WO2002099133A1 - Procede ameliore de detection et d'identification de micro-organismes causes d'infections - Google Patents

Procede ameliore de detection et d'identification de micro-organismes causes d'infections Download PDF

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WO2002099133A1
WO2002099133A1 PCT/JP2002/005107 JP0205107W WO02099133A1 WO 2002099133 A1 WO2002099133 A1 WO 2002099133A1 JP 0205107 W JP0205107 W JP 0205107W WO 02099133 A1 WO02099133 A1 WO 02099133A1
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Tsuneya Ohno
Akio Matsuhisa
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • One type of DNA probe for detection having a chain length of about 350 to about 600 bases The above DNA probe, and
  • the temperature at which this enzyme is reacted is about 26 ° C. to about 59 ° C., and the reaction time at which this enzyme is reacted is about 15 minutes to about 120 minutes.
  • the DNA and the DNA probe are combined in the presence of a surfactant, especially an anionic surfactant, preferably sodium dodecyl sulfate (SDS). It is hybridized.
  • a surfactant especially an anionic surfactant, preferably sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • FIG. 2 is a view showing a state when the cells are fixed at various leukocyte cell densities.
  • FIG. 3 shows the time course of the activity of lytic enzymes on a) Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, (b) Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli, and (c) Enterococcus faecal is.
  • Figure 4 shows the concentration dependence of the lytic activity of (a) 300 units / ml of N-acetylmuramidase, (b) 10,000 units / 111 of lysozyme, and (c) 50 units / ml of lysosphin fin by addition of DMS0.
  • FIG. 1 shows the concentration dependence of the lytic activity of (a) 300 units / ml of N-acetylmuramidase, (b) 10,000 units / 111 of lysozyme, and (c) 50 units / ml
  • FIG. 7 shows the effect of the enzyme treatment on the phagocytic sample, (a) a phagocytic sample of Staphylococcus aureus before the enzyme treatment, (b) a phagocytic sample of Enterococcus faecal is before the enzyme treatment, and (c) It is a figure which shows the state after the sample (a) was subjected to the enzyme treatment, and (d) the state after the sample (b) was subjected to the enzyme treatment.
  • Figure 10 shows the results of Southern blots (upper panel) and electrophoresis (lower panel), which show the chain length of the detection probe obtained by digoxigenin labeling of (a) the SA probe and (b) the PA probe and the signal intensity of the label.
  • FIG. 10 shows the results of Southern blots (upper panel) and electrophoresis (lower panel), which show the chain length of the detection probe obtained by digoxigenin labeling of (a) the SA probe and (b) the PA probe and the signal intensity of the label.
  • the clinical specimen that can be used in the present embodiment may be any clinical specimen containing phagocytes derived from a living body, such as blood, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, runny nose, sputum And other body fluids.
  • phagocytes derived from a living body
  • a living body such as blood, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, runny nose, sputum And other body fluids.
  • phagocytic cells derived from living organisms in the washing solution after washing the nasal cavity, bronchi, skin, various organs, bone, etc. Since these are contained, they can also be used as the clinical specimens of the present invention.
  • the slide glass is again immersed in acetone containing about 1 to about 10% APS for 1 minute, immediately washed lightly with acetone and sterile purified water, and then air-dried, preferably at about 20 ° C to about 60 ° C. Can be prepared by drying at about 42 ° C.
  • Lysostaphin is an enzyme that reduces the absorbance at 600 nm when Staphylococcus epidermidis and lysostaphin are reacted at 37 ° C for 5 minutes in PBS. If the enzyme activity of Staphylococcus aureus is 37 ° (:, ⁇ 7.5, and the absorbance at 620 nm is reduced from 0.240 to 0.125 in 10 minutes as 1 unit, use 500 units / mg or more. Is preferred.
  • a probe diluent was prepared. Apply a solution containing the DNA probe for detection (probe solution) to the smear site, and apply the solution at about 25 to about 50 ° C. Preferably, it is allowed to stand in a wet box at about 37 ° C. to about 42 ° C. for about 1 to about 3 hours, preferably for about 2 hours.
