JP2002505578A - 生存細胞を数える方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、細胞を生存度マーカーの遮断剤および生存度マーカーに同時または順次に接触させることで構成される、サンプル中の生存細胞を検出しかつ計数する方法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
生存細胞を数える方法
本発明は、生存標識で標識化する工程と、遮断剤で対比標識化する工程とを含
む、生存細胞、特に微生物を検出および/または計数する方法、標識および遮断
組成物、ならびに該方法を実施するためのキットに関する。
本発明は、それが細胞形態であると、胞子形成形態であるとを問わず、生細胞
を除く死細胞もしくは粒子を特異的に標識化することができる1種類以上の遮断
剤を含有する、死細胞を包含する他の粒子との生細胞の特異的計数を可能にする
組成物にも関する。
サンプル中の生存細胞の検出および/または計数は、ビール、ワイン、乳製品
等々のような発酵産物の製造用接種物の質を確保すること、および食品、健康管
理品または医薬品の無菌性を、使用もしくは上市前に制御することの双方のため
に関心が持たれている。
生存細胞という用語は、単細胞形態でのいかなる生物学的材料、すなわち、よ
り一般的には、生物学的系において自己増殖または増殖できる、遺伝情報を有す
るいかなる材料も意味すると理解される。これは、胞子形成形態を包含する、す
べての真核または原核細胞を包含し;例示すると、細菌、真菌および酵母が列挙
されることになる。
細胞の生存度を決定するには、様々な方法が利用可能であって、それらは、ペ
トリ皿で経時的に増加する個体数を数える慣用の方法を包含する。この手法によ
る微生物の計数は、実施するには遅いことが多く、結果は、培養の2〜7日後、
甚だしくは14日後にやっと観察され、この遅延は、腐りやすい食料品の市販と
は両立せず、また接種した皿の数が統計的計数に充分でないならば、著しい誤差
に悩まされることも多い。最後に、これらの手法は、ペトリ皿もしくは培養体中
で増殖する能力が限定的または皆無である、生きている微生物を検出かつ計数す
るためには機能しない。
慣用的な方法の長期の応答遅延を克服するために、直接的な計数手法が開発さ
れている。これは、特に、蛍光性標識および特にアクリジンオレンジを用いて計
数するDEFT手法(直接エピ蛍光手法)を包含し;この手法の使用、およびそ
の制約は、KennerおよびPrattが刊行した最近の総説〔Microbiological Review
(1994)58603-6150〕に記載されている。しかし、これらの手法は、大量の非特
異的吸着を生じ、それが、特に流動細胞計測装置のような装置系を用いてこの計
数を自動化したとき、偽陽性を数えることによって、経時的に増加する集団の計
数の過大評価へと導くという欠点を有する。
この取組み方の一つの変化形は、細胞性酵素による形質転換後に蛍光シグナル
を与えることができる、標識を用いることで構成される。蛍光シグナルの発光は
、酵素活性の存在の結果であり、生存細胞の存在を明らかにする。この手法は、
偽陽性の数を最小化すること、前駆体の酵素的転換によって、生細胞と死細胞と
を区別することができること、および膜の完全性を維持することによって、標識
の細胞内蓄積を促進することなどの利点を有する。それでもなお、この細胞内酵
素的転換には、水性培地中のいかなるエステルでもそうであるとおり、標識化緩
衝液による非特異的加水分解が付随する。たとえ最小であっても、この加水分解
は、それでも少量の非特異的標識化を生じることがあり、これらの標識を無菌性
の試験に用いる際には、決定的に重要となり得る。
細菌の生きている菌株を蛍光原性エステル、例えば二酢酸フルオレセイン(F
DA)または二酢酸カルボキシフルオレセイン(CFDA)で標識化する方法は
、特に、J.-P.Diaper et al.in Journal of Applied Bacteriology-(1994)
−77:221-228 and by J.Porter et al.Journal of Applied Bacteriology,(
1995)-79:399-408に記載している。
蛍光原性エステルという用語は、酵素の作用後に、光によって励起されたとき
