten, indem man sie 30 Minuten lang bei 37°C stehen ließ. Die Leukozyten wurden erhalten, indem man die Leukozytenfraktionen 10 Minuten lang bei 4°C bei 160 × g zentrifugierte. So erhaltene pelletisierte Leukozyten wurden mit 1 ml sterilisiertem gereinigtem Wasser suspendiert und die Suspension wurde sofort in einen isotonischen Zustand versetzt, indem man PBS im Überschuss hinzu gab (zubereitet, indem die PBS Rohlösung, die mit sterilisiertem gereinigtem Wasser aufgefüllt wurde, um 120 ml als Endvolumen zu erhalten, das 18,24 g Natriumchlorid, 6,012 g Natriummonohydrogenphosphat-Didecahydrat und 1,123 g Natriumphosphat-Dihydrat enthält, zwanzigfach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnt). Solche Suspensionen wurden dann erneut 10 Minuten lang bei 4°C bei 160 × g zentrifugiert.
BEISPIEL 2
Fixierung der Leukozyten
Mit APS beschichtete Objektträger wurden eingesetzt, wobei diese hergestellt wurden, indem man eine Schicht von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS, SIGMA) auf die Objektträger (JAPAN AR BROWN CO., LTD., PRODUKT ID. S311BL) auftrug. Das heißt, solche mit APS beschichteten Objektträger wurden hergestellt, indem man die Objektträger (PRODUKT ID. S311BL) in Halter einsetzte, diese in ein verdünntes neutrales Reinigungsmittel eintauchte, um sie zu waschen, das Reinigungsmittel mit Leitungswasser und dann mit gereinigtem Wasser gründlich davon entfernte, und sie dann bei erhöhter Temperatur (100°C oder mehr) beließ, um die Objektträger zu trocknen, und sie bei Raumtemperatur stehen ließ, um die Objektträger abzukühlen. Danach wurden diese Objektträger eine Minute lang in Aceton eingetaucht, das 2 APS enthielt und wurden sofort vorsichtig mit Aceton und dann mit sterilisiertem gereinigtem Wasser abgespült. Diese Objektträger wurden dann an der Luft getrocknet. Dieser Vorgang wurde wiederholt und umfasste das eine Minute dauernde Eintauchen dieser Objektträger in Aceton, das 2 APS enthielt, sofortiges vorsichtiges Abspülen der Objektträger mit Aceton und sterilisiertem gereinigtem Wasser, und Trocknen derselben an der Luft. Schließlich wurden die Objektträger bei einer Temperatur von 42°C getrocknet, um die mit APS beschichteten Objektträger herzustellen.
Pelletisierte Leukozyten wurden hergestellt, indem man Leukozytenfraktionen 10 Minuten lang bei 4°C bei 160 × g zentrifugierte. Dann wurde die Leukozytenpopulation festgestellt, indem man den pelletisierten Leukozyten eine kleine Menge PBS hinzufügte, sie suspendierte, und die Population mit einer Neubauer-Zählkammer zählte. Die Leukozyten wurden ordnungsgemäß auf die mit APS beschichteten Objektträger aufgebracht, indem man 5 μl der Leukozytensuspension in je de Vertiefung der Objektträger schmierte, die mit PBS auf eine Zellpopulation von 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung eingestellt wurden, eine ausgedehnte einlagige Schicht der Leukozyten zu erzeugte, und sie an der Luft vollständig trocknete. Danach wurden sie 20 Minuten lang in Carnoy-Fixiermittellösung (zubereitet durch Mischen von Ethanol, Chloroform und Essigsäure im Volumenverhältnis von 6:3:1) eingetaucht und wurden fünf Minuten lang in 75 %ige Ethanollösung eingetaucht. Schließlich wurden sie an der Luft vollständig getrocknet.
BEISPIEL 3
Behandlung zur Erhöhung der Permeabilität der Leukozytenzellmembran
Sie wurden 10 Minuten lang in PBS eingetaucht, dann in eine Lösung, die zubereitet wurde, indem man ein Vorbehandlungsreagens (zubereitet durch Mischen von 1,25 g Saponin, 1,25 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (spezifisches Gewicht von 1,068-1,075 (20/4°C), pH 5,5-7,5 (5 % Gewicht/Volumen)) und 25 ml PBS Rohlösung, und Auffüllen mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Endvolumen zu erhalten) zehnfach verdünnte, und wurden 10 Minuten lang in einer Zentrifuge behandelt, um ihre Permeabilität zu erhöhen.
BEISPIEL 4
Behandlung der Zellwand der Bakterien mit lytischen Enzymen
Um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen wurde eine Enzymlösung hergestellt durch Hinzufügen von, pro einzelnem Objektträger, 1 ml eines Reagenslösungsmittels (zubereitet durch 100-faches Verdünnen von 0,1 mol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthaltendem Dimethylsulfoxid (DMSO) mit PBS) zu einem Enzymreagens (N-Acetylmuramidase 1.000 Einheiten/ml, Lysozym 100.000 Einheiten/ml und/oder Lysostaphin 100 Einheiten/ml), von dem anschließend 1 ml bei einer Temperatur von 37°C-42°C in der feuchten Kam mer auf den Bereich getropft wurde, auf den die Leukozyten geschmiert worden waren, und 30 Minuten lang stehen gelassen wurde. Dann wurden sie in PBS eingetaucht, das 0,2 mol/l Salzsäure enthielt (zubereitet durch Zugabe von Salzsäure zu PBS Rohlösung, 20-faches Verdünnen derselben mit sterilisiertem gereinigtem Wasser und Einstellen der Endkonzentration der Salzsäure auf 0,2 mol/l) und wurden 10 Minuten lang in einer Zentrifuge behandelt, um ihre Permeabilität zu erhöhen.
BEISPIEL 5
Acetylierung von Proteinen der Zellmembran
Die Objektträger wurden dann in ein Acetylierungsreagens eingetaucht, das zubereitet wurde, indem man Acetanhydrid dem rohen Acetylierungsreagens (aufgefüllt mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 7,46 g Triethanolamin und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) hinzufügte, 10-fach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnte und die Endkonzentration von Acetanhydrid auf 0,8 einstellte, und wurden 10 Minuten lang in einer Zentrifuge behandelt. Danach wurden sie an der Luft vollständig getrocknet, indem man sie nacheinander jeweils drei Minuten lang in 75 %iges, 85 %iges und 98 %iges Ethanol eintauchte.
BEISPIEL 6
Alkalisierung von bakterieller DNA
(Denaturierung von Doppelstrang-DNA zu Einzelstrang-DNA)
Die Objektträger wurden dann drei Minuten lang in PBS eingetaucht, das 70 mmol/l Natriumhydroxid enthielt (zubereitet durch Hinzufügen von Natriumhydroxid zu PBS Rohlösung, 20-faches Verdünnen mit sterilisiertem gereinigtem Wasser und Einstellen der Endkonzentration von Natriumhydroxid auf 70 mmol/l). Danach wurden sie an der Luft vollständig ge trocknet, indem man sie nacheinander jeweils drei Minuten lang in 75 %iges, 85 %iges und 98 %iges Ethanol eintauchte.
BEISPIEL 7
Hybridisierung
Die Lösung der Sonde (1,0 ng/μl), die 15 ng der mit Digoxigenin markierten DNA Sonden enthielt, die mit der verdünnten Lösung der Sonde (enthaltend 0,25 SDS, 600 μl DNA aus Lachsperma, 50 μl 100 × Denhurt-Lösung, 500 μl Hybridisierungs-Rohlösung, 2250 μl Formamid und 1000 μl 50 %iges Dextransulfat) zubereitet worden waren, wurde auf den beschmierten Bereich aufgetragen und zwei Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C-42°C in der feuchten Kammer belassen. Eine Lösung der Sonde ohne SDS wurde als Kontrollprobe eingesetzt. Mit Digoxigenin markierte DNA Sonden wurden durch das Verfahren der Nick-Translation hergestellt. Dann wurden drei angefärbte Flaschen, die das Hybridisierungstensid enthielten (zubereitet durch Mischen der Hybridisierung-Rohlösung (zubereitet mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 75 ml als Gesamtvolumen zu erhalten, das 13,15 g Natriumchlorid, 6,615 g Trinatriumcitrat-Dihydrat enthält) im Verhältnis von Hybridisierungs-Rohlösung:sterilisiertem gereinigtem Wasser:Formamid = 5:45:50) zur Verfügung gestellt und sie wurden nacheinander jeweils 10 Minuten lang bei 42°C darin eingetaucht.
Danach wurden sie 10 Minuten lang zentrifugiert, während sie in PBS eingetaucht waren. Als mit Digoxigenin markierte DNA Sonden wurden aus Staphylococcus aureus Sonden von SA-24 (SEQUENZ ID. NR.: 1), SA-36 (SEQUENZ ID. NR.: 2) und SA-77 (SEQUENZ ID. NR.: 3) sowie solche aus Staphylococcus epidermidis von SE-22 (SEQUENZ ID. NR.: 4), SE-3 (SEQUENZ ID. NR.: 5) und SE-32 (SEQUENZ ID. NR.: 6) (siehe Japanisches Patent Nr. 2 798 499 ) eingesetzt. Auch wurde als eine Sonde aus Pseudomonas aeruginosa die von P2-2 (SEQUENZ ID. NR.: 7) (siehe Japanisches Patent Nr. 2 965 544 ) eingesetzt. Weiterhin wurden als Sonden aus Enterococcus faecalis die von EF-1 (SEQUENZ ID. NR.: 8), EF-27 (SEQUENZ ID. NR.: 9) und EF-7 (SEQUENZ ID. NR.: 10) (siehe Japanisches Patent Nr. 2 965 543 ) eingesetzt. Dann wurden auch Sonden aus Escherichia Coli von EC-24 (SEQUENZ ID. NR.: 11), EC-34 (SEQUENZ ID. NR.: 12) und EC-39 (SEQUENZ ID. NR.: 13), solche aus Enterobacter cloacae von ET-49 (SEQUENZ ID. NR.: 14) und solche aus Klebsiella pneumoniae von KI-50 (SEQUENZ ID. NR.: 15) (siehe Japanisches Patent Nr. 3 026 789 ) eingesetzt. Weiterhin wurden als Sonden aus Candida albicans solche von CA-26 (SEQUENZ ID. NR.: 16), CA-26-1 (SEQUENZ ID. NR.: 17), CA-26-2 (SEQUENZ ID. NR.: 18) und CA-26-3 (SEQUENZ ID. NR.: 19) (siehe Japanisches Patent Nr. 2 558 420 ) eingesetzt. Die vorliegenden Sonden wurden aus den oben aufgeführten Sonden durch das Verfahren der Nick-Translation hergestellt.
BEISPIEL 8
Blockierung
Nach der in situ Hybridisierung wurde ein Blockierungsschritt durchgeführt. Pro einzelnem Objektträger wurde 1 ml Blockierungsreagens (zubereitet mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 10 ml Endvolumen zu erhalten, das 2 ml Kaninchen-Normalserum und 0,5 ml PBS-Rohlösung enthält) auf dessen beschmierten Bereich getropft und die Objektträger wurden 30 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde das Blockierungsreagens entfernt.
BEISPIEL 9
Reaktion mit markiertem Antikörper
Eine Lösung markierter Antikörper wurde zubereitet, indem man den markierten Antikörper (zubereitet mit 12,6 μl Puffer A (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 100 ml Gesamtvolumen zu er halten, das 746 mg Triethanolamin, 17,5 mg Natriumchlorid, 20,3 mg Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 1,36 mg Zinkchlorid, 1000 mg Rinderserum-Albumin und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) um 14 μl Gesamtvolumen zu erhalten, das 1,05 Einheiten mit alkalischer Phosphatase markierter anti-Digoxigenin Antikörperlösung enthält) 50-fach mit der Antikörperverdünnung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 0,7 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 8,48 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 6,14 mg Natriumchlorid und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) verdünnte, dann wurden 10 μl der markierten Antikörperlösung auf jeden der beschmierten Bereiche getropft, und sie wurden 30 Minuten lang stehen gelassen. Danach wurden sie in die zehnfach verdünnte Tensidlösung des markierten Antikörpers (zubereitet mit sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 100 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 1 ml Polysolvate 20 und 50 ml PBS-Rohlösung enthält) eingetaucht und wurden 10 Minuten lang zentrifugiert, während sie in der Tensidlösung eingetaucht waren. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, dann wurden die Proben in die Behandlungslösung eingetaucht, die zubereitet wurde, indem man die Lösung 1 für die einleitende Behandlung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 6,06 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 2,92 g Natriumchlorid und eine ausreichende Menge Salzsäure enthält) mit der gleichen Menge der Lösung 2 für die einleitende Behandlung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 5,08 g Magnesiumchlorid Hexahydrat enthält) mischte und 5-fach mit sterilisiertem gereinigtem Wasser verdünnte. Die Proben wurden dann 10 Minuten lang zentrifugiert, während sie in der Behandlungslösung eingetaucht waren.