  • a blocking operation may be performed. Specifically, 1 ml of a blocking reagent (prepared to a total volume of 10 ml with 2 heron normal serum, 0.5 ml of PBS stock solution, and sterile purified water) per slide glass in a wet box was dropped onto the smear site. Let stand for ⁇ 60 minutes. Then remove the blocking reagent.
  • a blocking reagent prepared to a total volume of 10 ml with 2 heron normal serum, 0.5 ml of PBS stock solution, and sterile purified water
  • an edible dye for example, yellow No. 4 (tartrazine) can be used to further clarify the signal-cell contrast.
  • the substrate is colored purple and the naphthol black is colored blue, so it is difficult to counterstain due to the similar color.
  • this method was applied to the present invention, it was found to be useful when performing counterstaining.
  • the use of food dyes is an unprecedented method.
  • Anionic surfactants are classified into carboxylic acid type, sulfonic acid type, ester sulfate type and phosphate ester type, and nonionic surfactants are ester type, ether type, ester ether type and alkanol type. It is divided into monoamide type.
  • Cationic surfactants are classified into an alkylamine salt type and a quaternary ammonium salt type, and amphoteric surfactants are classified into a carboxybetaine type, a 2-alkylimidazoline derivative type and a dalysine type.
  • the carboxylic acid form of the anionic surfactant is subdivided into fatty acid monocarboxylates, N-acyl sarcosine salts and N-acyl glutamates.
  • fatty acid monocarboxylate includes sodium laurate And N-lasilyl sarcosine salts, N-lauroyl sarcocin sodium, N-lacilyl glutamate and N-lauroyl glutamate.
  • Typical examples thereof are polyethylene glycol fatty acid, polyethylene glycol oleate, and fatty acid polyoxyethylene sorbitan, urethane palmitate.
  • the alkanolamide type is only one of the fatty acid alkanolamides.
  • a representative example is lauric acid diethanolamide.
  • Alkylamine salt forms of surfactants include monoalkylamine salts, dialkylamine salts and trialkylamine salts, a typical example being monostearylamine hydrochloride.
  • the various surfactants described above are used in the in situ hybridization step, and the method of use is not particularly limited.
  • it may be mixed in a probe solution or a probe diluent, or may be mixed with a probe solution.
  • a solution containing a surfactant may be added before, simultaneously with, or after the application of the probe solution to the smear site, or a person skilled in the art can make appropriate changes.
  • the enzyme used in the DNA exposing step is at least one enzyme selected from the group consisting of lysosomal fin, lysozyme, N-acetylmethylamidase, zymolase, and a surfactant.
  • a kit for detecting and / or identifying an infectious disease-causing bacterium, which comprises an added probe solution and at least one DNA probe for detection, is also included.
  • the kit contains a blood separation reagent, an enzyme pretreatment reagent, an enzyme reagent, an acetylation reagent, a probe solution, a blocking reagent, a labeled antibody, a labeled antibody diluent, and a color development pretreatment solution, as shown in the examples below.
  • the method of the present invention provides accurate results by a very short and simple operation of about 8 hours to complete the entire operation. Especially because It can be a useful marker in the diagnosis and prognosis of infectious diseases such as sepsis or bacteremia that require prompt treatment.
  • Enterococcus faecal is inoculated into 50 ml of the BHI liquid medium and cultured at 37 ° C for 8 hours or more. The culture was centrifuged at 2,0Xg for 10 minutes at 4 ° C to collect the cells, suspended in PBS, and then heat-treated with an autoclave (120 ° C, 10 minutes).
  • Example 2 5 ml of heparinized healthy human blood was collected, and leukocytes were collected according to the method described in Example 1. Next, leukocytes are suspended in an appropriate amount of PBS, and the number of cells is counted using a hemocytometer. The cell number is adjusted to about 5 ⁇ 10 4 cells / ⁇ to about 2.5 ⁇ 10 5 cells / ⁇ The 5 1 is APS It was smeared on a ride glass well, air-dried, and fixed according to the method of Carnoy fixation described in Example 2. Using this sample, a test was performed according to the methods described in Examples 3 to 11.