に蛍光性である分子を生じる、いかなる非蛍光性分子も意味すると理解される。
一般に、蛍光標識化は、直接または細胞酵素による活性化によってであるかを
問わず、細胞培養の場合より比較にならないほど、優れた結果が得られる速度と
いう利点を有するが、限界シグナルのために、定量的な面で、より信頼性に欠け
るという短所を有する。この限界は、偽陽性または偽陰性の存在を生じ得る。そ
の理由は、この種の手法では、生細胞数の不正確な推計のいくつかの原因が存在
するためである:
a)微生物が胞子形成形態を示したときは、いかなる化合物、特に蛍光標識も
胞子に進入することが、不可能ではないにしても困難であり、これが、生微生物
数が過小評価されることへと導く。
b)懸濁液中の粒子、または死細胞の偽標識化が、特に蛍光標識化を直接達成
する場合に、偽陽性の計数を生じ得る。
c)生存細胞の特徴的酵素による蛍光原性前駆体の変換後に、能動的な機構に
よって流出が生じることがあり、この流出が、細胞内標識化を明らかに低下させ
、こうして、方法の感度の問題を提起する。
本発明は、フルオレセインエステルによる直接標識化のすべての短所を克服す
ることを対象とするが、想起すべきことに、この短所は、基本的には3種類のも
のである:
−エステル加水分解産物の能動的流出、
−過大評価へと導く、懸濁液中の粒子または死細胞の標識化による偽陽性の形成
、および
−生存細胞の過小評価へと導く、細菌、酵母または真菌の胞子を検出するのが不
可能であること。
そのため、本発明は、サンプル中の生細胞、粒子および死細胞の数を検出し、
かつ選択的に測定することによって、全菌叢中の生存細胞を検出かつ計数する方
法に関する。
より特に、本発明は、サンプル中の生存細胞を検出および/または計数する方
法であって、少なくとも:
a)生存度標識を対比染色または遮断する薬剤を含有する組成物に、標本を接
触させる工程、
b)生存度緩衝液中の1種類以上の生存度標識に、標本を接触させる工程、お
よび
c)該生存度標識の認識によって、全菌叢中の生存細胞を検出かつ計数する工
程
を含む、一連の工程を特徴とする。
本発明の方法では、工程a)は、工程b)の前か、またはそれと同時である。
本発明の方法は、膨潤性培地に細胞を接触させる、工程b)の前か、またはそ
れと同時である追加の工程を含むのが好都合である。同時であるならば、該膨潤
培地および生存度標識緩衝液は、1種類および同一培地からなるのみでよい。
この工程の目的は、胞子形態で存在する生存細胞への蛍光原性標識の組込みお
よび転換を可能にすることである。膨潤培地は、胞子を発芽させ得る培養液であ
り、結果的に、アミノ酸、ペプチド、糖類等々のような発芽誘導体を含有するこ
とになる。例えば、より特に細菌胞子の発芽を誘導するようなSCT(ダイズカ
ゼイントリプトン)、またはより特に糸状菌胞子の発芽に適するような麦芽抽出
物を挙げ得る。生存菌叢全体を測定することが望ましいときは、したがって、好
都合な膨潤培地は、SCTおよび麦芽抽出物の混合物を含有する。
本発明の方法では、調べる標本は、本来は、液体形態であって、濾過できるか
、またはいかなる固体上、もしくはいかなる気体中にも存在する粒子の懸濁から
生じてよく;細胞は、液体サンプル中で直接に、または該液体サンプルを濾過し
た後に、検出かつ計数してよい。
フィルターは、明らかに、細孔径が、検出および/または測定しようと望む生
存細胞のすべてを保持するのに充分に、小さくなるように選ぶ。
そうして、該フィルター上で、工程a)およびb)を実施し、ChemScan(登録
商標)型の走査細胞測定装置の利用によって、工程c)を適用し、一方では、生
存細胞の特異的蛍光の検出および計数を達成し、他方では、適切な場合に、それ
らの蛍光発光波長に基づく不活性粒子や死細胞の蛍光の検出を達成する。
液体サンプルを予め濾過する、本発明の実施態様の利点は、検出しようと望む
成分の濃度を顕著に高めることである。加えて、様々な工程は、細胞を固体の担
体上に蓄積したとき、実施するのが容易である。
本発明による方法では、濾過段階の後に、洗浄段階を実施してよい。
サンプルを濾過した後、減圧を解除し、下記のような遮断剤の組成物を、細胞
を含有するはずであるサンプルを担持するフィルター越しに通すか、または液体
培地での分析の場合は、サンプルに直接加える。
遮断剤または対比染色剤という用語は、分析しようとするサンプル中に存在す
る、不活性粒子または死細胞上の単数もしくは複数の生存度標識の結合部位と作
