FR2707665A1 - Procédé de mesure et d'évaluation de la vitalité des microorganismes et ses applications. - Google Patents
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Abstract
Ce procédé comprend: (a) le chargement des microorganismes en produit fluorescent, et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, et est caractérisé en ce qu'il comprend: (i) l'incubation desdits microorganismes pendant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentration comprise entre 1 muM et 300 muM, en présence d'un tampon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour l'obtention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a)), (ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes, (iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et (iv) la mesure du temps nécessaire à la disparition de la moitié de la fluorescence intracellulaire des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fenêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise entre 10 degréC et 40 degréC, de préférence entre 20 degréC et 40 degréC.
Description
[
La présente invention est relative à un pro-
cédé de mesure et d'évaluation de la vitalité de micro-
organismes vivants (bactéries, levures, microorganismes recombinants) et à ses applications, notamment dans l'appréciation de la qualité de l'inoculum (évaluation de la fermentation des bières, ferments lactiques) et le
suivi de la fermentation.
De manière générale, pour apprécier l'état biologique (vivant vs mort) des microorganismes, il existe de nombreuses méthodes qui évaluent la viabilité cellulaire (capacité des microorganismes à se reproduire, appréciation de l'intégrité membranaire) ou la vitalité
cellulaire (par exemple, pouvoir d'acidification).
Parmi ces différentes méthodes d'évaluation de
la viabilité ou de la vitalité des microorganismes (J.T.
TREVORS et al., Biotechnology Letters, 1983, 5, n' 2, 131-134); M.J. CHILVER et al., Amer. Soc. Brewing Chemists, 1978, 36, 13-18; J.C. SLAUGHTER et al., Enzyme Microb. Technol., 1992, 14, 64-67; B.V. KARA et al., J. Inst. Brew., 1988, 94, 153-159; H.M. SHAPIRO, 1988, Practical Flow Cytometry, Allan R. LISS, Inc. New-York; Demande de Brevet EP 333 560), on peut citer notamment: A. Méthodes d'évaluation de la viabilité: - la méthode de comptage sur milieu nutritif,
qui définit la viabilité comme la capacité des microorga-
nismes vivants à former des colonies visibles (TREVORS et al.; SHAPIRO et al., documents cités); cette méthode, bien que fiable, a l'inconvénient de nécessiter un temps de réponse long (24 à 72 heures), qui n'est pas adapté aux applications précitées; - le test d'exclusion au bleu de méthylène dans lequel la viabilité est définie comme la capacité
des microorganismes à ne pas se colorer au bleu de méthy-
lène; c'est-à-dire que seules les cellules mortes sont
colorées en bleu (TREVORS et al., document cité); cepen-
dant ce test a l'inconvénient de surestimer la viabi-
lité; - évaluation intracellulaire en glycogène et en tréhalose; ce test est basé sur l'hypothèse que la
concentration intracellulaire de glycogène (ou de tréha-
lose) est correlée à la viabilité des microorganismes (SLAUGHTER et al., document cité); il faut cependant noter qu'il n'existe pas de corrélation unique entre le contenu en glycogène ou tréhalose intracellulaire et la
viabilité et que ce test est donc d'interprétation diffi-
cile; - le test aux esters de fluorescéine (FDA
notamment), basé sur l'utilisation de précurseurs non-
fluorescents (fluorochromes tels que esters de fluores-
céine), qui lorsqu'ils pénètrent dans les cellules de mammifères ou les microorganismes, sont hydrolysés par des estérases non-spécifiques et produisent un produit fluorescent qui reste piégé dans sa majeure partie ou totalement à l'intérieur desdites cellules ou desdits microorganismes (B. ROTMAN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, 55, 134-141; SHAPIRO et al., document cité), lorsque ces derniers présentent une membrane intacte
(capacité d'accumuler le produit fluorescent).
De nombreux Auteurs ont mis ce dernier test en
application pour déterminer la viabilité de microorga-
nismes, levures ou autres cellules eucaryotes (lymphocytes) et bactéries dans différents environnements (eaux, sols... ) (J. BRUNING et al., J. Immunol. Meth., 1980, 33, 33-44; M.J. CHILVER, document cité;
T.H. CHRZANOWSKI et al., Microb. Ecol., 1984, 10, 179-
185; J.P. TIAPER et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38, 268- 272; B.E. SOTERSTROM, Biol. Biochem., 1977, 9, 59-63; T. TALBOT et al., J. Immunol. Meth.,
1987, 99, 137-140).
L'intensité de fluorescence des cellules indi-
viduelles, peut, par exemple, être mesurée par cytométrie de flux (H.M. SHAPIRO, document cité) ou par microscopie
(TREVORS et al., document cité).