  • Example 17 (1) 1 and the phagocytic sample of each bacterium prepared in Example 17 (1) 2 were spread on each well of an APS-coated slide glass in an amount of 5 l, and air-dried. Next, immerse in Carnoy's fixative as described in Example 2 for 20 minutes, immerse in 75% ethanol for 5 minutes, wash Carnoy's fixative, air-dry, and store at 4 ° C until use for testing (See Example 2). Then, pretreatment of the fixed sample was performed according to Example 3.
  • Example 17 (2) Performed according to the method described in (3).
  • a phagocytic sample prepared by the method described in Example 17 (1) 1 and 2 was used as a specimen.
  • the phagocytosis rate of the SA digested sample used was 24%, 1.48 ⁇ 10 5 cells / well.
  • the phagocytosis rate of the SE-phagocytosed sample was 28%, 2.07 ⁇ 10 5 cells / Pe.
  • the phagocytosis rate of the A-phagocytosed sample was 11%, which was 1.59 ⁇ 10 5 cells / Pe.
  • the phagocytosis rate of the EF digested sample was 24%, which was 1.72 ⁇ 10 5 cells / per ell.
  • the plate was immersed in a 2% blocking reagent (manufactured by Roche) for 30 minutes, and then a 1 / 5,000 amount of an alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody was added, followed by immersion for 30 minutes.
  • the mixture was shaken for 10 minutes with 100 mmol / 1 tris-hydrochloric acid (pH 7.5) and 150 ol / l sodium salt and washed twice. Then, it was washed by shaking with 100 bandol / l Tris-HCl (pH 9.5) and 150 mmol / l sodium chloride for 10 minutes. Thereafter, the color was developed by immersion in an NBT / BCIP solution. Finally, it was immersed in purified water to stop color development and dried. As a result, ⁇ in Fig. 10
  • the detection probe was digoxigenin-labeled from EC-24 (SEQ ID NO: 11), EC-34 (SEQ ID NO: 12) and EC-39 (SEQ ID NO: 13) as described in Example 24. And those prepared to have a length of about 350 to about 600 bases were used alone or in combination of three kinds. From the results obtained, as shown in Fig. 11, (a) EC-24, (b) EC-34 or (c) EC-39 were used rather than ( d) It was evident that the mixed probe "MIX" obtained by mixing these could clearly detect the signal and enhance the sensitivity.

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Description

明 細 書 感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法 技術分野
本発明は、 感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法に 関する。 また、 感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキ ット、 臨床検体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法および敗血症原 因微生物または菌血症原因菌を特定する方法に関する。 景技術
従来より、 血液中に存在する菌の証明法として血液培養法が広く用いられ ているが、 培養 ·分離同定の操作に 3〜14日程度の日数がかかる上、 検出率 が約 10%と低く、 敗血症のような緊急を要する診断法としては、 十分治療に 寄与していないのが現状である。
