FR2764305A1 - Procede de detection et de numeration de cellules viables dans un echantillon biologique et kit pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé de détection et de numération de cellules viables dans un échantillon comprenant simultanément ou séquentiellement la mise en contact des cellules avec des agents de blocage des marqueurs de viabilité et des marqueurs de viabilité.
Description
L'invention porte sur un procédé de détection et/ou de numération de
cellules viables notamment des microorganismes, comprenant une
étape de marquage avec un marqueur de viabilité et une étape de contre-
marquage avec un agent de blocage, sur les compositions de marquage et
de blocage ainsi que sur un kit pour la mise en oeuvre du procédé.
L'invention porte également sur une composition contenant un ou des agents de blocage capables de marquer spécifiquement des particules ou des cellules mortes, à l'exclusion des cellules vivantes qu'elles soient sous forme cellulaire ou sporulante, permettant une numération différentielle des cellules vivantes des autres particules incluant des
cellules mortes.
La détection et/ou la numération de cellules viables dans un échantillon a un intérêt tant pour s'assurer de la qualité des inoculums pour la production de produits issus de la fermentation tels la bière, le vin, les produits laitiers, etc... que pour contrôler la stérilité de produits alimentaires
ou sanitaires ou pharmaceutiques avant utilisation ou commercialisation.
Par cellules viables, on entend toute matière biologique sous forme unicellulaire, ou de façon plus générale toute matière contenant une information génétique qui est auto-reproductible ou reproductible dans un système biologique. Cela inclut toutes cellules eucaryotes ou procaryotes, y compris les formes sporulantes; à titre d'exemple, on citera les bactéries,
les champignons ou les levures.
Différentes méthodes sont disponibles afin de déterminer la viabilité cellulaire, incluant la méthode traditionnelle de numération sur boîte de pétri. La numération des microorganismes par cette technique est souvent longue à mettre en oeuvre, le résultat n'est observé qu'après 2 jours à 7 jours voire 14 jours d'incubation, délai incompatible avec la commercialisation de denrées périssables, et il est souvent entaché d'erreurs importantes si le nombre de boîtes ensemencées n'est pas suffisant pour un comptage statistique. Enfin, ces techniques sont inopérantes pour détecter et dénombrer les microorganismes vivants dont les capacités de croissance sur boite de Pétri ou en culture sont limitées ou nulles. Des techniques de dénombrement direct ont été développées pour palier au long délai de réponse des méthodes traditionnelles. Il s'agit en particulier de la technique DEFT (direct epifluorescence technic), dénombrement au moyen de marqueurs fluorescents et en particulier de l'acridine orange; I'utilisation de cette technique ainsi que ses limitations sont décrits dans une récente revue publiée par KENNER et PRATT (Microbiological Review (1994) 58 603- 615). Néanmoins, ces techniques ont l'inconvénient de générer de nombreuses adsorptions non spécifiques qui conduisent à une surestimation de la numération par comptage de faux positifs; en particulier quand ce dénombrement est automatisé à l'aide de
systèmes tels que les cytomètres en flux.
Une variante de cette approche consiste à utiliser des marqueurs susceptibles de donner un signal fluorescent après transformation par une enzyme cellulaire. L'émission du signal fluorescent est la conséquence de l'existence d'une activité enzymatique, et révèle la présence d'une cellule viable. Cette technique présente les avantages de minimiser le nombre de faux positifs, de pouvoir différencier les cellules viables des cellules mortes par la conversion enzymatique du précurseur, et de favoriser l'accumulation intracellulaire des marqueurs grâce au maintien de l'intégrité membranaire. Néanmoins, à cette conversion enzymatique intracellulaire est associée une hydrolyse non spécifique due au tampon de marquage, comme tout ester en milieu aqueux. Cette hydrolyse bien que minime peut générer toutefois un peu de marquage non spécifique, pouvant devenir
critique, dans l'utilisation de ces marqueurs pour un test de stérilité.
Les méthodes de marquage de souches vivantes de bactéries avec des esters fluorogéniques, comme la fluorescéine diacétate (FDA) ou la carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ont été décrites notamment par J.-P. DIAPER et al. dans Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77: 221- 228 et par J. Porter et al. dans Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79:
399-408.
Par ester fluorogénique, on entend toute molécule non fluorescente qui, après action d'une enzyme, donne naissance à une molécule
fluorescente après excitation par la lumière.
De manière générale, les marquages fluorescents obtenus directement ou par activation par une enzyme cellulaire ont l'avantage de la rapidité d'obtention des résultats qui est sans commune mesure avec la culture cellulaire, mais ont l'inconvénient d'être moins fiables sur le plan
quantitatif du fait de l'existence de faux positifs ou de faux négatifs.