BEISPIEL 10
Nachweis
Pro einzelnem Objektträger wurde 1 ml Färbemittel (Nitroblau Tetrazolium (NBT)/5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP) Lösung, pH 9,0-10,0: zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 10 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 3,3 mg NBT, 1,65 mg BCIP, 99 μg N,N-Dimethylformamid, 121 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan, eine ausreichende Menge Salzsäure, 58,4 mg Natriumchlorid, 101,6 mg Magnesiumchlorid-Hexahydrat enthält) auf den beschmierten Bereich der Objektträger getropft, indem man mit einer Wegwerfspritze filtrierte, die mit einem 0,2 μm Spritzen-Filteraufsatz ausgerüstet war, und wurde 30 Minuten lang bei 37°C im Dunkeln in der feuchten Kammer belassen. Dann wurden sie fünf Minuten lang in die Lösung eingetaucht, die erhalten wurde, indem man den Reiniger für das Färbemittel (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 606 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethan, eine ausreichende Menge Salzsäure und 186 mg Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure-Dihydrat enthält) zehnfach verdünnte, und wurden an der Luft getrocknet. Dann wurden sie in die Lösung eingetaucht, die erhalten wurde, indem man die Kontrastfärbungslösung (zubereitet mit einer ausreichenden Menge sterilisiertem gereinigtem Wasser, um 50 ml Gesamtvolumen zu erhalten, das 50 mg Fast Green FCF (Lebensmittelfarbstoff Grün Nr. 3) enthält) 10-fach verdünnte, und in eine 1 %ige Essigsäurelösung. Danach wurden sie wieder in die Lösung, die zubereitet wurde, indem man den vorher beschriebenen Reiniger 10-fach verdünnte, eingetaucht, um überschüssige Kontrastfärbungslösung zu entfernen und wurden an der Luft vollständig getrocknet.
BEISPIEL 11
Beurteilungsmaßstab
Wenn mindestens ein exprimiertes violettes Signal an den untersuchten Zellen, die mit der Kontrastfärbungslösung in einer einzelnen Vertiefung angefärbt wurden, durch die optische Mikroskopie (× 1.000) bestätigt wurde, wurde die Probe als positiv eingestuft. Als Resultat des vorliegenden Verfahrens waren aus zwölf Proben Bakterien in den fünf Proben in Probe A SA (Staphylococcus aureus), in den Proben F und G SE (Staphylococcus epidermidis), in der Probe J SE und EF (Enterococcus faecalis) und in der Probe L SA und CA (Candida albicans) ermittelt worden. Unterdessen waren, wenn die gleichen Proben der Blutkulturmethodik gemäß den bekannten Verfahren unterworfen wurden, obgleich das identische Resultat in Probe A als Nachweis von SA bestätigt wurde, keine Bakterien in irgendeiner der Proben F, G, J und L ermittelt worden. Dementsprechend wurde deutlich, dass das vorliegende Verfahren diese im Vergleich zu den Blutkulturverfahren schnell mit besserer Empfindlichkeit nachweisen konnte.
Im Hinblick auf das an Probe A SA erhaltene Resultat wird der Effekt, der erreicht wird, indem man SDS der Verdünnung der Sonde hinzufügt, in 1 gezeigt. Aus 1 ist ersichtlich, dass die Nachweisempfindlichkeit für das Signal durch Zugabe von 0,25 % SDS in bemerkenswertem Ausmaß verbessert werden konnte. Wendet man sich den anderen Proben zu, konnten Signale in ähnlicher Weise klar ermittelt werden, indem man ihnen SDS zusetzte. Unterdessen waren die Sonden, die in diesem Beispiel eingesetzt wurden, diejenigen, die durch Anwendung von Nick-Translation auf eine Kombination der Rasensequenzen aus SA-24 (SEQUENZ ID. NR.: 1), SA-36 (SEQUENZ ID. NR.: 2) und SA-77 (SEQUENZ ID. NR.: 3) hergestellt wurden.
BEISPIEL 12
Ermittlung der optimalen Zellpopulation der aufzuschmierenden und aufzubringenden Leukozyten
Die optimale Zellpopulation der Leukozyten, die auf die Vertiefung (die runde Vertiefung mit 5 mm Durchmesser) von mit APS beschichteten Objektträgern aufgeschmiert werden sollten, war untersucht worden. 10 ml hepariniertes Blut von gesunden Menschen wurden gesammelt, dann wurden entsprechend den Verfahren gemäß Beispiel 1 die Leukozyten daraus erhalten. Die so erhaltenen Leukozyten wurden in einer ausreichenden Menge PBS suspendiert und die Leukozytenpopulation pro 1 ml wurde mit einer Neubauer-Zählkammer ermittelt. Eine Verdünnungsreihe, beginnend mit (a) 1 × 10⁸ Zellen/ml und gefolgt von (b) 5 × 10⁷ Zellen/ml, (c) 1 × 10⁷ Zellen/ml, (d) 5 × 10⁶ Zellen/ml, (e) 1 × 10⁶ Zellen/ml, (f) 5 × 10⁵ Zellen/ml und (g) 1 × 10⁵ Zellen/ml wurde vorbereitet und 5 μl von jeder Population wurden auf die Objektträger geschmiert. Beschmierte Objektträger wurden an der Luft getrocknet und wurden mit Carnoy-Fixiermittellösung fixiert (siehe Beispiel 2). Unmittelbar danach wurden sie mit der vorher beschriebenen Kontrastfärbungslösung angefärbt und wurden dem Beurteilungsmaßstab entsprechend dem Verfahren von Beispiel 11 unterworfen. Als Resultat davon wurde festgestellt, dass die Zellpopulation von 1 × 10⁸ Zellen/ml zu hoch war für einen Nachweis und nicht geeignet war. Dann waren die Zellpopulationen von 5 × 10⁶ Zellen/ml oder weniger nicht geeignet, weil nur eine kleine Population in der Vertiefung beobachtet wurde. Dementsprechend sollte die Dichte (x Zellen/ml) der zu immobilisierenden Phagozyten im Bereich von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml < x Zellen/ml < etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml, vorzugsweise im Bereich von etwa 1 × 10⁷ Zellen/ml ≤ Zellen/ml ≤ etwa 5 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt werden. Es wurde gleichzeitig daraus deutlich, dass die Leukozytenpopulation (y Zellen/Vertiefung (5mm Durchmesser)), die in der einzelnen Vertiefung von mit APS beschichteten Objektträgern immobilisiert werden soll, im Bereich von etwa 2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung < y Zellen/Vertiefung (5mm Durchmesser) < etwa 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung, vorzugsweise etwa 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung ≤ y Zellen/Vertiefung (5mm Durchmesser) ≤ etwa 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung eingestellt werden sollte. Experimentelle Ergebnisse an den Proben (a)-(f) wurden jeweils in 2(a)–(f) veranschaulicht.
BEISPIEL 13
Untersuchung des einzusetzenden lytischen Enzyms
Die enzymatischen Bedingungen für die Lyse von Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Enterococcus faecalis (ATCC 19433) und Escherichia coli (ATCC 11775) waren untersucht worden. Lysostaphin (Bur. J. Biochem., 38, pp. 293-300, 1973) wurde als lytisches Enzym für Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis verwendet. Was Enterococcus faecalis angeht, so wurde N-Acetylmuramidase (Archs. Oral Biol., 23, pp. 543-549, 1978), Lysozym (SEIKAGAKU CORPORATION) verwendet. Was Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli anbetrifft, so wurde 70 mmol/l Natriumhydroxid enthaltendes PBS verwendet. All diese Bakterien wurden in 5 ml BHI („Brain Heart Infusion", Gehirn-Herz-Infusion) Flüssigmedium (DIFCO) geimpft und wurden bei 37°C acht Stunden lang oder länger kultiviert. Die kultivierten Lösungen wurden gesammelt, indem man sie 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugierte. Die zu untersuchenden Proben wurden vorbereitet, indem man die erhaltenen Bakterien in PBS suspendierte.
Lyseaktivitäten wurden mit einem Microplate Reader festgestellt, indem man die verringerte Dichte der untersuchten Probenlösung bei der Absorption bei 600 nm auswertete. Als Ergebnis davon wurden Staphylococcus aureus und Staphylo coccus epidermidis mit Lysostaphin lysiert. Was Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli anbetrifft, so war eine Enzymbehandlung nicht notwendig, weil sie mit 70 mmol/l Natriumhydroxid enthaltendem PBS lysiert wurden. Was Enterococcus faecalis angeht, so wurde entdeckt, dass die Lyseaktivitäten dafür verbessert wurden, wenn man nicht N-Acetylmuramidase allein, sondern eine Kombination von N-Acetylmuramidase mit Lysozym verwendete. Wenn aber zum Beispiel Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oder dergleichen die durch Phagozytose verdauten Bakterien sind, sind solche Enzymbehandlungen möglicherweise nicht notwendig, weil ihre Zellwände durch die alkalische Behandlung aufgelöst werden und dadurch ihre Gene freigelegt werden. Jedes Enzym, das im Vorbehandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung zur Auflösung des exogenen Mikroorganismus eingesetzt wird, wäre nicht nur auf den vorher beschriebenen Stamm von Bakterien anwendbar, sondern auch auf die anderen Stämme von Bakterien einschließlich derer, die zur Klasse Staphylococcus, zur Klasse Streptococcus, zur Klasse Bacillus und zur Klasse Micrococcus gehören. Solche Enzyme können als einzelne Enzyme eingesetzt werden, aber es ist recht nützlich, sie als Mischung von Enzymen einzusetzen. Diese Resultate wurden in 3 dargestellt, im Einzelnen als 3(a) Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis, (b) Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coil, und (c) Enterococcus faecalis.
BEISPIEL 14
Untersuchung der Enzymlösung
(Ermittlung der optimalen Konzentration von DMSO)
Da die Protease, die im Enzymreagens enthalten ist, die Form von Leukozyten zerstört, war die Enzymaktivität von DMSO, das das Lösungsmittel für PMSF ist, welches verwendet wird, um die Form der Leukozyten zu bewahren, untersucht worden. Enterococcus faecalis wurde in 50 ml BHI Flüssigme dium, das oben beschrieben wurde, geimpft und wurde bei 37°C acht Stunden lang oder länger kultiviert. Bakterienzellen wurden gewonnen, indem man die Kulturflüssigkeit 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugierte, dann wurden sie in PBS suspendiert und wurden einer Wärmebehandlung in einem Autoklaven (120°C, 10 Minuten) unterzogen. Als Nächstes wurden diese 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugiert, dann wurde der Überstand verworfen und die Niederschläge wurden in 1 ml PBS suspendiert und wurden lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben wurden in 5 mmol/l Tris-HCl (pH 6,0), das 0-10 % DMSO enthielt und dann in 2 mmol/l Magnesiumchlorid suspendiert und wurden als Probe für N-Acetylmuramidase bestimmt. Mikrococcus luteus (JCM1464) wurde in 5 ml BHI Flüssigmedium (supra) geimpft und wurde bei 37°C acht Stunden lang oder länger kultiviert. Bakterienzellen wurden gewonnen, indem man die kultivierte Bakterienlösung 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugierte. Dann wurde der Überstand verworfen und die Bakterienzellen wurden gewonnen, indem man die Bakterienpellets durch Suspendieren in PBS spülte und sie wieder 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugierte. Die so erhaltenen Bakterien wurden in PBS suspendiert, das 0-10 % DMSO enthielt und wurden als Probe für Lysozym bestimmt. Andererseits wurden auch Proben für Lysostaphin vorbereitet, indem man Staphylococcus epidermidis im Wesentlichen nach dem Verfahren für die Proben für Lysozym züchtete und gewann, und die gezüchteten Bakterien mit PBS, das etwa 0 % bis etwa 10% DMSO enthielt, suspendierte.