そこで、 本発明者らは上記問題を解決するために、 貪食細胞によって貪食 された外来微生物を検出または同定するための方法、 すなわち、 貪食細胞中 に存在する外来微生物由来の遺伝子を、 該遺伝子に特異的にハイブリダィゼ ーションすることのできるプローブを用いて in s i tuハイブリダィゼーショ ンを施すことで、 その検出を図る方法を発明した (特公平 7— 40号)。
特公平 7— 40号に記載された方法に従って、 敗血症が疑われた患者血液を 用いて検査したところ、 血液培養法と比較して約 4倍の感度で菌を検出し、 さらに 24時間以内に判定できたことなどから、 感染症分野において脚光を浴 びるに至っている。
本願発明は、 特公平 7— 40号に記載された発明、 すなわち、 生体由来の食 細胞を含む臨床検体より食細胞を得、 得られた食細胞を固定し、 該食細胞膜 の透過性を亢進させる処理を施し、 該食細胞中に存在すると予想される感染 症原因菌の D NAを露出させる処理を施し、 この露出 D NAにストリンジェ ントな条件下でハイブリダイゼ一ションできる検出用 D N Aプロ一ブを用い て in s i tuハイブリダィゼーシヨンを行い、 得られたシグナルにより感染症 原因菌を検出および Zまたは同定するための方法について、 この方法による 検出効率 ·検出感度をさらに高めることを目的とする。 発明の開示
本発明は、 以上詳説した現状に鑑みて成し遂げられたものであり、 その要 旨とするところは、 以下のとおりである。
生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、 得られた食細胞を固定 し、 該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、 該食細胞中に存在すると 予想される感染症原因微生物の D N Aを露出させる処理を施し、 該 D NAに ストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーションできる検出用 D NAプ ローブを用いて in s i tuハイブリダィゼ一シヨンを行い、 得られたシグナル により感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するための方法であつ て、 下記(1)〜(8)の特徴、 すなわち、
(1) 固定化する食細胞の密度 ( X個/ ml) が、 約 5 X 106個/ mlく X個/ ml <約 1 X 108個 /mlであること、
(2) D NA露出工程においてリゾスタフインが使用され、 その力価が、 約 1単位/ ml〜約 1, 000単位 /mlであること、
(3) D NA露出工程においてリゾチームが使用され、 その力価が、 約
1, 000単位/ ml〜約 1 , 000, 000単位/ mlであること、
(4) D N A露出工程において N-ァセチルムラミダーゼが使用され、 その 力価が、 約 10単位/ ml〜約 10, 000単位/ mlであること、
(5) D N A露出工程においてザィモラーゼが使用され、 その力価が、 約 50単位/ ml〜約 500単位/ mlであること、
(6) in s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程において界面活性剤を使用 すること、
(7) 検出用 D NAプローブが、 約 350〜約 600塩基長の鎖長を有する 1種 以上の D NAプローブであること、 および
(8) 検出用 D NAプローブの濃度が、 約 0. lng/ i l〜約 2. 2ng/^ lの濃度 であること、
の少なくとも 1つ以上の特徴を有する、 感染症原因微生物を検出および Z または同定するための方法である。
D N A露出工程にあっては、 好ましくは、 リゾスタフイン、 リゾチーム、 N -ァセチルムラミダーゼおよびザィモラーゼより選択される 1つ以上の酵素 が使用され、 そして、 リゾスタフインの力価が、 約 10単位/ ml〜約 100単位/ ml、 リゾチームの力価が約 10, 000単位 /ml〜約 100, 000単位/ ml、 N -ァセチル ムラミダ一ゼのカ価が約 100単位 /ml〜約 1, 000単位 /ml、 ザィモラ一ゼのカ価 が約 100単位/ ml〜約 500単位 /mlであるものを使用する。
D NA露出工程にあっては、 好ましくは、 酵素を使用し、 そして、 この酵 素を反応させる温度を約 26°C〜約 59°Cとし、 また、 この酵素を反応させる反 応時間を約 15分〜約 120分とする。
D NA露出工程にあっては、 好ましくは、 さらに食細胞の形態を保持させ る物質、 特に、 フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィドを、 好ましくは、 約 10 mo l/l〜約 10讓 o l/lの濃度で使用する。 食細胞の形態を保持させる 物質として、 好ましくは、 ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質を使 用する。
食細胞の形態を保持させる物質を、 好ましくは、 ジメチルスルフォキシド にて溶解された物質とし、 そして、 ジメチルスルフォキシドは D NA露出ェ 程で用いられる溶液において 5 %未満の濃度で調製する。
In s i tuハイブリダィゼーシヨンの工程にあっては、 D NAと D NAプロ —ブとが、 界面活性剤、 特に、 ァニオン界面活性剤、 好ましくは、 ドデシル 硫酸ナトリゥム(SDS)の存在下でハイプリダイズされる。
In s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程にあっては、 好ましくは、 ハイブ リダィズ反応させる温度を約 25°C〜約 50°Cとし、 そして、 ハイブリダィズ反 応させる反応時間を約 30分〜約 900分とする。 固定工程の前に、 得られた食細胞を支持担体上に支持させる工程をさらに 含み、 なおかつ、 その支持担体を、 3-ァミノプロピルトリエトキシシランを コートしたスライドグラスとする。
シグナルの検出の際に、 シグナルと細胞のコントラストを明確にさせるた めの色素を使用する。 また、 臨床検体を、 好ましくは、 血液とする。