用し合い、かつ該粒子または該死細胞上の単数もしくは複数の生存度標識の非特
異的結合を防止することができる、いかなる分子または分子混合物をも意味する
と理解される。
遮断剤または対比染色剤は、不活性粒子または死細胞と特異的に作用し合い、
かつ生存度標識もしくはその誘導体によるいかなる偽の蛍光発光も、
−エネルギー移動による偽の光の吸収、
−非特異的結合の部位での競合、または
−双方の現象の同時発生、もしくは遮断剤の連動
のいずれかによって打ち消すという特徴を有することができる、いかなる分子も
しくは分子混合物からなってもよい。
好都合には、遮断剤は、類似の構造的特徴を有するが、発光しないか、または
生存度標識のそれとは異なる波長で発光する一範囲の蛍光標識から、かつ好都合
には、用いる生存度標識の発光波長と等しい蛍光吸収波長を有する標識中から選
ぶことになる。
工程b)で用いる生存度標識は、好都合には、蛍光標識、例えばフルオレセイ
ンエステル類、カルボキシフルオレセイン、BCEF、二酢酸5,6−カルボキ
シフルオレセイン(CFDA)もしくは二酢酸フルオレセイン、またはそれらの
混合物である。これらの生存度標識は、それぞれ、標的特異性を有し、適切な標
識化緩衝液の条件を必要とする。例示すると、CFDAは、より特に細菌を標識
化するのに適するのに対し、FDAは、中性のpH条件下で真菌または酵母に蓄積
できる、より優れた能力を有する。したがって、これら2種類の蛍光エステルの
混合物は、一生物学的サンプル中に同時に存在する幅広い範囲の微生物を検出か
つ計数することを可能にすることになる。
一般的には、生存度標識は、キサンテン類、アクリジン類、フルオロン類およ
びアミノアジド類が形成する群から選ぶ。
ここで注目すべきことに、本発明の方法は、ともに微生物および動物細胞の同
定のために、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)を蛍光標識として、
特異的なリガンド(モノもしくはポリクローナル抗体および/または核酸プロー
ブ)と組み合せて用いるときに用いてもよい。この場合、発光される蛍光の非特
異的吸収が、しばしば観察される。リガンドによる標識化の前またはそれと同時
に、遮断剤組成物を用いることは、この人為的結果を防止するのを可能にし得る
。
本発明は、不活性粒子または非生存細胞との第一の蛍光化合物の結合を防止で
きる遮断剤組成物であって、
a)第一生存度標識の蛍光発光波長に実質的に等しい蛍光吸収波長を有する、
エリトロシンB、エチルエオシン、メチルエオシン、エオシンBもしくはY、フ
ロキシンB、またはそれらの混合物のようなフルオロン類がより特に選ばれる、
1種類以上の第二の蛍光化合物と;
b)偽標識化の原因である、標識の加水分解の結果として生じる生成物と競合
しやすい1種類以上の化合物と;
c)a)およびb)の混合物と
を含むことを特徴とする遮断剤組成物にも関する。
本発明は、高いイオン強度の緩衝液中の生存度標識の1種類以上の混合物から
なる標識化組成物にも関する。
本発明は、サンプル中の、死細胞を除く、胞子形成形態を包含する生存細胞の
経時的に増加する個体数を検出および/または計数する方法の用途にも関し;同
様に、本発明は、該死細胞を特定して数えることも可能にする。
最後に、本発明は、全菌叢中の生存細胞を検出かつ計数することを可能にする
キットであって、少なくとも:
−上記の生存度標識または生存度標識組成物による偽標識化を遮断する薬剤;
−上記の1種類以上の生存度標識を含有する組成物;
−生存度緩衝液;
−適切な場合には、膨潤培地および;
−様々な組成物および緩衝液の、使用の時点で調製される希釈の実験手順;
を含むキットに関する。
発明の詳細な説明
本発明の方法において、遮断剤は、特異的な標識化によって、一方では生細胞
を、他方では粒子および死細胞を識別することを可能にする。標識剤が、フルオ
レセイン誘導体であり、515nmの発光波長を有するとき、遮断剤は、好ましく
は、同じ範囲に吸収波長を有するキサンテン族のハロゲン誘導体、またはそれ
らの誘導体であると思われる。
この場合、遮断剤は、好ましくは、少なくとも1個のハロゲン原子、例えば塩
素、臭素、フッ素および/またはヨウ素で置換されたフルオロンが形成する群か
ら選ばれ;置換フルオロン類のうちでは、例えば、エオシンB、エオシンY、フ