En effet, dans ce type de technique, il existe plusieurs causes de mésestimation du nombre de cellules viables: a) lorsque le microorganime se présente sous une forme sporulante, l'entrée d'un composé quelconque et en particulier des marqueurs fluorescents à l'intérieur de la spore est difficile sinon impossible et conduit
donc à sous-estimer le nombre de microorganismes vivants.
b) un marquage parasite de particules en suspension ou de cellules mortes peut entraîner la numération de faux positifs, surtout dans le cas de
marquage fluorescent obtenu directement.
c) après transformation du précurseur fluorogénique par une enzyme caractéristique de la cellule viable, il peut se produire un efflux par un mécanisme actif, lequel efflux diminue bien évidemment le marquage
intra cellulaire et pose donc un problème de sensibilité de la méthode.
La présente invention vise à surmonter tous les inconvénients du marquage direct par les esters de fluorescéine qui, rappelons-le, sont essentiellement de trois types: - I'effiux actif des produits d'hydrolyse des esters, - I'obtention de faux positifs par le marquage des particules en suspension ou des cellules mortes conduisant à une surestimation, I'impossibilité de détecter les spores de bactéries, levures ou
champignons, conduisant à une sous-estimation de cellules viables.
A cet effet, la présente invention porte sur un procédé de détection et de numération de cellules viables dans une flore totale par détection et mesure sélective du nombre de cellules vivantes, des particules et des
cellules mortes dans un échantillon.
Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé de détection et/ou de numération de cellules viables dans un échantillon et caractérisé par une succession d'étapes comprenant au moins: a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des agents de blocage des marqueurs de viabilité, b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité dans un tampon de viabilité,
c) la détection et la numération des cellules viables dans la flore totale.
Dans le procédé de l'invention, l'étape a) est antérieure ou
simultanée à l'étape b).
Le procédé de l'invention comprend avantageusement une étape complémentaire qui est la mise en contact des cellules avec un milieu de gonflement, laquelle étape est préalable ou simultanée à l'étape b). Si elle est simultanée, le milieu de gonflement et le tampon de viabilité peuvent ne
constituer qu'un seul et même milieu.
Cette étape a pour but de permettre l'incorporation et la conversion des marqueurs fluorogéniques dans des cellules viables existant sous forme de spores. Le milieu de gonflement sera un milieu de culture susceptible de faire germer les spores, et contenant par conséquent des inducteurs de germination, tels des acides aminés, des peptides, des sucres etc... A titre d'exemple, on pourra citer, le tampon TCS (tripton caseine soja) qui induira plus particulièrement la germination des spores bactériennes, ou l'extrait de malt qui sera plus particulièrement approprié à induire la germination de spores de moisissure. Un milieu de gonflement avantageux lorsque l'on souhaite mesurer une flore viable globale, contient
donc un mélange de TCS et d'extrait de malt.
Dans le procédé de l'invention, I'échantillon étudié peut être à l'origine sous forme liquide, apte à être filtré, ou résulter de la mise en suspension de particules présentes sur un solide ou dans un gaz quelconque; les cellules peuvent être détectées et dénombrées, soit directement dans un échantillon liquide, soit après filtration de l'échantillon
liquide.
Le filtre sera bien évidemment choisi de telle façon que la taille des pores soit suffisamment petite pour retenir l'ensemble des cellules viables
que l'on souhaite détecter et/ou mesurer.
Les étapes a) et b) sont alors réalisées sur le filtre et l'étape c) est appliquée par l'utilisation d'un cytomètre à balayage de type CHEMSCAN de façon à obtenir, d'une part, la détection et le comptage de la fluorescence spécifique des cellules viables et, d'autre part, le cas échéant, la détection de la fluorescence des particules inertes et des cellules
mortes, sur la base de leur longueur d'onde d'émission de fluorescence.
L'avantage dans le mode de réalisation de l'invention dans lequel l'échantillon liquide est préalablement filtré est d'augmenter
significativement la concentration des éléments que l'on souhaite détecter.
En outre, la mise en oeuvre des différentes étapes est plus aisée quand les
cellules sont déposées sur un support solide.
Dans le procédé selon l'invention, I'étape de filtration peut être suivie
d'une étape de lavage.
Après filtration de l'échantillon, le vide est cassé et la composition d'agents de blocage telle que décrite ci-dessous est passée sur le filtre portant l'échantillon susceptible de contenir des cellules ou ajouté
directement dans l'échantillon dans le cas d'une analyse en milieu liquide.
Par agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant, on entend toute molécule ou mélange de molécules susceptible d'interagir avec les sites de fixation du ou des marqueurs de viabilité sur des particules inertes ou des cellules mortes présentes dans l'échantillon à analyser et empêchant une fixation non spécifique du ou des marqueurs de viabilité
sur lesdites particules ou cellules mortes.
Un agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant peut également être constitué de toute molécule ou mélange de molécules suceptibles d'interagir spécifiquement avec les particules inertes ou cellules mortes ayant comme caractéristique de neutraliser une émission éventuelle de fluorescence parasite par le marqueur de viabilité ou ses dérivés, soit par: - absorption de la lumière parasite, par transfert d'énergie, compétition sur le site de fixation non spécifique,
- soit les deux simultanément ou par combinaison d'agents de blocage.