Toutefois, comme SHAPIRO l'a clairement mon-
tré, le critère de l'intégrité membranaire pour l'évalua-
tion de la viabilité présente des limites; en particu-
lier, la distinction entre les cellules marquées (qui sont considérées comme viables) et les cellules qui ne sont pas marquées (considérées comme non-viables), n'est pas absolue. En effet, des cellules qui ont perdu la capacité à se reproduire (c'est-à-dire des cellules considérées comme non-viables), peuvent néanmoins être
colorées si elles présentent une membrane intacte.
B. Méthode d'évaluation de la vitalité cellu-
laire: - le test du pouvoir d'acidification: ce test est basé sur l'hypothèse que les levures viables sont capables d'acidifier le milieu alors que les levures mortes ne le sont pas (KARA et al., document cité); cette méthode a l'inconvénient d'être une mesure globale, qui ne permet pas d'apprécier l'état cellulaire de la
population étudiée.
L'ensemble des méthodes de détermination de la viabilité ou de la vitalité des microorganismes de l'Art
antérieur présentent donc l'inconvénient majeur de ne pas être fiables ou de présenter un trop long délai de ré-
ponse (méthode de comptage sur milieu nutritif) et ne permettent donc pas, pour la plupart, de distinguer effectivement les cellules viables des cellules non- viables (faux-positifs, faux- négatifs, difficulté d'interprétation, long délai de réponse, etc.. .).30 La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une méthode, permettant d'évaluer de manière plus sûre la viabilité des microorganismes vivants, qui ne présente pas les inconvénients des procé- dés de l'Art antérieur (faux-positifs, faux- négatifs,35 interprétation difficile, long délai de réponse, etc...) et qui permet de suivre notamment l'évolution d'un
processus de fermentation, de manière fiable.
La présente invention a pour objet un procédé
d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorga-
nismes, comprenant: (a) le chargement des microorganismes en pro- duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20'C et 50'C avec un marqueur (fluorochrome), et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend:
(i) l'incubation desdits microorganismes pen-
dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra-
tion comprise entre 1 pM et 300 pM, en présence d'un tam-
pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour l'ob-
tention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a)), (ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes, (iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et
(iv) la mesure du temps nécessaire à la dispa-
rition de la moitié de la fluorescence intracellulaire des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fenêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise
entre 10'C et 40'C, de préférence entre 20'C et 40'C.
De manière inattendue, le temps nécessaire à
la disparition de la moitié de la fluorescence intra-
cellulaire des microorganismes, en présence d'une source
énergétique, est fonction de la vitalité des microorga-
nismes, définie comme la capacité des microorganismes à métaboliser rapidement après transfert d'un milieu pauvre
en nutriments à un milieu riche en nutriments.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du-
dit procédé, le marqueur est choisi parmi le FDA, le 6-
CFDA, le 5-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2',7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfoFDA, le 5 (6) 2',7' dichloro-FDA, l'ester de 5,6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-O-méthylfluorescéine,
le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-
carboxyfluorescéine (BCECF/AM), le pentaacétoxy ester de 2',7'bis(carboxyéthyl)-5(6)-fluorescéine (BCECF/AM), le
diacétate d'azidofluorescéine, le diacétate de chloro-
méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le
4-méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl-
umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4-
méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli-
feryl, l'alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7-
amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4-
méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la
glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé-
toxy-2,3-dicyanobenzène (ABD), 1'hydroéthidine, l'acétate
de résorufine.
Un tel marqueur (fluorochrome) est, comme pré-
cisé ci-dessus, une substance non fluorescente ou peu fluorescente, qui pénètre dans le microorganisme et y est hydrolysée, de manière à fournir un produit fluorescent
qui est piégé à l'intérieur dudit microorganisme.
De manière préférée, ledit marqueur est du
diacétate de carboxyfluorescéine (cFDA).
Lors de l'étape de chargement (a), le produit
fluorescent reste piégé correctement dans les microorga-
nismes stockés à 0', mais à partir de 10 , on observe un efflux de produit marqué rapide, en présence de ladite
source énergétique, si les microorganismes sont vitaux.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta-
geux dudit procédé, ladite source énergétique est un sucre. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre, ledit sucre est choisi parmi le glucose,
le fructose, le mannose et le lactose. Selon une modalité préférée de cette disposi-
tion, ledit sucre est du glucose 10 mrM. On peut citer à titre indicatif, comme tampon de marquage et/ou tampon d'efflux, un tampon acétate-NaCl à pH 7, un tampon PBS à pH 7, un tampon citrate-phosphate
à pH 4 ou 7,3 ou un tampon phosphate à pH 7.