ロキシンB、エリトロシンB、エチルエオシン、または後者の2種類以上の混合
物が列挙され得る。特に好適な方式では、遮断剤は、少なくとも3個のハロゲン
原子、好ましくは4個のハロゲン原予、特に4個のヨウ素原子または4個の臭素
原子で置換されたフルオロン類、特にエオシンY、フロキシンB、エリトロシン
、エチルエオシン、または後者のうち2種類以上の混合物が形成する群から選ぶ
。優れた結果は、エリトロシンB、エチルエオシン、またはそれらの混合物が形
成する群から遮断剤を選んだときに得られている。
標識間の類似性は、試験する染色剤の大部分が、望みの研究に不充分であると
判明する限りは、重要であり;特に、青い染色剤、例えばエバンスブルー、トリ
パンブルーまたはメチレンブルーは、不充分である。
下記の表1は、その特性および効果について試験した、主な染色剤を要約して
いる。 活性を有する遮断剤は、単独または組み合せて用いてよい。組合せを用いるこ
との利点は、これらの遮断剤の作用範囲を増大させることである。
例示すると、フルオレセインのブロモ誘導体であるエチルエオシン、フロキシ
ンBおよびエオシンYは、好ましくは、死んだ微生物を標識化するが、フルオレ
セインのヨード誘導体であるエリトロシンは、好ましくは、分析しようとする培
地中の不活性粒子を標識化する。そのため、エチルエオシンとエリトロシンとの
混合物は、いかなるサンプル中の、生存微生物ではない粒子や細胞のセットの標
識化についても特に優れた性能を有する。
本発明は、より特にエリトロシンB、エチルエオシン、メチルエオシン、エオ
シンBおよびY、フロキシンB、またはこれらの混合物が形成する群から選ばれ
るフルオロン類を、10/1〜1/10にわたる重量での濃度比で含む遮断剤組
成物にも関する。フルオロン類およびそれらの相対濃度の選択は、分析すること
を要する産物の種類はもとより、その培地にも依存する。例えば、水の微生物学
的分析のためには、エリトロシンおよびエチルエオシンを、5/1〜1/5、好
ましくは、例えば2/1、すなわち、それぞれ0.004%および0.002%
の最終濃度と同等な比で用いる。
該溶液は、非特異的蛍光シグナルの原因となる生存度標識の加水分解産物が、
分析されるサンプルの種類に応じて、1〜10%の重量の生存度標識を占めると
き、該加水分解産物のそれの2〜15倍である濃度の成分を含む。
本発明の方法は、調べるサンプル中に存在するいかなる種類の細胞も標識化で
きる、万能型の標識化組成物の使用を含む。細胞は、生物学的活性形態または胞
子形成形態での、原核生物、単細胞の真核生物、動物細胞であってよい。蛍光シ
グナルが望ましいときは、標識化組成物は、実験者が、使用の時点で、高いイオ
ン強度の標識化緩衝液に希釈するものである。標識化組成物は、好ましくは、5
〜10mg/mlの濃度の二酢酸5(6)カルボキシフルオレセイン(CFDA)と
、0.5〜5mg/mlの濃度の二酢酸フルオレセイン(FDA)との純アセトン(
QS)中の混合物からなる。CFDAとFDAとの重量比は、好ましくは、5/
1〜15/1であり、最適条件下では9/1、すなわち1mlについて、純アセト
ン中において9mg/ml(19.5mM)のCFDAおよび1mg/ml
(2.4mM)のFDAであることになる。
サンプル中の存在し得る望みの微生物を標識化する時点で、上記のような標識
化組成物を、そのイオン強度が0.5より大きく、水溶液中に:
−非イオン洗剤、
−キレート化剤、
−緩衝液、および
−塩
を含む標識化緩衝液で100倍に希釈する。
好適な組成物を、下記の表2に提示する:
酢酸ナトリウム緩衝液は、リン酸塩、Hepes、クエン酸塩等々の緩衝液形式の
その他の緩衝液に置き換えてよい。同様に、塩化ナトリウムは、塩化カリウム(
KCl)、(NH4)2SO4等々に置き換えてよい。
上記のような標識または標識混合物からなり、標識化緩衝液に希釈した組成物
も、本発明の一部を形成する。
問題の緩衝液の特に注目に値する効能は、その非常に高いイオン強度のために
驚異的である。この理由は、等張性が、一般的に、生存細胞の完全性を保存する
ために採用される方針であることによる。定常期にある細菌に対してフローサイ
トメトリーによって実施した試験を、図1に提示する。
図1は、検出された細胞の数に対するイオン強度の効果を表す。X軸は、蛍光
強度を示し、Y軸は、検出された細胞の数を示す。左の列は、Bacillus subtili