De manière avantageuse, les agents bloquants seront choisis dans la gamme de marqueurs fluorescents, ayant des caractéristiques structurales analogues, mais n'émettant pas ou émettant à des longueurs d'onde, différentes de celles de marqueurs de viabilité, et d'une façon avantageuse parmi les marqueurs ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission des
marqueurs de viabilité utilisés.
Les marqueurs de viabilité utilisés dans l'étape b) sont avantageusement des marqueurs fluorescents, tels des esters de la
fluorescéine, de la carboxyfluorescéine, du BCEF, du 5-6-
carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ou du fluorescéine diacétate ou un mélange de ceux-ci. Ces marqueurs de viabilité ont chacun une spécificité de cibles, et nécessitent des conditions de tampons de marquage adaptées. A titre d'exemple, le CFDA est plus particulièrement approprié pour marquer des bactéries alors que le FDA a une meilleure capacité d'accumulation dans les champignons ou les levures dans des conditions de pH neutre. Un mélange de ces deux esters fluorescents permettra donc de détecter et de dénombrer un large spectre de microorganismes
présents simultanément dans un échantillon biologique.
De manière générale, les marqueurs de viabilité sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones et les
aminoazides.
Il doit être noté ici que le procédé de l'invention est aussi utilisable quand l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est utilisé comme marqueur fluorescent en association avec un ligand spécifique (anticorps mono ou polyclonal et/ou sonde nucléique) qu'il s'agisse de l'identification de microorganismes ou de cellules animales. Dans ce cas, il est souvent
observé une adsorption non spécifique de la fluorescence émise.
L'utilisation d'une composition d'agents bloquants préalable ou simultanée
au marquage par le ligand peut permettre d'éviter cet artefact.
L'invention porte également sur une composition d'agents de blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes caractérisée en ce qu'elle comprend: a) un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité;
sont plus particulièrement choisis des fluorones tels l'érythrosine B, l'éthyl-
éosine, la methyl-eosine, I'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci; b) un ou plusieurs composés susceptibles d'entrer en compétition avec le produit résultant de l'hydrolyse du marqueur, cause du marquage parasite;
c) un mélange de a) et b).
La présente invention est également relative à une composition de marquage constituée d'un ou des mélanges de marqueurs de viabilité dans
un tampon à haute force ionique.
L'invention porte également sur l'utilisation du procédé à la détection et/ou à la numération des cellules viables dans un échantillon y compris des formes sporulantes, à l'exclusion des cellules mortes; elle permet de la
même faç,on de dénombrer spécifiquement ces demrnières.
L'invention porte enfin sur un kit ou trousse permettant la détection et la numération des cellules viables dans une flore totale, lequel kit comprenant au moins: - un agent de blocage d'un marquage parasite par les marqueurs de
viabilité ou une composition de marqueurs de viabilité telle que décrite ci-
dessus; - une composition contenant un ou plusieurs marqueurs de viabilité tels que décrits ci-dessus; - un tampon de viabilité; - le cas échéant, un milieu de gonflement; - un protocole expérimental pour les dilutions extemporanées des différents
compositions et tampons.
Description détaillée de l'invention:
Dans le procédé de l'invention, les agents de blocage permettent de différencier d'une part les cellules vivantes et, d'autre part, les particules et les cellules mortes par marquage différentiel. Quand les agents de marquage sont des dérivés de la fluorescéine et ayant une longueur d'onde d'émission de 515 nm, les agents de blocage seront de préférence des dérivés halogénés de la famille des xanthènes ayant une longueur d'onde d'absorption dans la même fenêtre ou les dérivés de ceux-ci. Dans ce cas, l'agent bloquant est choisi de préférence dans le groupe formé par les fluorones substituées par au moins un atome d'halogène, tel que chlore, brome, fluore et/ou iode; parmi les fluorones substituées on peut citer, par exemple, l'éosine B, l'éosine Y, la phloxine B,
l'érythrosine B, I'éthyl-éosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci.
L'agent bloquant est, de manière préférée, choisi dans le groupe formé par les fluorones substituées au moins par 3 atomes d'halogène, et, de préférence, par 4 atomes d'halogène, et, notamment, par 4 atomes d'iode ou 4 atomes de brome, tels que, notamment, l'éosine Y, la phloxine B, l'érythrosine, l'éthyléosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. De bons résultats ont été obtenus lorsque l'agent bloquant est choisi dans le
groupe formé par l'érythrosine B, I'éthyl-éosine ou un mélange de ceuxci.
La similitude des marqueurs est importante dans la mesure o la plupart des colorants testés se révèlent inefficaces dans l'application recherchée, en particulier les colorants bleus sont inefficaces comme le
bleu evans, le bleu trypan ou le bleu de méthylène.