Die Enzymaktivitäten wurden mit einem Microplate Reader ausgewertet, indem man die Verringerung der Absorption bei 600 nm an den untersuchten Proben bestimmte. Die Korrelation zwischen DMSO und den Enzymaktivitäten wurden in diesem Beispiel bei einem Enzymtiter von (a) N-Acetylmuramidase 300 Einheiten/ml, (b) Lysozym 10.000 Einheiten/ml und (c) Lysostaphin 50 Einheiten/ml experimentell untersucht. Als die einzelnen Enzymaktivitäten an Hand der Abnahme der Dichte der Bakteriensuspension (O. D. = 600 nm) über eine vorgegebene Zeitdauer ausgewertet wurden, zeigte sich wenig Korrelation zwischen DMSO und Aktivität von N-Acetylmuramidase, während 5 % oder mehr DMSO die Aktivitäten von Lysozym und Lysostaphin verringerten. Es zeigte sich keine Abnahme der Enzymaktivitäten bei DMSO-Konzentration von 2 % oder weniger. Dementsprechend wird die Konzentration des zum Lösen von PMSF verwendeten DMSO auf weniger als 5 %, vorzugsweise 2 % oder weniger, besonders bevorzugt etwa 1 % eingestellt. Die Ergebnisse wurden in 4(a)–(c) und in der folgenden Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Korrelation zwischen DMSO und Enzymaktivität (Dichteabnahme in der Bakteriensuspension)