Le tampon d'efflux peut être soit de composi-
tion identique au tampon de marquage (même pH), soit de
composition différente (pH différent).
L'élimination du marqueur non incorporé est
réalisée de préférence par lavage rapide des microorga-
nismes marqués.
En variante, le procédé conforme à l'invention comprend, après l'élimination du marqueur non incorporé (étape (ii)), (iii) la mise en oeuvre de l'étape (b) sur deux ensembles d'échantillons de microorganismes: - l'ensemble A, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8 et à une température comprise entre 10'C et 40'C, de préférence entre 20 C et 40'C; - l'ensemble B, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à 60 min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, auquel une source énergétique a été ajoutée, et à
une température comprise entre 10'C et 40'C, de préfé-
rence entre 20'C et 40'C; et (iv) l'évaluation de la vitalité des microorganismes en fonction du rapport des intensités de fluorescence intracellulaire: ensemble B/ensemble A. La mesure de l'intensité de fluorescence à des intervalles de temps réguliers permet d'apprécier le flux de sortie (efflux) du produit fluorescent; plus la vitesse d'efflux est importante, plus les microorganismes sont métaboliquement actifs. L'appréciation différentielle de l'efflux de
produit fluorescent entre les microorganismes de l'en-
semble B et les microorganismes de l'ensemble A permet d'évaluer la vitalité des microorganismes vivants de
manière fiable.
En effet, le tampon d'efflux, associé à une source énergétique ajoutée aux microorganismes (ensemble
B), stimule significativement l'efflux de produit fluo-
rescent (à pH 7,3 ou à pH 4, par exemple et à une tempé-
rature entre 20'C et 40'C), seulement si lesdits microor-
ganismes présentent une certaine vitalité.
De manière générale, les résultats obtenus par
cytométrie de flux se présentent sous la forme d'histo-
grammes. La perte de fluorescence (efflux à partir de ou 20'C) se caractérise par un déplacement vers les
bas canaux de fluorescence, dans les histogrammes.
L'addition de sucre (ensemble B) entraîne un déplacement (perte de fluorescence supérieure des microorganismes). C'est ce déplacement vers les bas canaux de fluorescence, augmenté par l'addition de sucre,
qui permet d'apprécier, comme précisé ci-dessus, la vita-
lité de la population de microorganismes.
Le procédé conforme à l'invention présente l'avantage d'apprécier la viabilité des microorganismes
de manière fiable, en faisant intervenir d'autres para-
mètres que l'intégrité membranaire.
La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il com- prend: - au moins un marqueur de microorganismes viables (esters de fluorescéine), - un tampon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, - un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8,
- un sucre.
Outre les dispositions qui précèdent, l'inven-
tion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti-
ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des
exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré-
sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune
manière une limitation.
EXEMPLE i: Mesure de la vitalité de levures.
A) Lavaae des levures: 2 ml d'une suspension de levures (approximativement 5.107 cellules /ml) sont centrifugés secondes à 13 490 g; le surnageant est éliminé par aspiration, puis le culot est remis en suspension dans 2 ml de tampon de marquage comprenant, par exemple, du tampon McIlvaine à pH 4 (le tampon McIlvaine est composé
de 30,7 ml d'acide citrique (100 mM) et 19,3 ml de di-
sodium hydrogène phosphate dihydrate (200 mM)); la sus-
pension est à nouveau centrifugée 90 secondes à 13 490 g, puis le surnageant de cette deuxième centrifugation est éliminé par aspiration; on procède à un deuxième lavage des levures par remise en suspension du culot dans 2 ml de tampon de marquage tel que défini ci- dessus; l'échantillon de levures ainsi lavé est placé dans de la
glace jusqu'au marquage.
La suspension de levures lavée ne doit pas
contenir moins de 2.106 cellules/ml.
Lorsque la concentration cellulaire initiale est importante (> à 2.106 cellules/ml), l'étape de lavage
peut être remplacée par une étape de dilution.
B) MarauaQe: On prélève 2 ml de suspension de levures lavées que l'on agite vigoureusement, puis on ajoute j1 de cFDA, de manière à obtenir une concentration
finale de 43 pM.
La suspension est ensuite incubée 15 min à
C et placée dans de la glace, pour éviter tout efflux.
Il faut noter que l'intensité de fluorescence
des levures après chargement en cF dépend de la concen-
tration en fluorochrome marqueur.
En conséquence, pour obtenir une bonne ana-
lyse, la concentration en marqueur doit être ajustée de telle sorte que l'intensité de fluorescence moyenne de la population de levures se trouve, de préférence, à droite
du canal 100 sur l'histogramme.