Le tableau 1 ci-dessous résume les principaux colorants qui ont été testés avec leurs caractéristiques et leurs effets:
Tableau 1:
COLORANTS ACTION COLORANTS ACTION
Colorants bleus: Pas d'action Congo Red Pas d'action bleu Evans, (0,005 %) bleu Trypan, bleu Méthylène Ruthenium Red Pas ou peu d'action Alizarin Reds Pas d'action
(0.005 %)
Nile Red Pas d'effet Eosine B (0,005 %) Peu d'action (8 pg/ml) Fast Red Non utilisable Phenosafranine Peu d'action (30 pg/ml) (0,002 %) Rouge neutre Actif Eosine Y (0,01%) Actif
(0,003 %)
Erythrosine B Actif Phloxine B Actif
(0,004%) (0,005 %)
Ethyléosine Actif
(0,002 %) __
Les agents bloquants actifs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison.
L'avantage d'utiliser une combinaison est d'augmenter le spectre d'action de ces agents bloquants. A titre d'exemple, I'éthyl-éosine, la Phloxine B et l'Eosine Y qui sont des dérivés bromés de la fluorescéine vont marquer préférentiellement les microorganismes tués alors que l'érythrosine, dérivé iodé de la fluorescéine, va marquer de préférence les particules inertes dans le milieu à analyser. Un mélange d'éthyl-éosine et d'érythrosine sera donc particulièrement performant pour marquer l'ensemble des particules ou cellules qui ne sont pas des microorganismes viables dans un échantillon quelconque. L'invention porte également sur une composition d'agents bloquants comprenant des fluorones plus particulièrement choisis dans le groupe ll formé par l'érythrosine B, I'éthyl-éosine, la methyl-eosine, I'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci dans des rapports de concentrations en poids allant de 10/1 à 1/10. Le choix des fluorones et de leurs concentrations relatives dépendra du type de produit que l'on doit analyser, ainsi que de son milieu. Par exemple, pour l'analyse microbiologique de l'eau, l'érythrosine et l'éthyl-éosine sont utilisées dans des rapports compris entre 5/1 et 1/5, et de façon préférée, par exemple de 2/1, soit des
concentrations finales respectives de 0,004 %o et 0,002 %o.
La solution comprend les constituants à une concentration qui est entre 2 et 15fois celle du produit d'hydrolyse du marqueur de viabilité responsable des signaux de fluorescence non spécifiques, sachant que les produits d'hydrolyse représentent entre 1 et 10 % en poids du marqueur de
viabilité selon le type d'échantillon analysé.
Le procédé de l'invention comprend l'utilisation d'une composition de marquage de type universel susceptible de marquer n'importe quel type de cellules présent dans l'échantillon étudié. Les cellules peuvent être un procaryote, un eucaryote monocellulaire, une cellule animale, sous une forme biologiquement active ou sous une forme sporulante. Une composition de marquage sera, quand le signal fluorescent sera recherché, une composition de marqueurs que l'expérimentateur diluera extemporanément dans le tampon de marquage à haute force ionique. La composition de marqueur sera constituée préférentiellement d'un mélange de 5(6)carboxyfiuorescéine diacétate (CFDA) à une concentration comprise entre 5 et 10 mg par ml, et de fluorescéine diacétate (FDA) à une concentration comprise entre 0,5 et 5 mg par ml dans de l'acétone pur (q. s.p.). De préférence, les rapports en poids de CFDA et de FDA seront compris entre 5/1 et 15/1 et de façon optimale de 9/1 soit pour 1 ml, 9 mg/ml (19,5 mM) de CFDA et 1 mg/ml (2,4 mM) de FDA dans de
l'acétone pur.
Au moment du marquage des microorganismes éventuels recherchés dans l'échantillon, la composition de marqueur telle que décrite ci-dessus est diluée au centième dans un tampon de marquage dont la force ionique est supérieure à 0,5 et comprenant dans une solution aqueuse.: - un détergent non ionique, - un agent chélateur, - un tampon, et
- un sel.
Une composition préférée est présentée dans le tableau 2 suivant:
Tableau 2:
Limites de Concentration concentration préférée Tween 20 (Polyoxyéthylène Sorbitan 0,005 % - 0,1 % 0,03 % Monolaurate) Ethylène Diamine tétra acétique 1 mM - 10 mM 5 mM 3SS trisodium Acétate de Sodium trihydraté 10 mM 50 mM Chlorure de sodium 0,5 mM - 1,5 M 1,13 M Eau Ultrapure qsp Le tampon acétate de sodium peut être indifféremment remplacé par d'autres tampons de type tampon phosphate, HEPES, citrate, etc... De la même façon, le chlorure de sodium peut être remplacé par du chlorure de
potassium (KCL), du NH4(2)SO4 etc...
La composition constituée d'un marqueur, ou d'un mélange de marqueurs telle que décrite ci-dessus et diluée dans le tampon de
marquage, fait également partie de l'invention.
L'efficacité particulièrement importante du tampon en question est surprenante du fait de sa très haute force ionique. En effet, I'isotonicité était généralement la solution retenue pour conserver l'intégrité de la cellule viable. Des essais réalisés en cytométrie en flux sur des bactéries en
phase stationnaire sont présentés dans la figure 1.