zugegebene Menge DMSO (%)	N-Acetylmuramidase O. D./5 min	Lysozym O. D./3 min	Lysostaphin O. D./10 min
0 (Kontrolle)	79,3 ± 4,8	0,689 ± 0,028	0,168 ± 0,017
0,1	75,0 ± 3,2	0,678 ± 0,026	0,164 ± 0,009
1	75,8 ± 2,8	0,660 ± 0,026	0,160 ± 0,008
2	75,8 ± 2,5	0,653 ± 0,024	0,145 ± 0,009
5	76,3 ± 4,9	0,566 ± 0,017	0,124 ± 0,006
10	73,8 ± 3,5	0,464 ± 0,016	0,094 ± 0,006

BEISPIEL 15
Untersuchungen an der Lösung für die enzymatische Lyse (Ermittlung der optimalen Konzentration von PMSF)
Weil die Protease, die im Enzymreagens enthalten ist, die Morphologie von Leukozyten beeinträchtigt, wurden die Effekte von PMSF (hergestellt durch PIERCE), das hinzugefügt wird, um die Morphologie der Leukozyten zu bewahren, auf die Enzymaktivität überprüft. PMSF wurde in 100 μl DMSO (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ge löst und mit PBS auf 10 ml verdünnt, so dass die Endkonzentration von PMSF null (0 mmol/l) bis 1 mmol/l beträgt. Zu dieser Lösung wurde so viel Proteinase K (hergestellt von Boehringer Mannheim) gegeben, dass der Titer der Protease 0,2 Einheiten/ml beträgt. Es wurde hepariniertes Blut von gesunden Menschen in einer Menge von 5 ml gesammelt, und Leukozyten wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten. Als Nächstes wurden die Leukozyten in einer angemessenen Menge PBS suspendiert und die Zellanzahl wurde mit einer Zählkammer gemessen. Die Zellanzahl wurde auf etwa 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung bis etwa 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung eingestellt und 5 μl davon wurden auf die Vertiefung des mit APS beschichteten Objektträgerglases geschmiert. Nach Trocknung an der Luft wurde die Fixierung entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren der Carnoy-Fixierung durchgeführt. Mit dieser Probe wurden Tests gemäß dem in den Beispielen 3 bis 11 beschriebenen Verfahren durchgeführt. In der Folge der Durchführung der Tests bei Konzentrationen von PMSF von 1 μmol/l bis 1 mmol/l wurden Effekte bei Konzentrationen von 10 μmol/l oder größer gefunden, während eine Verschlechterung der Morphologie der Leukozyten bei einer Konzentration von PMSF von 0,1 mmol/l oder größer vollständig unterdrückt wurde. Die Ergebnisse werden jeweils in 5 gezeigt, für (a): 0,2 Einheiten/ml Protease allein, (b): 1 μmol/ml PMSF hinzugefügt, (c): 10 μmol/ml PMSF hinzugefügt, (d): 0,1 mmol/ml PMSF hinzugefügt und (e): 1 mmol/ml PMSF hinzugefügt.
BEISPIEL 16
Ermittlung des optimalen Titers des lytischen Enzyms Zymolase
Der optimale Titer von Zymolase für das Freilegen von DNA wurde durch Lyse von Candida albicans untersucht. Candida albicans wurde in YPD Medium geimpft und einen Tag und eine Nacht lang bei 30°C gezüchtet. Dann wurden zwei Arten von Lösungen vorbereitet: eine Lösung von Candida albicans als in PBS suspendiertes Substrat (Substrat 1); und eine Lösung, die hergestellt wurde durch Carnoy-Fixierung, Eintauchen in 70 %iges Ethanol, Trocknung an der Luft und Suspendieren in PBS (Substrat 2). Bei der Reaktion wurde eine Mischung von Zymolase/PBS: 0,5ml, Substrat: 1,5 ml, M/15 Phosphatpuffer: 2,5 ml und steriles gereinigtes Wasser: 0,5 ml, aufgefüllt auf ein Gesamtvolumen von 5,0 ml, verwendet.
Danach ließ man bei 37°C 2 Stunden lang reagieren, und die OD₈₀₀ wurde gemessen. Außerdem betrug die Konzentration von Zymolase (Zymolyase-100T) für den Gebrauch 0 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2,5 mg/ml und 5 mg/ml. Infolgedessen betrugen die jeweiligen Werte OD₈₀₀ bei Verwendung von Substrat 1 0,533, 0,521, 0,553, 0,554, 0,548, 0,417, 0,394, 0,288, 0,163 und 0,113 und die jeweiligen Werte OD₈₀₀ bei Verwendung von Substrat 2 betrugen 0,445, 0,411, 0,359, 0,282, 0,232, 0,146, 0,115, 0,096, 0,08 und 0,057. Es wurde nachgewiesen, dass eine Wirkung auftrat, wenn sowohl das Substrat 1 wie auch das Substrat 2 im Bereich von 0,5 mg/ml bis 5 mg/ml, und insbesondere im Bereich von 1 mg/ml bis 5 mg/ml waren. Das heißt, die zu verwendende Menge Zymolase beträgt vorzugsweise 50 Einheiten/ml bis 500 Einheiten/ml, besonders bevorzugt 100 Einheiten/ml bis 500 Einheiten/ml.
BEISPIEL 17
Ermittlung der optimalen Bedingungen (Titer) für die Enzymbehandlung
(1) Herstellung einer verdauten Probe
[1] Präparation von U937 Zellen
U937 Zellen (etablierte Monozyten-Zelllinie: ATCC CRL-1593.2) wurden in einem RPMI 1640 Medium (25 ml) in einer Zellkulturflasche (175 cm²) in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxidgas bei 37°C gezüchtet. Als Nächstes wurde die U937 Zellkulturflüssigkeit in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt und 10 Minuten lang bei 4°C bei 220 × g zentrifugiert, um die U937 Zellen zu gewinnen. Dann wurden die so gewonnenen U937 Zellen in 200 μl PBS suspendiert und die Zellanzahl wurde mit einer Zählkammer gezählt. Die Zellanzahl wurde auf 1 × 10⁴ Zellen/μl bis 2 × 10⁴ Zellen/μl eingestellt.
[2] Herstellung einer Probe verdauter Bakterien
Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), Enterococcus faecalis (ATCC 19433) und Escherichia coli (ATCC 11775) wurden jeweils in 5 ml BHI Kulturmedium geimpft und bei 37°C 8 Stunden lang oder länger gezüchtet. Die Bakterienkulturflüssigkeit wurde 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g zentrifugiert, um die Bakterium zu erhalten. Nach Verwerfen des Überstands wurde das Bakterienpellet in 5 ml PBS suspendiert, und es wurde noch einmal 10 Minuten lang bei 4°C bei 2.000 × g eine Zentrifugierung durchgeführt, um die Bakterien zu gewinnen. Die so erhaltenen Bakterien wurden in 5 ml PBS suspendiert und danach wurden 15 ml Bakterien enthaltender Flüssigkeit hergestellt, zubereitet, indem man mit PBS verdünnte, um eine Trübung (O. D. = 600 Nanometer) der Bakterien enthaltenden Flüssigkeit, die mit einem Absorptionsmessgerät gemessen wurde, von jeweils 0,01 bis 0,03 für Staphylococcus aureus, 0,01 bis 0,03 für Staphylococcus epidermidis, 0,02 bis 0,03 für Pseudomonas-Aeruginosa, 0,01 bis 0,03 für Enterococcus faecalis, 0,02 bis 0,03 für Escherichia coli zu erzeugen. Die so hergestellte Bakterien enthaltende Flüssigkeit wurde in eine separate 175 cm² Kulturflasche überführt und 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur ruhig stehen gelassen. Fünfzig ml hepariniertes Blut von gesunden Menschen wurden gesammelt und dazu wurde das Reagens für die Abtrennung von Blutkörperchen in einem Verhältnis von 4:1 gegeben und 30 Minuten lang bei 37°C ruhig stehen gelassen, um die Leukozytenfraktion zu erhalten. Die so erhaltene Leukozytenfraktion wurde mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Der Überstand in der Kulturflasche (supra) wurde vorsichtig abgeschüttet und jeweils 10 ml der der mit PBS verdünnten Leukozytenfraktion wurde der Flasche zugegeben, gefolgt von 10 Minuten langem Stehen lassen bei Zimmertemperatur. Der Überstand in der Kulturflasche wurde verworfen, und die am Boden der Flasche anhaftenden Leukozyten wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml PBS, die 0,02 % EDTA enthielt, überführt und 10 Minuten lang bei 4°C bei 140 × g bis 180 × g zentrifugiert, um die Leukozyten zu erhalten. Weil in den erhaltenen Leukozyten eine Kontamination durch Erythrozyten festgestellt wurde, wurden die Niederschläge der Leukozyten vorsichtig in 1 ml sterilem gereinigtem Wasser suspendiert, um Hämolyse zu ermöglichen, einer Isotonisierung durch Zugabe von 14 ml PBS unterzogen, gefolgt von erneuter 10 Minuten langer Zentrifugierung bei 4°C bei 140 × g bis 180 × g, um die Leukozyten zu gewinnen. Die erhaltenen Leukozyten wurden in PBS suspendiert, und die Zellanzahl wurde mit einer Zählkammer gezählt, um sie auf einen Wert im Bereich von 1 × 10⁴ Zellen/μl bis 5 × 10⁴ Zellen/μl einzustellen. Diese verdauten Proben wurden gekennzeichnet als verdaute Probe von SA, verdaute Probe von SE, verdaute Probe von PA, verdaute Probe von EF, und verdaute Probe von EK.
[3] Schmieren und Fixierung
Jeweils 5 μl der U937 Zellen, die in Beispiel 17 (1) [1] präpariert wurden und jeweils 5 μl von jeder verdauten Probe von Bakterien, die in Beispiel 17 (1) [2] hergestellt wurden, wurden auf jede Vertiefung des mit APS beschichteten Objektträgers geschmiert und an der Luft getrocknet. Nachdem man den Objektträger 20 Minuten lang in Carnoy-Fixiermittel, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, eingetaucht hatte, wurde er als Nächstes 5 Minuten lang in 75 %iges Ethanol eingetaucht. Nach Abwaschen des Carnoy-Fixiermittels und Trocknen an der Luft wurde der Objektträger bis zum Gebrauch im Test bei 4°C gelagert (siehe Beispiel 2). Als Nächstes wurde eine Vorbehandlung der fixierten Probe gemäß Beispiel 3 durchgeführt.
(2) Standard und Verfahren für die Prüfung einer verdauten Probe
[1] Zellanzahl
Die auf das Objektträgerglas aufzuschmierende und dort zu fixierende Anzahl von Zellen für jede Probe verdauter Bakterien betrug 5,0 × 10⁴ bis 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung, während die Anzahl der U937 Zellen 5,0 × 10⁴ bis 1,0 × 10⁵ Zellen/Vertiefung betrug.
[2] Phagozytoserate
Die auf das Objektträgerglas aufgeschmierte und dort fixierte Probe verdauter Bakterien wurde mit einer Färbelösung mit Acridinorange angefärbt, und etwa 200 Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (× 1.000) wahllos ausgezählt. Unter den gemessenen Zellen wurden Zellen, die in ihrem Inneren phagozytierte Bakterien enthielten (Zellen, bei denen irgendeine für Phagozytose charakteristische Änderung der Morphologie festgestellt wurde, wie in 6 durch Pfeile angezeigt) als positive Zellen bestimmt, und die Phagozytoserate (%) wurde nach der unten angegebenen mathematischen Formel errechnet. Phagozytoserate (%) = [(Anzahl positiver Zellen/Anzahl gemessener Zellen) × 100]
Die so berechnete Phagozytoserate (%) jeder Probe verdauter Bakterien betrug 10 % oder mehr.
[3] Prüfverfahren