C) Lavaae aDrès marauae: 2 ml de suspension de levures marquées sont
centrifugés pendant 90 secondes à 13 490 g, puis on éli-
mine le surnageant par aspiration; le culot est remis en suspension dans 2 ml de tampon d'efflux, maintenu à 0'C
et constitué par un tampon McIlvaine à pH 7,3; on pro-
cède à nouveau à une centrifugation pendant 90 secondes à 13 490 g, on élimine le surnageant par aspiration et on remet en suspension le culot obtenu dans 2 ml de tampon
d'efflux à 0'C tel que défini ci-dessus.
L'échantillon est ensuite placé dans de la glace jusqu'au moment o l'on effectuera la mesure de
l'efflux proprement dite.
D) Mesure de l'efflux: * Méthode différentielle: a) Prélever un aliquot de 1 ml à partir de la
suspension obtenue en C) et la diluer dans 30 ml de tam-
pon d'efflux tel que défini ci-dessus, l'agiter et l'ana-
lyser directement à l'aide d'un cytomètre de flux (à
température ambiante).
b) Prélever un autre aliquot de 1 ml, à partir de la suspension obtenue en C) et la diluer, soit dans ml de tampon d'efflux tel que défini ci- dessus (ensemble A), soit dans 30 ml de tampon d'efflux auquel on a ajouté 200 Al de glucose (ensemble B), de manière à obtenir une concentration finale en glucose de 10 mM; on agite et on place ladite suspension dans un bain-marie à une température comprise entre 10 et 40'C, de préférence
entre 20 C et 40'C.
On prélève, à intervalles de temps régulier, des aliquots de chacune de ces suspensions (3 ml) que
l'on analyse directement par cytomètre de flux.
De manière idéale, la population de levures qui va être analysée par cytométrie de flux doit contenir
environ 5.104 à 105 cellules/ml (équivalent à approxima-
tivement 1.104 à 2.104 cellules sur l'histogramme).
Le volume de l'échantillon analysé et/ou la dilution dans le tampon d'efflux sera adapté en fonction de la concentration initiale en cellules. La température d'efflux peut varier entre 0 (pas d'efflux) et 40'C
(efflux important).
* Méthode au glucose seul Dans les conditions du b) ci-dessus, à 40'C,
l'histogramme d'une suspension de levures mises en cul-
ture pendant une nuit va "disparaître" après approximati-
vement 25 min (lorsque le glucose est ajouté). A 30'C,
l'histogramme d'une suspension de levures viables dispa-
raîtra après approximativement 50 min (lorsque le glucose
est ajouté).
* Résultats a) Mesure de l'efflux:
Des cellules de S. cerevisiae ont été char-
gées, comme précisé ci-dessus, à pH 4 et la rétention de cF est étudiée dans différentes conditions (ensembles A
et B).
Comme le montre la figure 1 (qui comporte en abscisse, le temps en minute, et en ordonnée, le pourcen-
tage de carboxyfluorescéine piégé), le cF est piégé dans des cellules stockées à 0 C, mais à 30', un efflux rapide 5 de cF se produit, dépendant du pH.
L'addition de glucose aux cellules à pH 7,3 entraîne une stimulation significative de l'efflux de cF, qui suggère que le cF est libéré d'une manière dépendante
de l'énergie. Le fructose et le mannose stimulent l'ef-
flux de cF de la même manière que le glucose, tandis que
le galactose et le glycérol n'ont aucun effet.
La figure 1 montre la mesure de l'efflux à pH 7,3, à 0 C (M), 30'C (A) et 30'C en présence de 10 mM
glucose (A). L'efflux à pH 4 a été mesuré à 30'C (O) et15 à 30 C en présence de glucose 10 mM (S).
Pour cette expérience, des cellules de S. cerevisiae ont été chargées en cF par incubation à 40'C avec du cFDA 0,22 mM; les cellules ont été lavées et remises en suspension dans un tampon McIlvaine pH 4,
comme précisé ci-dessus.
La stimulation du transport du cF à pH 7,3, après addition de glucose (figure 1), suggère que le
transport est effectivement actif.
L'efflux du cF peut être déterminé comme mon-
tré ci-dessus par cytométrie de flux; l'histogramme va subir un déplacement vers les bas canaux de fluorescence
sur l'axe des X comme résultat de la perte de la fluores-
cence intracellulaire et ce phénomène est corrélé à la
capacité des cellules à créer ou maintenir une force pro-
tonique active (ensemble B).