sによる結果を、右の列は、Serratia marcescensによる結果を表す。それらは、
イオン強度の増加が、蛍光強度の増加を伴い、生細胞での標識の増大し
た蓄積の結果として生じることを示す。
この実験は、0.8Mより大きいイオン強度が、精密な計数に望ましいことを
明確に示している。
本発明の方法では、分析しようとする培地中に存在し得る、胞子の膨潤の工程
を、SCT型、麦芽抽出物、または好都合には両者の混合物の培地の添加によっ
て実施する。
上記のような遮断剤で予め処理したサンプルは、液体培地中で数える場合は、
分析しようとするサンプルを膨潤培地中に希釈または再懸濁させるか、あるいは
分析しようとするサンプルをろ取した膜を、膨潤培地で飽和した吸着性担体に積
み換えるかのいずれかによって、膨潤培地に接触させる。次いで、サンプルを、
望みの適用に応じて、30または37℃で40分〜3時間培養するが;37℃で
の短い40分の培養は、細菌胞子の検出を可能にすることになるのに対し、より
長い(30℃で3時間)培養は、糸状菌胞子の検出も可能にすることになる。
しかしながら、同じ結果を得るために、温度を下げ、培養の持続時間を延長し
てもよい。
微生物の検出のためには、サンプルを、膨潤工程のそれと同様に、上記のよう
な標識化溶液の存在下に置き、30℃プラスマイナス3℃で30分間培養する。
本発明の方法では、単数もしくは複数の遮断剤は、単数もしくは複数の生存度
標識との濃度比が5/1〜15/1であって、染色剤と対比染色剤との間に用い
られる、1/10前後である通常の比の逆であるという特別な特徴を有する。フ
ルオレセイン誘導体についての最適比は、約10/1であると思われる。
遮断剤によるサンプルの処理は、常に、生存度標識を含有する組成物による処
理の前にか、または非常に近くにはそれと同時に実施することになる。
本発明の変化形では、親水性担体は、膨潤工程または標識化工程のいずれかで
、濾過された微生物を有するフィルターに、膨潤緩衝液または標識化緩衝液を直
接蓄積することによって省いてもよい。
最後に、本発明の方法は、生存度標識が発光するシグナルを測定するのに適し
たいかなる手段にもよる、分析の工程を含む。しかし、分析を、標識化組成物と
の培養の直後に実施しないならば、サンプルは、8±4℃に置き、かつ、しかし
30分の持続時間を超えずに、光から遮蔽しなければならない。
本発明による検出および/または計数の方法は、特に、ヨーロッパ特許第0,33
3,561号公報、および国際公開特許第WO89/08714号公報に記載され、ChemScan(
登録商標)およびChemFlow(登録商標)の商品名のもとに販売される、機械の中
で実施してよい。
本発明は、生細胞の存在を調べるいかなる用途において、本発明の方法を実施
すること、およびそのキットを用いることにも関する。
本発明による方法およびキットは、特に、健康管理、食品もしくは医薬の製品
中に存在し得る微生物を検出および/または計数するために用いてよい。
本発明の方法およびキットは、農産食品、製薬または滋養の用途を問わず、か
つ製造工程の工程、または完成品いずれにおいても、滅菌のような工業的工程を
制御するために用いてよい。同様に、該方法およびキットは、滅菌濾過の前後の
細菌負荷(生物負担)を制御するのに用いてよい。
最後に、本発明の方法およびキットは、標準的方法によっては検出されない生
存微生物を明らかにするのに用いてよい。これらは、例えば:
−特に、微生物の細胞分裂に干渉し、そのためにペトリ皿型の標準的方法では検
出されないものに対する、抗生物質の薬効を制御すること;
−病院の環境での院内感染を生じやすい汚染を探索すること:
−例えば医薬製品の、製造途上での発熱原性の試験と、サンプル中の微生物の存
在との間のあり得る関連性を確定すること;
−尿中のリンパ球を検出すること
を含む。
当業者は、必要に応じて、望みの用途に該方法を実施することができると思わ
れる。
全く同一のサンプルに対して、標識化し、生存細胞と実質的に同一の大きさの
、懸濁液中の死細胞または粒子であり得る粒子から、生存細胞を識別する手段を
提供する発明が初めて用意されたのであって、これは:
−膨潤培地および胞子の標識化の存在よる偽陰性の排除、
−遮断剤組成物による偽陽性の排除、
−より格別には微生物に対する、高いイオン強度の標識化緩衝液の使用による感
度の上昇
によって付与される信頼性を伴って達成される。