Die in Beispiel 17 (2) [1] und [2] hergestellte verdaute Probe wurde als Probe verwendet. Die verwendete verdaute Probe von SA wies eine Phagozytoserate von 23 % bei 1,98 × 10⁵ Zellen/Vertiefung auf. Die verdaute Probe von SE wies eine Phagozytoserate von 27 % bei 1,74 × 10⁵ Zellen/Vertiefung auf. Weiterhin wies die verdaute Probe von EF eine Phagozytoserate von 34 % bei 6,40 × 10⁴ Zellen/Vertiefung auf.
An dem Objektträger, auf den die jeweilige verdaute Probe geschmiert war, wurde die enzymatische Vorbehandlung gemäß dem in Beispiel 3 beschrieben Verfahren durchgeführt. Nachdem die enzymatische Vorbehandlung beendet war, wurde der Objektträger als Nächstes in einen feuchten Behälter gelegt, und eine Reaktion wurde ermöglicht, indem man 1 ml der jeweiligen Enzymlösung, die zubereitet wurde, um den jeweiligen Titer zu ergeben, auf die beschmierte Stelle der Probe tropfte. Danach wurde der Objektträger jeweils 10 Minuten lang in PBS, der 0,2 mol/l Salzsäure enthielt, und in 70 %iges Ethanol eingetaucht und an der Luft getrocknet. Nachdem man diesen Objektträger 3 Minuten lang in PBS eingetaucht hatte, das 70 mmol/l Natriumhydroxid enthielt, und 10 Minuten lang in 70 %iges Ethanol, wurde er mit eine 1% Acridinorange enthaltenden Färbelösung angefärbt und an der Luft getrocknet. Dann wurde die Auswertung mit einem Fluoreszenzmikroskop (× 1.000) durchgeführt. Für Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis wurde die Ermittlung des optimalen Titers mit Lysostaphin durchgeführt. Um den optimalen Titer zu ermitteln, wenn N-Acetylmuramidase und Lysozym für Enterococcus faecalis in Kombination benutzt werden, wurde die Ermittlung des optimalem Titers von Lysozym an Fällen durchgeführt, bei denen der Titer von N-Acetylmuramidase bei 100 Einheiten/ml festgehalten wurde, und des optimalen Titers von N-Acetylmuramidase an Fällen, bei denen der Titer von Lysozym bei 10.000 Einheiten/ml festgehalten wurde. Die Ermittlung wurde als „adäquat" beurteilt, wenn durch die Enzymbehandlung keine Bakterienzellen in den Leukozyten identifiziert wurden.
[4] Ergebnisse
Wie in Tabelle 4 beschrieben, wurden für die Lyse von Staphylococcus aureus ausreichende Effekte bei einem Titer von Lysostaphin von 1 Einheit/ml erzielt, jedoch war für die Lyse von Staphylococcus epidermidis ein Titer von Lysostaphin von 10 Einheiten/ml oder mehr erforderlich. Daher wurde der optimale Titer von Lysostaphin auf 10 Einheiten/ml bis 100 Einheiten/ml festgesetzt. Außerdem trat bei der Lyse von Enterococcus faecalis bei einem Titer von N-Acetylmuramidase von 10 Einheiten/ml oder weniger keine Lyse auf, wenn der Titer von Lysozym bei 10.000 Einheiten/ml festgehalten wurde. Was Lysozym angeht, so trat, wenn der Titer von N-Acetylmuramidase bei 100 Einheiten/ml festgehalten wurde, bei einem Titer von Lysozym von 1.000 Einheiten/ml oder weniger keine Lyse auf, wie in Tabelle 5 dargestellt ist. Daher wurde der optimale Titer von N-Acetylmuramidase auf 100 Einheiten/ml bis 1.000 Einheiten/ml festgesetzt, während der optimale Titer von Lysozym auf 10.000 Einhei ten/ml bis 100.000 Einheiten/ml festgesetzt wurde. Die Resultate sind in 7 gezeigt. In der Abbildung bildlich dargestellt sind Zustände von: (a) die verdaute Probe von Staphylococcus aureus vor der Enzymbehandlung, (b) die verdaute Probe von Enterococcus faecalis vor der Enzymbehandlung, (c) die Probe (a) nach der Enzymbehandlung, und (d) die Probe (b) nach der Enzymbehandlung.
TABELLE 4 Optimaler Titer für die Enzymbehandlung von S. aureus, S. epidermidis mit Lysostaphin
TABELLE 5 Optimaler Titer für die Enzymbehandlung von E. faecalis mit N-Acetylmuramidase und Lysozym
Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde der optimale Titer für jedes der Enzyme wie oben beschrieben bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt.
BEISPIEL 18
Ermittlung der optimalen Bedingungen für die Enzymbehandlung (Temperatur)
Mit einem Objektträger, auf den die jeweilige verdaute Probe geschmiert war, wurde die Prüfung entsprechend dem in Beispiel 17 (2) [3] beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Zeitdauer der Enzymbehandlung in diesem Test betrug 30 Minuten, und die Temperaturen für die Untersuchung waren 4°C, 25°C, 37°C, 42°C und 60°C. Außerdem betrug der Titer des jeweiligen Enzyms für N-Acetylmuramidase (100 Einheiten/ml, hergestellt durch Seikagaku Corporation), für Lysozym (10.000 Einheiten/ml, hergestellt durch Seikagaku Corporation), für Lysostaphin (10 Einheiten/ml, hergestellt von SIGMA).
Die Untersuchung wurde entsprechend dem in Beispiel 17 (2) [3] beschriebenen Verfahren durchgeführt. In der Folge wurden für Staphylococcus aureus im Temperaturbereich von 4°C bis 60°C in den Leukozyten keine Bakterienzellen gefunden. Für Staphylococcus epidermidis wurden, obgleich bei Temperaturen von 4°C und von 25°C Bakterienzellen in den Leukozyten verblieben, keine Bakterienzellen bei 37°C oder mehr gefunden. Weiterhin wurden für Enterococcus faecalis, obgleich bei Behandlungstemperaturen von 4°C, 25°C und 60°C Bakterienzellen verblieben, keine Bakterienzellen bei 37°C und 42°C gefunden. Daher wurde die optimale Temperatur für die Enzymbehandlung auf 37°C bis 42°C festgesetzt. Die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt.
TABELLE 6 Optimale Temperatur für die Behandlung mit Enzymreagens
Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde die optimale Temperatur für die Enzymbehandlung bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt.
BEISPIEL 19
Untersuchung der optimalen Bedingungen für die Enzymbehandlung (Zeitdauer)
Entsprechend dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellte verdaute Proben wurden als Proben verwendet. Die Zeitdauer der Untersuchung betrug 0 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten. Die Phagozytoserate der verwendeten verdauten Probe von SA betrug 18 % bei 7,80 × 10⁴ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verwendeten verdauten Probe von SE betrug 34 % bei 1,10 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Weiterhin betrug die Phagozytoserate vier verdauten Probe von EF 28 % bei 1,30 × 10⁵ Zellen/Vertiefung.
Mit einem Objektträger, auf den die jeweilige verdaute Probe geschmiert war, wurde die Prüfung entsprechend dem in Beispiel 17 (2) [3] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Temperatur bei der Enzymbehandlung in diesem Test betrug 37°C, und der Titer des jeweiligen Enzyms betrug 100 Einheiten/ml für N-Acetylmuramidase, 10.000 Einheiten/ml für Lysozym, 10 Einheiten/ml für Lysostaphin. Die Untersuchung wurde entsprechend dem in Beispiel 17 (2) [3] beschrieben Verfahren durchgeführt. Als Resultat wurde für alle Proben von verdautem Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und Enterococcus faecalis in den Leukozyten keine Bakterienzellen gefunden, wenn die Zeitdauer der Enzymbehandlung 20 Minuten oder länger betrug (inadäquat bei 0 Minuten und 10 Minuten). Folglich beträgt die optimale Zeitdauer der Enzymbehandlung mindestens 15 Minuten oder länger, vorzugsweise 20 Minuten oder länger und besonders bevorzugt 30 Minuten bis 60 Minuten. Die Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt.
TABELLE 7 Optimale Zeitdauer der Behandlung mit Enzymreagens
Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde die optimale Zeitdauer der Enzymbehandlung bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt.
BEISPIEL 20
Untersuchung der optimalen Bedingungen für die Enzymbehandlung (Zeitdauer)
Bei der in situ Hybridisierungreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration der Sonde ein wichtiger Faktor, der die Hybridisierungsgeschwindigkeit beeinflusst. Wenn die Konzentration der Sonde zu niedrig ist, kann die Reaktionsgeschwindigkeit verringert sein, was möglicherweise zu unklaren Signalen führt. Außerdem kann die Verwendung einer Überschussmenge der Sonde einer der Gründe für eine unspezifische Reaktion sein.
Daher wurde die optimale Konzentration in Verbindung mit verschiedenen Sondenlösungen untersucht. Als Erstes wurden die nach dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellten verdauten Proben als Proben verwendet. Die Phagozytoserate der benutzten verdauten Probe von SA betrug 24 % bei 1,48 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von SE betrug 28 % bei 2,07 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von PA betrug 11 % bei 1,59 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Außerdem betrug die Phagozytoserate der verdauten Probe von EF 24 % bei 1,72 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von EK betrug 12 % bei 1,63 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Mit einem Objektträgerglas, auf das die jeweilige verdaute Probe geschmiert war, wurde die Prüfung entsprechend dem in Beispiel 17 (2) [3] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Sonden wurden vor Gebrauch mit Digoxigenin markiert und die Konzentrationen der jeweiligen Sonde für Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia Coli wurden auf 0,06 ng/μl, 0,6 ng/μl, 1,2 ng/μl, 1,8 ng/μl, 2,4 ng/μl, 3 ng/μl eingestellt. Die auf die jeweils oben beschriebene Konzentration eingestellte Sondenlösung wurde auf dem Objektträger, auf den die verdaute Probe geschmiert war, angewendet (siehe 8) und entsprechend dem in den Beispielen 3-11 beschriebenen Verfahren untersucht.
In der Folge wurde das Signal bei niedrigerer Konzentration (0,06 ng/μl) unklar, und andererseits wurde eine Zunahme des Hintergrundes bei höherer Konzentration (2,4 ng/μl und 3 ng/μl) beobachtet. Daher wurden die Konzentrationen der Sonden für SA, SE, PA, EF und EK auf 0,6 bis 1,8 ng/μl, vorzugsweise 0,6 bis 1,2 ng/μl festgesetzt. Weiterhin werden sie, da ein inadäquates Resultat bei 0,06 ng/μl erhalten wurde, während ein adäquates Resultat bei 0,6 ng/μl erhalten wurde, vorzugsweise auf 0,1 ng/μl oder mehr festgesetzt.