La figure I représente l'effet de la force ionique sur le nombre de cellules détectées. L'abscisse indique l'intensité de fluorescence, et l'ordonnée le nombre de cellules détectées. La colonne de gauche représente les résultats avec Bacillus subtilis et celle de droite avec Serratia marcescens. Ils montrent qu'une augmentation de la force ionique s'accompagne d'une augmentation de l'intensité de fluorescence, résultant
d'une meilleure accumulation du marqueur dans les cellules vivantes.
Cette expérience indique clairement qu'une force ionique supérieure
à 0.8 M est recommandée pour un dénombrement précis.
Dans le procédé de l'invention, une étape de gonflement des spores présentes le cas échéant dans le milieu à analyser est réalisée par I'addition d'un milieu de type TCS, d'un extrait de malt ou avantageusement
d'un mélange des deux.
L'échantillon traité au préalable avec l'agent bloquant tel que décrit plus haut est mis en contact avec le milieu de gonflement soit par dilution ou resuspension de l'échantillon à analyser dans le milieu de gonflement dans le cas d'un dénombrement en milieu liquide, soit par transfert de la membrane sur lequel l'échantillon à analyser a été filtré, sur un support absorbant saturé du milieu de gonflement. L'échantillon est alors incubé de mm à 3 heures à 30 ou 37 C selon l'application recherchée; une incubation courte 40 mm à 37 C permettra la détection des spores de bactéries, tandis qu'une incubation plus longue (3 heures à 30 C)
permettra aussi la détection des spores de moisissures.
Néanmoins, on peut diminuer la température et allonger la durée
d'incubation pour obtenir le même résultat.
Pour la détection des microorganismes, les échantillons sont mis en présence de la solution de marquage tel que décrit précédemment, d'une manière similaire à l'étape de gonflement et incubés 30 minutes à 30 C à
plus ou moins 3 C.
Dans le procédé de l'invention, le ou les agents de blocage a comme particularité d'être dans un rapport de concentration avec le ou les marqueurs de viabilité de 5 à 15 pour 1, ce qui est l'inverse des rapports habituels utilisés entre colorants et contre-colorants qui sont de l'ordre de 1/10. Un ratio optimal, pour les dérivés dela fluorescéine, sera d'environ 10
pour 1.
Le traitement de l'échantillon avec l'agent de blocage sera toujours antérieur, ou à la limite simultané au traitement par la composition
contenant les marqueurs de viabilité.
Dans une variante de l'invention, on peut s'affranchir du support hydrophile, soit dans l'étape de gonflement, soit dans l'étape de marquage par dépôt direct du milieu de gonflement ou du tampon de marquage sur
ou sous le filtre porteur des microorganismes filtrés.
Le procédé de l'invention comprend enfin une étape d'analyse par
tout moyen approprié à mesurer le signal émis par le marqueur de viabilité.
Si, toutefois, I'analyse n'est pas réalisée immédiatement après l'incubation avec la composition de marquage, les échantillons doivent être placés à 8+ 4 C à l'abri de la lumière, mais sans toutefois excéder une durée de
minutes.
Le procédé de détection et/ou de numération selon l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans l'appareil décrit dans les demandes de brevet EP 0 333 561 et WO 89/08714 et vendu sous les marques
CHEMSCAN et CHEMFLOW .
L'invention porte également sur la mise en oeuvre et l'utilisation du kit du procédé de l'invention dans toutes les applications o la présence de
cellules vivantes est recherchée.
Le procédé et le kit selon l'invention peuvent être utilisés notamment pour détecter et/ou dénombrer d'éventuels microorganismes dans des
produits d'hygiène, alimentaires ou pharmaceutiques.
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être également utilisés pour contrôler un processus industriel comme la stérilisation que ce soit dans les applications agroalimentaires, pharmaceutiques ou nutraceutiques et ce, soit dans une étape d'un procédé de fabrication, soit sur le produit fini. De la même façon, le procédé et le kit peuvent être utilisés pour contrôler la charge bactérienne avant et après une filtration stérilisante (bioburden). Le procédé et le kit de l'invention peuvent être enfin utilisés pour la mise en évidence de microorganismes viables non détectables par les méthodes classiques. Il peut s'agir par exemple: - du contrôle d'efficacité d'un antibiotique, particulièrement pour ceux qui interfèrent avec la division cellulaire des microorganismes et donc ne sont pas détectables avec les méthodes classiques de type boîte de pétri; - la recherche de contaminations susceptibles de produire des infections nocosomiales en milieu hospitalier; - d'établir une éventuelle corrélation entre un test de pyrogénicité en cours de process de fabrication, par exemple de médicaments, et la présence de micro-organismes dans l'échantillon;
- la détection de lymphocytes dans les urines.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin, mettre en oeuvre le
procédé pour l'utilisation souhaitée.