L'intensité de fluorescence intracellulaire en
cF des microorganismes de l'ensemble B à 15 min est infé-
rieure à celle de l'ensemble A d'un facteur compris entre 2 et 4, le rapport intensité de fluorescence ensemble B/intensité de fluorescence ensemble A étant inférieur à 1. Dans la méthode au glucose seul, on mesure le temps nécessaire à la disparition de la moitié de la
fluorescence intracellulaire, dans une fenêtre prédéter-
minée (voir figure 9).
b) Mise en évidence d'un svstème de transport actif:
- efflux de cF contre un gradient de concen-
tration: Pour déterminer si l'efflux de cF est lié à l'énergie métabolique et non à un flux passif, l'efflux
est étudié en présence d'une concentration de cF extra-
cellulaire importante (1 mM). Ensuite, l'efflux est cal-
culé, après la détermination de la concentration de cF intracellulaire.
La concentration de cF intracellulaire ini-
tiale est d'environ 0,5 mM. L'efflux, en l'absence et en présence de cF extracellulaire 1 mM est comparable, en présence d'une source d'énergie; l'efflux s'effectue
donc contre le gradient de concentration.
Ces résultats suggèrent effectivement que l'efflux de cF chez S. cerevisiae est réalisé à l'aide
d'un système de transport actif.
- Inhibition de l'efflux de cF: l'effet de différents composés sur l'efflux de cF a été étudié de manière à conforter l'hypothèse du
système de transport actif de cF.
(i) effet du DNP et de l'acide benzoique: la figure 2 illustre l'effet du DNP (1 mM) et de l'acide
benzoique (10 mM) sur l'efflux de cF.
Pour réaliser cet essai, les cellules sont préincubées 20 min à 40'C avec un tampon McIlvaine pH 4, en l'absence (S) ou en présence de 2, 4 DNP 1 mM (A) ou d'acide benzolque 10 mM (M). Après lavage, les cellules sont chargées en cF par incubation à 40'C avec 43 pM cFDA dans un tampon McIlvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon McIlvaine pH 7,3. Le test d'efflux est réalisé à 'C. Cette figure 2 montre que le DNP est plus efficace dans l'inhibition de l'efflux de cF que l'acide benzoïque. Ces résultats confortent la présence d'un
efflux énergie-dépendant.
(ii) effet du TPP+ (ions tétraphénylphospho-
nium):
la figure 3 montre que le TPP+, à une concen-
tration de 10 mM, inhibe complètement l'efflux de cF.
L'addition de TPP+ n'entraîne pas une diminution impor-
tante de la concentration intracellulaire en ATP. Ceci
suggère que l'efflux de cF est lié à la pompe à protons.
De manière plus précise, la figure 3 qui com-
porte, en abscisse, le temps en minute et, en ordonnée, le pourcentage de carboxyfluorescéine piégée, illustre
l'effet du TPP+ sur l'ef flux de cF (A) et sur la concen-
tration intracellulaire en ATP (B) dans des cellules de S. cerevisiae énergisées, comme suit: les cellules sont chargées en cF par incubation à 40'C avec du cFDA 43 gM
dans un tampon McIlvaine pH 4, lavées et remises en sus-
pension dans un tampon McIlvaine pH 7,3. L'essai est réa-
lisé à 30'C, l'efflux est mesuré en absence (S) ou en
présence de TPP+ 10 mM (A).
(iii) effet des inhibiteurs de l'ATP-ase: De tels composés sont notamment le vanadate,
le DES et le DCCD (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide); l'ef-
fet de ces composés sur la pompe à protons dans les cel-
lules de levures entières énergisées est illustré à la
figure 4.
La production d'ions H+ est mesurée de manière
continue, avec une électrode à pH (détermination directe-
ment à partir de la pente (en nmol H+/min/mg de pro-
téine)). Après l'addition de glucose (10 mM) (levures énergisées), la libération initiale d'H+ est augmentée à
* environ 540 nmol H+/min/mg de protéines. Parmi les inhi-
biteurs testés, le DES (150 gM) est le plus efficace: la production d'H+ en présence de glucose (10 mM) est de 122 nmol H+/min/mg de protéines. L'incubation avec le DCCD (200 gM) diminue la production d'H+ approximativement de 50 % à environ 330 nmol H+/min/mg de pro- téines, tandis que le vanadate, qui est un analogue de phosphate, ne montre qu'un faible effet (436 nmol/min/mg de protéines).10 Une plus longue pré-incubation des cellules
(45 min avec le DCCD ou le vanadate) ne change pas l'ef-
fet obtenu.
La figure 4, qui comprend, en abscisse, le temps en minute, et en ordonnée, le pourcentage de cF piégé, illustre l'effet sur l'efflux de cF (A) et sur la concentration intracellulaire d'ATP (B) de différents composés sur des cellules de S. cerevisiae énergisées,
par différents composés.