Außerdem werden sie, da ein inadäquates Resultat bei 2,4 ng/μl erhalten wurde, und ein adäquates Resultat bei 1,8 ng/μl erhalten wurde, vorzugsweise auf 2,2 ng/μl oder weniger festgesetzt. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 8-12 gezeigt. TABELLE 8: Sonde für SA

Verdaute Probe	Konzentration der Sonde (ng/μl)
Verdaute Probe	0,06	0,6	1,2	1,8	2,4	3
Verdaute Probe von SA	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	+	+

TABELLE 9: Sonde für SE

Verdaute Probe	Konzentration der Sonde (ng/μl)
Verdaute Probe	0,06	0,6	1,2	1,8	2,4	3
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	+
Verdaute Probe von SE	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	+
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	+
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	+

TABELLE 10: Sonde für PA

Verdaute Probe	Konzentration der Sonde (ng/μl)
Verdaute Probe	0,06	0,6	1,2	1,8	2,4	3
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von PA	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	+
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	+

TABELLE 11: Sonde für EF

Verdaute Probe	Konzentration der Sonde (ng/μl)
Verdaute Probe	0,06	0,6	1,2	1,8	2,4	3
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	+
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von EF	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 12: Sonde für EK

Verdaute Probe	Konzentration der Sonde (ng/μl)
Verdaute Probe	0,06	0,6	1,2	1,8	2,4	3
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	+	+
Verdaute Probe von EK	–	+	+	+	+	+

Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde die oben beschriebene optimale Konzentration der jeweiligen Sonde bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt.
BEISPIEL 21
Untersuchung der Hybridisierungstemperatur
Die Reaktionstemperatur bei der Hybridisierungreaktion ist ein Parameter, der die Hybridisierungsgeschwindigkeit und die Stabilität des Hybrids beeinflusst. Weil bekannt ist, dass hohe Temperaturen bei der Hybridisierungreaktion die Morphologie der Zellen verschlechtern, wurde eine Untersuchung der optimalen Temperatur (4°C, 25°C, 37°C, 42°C, 50°C und 60°C) durchgeführt.
Als Erstes wurden die nach dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellten verdauten Proben als Proben verwendet. Die Phagozytoserate der verwendeten verdauten Probe von SA betrug 31 bei 1,38 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von SE betrug 42 bei 1,95 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von PA betrug 14 bei 1,27 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Außerdem betrug die Phagozytoserate der verdauten Probe von EF 48 bei 1,05 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von EK betrug 17 bei 1,85 × 10⁵ Zellen/Vertiefung.