Pour la première fois, on est en présence d'une invention qui foumrnit un moyen de marquer dans un seul et même échantillon et discriminer les cellules viables des particules de taille sensiblement identique aux cellules viables que peuvent être des cellules mortes ou des particules en suspension, et ce avec une fiabilité conférée par: - I'élimination des faux négatifs par la présence d'un milieu de gonflement et le marquage des spores, - l'élimination des faux positifs grâce à la composition d'agents de blocage, - I'augmentation de la sensibilité du fait de l'utilisation d'un tampon de marquage à haute force ionique plus particulièrement pour les microorganismes. Outre les développements et avantages détaillés ci-dessus, l'invention comporte également d'autres avantages et caractéristiques découlant des exemples qui suivent, donnés à titre d'illustration sans
cependant en limiter la portée. Exe l 1: Mise en oeuvre du procédé en absence de toute filtration
d'échantillons: Dans un premier temps, la mise en oeuvre du procédé consiste à réaliser un pré-traitement avec un agent de blocage préalablement au traitement par les marqueurs de viabilité. Le but de cette expérimentation est de montrer l'efficacité de ce traitement pour éliminer les faux positifs résultant d'une interaction non spécifique entre les marqueurs de viabilité et la
membrane de filtration.
Nous avons utilisé une composition de contre-colorants contenant Erythrosine et Ethyl Eosine dans un rapport pondérai de 2, appelé CSE (Counter Staining E), ayant la compositiion suivante: 0,004 % d'Erythrosine B dilué dans l'Hépès et 0,002 % d'Ethyl-Eosine dilué
également dans l'Hépès.
Le tableau 3 ci-dessous compare les résultats de fluorescence mesurés au CHEMSCAN et obtenus sans ou avec traitement préalable par le CSE:
Tableau 3:
agent de blocage Nombre de F+% des membranes membranes donnant 0 Sans 36 mem- 9 membranes donnent 0 25 % branes 14 membranes donnent 1 3 membranes donnent 1 2 membranes donnent 3 2 membranes ont un nombre de F+ >3 Avec CSE 42 mem- 34 membranes donnent 0 81 % (Erythrosine + Ethyl branes membrane donne Eosine).À1 membrane donne 1 Eosine) 2 membranes donnent 2 1 membrane a un nombre de F+> 3 Le protocole suivi est le suivant: a) préparation des supports de filtration: Les supports de filtration sont rincés successivement avec trois fois 1 ml d'éthanol à 70 % (v/v) puis par 3 fois 1 ml d'eau filtrée (à travers 1 filtre de 0,22 pm). Le support de filtration utilisé est une membrane de poyester, qui
est ensuite placée sur un support de filtration humide.
b) filtration du contre-colorant CSE: Le CSE est ensuite filtré à travers la membrane de polyester positionnée
sur le support de filtration humide à raison de 1 ml de CSE.
c) marquage par les marqueurs de viabilité: Le marqueur de viabilité comprend 9 mg par ml (19,5 mM) de diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) et I mg/ml (2,4 mM) de diacétate de fluorescéine (FDA) dans de l'acétone anhydre pure. La solution de viabilité a été préparée et diluée extemporanément ensuite au centième dans un tampon dont la composition est la suivante: - 0,03 % (v/v) de tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate), - du phosphate de sodium trihydraté 50 mM, pH7 - du chlorure de sodium 1,13 mM dans de l'eau ultrapure. c.1) - Aspirer 20 ml de milieu de gonflement dans une seringue stérile, - Préfiltrer les 20 ml de milieu de gonflement dans un flacon stérile,
- Garder cette solution à température ambiante.
c.2) Dans une boîte de Pétri, placer un support absorbant (PAD) en cellulose ou en polypropylène: - Imbiber le support cellulosique absorbant (PAD cellulose) avec 650 pl de milieu de gonflement, ou imbiber le PAD en polypropylène avec 300 pl de milieu de gonflement, tel que décrit plus haut, - Transférer la membrane polyester sur le PAD, - Placer les boîtes fermées et identifiées dans l'étuve à l'abri de la lumière
- Incuber 40 mm (+ 3 C).
c.3) Durant ce temps d'incubation, préparer la solution de marquage.
Exemple pour 20 analyses: - Dans un flacon stérile contenant 20 ml de tampon de marquage préfiltré sur 0,22 pm, ajouter 200 pl de substrat de viabilité en prenant soin de ne pas toucher la paroi du flacon, Homogénéiser, - Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium. Stocker la solution
ainsi préparée entre 8 C + 4 C (4 heures maximum).
c.4) Dans chaque boîte de Pétri, placer un nouveau PAD (cellulose ou polypropylène) - imbiber le PAD cellulose avec 650 pl de solution de marquage, ou le PAD en polypropylène avec 300 pl de solution de marquage transférer la membrane polyester du PAD saturé de milieu de gonflement
au PAD saturé de solution de marquage.