Comme dans les essais précédents, les cellules sont chargées en cF par incubation à 40'C avec du cFDA 43 pM dans un tampon McIlvaine pH 4, lavées et remises en
suspension dans un tampon McIlvaine pH 7,3.
L'essai est réalisé à 30'C. La courbe (O) correspond à l'addition d'aucun produit, la courbe (A) correspond à l'addition de DES (150 UM) ou la courbe (*)
correspond à l'addition de DCCD (100 AM).
Cette figure montre que l'inhibition de la
pompe à protons est corrélée avec l'inhibition de l'ef-
flux de cF. Dans les cellules entières énergisées, le DES inhibe de manière importante l'efflux de cF, tandis que
le DCCD ne montre qu'un faible effet.
La concentration en ATP intracellulaire n'est
pas influencée, ni par le DES, ni par le DCCD. Le vana-
date (1 mM) ne montre aucun effet.
c) Etude de la cinétiaue de l'efflux de cF: Les cellules sont chargées avec différentes concentrations de cF et la vitesse d'efflux initiale est
déterminée (figure 5).
La figure 5 comporte en abscisse, la concen-
tration intracellulaire en cF (mM) et en ordonnée, la vitesse d'efflux de cF (gmol/min), après chargement de cellules de S. cerevisiae avec du cF, par incubation à 'C, pendant des temps variables, avec du cFDA (0, 22 mM) dans un tampon McIlvaine pH 4, lavage et remise en suspension dans un tampon McIlvaine pH 7,3, comme précisé ci-dessus; à partir de la pente, dans le plot d'Arrhénius (figure 6), une énergie d'activation de kJ/mol est calculée, ce qui confirme l'implication d'un système de transport; apparemment le système de transport (flux de sortie du cF) obéit à la cinétique de
Michaelis-Menten.
Les résultats sont analysés sous la forme d'un plot d'Eadie-Hofstee et le Km du transport de cF de 0,25 mM est calculé. Les résultats indiquent que le cF
est libéré à l'aide d'un système de transport membra-
naire, à partir de cellules S. cerevisiae chargées comme décrit précédemment (incubation à 40'C avec différentes concentrations de cFDA dans un tampon McIlvaine pH 4), lavage et remise en suspension dans un tampon McIlvaine pH 7,3). L'efflux est mesuré à 30' en présence de glucose
(10 mM).
L'efflux, mesuré à différentes températures (figure 7) montre que cet efflux est dépendant de la température. E) Analyse des données obtenues en cvtométrie de flux: Le cytomètre de flux utilisé est un cytomètre
de flux Chemflow .
Le système fluidique comprend un flux lami-
naire fermé avec un débit maximum de 0,4 ml/min. Pour l'énumération par cytométrie de flux, un échantillon de gl est analysé. Dans des conditions normales, la concentration maximale de particules fluorescentes qui
peuvent être mesurées par ce cytomètre de flux est limi-
tée approximativement à 1.105/ml.
L'instrument comprend une source lumineuse constituée par un arc demercure HPO 100 W. La longueur d'onde d'excitation est sélectionnée par l'utilisation de
2 filtres de bandes et est compris entre 450 et 490 nm.
La longueur d'onde d'émission est de 515 nm et est sélec-
tionnée à l'aide d'un filtre dichroique de 500 nm (éliminant les signaux inférieurs à 500 nm) et un filtre
interférentiel (FI 515) à 515 nm.
Les données sont présentées sous forme d'his-
togramme dans lesquels l'axe des Y correspond au nombre de particules fluorescentes et l'axe des X est divisé en
canaux (0 à 255) correspondant à l'intensité de fluores-
cence des particules.
Une amplification logarithmique (mode logl) du signal entrant est appliquée pour mesurer directement un nombre plus grand de signaux sur un histogramme; les données peuvent être, si nécessaire, recalculées selon
une échelle linéaire.
La figure 8 illustre la détermination (histogramme) de l'efflux de cF. La concentration en cF intracellulaire moyenne d'une culture de S. cerevisiae chargée par du cFDA est d'environ 0,1 à 0,4 mM, qui est
approximativement équivalent à 1.107 molécules fluores-
centes/cellule. La concentration en fluorescéine intra-
cellulaire minimale qui pourrait être mesurée (canal 1
dans le mode log 1 du cytomètre de flux) est approximati-
vement compris entre 0,05 et 0,1 mM.