An einem Objektträger, auf den die jeweilige verdaute Probe und U937 Zellen geschmiert und fixiert worden waren (siehe 9), wurde die Untersuchung entsprechend dem in den Beispielen 3-11 beschriebenen Verfahren durchgeführt. In der Folge wurde auf Grund der der verringerten Hybridisierungsgeschwindigkeit bei einer Hybridisierungtemperatur von 4°C oder weniger für keine Art von Sonde ein stabiles Signal beobachtet. Weiterhin wurden bei 60°C Änderungen in der Morphologie der Zelle festgestellt und folglich wurde kein stabiles Signal beobachtet. Außerdem konnte bei 25°C und 50°C der Nachweis besser durchgeführt werden als bei Temperaturen von 37°C und 42°C, obgleich das Signal unklar war. Folglich kann die optimale Temperatur bei der Hybridisierung 25°C bis 50°C, besonders bevorzugt 37 bis 42 °C betragen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 13-17 gezeigt. TABELLE 13: Sonde für SA

Verdaute Probe	Hybridisierungstemperatur (°C)
Verdaute Probe	4	25	37	42	50	60
Verdaute Probe von SA	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 14: Sonde für SE

Verdaute Probe	Hybridisierungstemperatur (°C)
Verdaute Probe	4	25	37	42	50	60
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	+	+	+	+	+	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 15: Sonde für PA

Verdaute Probe	Hybridisierungstemperatur (°C)
Verdaute Probe	4	25	37	42	50	60
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	+	+	+	+	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 16: Sonde für EF

Verdaute Probe	Hybridisierungstemperatur (°C)
Verdaute Probe	4	25	37	42	50	60
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	+	+	+	+	+	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 17: Sonde für EK

Verdaute Probe	Hybridisierungstemperatur (°C)
Verdaute Probe	4	25	37	42	50	60
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	+	+	+	+	–

Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde die optimale Hybridisierungstemperatur bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt
BEISPIEL 22
Untersuchung der Hybridisierungsdauer
Die nach dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellten verdauten Proben wurden als Proben verwendet, und die Untersuchung wurde für eine Zeitdauer der Hybridisierung von 10 Minuten, 60 Minuten, 90 Minuten, 120 Minuten, 180 Minuten und 900 Minuten durchgeführt. Die Phagozytoserate der verwendeten verdauten Probe von SA betrug 47 % bei 1,45 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von SE betrug 47 % bei 1,33 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von PA betrug 15 % bei 1,91 × 10⁵ Zellen/Vertiefung.
Außerdem betrug die Phagozytoserate der verdauten Probe von EF 41 % bei 1,45 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Die Phagozytoserate der verdauten Probe von EK betrug 20 % bei 1,23 × 10⁵ Zellen/Vertiefung.

An einem Objektträger, auf den die jeweilige verdaute Probe und U937 Zellen geschmiert und fixiert worden waren (siehe 9), wurde die Untersuchung entsprechend dem in den Beispielen 3-11 beschriebenen Verfahren durchgeführt. In der Folge wurde, obgleich bei einer Zeitdauer der Hybridisierung von 10 Minuten kein Signal beobachtet wurde, bei einer Zeitdauer von 60 Minuten oder mehr ein Signal beobachtet, und ein stabiles Signal wurde bei einer Zeitdauer von 90 Minuten oder mehr beobachtet. Weiterhin wurde auch bei einer Zeitdauer der Hybridisierung von 900 Minuten keine Veränderung bei dem Nachweis des Signals beobachtet. Daher ist es bevorzugt, dass die Zeitdauer mindestens 30 Minuten oder mehr beträgt, vorzugsweise 60 Minuten oder mehr, und besonders bevorzugt 90 Minuten oder mehr. Die besonders bevorzugte optimale Zeitdauer der Hybridisierung kann auf 120 Minuten bis 900 Minuten festgesetzt werden. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 18-22 gezeigt. TABELLE 18: Sonde für SA

Verdaute Probe	Hybridisierungsdauer (Minuten)
Verdaute Probe	10	60	90	120	180	900
Verdaute Probe von SA	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 19: Sonde für SE

Verdaute Probe	Hybridisierungsdauer (Minuten)
Verdaute Probe	10	60	90	120	180	900
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	+	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 20: Sonde für SE¹

Verdaute Probe	Hybridisierungsdauer (Minuten)
Verdaute Probe	10	60	90	120	180	900
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

TABELLE 21: Sonde für EF

Verdaute Probe	Hybridisierungsdauer (Minuten)
Verdaute Probe	10	60	90	120	180	900
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	+	+	+	+	+	+
Verdaute Probe von EK	–	–	–	–	–	–

¹ Anm. Übersetzung: richtig wahrscheinlich "Sonde für PA"

Verdaute Probe	Hybridisierungsdauer (Minuten)
Verdaute Probe	10	60	90	120	180	900
Verdaute Probe von SA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von SE	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von PA	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EF	–	–	–	–	–	–
Verdaute Probe von EK	–	+	+	+	+	+

Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wurde die optimale Zeitdauer der Hybridisierung bei der Identifizierung eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus in der klinischen Probe der vorliegenden Erfindung auch in gleicher Weise festgesetzt
BEISPIEL 23
Einfluss des der Hybridisierungslösung hinzugefügten Tensids
Die nach dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellten verdauten Proben wurden als Proben verwendet. Als jedes der verschiedenen Tenside (SDS, Laurylsarkosin, Saponin, BRIJ35, Tween 20, Triton X-100) der Verdünnungslösung für die Sonde hinzugefügt wurde, gefolgt von gemäß Beispiel 7 durchgeführter Hybridisierung, wurde die Nachweisempfindlichkeit durch Zugabe von 0,25 % SDS drastisch erhöht. Außerdem konnte die Nachweisempfindlichkeit durch Laurylsarkosin, BRIJ 35 oder Tween 20 verbessert werden. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 23 gezeigt. TABELLE 23