上に詳述した進展および利点に加え、本発明は、下記に示す実施例から明らか
になる、その他の利点および特徴を有するが、該実施例は、例示のために与えら
れ、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1:サンプルのいかなる濾過も不在下での本方法の実施:
第一段階では、本方法の実施は、生存度標識による処理に先立つ遮断剤による
前処理を実施することからなる。この実験の目的は、生存度標識と濾過膜との非
特異的相互作用から生じる偽陽性を排除する際の、この処理の効力を示すことで
ある。
本発明者らは、エリトロシおよびエチルエオシンを2の重量比で含有する、C
SE(対比染色剤E)と称する対比染色剤組成物を用いたが、これは、下記の組
成を有した:Hepesに希釈した0.004%のエリトロシンB、およびやはりHep
esに希釈した0.002%エチルエオシン。
下記の表3は、CSEによる事前の処理を伴ってか、または伴わずに得られた
、ChemScanで測定した蛍光を比較した。
用いた手順は下記のとおりであった:
a)濾過担体の調製:
濾過担体は、70%(容量/容量)エタノール1mlで3回、次いで濾過した
水(0.22μmのフィルター越しに濾過した)1mlで3回連続的に洗浄した。
用いた濾過担体は、ポリエステル膜であり、そうしてこれを濡れた濾過担体上に
置いた。
b)CSE対比染色剤の濾過:
次いで、濡れた濾過担体の上に定置したポリエステル膜越しに、CSE1mlの
量でCSEを濾過した。
c)生存度標識による標識化:
生存度標識は、純粋な無水アセトン中に9mg/ml(19.5mM)の二酢酸カル
ボキシフルオレセイン(CFDA)、および1mg/ml(2.4mM)の二酢酸フルオ
レセインを含んだ。使用の時点で、生存度溶液を調製し、次いで緩衝液で100
倍に希釈したが、その組成は下記のとおりであった:
−0.03%(容量/容量)のトゥイーン20(ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウラート)、
−50mMのリン酸ナトリウム三水和物、pH7、
−超純水中の1.13mMの塩化ナトリウム。
c1)
−膨潤培地20mlを無菌注射筒に吸引した、
−膨潤培地20mlを無菌フラスコ中に前濾過した、
−この溶液を室温に保った。
c2)ペトリ皿にセルロースまたはポリプロピレンの吸収性担体(PAD)を
入れた:
−上記のとおり、吸収性セルロース担体(セルロースPAD)を膨潤培地65
0μlに浸漬したか、またはポリプロピレンPADを膨潤培地300μlに浸漬
した、
−ポリエステル膜をPAD上に移した、
−閉鎖し、標識化した皿を、遮光したオーブンに入れた、
−40℃(±3℃)で培養した。
c3)この培養の間に、標識化溶液を調製した。
20回の分析のための実施例:
−0.22μmフィルター越しに前濾過しておいた標識化緩衝液20mlを含む
無菌フラスコに、生存度基質200μlを加えるが、添加の際、フラスコの壁に
触れないよう注意した、
−均質化した、
−フラスコをアルミニウム箔で包んだ。こうして調製した溶液を8℃±4℃で
(最長4時間)保存した。
c4)各ペトリ皿に新たなPAD(セルロースまたはポリプロピレン)を入れ
、
−セルロースPADを標識化溶液650μlに浸漬したか、またはポリプロピ
レンPADを標識化溶液300μlに浸漬した、
−膨潤培地で浸したPADのポリエステル膜を、標識化溶液で浸したPADに
移した、
−30℃(±3℃)で30分間(±5分間)、遮光して培養した。
c5)各サンプルを個別に分析した。分析が培養直後でないならば、サンプル
(PAD上の膜)を8℃±4℃で、遮光して放置した(30分を越えない)。
得られた結果を上の表IIに表す。
遮断剤で処理しなかった膜36枚は、上記の工程b)を通さなかった。
結果は、単に遮断剤で処理することによって、偽陽性を有する膜の数を75%
から19%にさせることを示す。
実施例2:緩衝ペプトン水に対する本方法の効能
ペプトン水は、特に国際公開特許第WO89/08714号公報に記載されたとおり、計
数を精密に実施するための細菌希釈を作成するのに用いる水である。
しかし、ある種のペプトン水は、サンプルをフルオレセインエステルで処理し
たときに、おそらく、ペプトン水中の、標識の加水分解に起因するフルオレセイ