La figure 8 illustre un déplacement vers la gauche des histogrammes dû à la perte de fluorescence à d'une culture de levures chargée en cF. L'addition de
glucose entraîne un déplacement supplémentaire significa-
tif vers la gauche, de l'intensité de fluorescence des cellules. Pour montrer que ce déplacement supplémentaire est bien un paramètre de l'analyse de la vitalité des levures, des essais comparatifs sont effectués avec des levures S. cerevisiae stressées par une incubation courte à haute température (60'C, 1,5 min), du DNP (1 mM) ou de
l'acide benzolque (10 mM).
Les histogrammes obtenus montrent que ni le
nombre initial de particules fluorescentes, ni l'inten-
sité de fluorescence initiale des cellules chargées en
cF, sont significativement diminués.
Cependant, la diminution des CFU après traite-
ment à la température de la suspension de S. cerevisiae est supérieure à 4 unités log et le déplacement vers la
gauche de l'histogramme est significativement réduit.
Dans ce cas, l'addition du glucose n'a prati-
quement aucun effet; ceci suggère donc que les cellules
ne sont pas vitales.
A l'opposé, des cellules lavées préincubées avec de l'acide benzoïque ne montrent aucune diminution
des CFU, mais la réduction du déplacement de l'histo-
gramme est significativement importante comparée au contrôle. Cependant, l'addition postérieure de glucose
induit un déplacement vers la gauche (diminution de l'in-
tensité de fluorescence intracellulaire); ceci indique
que les cellules sont stressées, mais ont encore une cer-
taine vitalité.
Dans le cas du DNP, les cellules sont sévère- ment stressées, dans la mesure o on note une diminution
de la concentration de i'ATP intracellulaire et une dimi-
nution des CFU, mais le faible déplacement de l'histo-
gramme vers la gauche après addition de glucose indique qu'au moins une partie importante de la population a
perdu beaucoup de sa vitalité.
Dans les histogrammes de la figure 8, les cel-
lules ont été chargées par 15 minutes d'incubation avec du cFDA 43 gM à 40 C dans un tampon McIlvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon McIlvaine
à pH 7,3.
La perte de fluorescence à 40 C après 0, 20, 40 et 60 minutes est mesurée avec un cytomètre de flux pour des cellules non énergisées (histogrammes A à D) et pour des cellules énergisées avec du glucose (10 mM)
(histogrammes E à F).
Les cellules ont été prétraitées comme suit: aucun traitement (histogrammes A et E), préincubation avec du DNP (1 mM) (histogrammes B et F), traitement par la chaleur à 60'C pendant 90 secondes (histogrammes C et G) et préincubation avec de l'acide benzolque (10 mM)
(histogrammes D et H).
La relation viabilité-vitalité des cellules est illustrée à la figure 9 qui montre qu'il existe une excellente corrélation entre les cellules viables (méthode de comptage sur milieu nutritif: comptage après jours d'incubation, sur un milieu agar Sabouraud) et la fraction de cellules de levures qui ont perdu la plupart de leur cF après 30 min à 40'C, de telle sorte qu'elles
ne peuvent plus être détectées par le cytomètre de flux.
Les résultats obtenus sur cette figure 9 ont été effectués en chargeant les cellules avec du cF par incubation avec du cFDA 43 SM dans un tampon McIlvaine pH 4, lavées et remises en suspension dans un tampon
McIlvaine pH 7,3.
Le test d'efflux est réalisé à 40'C. Les cel-
lules fluorescentes sont comptées au temps 0 et après 30 min.
EXEMPLE 2: Mesure de la vitalité de bactéries.
A) Lavage des bactéries: Des bactéries Lactococcus lactis cultivées pendant une nuit dans un milieu M17, sont lavées et remises en suspension dans un tampon phosphate 50 mM pH 7. B) Marcuace: On prélève 2 ml de suspension de bactéries lavées que l'on agite vigoureusement, puis on ajoute du cFDA, de manière à obtenir une concentration finale de 43 pM. La suspension est ensuite incubée 10 min à 'C et placée dans de la glace (0'C), pour éviter tout efflux. C) Lavaae après marauaae: 2 ml de suspension de bactéries marquées sont centrifugés pendant 4 à 5 min à 13 490 g, puis on élimine
le surnageant par aspiration; le culot est remis en sus-
pension dans 2 ml de tampon d'efflux, maintenu à 0'C, et
constitué par du tampon phosphate 50 mM pH 7; on pro-
cède, éventuellement, à nouveau à une centrifugation pen-
dant 4 à 5 min à 13 490 g, on élimine le surnageant par aspiration et on remet en suspension le culot obtenu dans
2 ml de tampon d'efflux à 0'C.
D) Mesure de l'efflux: On mesure l'efflux, dans les conditions de l'exemple 1, en présence de glucose 10 mM ou de lactose
mM, le tampon d'efflux étant, comme ci-dessus, un tam-
pon phosphate 50 mM pH 7.