Tensid Signalnachweis

keines zugegeben +

SDS +++

Laurylsarkosin ++

Saponin +

BRIJ 35 ++

Tween 20 ++

Triton X-100 +
Außerdem wurde in der Folge der Verwendung von SDS in verschiedenen Konzentrationen gefunden, dass die bevorzugte Konzentration 1 % oder weniger betrug, besonders bevorzugt 0,1 % bis 0,5 % und noch mehr bevorzugt 0,25 %.
Die Anwendung dieser Ergebnisse, die mit den verdauten Proben erhalten wurden, auf die vorliegende Erfindung könnte ähnliche Resultate ergeben. Folglich wird auch in der vorliegenden Erfindung ein Tensid, insbesondere SDS, in dem Schritt der in situ Hybridisierung zugegeben.
BEISPIEL 24
Untersuchung der Kettenlänge der in der Hybridisierung verwendeten Sonde
Eine Sonde für Staphylococcus aureus (SA-24 (SEQUENZ ID. NR.: 1)) und eine Sonde für Pseudomonas aeruginosa (P2-2 (SEQUENZ ID. NR.: 7)) wurden mit Digoxigenin markiert.
Zuerst wurde 1 μg gereinigtes Produkt von jeder der Arten von DNA Sonden mit 5 μl 10 × L. B. (0,5 mol/l Tris-HCl (pH 7,5), 50 mmol/l Magnesiumchlorid, 5 μl 0,5 mg Rinderserumalbumin), 5 μl 100 mmol/l Dithiothreitol, jeweils 1 nmol dNTPs (A, G, C), 0,5 nmol Digoxigenin-dUTP (DIG-dUTP), jeweils 0,5 nmol dTTP, 3 μl DNAse (eine Menge, die 25 mU, 75 mU und 200 mU entspricht), 1 μl 10 U/μl DNA-Polymerase und einer angemessenen Menge sterilem gereinigtem Wasser zubereitet, um ein Gesamtvolumen von 50 μl zu ergeben. Die Markierung mit Digoxigenin wurde 2 Stunden lang bei 15°C durchgeführt. Nach dem Markieren wurde die Mischung 5 Minuten lang aufgekocht, um die Reaktion zu beenden. Die Reaktionsflüssigkeit wurde nach der Beendigung in eine Drehsäule (CENTRI-SEP COLUMUNS CS901, PRINCETON SEPARATIONS, INC.) eingespritzt und 2 Minuten lang bei 25°C (3.000 × g) zentrifugiert, um freie Nukleotide zu entfernen. Dann wurde die Konzentration des Eluats mit einem Absorptionsmessgerät gemessen. Eine Elektrophorese wurde auf einem 3% Agarosegel durchgeführt, um die Länge zu bestätigen.
Dann wurde die DNA im Agarosegel durch das Southern Blot Verfahren auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Dann wurde die Membran 30 Minuten lang in 2 %iges Blockierungsreagens (hergestellt von Roche) eingetaucht, und danach wurde mit alkalischer Phosphatase markierter anti-Digoxigenin-Antikörper in einer Menge von 1/5.000 zugegeben und man ließ 30 Minuten lang eintauchen. Anschließend wurde die Membran zweimal gewaschen, indem man in 100 mmol/l Tris-HCl (pH 7,5) und in 150 mmol/l Natriumchlorid 10 Minuten lang schüttelte. Danach wurde gewaschen, indem man in 100 mmol/l Tris-HCl (pH 9,5) und in 150 mmol/l Natriumchlorid 10 Minuten lang schüttelte. Dann wurde durch Eintauchen in eine NBT/BCIP Lösung eine Farbentwicklung durchgeführt.
Schließlich wurde die Membran in gereinigtes Wasser eingetaucht, um die Farbentwicklung zu stoppen, und getrocknet. In der Folge wurde, wie in 10 jeweils für (a) die Verwendung der Sonde für SA und (b) die Verwendung der Sonde für PA gezeigt ist, gefunden, dass, in den Fällen, in denen die Spaltung unter Verwendung von 25 mU DNAse (in der Abbildung Band 1) durchgeführt wurde, so dass die Kettenlänge eine Verteilung von Basenlängen von vorwiegend etwa 350 bis etwa 600 aufweist, hohe Markierungseffizienz erzielt wurde. Wenn die so erhaltene Sonde für den Nachweis in dem Verfahren für den Nachweis eines eine ansteckende Krankheit verursachenden Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, in dem eine verdaute Probe oder eine klinische Probe von einem Patienten, der unter einer ansteckenden Krankheit leidet, verwendet wurden, um die Hybridisierung durchzuführen, konnte mit ausgezeichneter Empfindlichkeit ein Signal ermittelt werden. Folglich wurde entdeckt, dass die Kettenlänge der Sonde, die in der Hybridisierung benutzt wird, eine Länge von etwa 350 bis etwa 600 Basen sein kann, und vorzugsweise eine Länge von etwa 350 bis etwa 550 Basen.
BEISPIEL 25
Untersuchung der in der Hybridisierung benutzten Sonde
Verdaute Proben von Escherichia Coli die entsprechend dem in Beispiel 17 (1) [1] und [2] beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wurden als Proben verwendet, um die Sonden für den Nachweis zu untersuchen.
Sonden für den Nachweis wurden wie in Beispiel 24 beschrieben durch Markieren mit Digoxigenin hergestellt aus EC-24 (SEQUENZ ID. NR.: 11), EC-34 (SEQUENZ ID. NR.: 12) und EC-39 (SEQUENZ ID. NR.: 13), so dass sie eine Länge von etwa 350 bis etwa 600 Basen aufwiesen, und wurden jeweils allein oder in einer Kombination dieser drei verwendet. Aus den so erhaltenen Ergebnissen wurde deutlich, dass das Signal deutlicher nachgewiesen werden konnte mit dem Ergebnis einer erhöhten Empfindlichkeit für (d) die Mischung der Sonden MIX, die hergestellt wurde durch Vermischen der drei Sonden ((a) EC-24, (b) EC-34 und (c) EC-39), als bei Verwendung jeder der Sonden (a) EC-24, (b) EC-34, oder (c) EC-39 alleine, wie in 11 gezeigt.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Da die in situ Hybridisierung gemäß dem vorliegenden Verfahren innerhalb von zwei Stunden oder weniger stabile Signale liefern kann, können die Ergebnisse des Nachweises sehr schnell erhalten werden. Es ist offensichtlich, dass ein solch schneller Nachweis den Wert des vorliegenden Verfahrens für die schnelle Diagnose von Sepsis zeigt.
SEQUENZLISTEN

Claims

Ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Identifizieren infektiöse Krankheiten verursachender Mikroorganismen, umfassend die Schritte: (a) Entnahme von Phagozyten aus einer klinischen Probe, die aktive Phagozyten enthält; (b) Befestigung der so entnommenen Phagozyten auf einer Unterlage; (c) Behandlung der Phagozyten, um die Durchlässigkeit von deren Zellmembranen zu erhöhen; (d) weitere Behandlung der Phagozyten mit einem lytischen Enzym und einem Proteaseinhibitor, um DNA in den Erreger-Mikroorganismen freizulegen, die in den Phagozyten vorhanden sein können; (e) in situ Hybridisierung der so freigelegten DNA mit einer oder mehreren markierten DNA-Sonde(n), die mit der so freigelegten DNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren können, wobei in dem Schritt der in situ Hybridisierung Tensid eingesetzt wird; und (f) Nachweisen und/oder Identifizieren der Erreger-Mikroorganismen auf der Basis der so detektierten Hybridisierungssignale.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem besagtes lytisches Enzym in Schritt (d) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lysostaphin in dem Titer von 1 Einheit/ml bis 1.000 Einheiten/ml, Lysozym in dem Titer von 1.000 Einheiten/ml bis 1.000.000 Einheiten/ml, N-Acetylmuramidase in dem Titer von 10 Einheiten/ml bis 10.000 Einheiten/ml, und Zymolyase in dem Titer von 50 Einheiten/ml bis 500 Einheiten/ml.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das lytische Enzym in Schritt (d) ausgewählt ist aus Lysostaphin in dem Titer von 10-100 Einheiten/ml, Lysozym in dem Titer von 10.000-100.000 Einheiten/ml, N-Acetylmuramidase in dem Titer von 100-1.000 Einheiten/ml und Zymolyase in dem Titer von 100-500 Einheiten/ml.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem in Schritt (d) die Phagozyten bei 26°C-59°C für 15-20 Minuten behandelt werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Proteaseinhibitor in Schritt (d) Phenylmethylsulfonylfluorid ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die Konzentration von besagtem Phenylmethylsulfonylfluorid 10 μmol/l bis etwa 10 mmol/l beträgt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6, bei dem besagtes Phenylmethylsulfonylfluorid in Dimethylsulfoxid gelöst ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem die Konzentration des Dimethylsulfoxids in der in Schritt (d) einzusetzenden Lösung auf weniger als 5 % vol/vol eingestellt wird.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem besagtes Tensid ein anionisches Tensid ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem besagtes anionisches Tensid Natriumdodecylsulfat ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Hybridisierungsreaktion in besagtem in situ Hybridisierungsschritt (e) bei 25°C-50°C für 30-900 Minuten durchgeführt wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Verfahren, besagtem Befestigungsschritt (b) vorausgehend, einen Schritt umfasst, in dem die so entnommenen Phagozyten auf eine feste Unterlage aufgebracht werden, wobei die feste Unterlage ein mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichteter Objektträger ist.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem das Verfahren in besagtem Signal-Nachweisschritt (f) ein Pigment verwendet, um den Kontrast zwischen Signalen und Zellen hervorzuheben bzw. zu verstärken.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die besagte klinische Probe Blut ist.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Zelldichte (x Zellen/ml) besagter zu befestigender Phagozyten 5 × 10⁶ Zellen/ml < x Zellen/ml < 1 × 10⁸ Zellen/ml ist.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Kettenlänge besagter DNA-Sonde(n) von 350 bis 600 Basen beträgt.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration besagter DNA-Sonde von 0,1 ng/μl bis 2,2 ng/μl beträgt.
Verwendung eines Verfahrens, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 17 beansprucht ist, in einem Verfahren zur Diagnose von Sepsis oder Bakteriämie.