ンおよび残存する粒子成分の相互作用によって生じる、多くの偽陽性を示すとい
う問題を提起する。実施例1と同じ手順を用いたが、工程a)のフィルターの調
製と工程b)の遮断剤の濾過との間に、無菌ペプトン水50mlの濾過という工程
を導入した。得られた結果を下記の表4.1、4.2および4.3に示す。 工程b)の不在下および存在下で、6回の濾過を実施した。用いた遮断剤およ
び生存度標識は、実施例1と同じである。記号F+は、ChemScan(登録商標)が
検出した蛍光粒子の数を示す。「一次計数」を示す列は、実際は、ChemScan(登
録商標)によって実施する識別の工程前の蛍光の数であるが、ChemScan(登録商
標)は、機械にプログラムされた形状および大きさを有する粒子に付随しない、
すべての事象を排除するのを可能にすることを想起されたい。
これらの実験の解釈は、遮断剤の使用は、一次計数で数えられた、したがって
、おそらく、膜上に存在する粒子による人為産物である、すべての蛍光事象の約
90%およびChemScan(登録商標)による識別後に得られた、したがって偽陽性
である多量の真の蛍光事象の排除を可能にすることを明らかにする(数字は、減
少の百分率に対して過小にすぎるため、合理的には測定されない)。特に、遮断
剤で処理した6枚中2枚の膜は、CSEによる前処理後には、生存度標識による
陽性の蛍光を全く示さないことが観察された。
実施例3:抗生物質の滅菌した溶液で実施する方法
実験は、実施例2と全く同一であるが、実施例1の工程a)とb)との間で、
無菌抗生物質溶液10mlをポリエステル膜越しに濾過した。
結果を下記の表5に示す:
ここでも、対比染色剤の不在下で、ChemScanは、識別後に蛍光を示すそれぞれ
322個および293個の粒子を検出したのに対し、CSEで処理すると、この
数字は、それぞれ5および12個の蛍光粒子まで低下する、すなわち、偽陽性の
数に関して、初めの事例では98.5%の低下、そして第二の事例では、96%
の低下である。
結論として、本発明の方法は、微生物を含んでいるはずのサンプルに対する、
生存度標識の直接の使用によって得られる偽陽性の、80〜99%にわたる劇的
な減少へと導くことが明確に認められる。
その上、この技術は、偽陰性を全く示さない、換言すれば、遮断剤は、サンプ
ル中で数えられた生存微生物の数を減少させないという利点を有する。
対比染色剤、より特にCSEは、その上、キットに用いることができるという
利点を有するが、それは、商業的頒布に適合するオートクレーブ滅菌および貯蔵
の特性をこれが有するからである。
単数または複数の遮断剤を含有する組成物の利点の中で特別なのは、提唱され
た混合物が、死細胞と非有機粒子との双方を標識化するのを可能にすることに起
因する、広い使用範囲である。言うまでもなく、試験しようと望むサンプルに応
じて、残余の工程で用いられる生存度標識に対して望みの比率内にとどまるよう
に、これらの遮断剤の一つまたはその他を用いるのが好ましいと思われる。
望みであれば、かつ分析することが望まれる、サンプルに応じて、当業者は、
その遮断剤組成物とその生存度標識組成物との双方、および二者間の重量比を選
ぶ方法を知るものと思われる。
最後に、本発明の方法および組成物の最終的利点は、ただ一連の操作で、一方
では胞子形成形態と、他方では不活性形態とを包含する、生細胞を排他的に数え
ることを可能にすることである。
本発明の方法は、他の標識化剤/遮断剤の対に一般的に応用できる。当業者は
、さらに、本文の当初に述べた、生存度標識の特徴を補完する特徴の一つまたは
その他を有する遮断剤を決定できると思われる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
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,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
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S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
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,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y