- incuber 30 mn (+ 5mn) à 30 C (+3 C) à l'abri de la lumière.
c.5) Analyser chaque échantillon individuellement. Si l'analyse n'est pas immédiate après l'incubation, placer les échantillons (membranes sur PAD)
à 8 C + 4 C à l'abri de la lumière (Ne pas dépasser 30 mn).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau Il ci-dessus Les 36 membranes non traitées par l'agent de blocage n'ont pas
subi l'étape b) ci-dessus.
Les résultats indiquent que le simple fait de traiter avec l'agent de blocage permet de faire passer le nombre de membranes portant des faux
positifs de 75 % à 19 %.
Exemple 2: Efficacité du procédé sur l'eau peptonée et tamponée: L'eau peptonée est une eau utilisée pour faire des dilutions de bactéries afin justement d'en réaliser la numération comme cela est décrit
notamment dans le brevet WO 8908714.
Néanmoins, certains types d'eau peptonée posent le problème de donner de nombreux faux positifs quand l'échantillon est traité avec des ester de fluorescéine, ce qui résulte probablement d'une interaction entre la fluorescéine résultant de l'hydrolyse du marqueur qui s'accrocherait sur des éléments particulaires résidant dans l'eau peptonée. Le même protocole que dans l'exemple 1 a été utilisé sauf qu'une étape de filtration de 50 ml d'eau peptonée stérile a été introduite entre l'étape a) de préparation du filtre et l'étape b) de filtration de l'agent de blocage. Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 4.1, 4.2 et 4.3 ci-dessous:
Tableau 4.1
Contre-colorants Comptage primaire F Contrôle 6835 / 7804 /10677 8/4/ 11 Rouge neutre 699/ 1371 /894 1 /4/.3 Contrôle 2706/3142/2848 6 / 7 / 6 Erythrosine B 87 / 71 / 107 0 / 0 / 1 Contrôle 7445 / 7588 / 5986 8 / 9 / 15 Nile red 178 / 678 / 343 10 / 4 / 7
Tableau 4.2:
Contre-colorants Comptage primaire F+ Contrôle 2674 / 2968 / 2997 69 / 95 / 111 Congored 1425 /1361 /3387 72 / 64/ 71 Alizarin Red S 1762 / 2030 56 / 82 Phénosafranine 214 /252 / 273 18 / 25 / 37 Tableau 4.3: Contrecolorants Comptage primaire F+ Contrôle 2554 / 2492 / 2299 59 / 57/ 56 Eosine B 1229 / 1471 / 1169 31/49/41 Eosine Y 278 /451 / 3166 11 / 21 /21 Phloxine B 122 / 110 / 129 6 / 4 / 16 Ethyl-eosine 82/66/97 5/2/3
Six filtrations ont été réalisées en l'absence de l'étape b) et avec l'étape b).
l'agent de blocage et le marqueur de viabilité utilisés sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le signe F+ indique le nombre de particules fluorescentes détectées par le CHEMSCAN . La colonne qui indique "comptage primaire" est en fait le comptage de fluorescence avant l'étape de discrimination effectuée par le CHEMSCAN laquelle permet d'éliminer, nous le rappelons, tous les événements non rattachés à une particule de
forme et de taille pris en compte dans le programme de l'appareil.
L'interprétation de ces expériences rend évidente que l'utilisation de l'agent de blocage permet d'éliminer environ 90 % de tous les événements de fluorescence comptés en comptage primaire - et qui sont donc des artefacts dus probablement aux particules présentes sur la membrane - et la grosse majorité des événements de fluorescence vrais obtenus après discrimination par le CHEMSCAN et qui sont donc des faux positifs (les chiffres sont trop faibles pour raisonnablement mesurer la diminution en pourcentage). Il est notamment observé que deux membranes sur les six traitées par l'agent de blocage ne donne aucune fluorescence positive par
le marqueur de viabilité après le prétraitement par le CSE.
Exemple 3: Procédé réalisé sur une solution d'antibiotiques stérilisée: L'expérience est strictement identique à celle de l'exemple 2 à l'exception que 10 ml d'une solution d'antibiotique stérile ont été filtrés sur la
membrane de polyester entre les étapes a) et b) dans l'exemple 1.
Les résultats sont présentés dans le tableau 5 suivant:
Tableau 5:
Produit stérile Solution Ab comptage primaire F+ stérile Sans CSE 2 2206-2426 322-293 Avec CSE 2 79-152 5-12 Phloxine B 290 16 16 - 42
0,005 % 566 44
Eosine B 1442 104 100 - 370
0,005 % 2001 374
Là-encore, en l'absence de contre-colorant, le CHEMSCAN a détecté respectivement 322 et 293 particules présentant une fluorescence après discrimination alors que par le traitement avec le CSE, ce chiffre est ramené à respectivemet 5 et 12 particules fluorescentes soit une diminution de 98,5 % dans le premier cas et de 96 % dans le deuxième cas
du nombre de faux positifs.
En conclusion, il apparaît clairement que le procédé de l'invention conduit à une réduction drastique des faux positifs obtenus par utilisation directe de marqueurs de viabilité sur un échantillon susceptible de contenir
des microorganismes; cette diminution allant de 80 à 99 %.