Les résultats sont illustrés à la figure 10 (abscisse: temps en min, ordonnée: pourcentage de cFDA retenu). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de
mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-
nent d'être décrits de façon plus explicite; elle en em-
brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve-
nir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écar-
ter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (4)
1') Procédé d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorganismes, comprenant:
(a) le chargement des microorganismes en pro-
duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20'C et 50'C avec un marqueur (fluorochrome), et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend:
(i) l'incubation desdits microorganismes pen-
dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra-
tion comprise entre 1 pM et 300 pM, en présence d'un tam-
pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour l'ob-
tention de microorganismes chargés en produit fluorescent (étape de chargement (a)), (ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes, (iii) l'addition d'une source énergétique, préalablement à l'étape (b) et
(iv) la mesure du temps nécessaire à la dispa-
rition de la moitié de la fluorescence intracellulaire
des microorganismes, par cytométrie de flux, dans une fe-
nêtre d'intensité prédéterminée, à un pH compris entre 4 et 8 (tampon d'efflux) et à une température comprise
entre 10 C et 40'C, de préférence entre 20'C et 40'C.
2') Procédé d'évaluation et de mesure de la viabilité des microorganismes, comprenant:
(a) le chargement des microorganismes en pro-
duit fluorescent, par incubation desdits microorganismes à une température comprise entre 20'C et 50'C avec un marqueur (fluorochrome), et (b) la mesure de l'intensité de fluorescence intracellulaire par cytométrie de flux, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend:
(i) l'incubation desdits microorganismes pen-
dant 5 à 20 minutes avec ledit marqueur à une concentra-
tion comprise entre 1 pM et 300 M, en présence d'un tam-
pon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, pour l'ob-
tention de microorganismes chargés en produits fluores-
cents, (ii) l'élimination du marqueur non incorporé dans les microorganismes, (iii) la mise en oeuvre de l'étape (b) sur deux ensembles d'échantillons de microorganismes: - l'ensemble A, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8 et à une température comprise entre 10'C et 40'C, de préférence entre 20'C et 40'C; - l'ensemble B, dans lequel l'intensité de fluorescence intracellulaire des microorganismes est mesurée à des intervalles de temps réguliers pendant 5 à min, dans un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, auquel une source énergétique a été ajoutée, et à
une température comprise entre 10'C et 40'C, de préfé-
rence entre 20'C et 40 C; et (iv) l'évaluation de la vitalité des microorganismes en fonction du rapport des intensités de fluorescence intracellulaire: ensemble B/ensemble A.
3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que le marqueur est
choisi parmi les esters de fluorescéine: le FDA, le 6-
CFDA, le 5-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2',7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfoFDA, le 5 (6) 2',7' dichloro-FDA, l'ester de 5,6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-O-méthylfluorescéine,
le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-
carboxyfluorescéine (BCECF/AM), le pentaacétoxy ester de 2',7'bis(carboxyéthyl)-5(6)-fluorescéine (BCECF/AM), le
diacétate d'azidofluorescéine, le diacétate de chloro-
méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4-méthylumbelliferyl bêta-Dgalactoside, le 4-méthyl-
umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4-
méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli-
feryl, l'alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7-
amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4-
méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la
glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé-
toxy-2,3-dicyanobenzène (ABD), l'hydroéthidine, l'acétate
de résorufine.
4') Procédé selon l'une quelconque des reven-
dications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit marqueur est
du diacétate de carboxyfluorescéine.
') Procédé selon l'une quelconque des reven-
dications 1 à 4, caractérisé en ce que la source énergé-
tique est un sucre.
6') Procédé selon la revendication 5, caracté-
risé en ce que le sucre est choisi parmi le glucose, le
fructose, le mannose et le lactose.
7') Procédé selon la revendication 6, caracté-
risé en ce que le sucre est du glucose 10 mM.
8') Kit ou trousse pour la mise en oeuvre du
procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,
caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un marqueur de microorganismes viables, - un tampon de marquage à un pH compris entre 4 et 8, - un tampon d'efflux à un pH compris entre 4 et 8, et
- un sucre.
9') Application du procédé selon l'une quel-
conque des revendications 1 à 7, à l'évaluation d'une
fermentation.
) Application du procédé selon l'une quel-
conque des revendications 1 à 7, au suivi d'une fermenta-
tion.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| FR9307848A FR2707665A1 (fr) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Procédé de mesure et d'évaluation de la vitalité des microorganismes et ses applications. |
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| FR9307848A FR2707665A1 (fr) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | Procédé de mesure et d'évaluation de la vitalité des microorganismes et ses applications. |
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