U,ZW
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.1種類以上の生存度標識で標識化する工程を含むサンプル中の生存細胞を検 出し、計数するための方法であって: a)細胞を生存度標識を遮断する薬剤を含有する組成物に接触させる工程、 b)細胞を生存度緩衝液中の1種類以上の生存度標識に接触させる工程、 c)総菌叢中の生存細胞を検出し、かつ計数する工程 を含み、ここで、工程a)が、工程b)の前またはそれと同時に存在することを 特徴とする方法。 2.サンプルを前濾過する、請求項1記載の方法。 3.工程c)を流動細胞測定装置または走査細胞測定装置の機械によって実施す る、請求項1記載の方法。 4.生存度緩衝液が、0.5〜3Mのイオン強度を有する、請求項1記載の方法 。 5.工程b)の前または同時に細胞を膨潤培地にも接触させる、請求項1〜4の いずれか1項記載の方法。 6.遮断剤が、ハロゲン化キサンテンまたはそれらの誘導体、および特に少なく とも1個のハロゲン原子で置換されたフルオレン類で形成される群から選ばれる ことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。 7.遮断剤が、エリトロシンB、エチルエオシン、エオシンB、エオシンYもし くはフロキシンB、またはそれらの混合物で形成される群から選ばれることを特 徴とする、請求項6記載の方法。 8.遮断剤が、エリトロシンBおよびエチルエオシンの10/1〜1/10にわ たる比率の混合物であることを特徴とする、請求項7記載の方法。 9.生存度標識が、キサンテン、アクリジン、フルオロンが形成する群、および アミノアジドの群から選ばれることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項 記載の方法。 10.生存度標識が、FDA、6−CFDA、5−CFDA、ニラウリン酸フル オレセイン、5−もしくは6−CFDAのエステル、N−ヒドロキシスクシンイ ミド、またはそれらの混合物が形成する群から選ばれることを特徴とする、請求 項9記載の方法。 11.生存度標識が、FDAおよび5−CFDAの5/1〜15/1の比率の混 合物であることを特徴とする、請求項9または10記載の方法。 12.不活性粒子または非生存細胞との第一蛍光化合物の結合を妨げることがで きる遮断剤組成物であって、該第一生存度標識の蛍光発光波長に実質的に等しい 蛍光吸収波長を有する1種類以上の第二蛍光化合物を含むことを特徴とする組成 物。 13.第二蛍光剤が、エリトロシンB、エチルエオシン、またはそれらの混合物 が形成する群から選ばれることを特徴とする、請求項12記載の組成物。 14.遮断剤が、それぞれ0.004%および0.002%の最終濃度のエリト ロシンBおよびエチルエオシンからなるCSEであることを特徴とする、請求項 13記載の組成物。 15.粒子および死細胞の排除でもってサンプル中の生存細胞を検出する方法で あって、サンプルを請求項12記載の組成物に接触させる工程、次いで該サンプ ルを生存度標識に接触させる工程および該サンプル中の生存細胞を検出し、かつ 計数する工程を含む方法。 16.細胞が、適切な場合には胞子形成形態を含む、生存微生物である、請求項 15記載の方法。 17.全菌叢中の生存細胞を検出し、かつ計数するためのキットであって、少な くとも: −生存度標識による偽標識化を遮断する1種類以上の薬剤; −1種類以上の生存度標識; −生存度緩衝液; −適切な場合には、膨潤および/または発芽培地; を含むキット。 18.遮断剤または不活性粒子もしくは非生存細胞との第一蛍光化合物の結合を 防止できる遮断剤が、該第一生存度標識の蛍光発光波長に実質的に等しい蛍光吸 収波長を有する1種類以上の第二蛍光化合物を含むことを特徴とする、請求項1 7記載のキット。 19.生存度標識が、FDA、6−CFDA、5−CFDA、二ラウリン酸フル オレセイン、5−もしくは6−CFDAのエステル、N−ヒドロキシスクシンイ ミド、またはそれらの混合物で形成される群から選ばれる、請求項17記載のキ ット。 20.膨潤培地が、SCBおよび麦芽抽出物の混合物である、請求項17記載の キット。
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