En outre, cette technologie a l'avantage de ne présenter aucun faux négatif, autrement dit l'agent de blocage ne diminue pas le nombre de
cellules viables dénombrées dans un échantillon.
Le contre-colorant et plus particulièrement le CSE a en outre I'avantage de pouvoir être utilisé dans un kit puisqu'il a des propriétés d'autoclavage et de conservation compatibles avec une distribution commerciale. Un avantage et non des moindres de la composition contenant le ou les agents de blocage est son large spectre d'utilisation puisque le mélange proposé permet tant de marquer les cellules mortes que les particules non organiques. Il va de soi que selon l'échantillon que l'on souhaite tester, l'un ou l'autre de ces agents de blocage sera préférentiellement utilisé de telle façon qu'il reste dans les rapports
souhaités avec les marqueurs de viabilité utilisés dans la suite du procédé.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin et en fonction de l'échantillon qu'il souhaite analyser, choisir tant sa composition d'agents de blocage que celle de marqueurs de viabilité et le rapport pondérai entre les deux. Enfin, le dernier avantage du procédé et des compositions de l'invention est que, en une seule série de manipulations, ils permettent de dénombrer exclusivement les cellules vivantes y compris les formes
sporulantes, d'une part, et les formes inertes, d'autre part.
Le procédé de l'invention est d'application général à d'autres couples agent de marquage/agent de blocage. L'homme du métier pourra toujours déterminer l'agent de blocage ayant l'une ou l'autre des caractéristiques citées en début de texte complémentaires des
caractéristiques du marqueur de viabilité.
Claims (20)
1. Procédé de détection et de numération de cellules viables dans un échantillon comprenant une étape de marquage avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité caractérisés en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des agents de blocage des marqueurs de viabilité, b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité dans un tampon de viabilité, c) la détection et la numération des cellules viables dans la flore totale,
et dans lequel, I'étape a) est antérieure ou simultanée à l'étape b).
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que
I'échantillon est préalablement filtré.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que
l'étape c) est réalisée par un appareil de cytométrie à balayage.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que la force ionique du tampon de viabilité est supérieure à 0,8 M.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans laquelle les
cellules sont en outre mises en contact avec un milieu de gonflement avant
ou simultanément à l'étape b).
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé
en ce que les agents de blocage sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes halogénés ou les dérivés de ceux-ci, et notamment de fluorones
substitués par au moins un atome d'halogène.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent bloquant est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine B, I'éthyléosine,
I'Eosine B, I'Eosine y, le Phloxine B ou un mélange de ceux-ci.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'agent bloquant est un mélange d'érythrosine B et d'éthyl-éosine dans des
proportions allant de 10/1 à 1/10.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,
caractérisé en ce que les marqueurs de viabilité sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones ainsi que dans
le groupe des amino-azides.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur de viabilité est choisi dans le groupe formé du FDA, du 6-CFDA,
du 5-CFDA, le dilaurate de fluorescéine, I'ester de 5 ou 6-CFDA, N-
hydroxysuccinimide ou un mélange de ceux-ci.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le marqueur de viabilité est un mélange de FDA et de CFDA dans des
proportions comprises entre 5/1 et 15/1.
12. Composition d'agents de blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes caractérisés en ce qu'elle comprend un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur d'onde d'adsorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde
d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité.
13. Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que le second agent fluorescent est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine
B, l'éthyl-éosine ou un mélange de ceux-ci.
14. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce que I'agent de blocage est le CSE constitué d'érythrosine B et d'éthyl- éosine
aux concentrations finales respectives de 0,004% et 0,002%.
15. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 11 ou
d'une composition selon l'une des revendications 12 à 14 à la détection
des cellules viables dans un échantillon, à l'exclusion des particules et des
cellules mortes.
16. Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce que les cellules sont des microorganismes viables comprenant le cas échéant des formes sporulantes.
17. Trousse ou kit permettant la détection et/ou la numération des cellules viables dans une durée totale et comprenant au moins: - un ou des agents de blocage d'un marquage parasite par des marqueurs de viabilité; - un ou plusieurs marqueurs de viabilité; - un tampon de viabilité;
- le cas échéant un milieu de gonflement et/ou de germination.
18. Trousse selon la revendication 17 caractérisée en ce que le ou
les agents de blocage sont conformes à l'une des revendications 12 à 14.
19. Trousse selon l'une des revendications 17 ou 18 caractérisée en
ce que le marqueur de viabilité est choisi dans le groupe formé de FDA, du 6-CFDA, du 5-CFDA, le dilaurate de fluorescéine, l'ester de 5 ou 6- CFDA,
N-hydroxysuccinimide ou un mélange de ceux-ci.
20. Trousse selon l'une des revendications 17 à 19 caractérisée en
ce que le milieu de gonflement est un mélange de TCS et d'extrait de malt.
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
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Also Published As
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