さらに、 本発明によれば、 食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を 得、得られた食細胞を固定し、その細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、 その食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物の D NAを露出させ る処理を施し、 該 D NAにストリンジェントな条件下 Λィブリダイゼ一ショ ンできる検出用 D N Aプローブを用いて界面活性剤の存在下で in s i tuハイ ブリダィゼーションを行い、 得られたシグナルにより感染症原因微生物を検 出および Zまたは同定するためのキットであって、
(1) D N A露出工程において使用される酵素が、 少なくとも、 リゾス夕 フィン、 リゾチーム、 N-ァセチルムラミダ一ゼ、 ザィモラ一ゼからなる群よ り選択される 1種以上の酵素であり、 および
(2) 少なくとも 1種以上の検出用 D NAプローブを含む、
感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキットも提供され る。
また、 本発明によれば、 生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食 細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法であって、 前出の感染症原因微生物の検出および/または同定方法における in s i tuハ イブリダィゼ一シヨン法を用いて該遺伝子を検出する工程を含み、 該臨床検 体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。
そして、 敗血症または菌血症の診断方法であって、 前出の感染症原因微生 物の検出および Zまたは同定方法における in si tuハイブリダィゼ一シヨン 法を用いて原因微生物の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、 同定された結果に基づいて敗血症原因微生物または菌血症原因菌を特定する 方法も、 本願発明によって提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンを(a) 界面活性剤(SDS)不使用 下および (b) 界面活性剤 (SDS)使用下で実施した結果を示す図である。
第 2図は、 種々の白血球細胞密度で固定した際の様子を示す図である。 第 3図は、 a) Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidi s、 (b) Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia col i、 ならびに (c) Ent erococcus faecal isに対する 溶菌酵素の活性を経時的に示す図である。 第 4図は、 (a) N-ァセチルムラミダ一ゼ 300単位/ ml、 (b) リゾチーム 10, 000単位/1111、 および(c) リゾス夕フィン 50単位/ mlの溶菌活性に対する DMS0の添加による濃度依存的効果を示す図である。
第 5図は、 白血球に形態劣化をもたらすプロテア一ゼの作用を抑制するた めに用いる PMSFの添加効果を、 (a) プロテア一ゼ 0. 2単位/] nlのみ、 (b) PMSF 1 mol/ml添加、 (c) PMSF 10 mol/ml添加、 (d) PMSF O. lmmol/ml添 加、 および(e)PMSF 1匪 ol/ml添加について示す図である。
第 6図は、 本発明に従って調製した貪食サンプルにおいて、 食細胞が細菌 を貪食して形態変化を起こしていることを示す図である。
第 7図は、 貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図で、 (a) 酵素処 理前の Staphylococcus aureusの貪食サンプル、 (b) 酵素処理前の Enterococ cus f aecal i sの貪食サンプル、 (c) サンプル(a)を酵素処理した後の様子、 および (d) サンプル(b)を酵素処理した後の様子を示す図である。
第 8図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンでの至適プローブ濃度の検討 のために用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。 第 9図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンでの至適温度の検討のために 用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。
第 10図は、 (a) SAプロ一ブおよび (b) PAプローブのジゴキシゲニンラベル 化で得られる検出用プローブの鎖長とラベルによるシグナル強度を示すサザ ンブロット (上段) および電気泳動 (下段) の図である。
第 11図は、 Escher i chi a col i貪食サンプルに関する in s i tu八イブリダィ ゼ一シヨンにおいて、 検出用プローブとして、 (a) EC- 24、 (b) EC- 34、 (c) EC - 39、 および (d)プローブ(a)〜(c)の混合プロ一ブ (M I X)を用いた場合に認 められたシグナル検出の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本実施態様において使用することができる臨床検体としては、 生体由来の 食細胞が含まれる臨床検体であればいずれでも良く、例えば、血液、組織液、 リンパ液、 脳脊髄液、膿、 粘液、 鼻水、 痰などの体液が挙げられる。 また、 糖尿病、 腎障害、 肝障害などの病態によっては、 尿、 腹水、 透析排液など、 その他、 鼻腔、 気管支、 皮膚、 各種臓器、 骨などを洗浄した後の洗浄液にも 生体由来の食細胞が含有されるため、 これらも本発明の臨床検体とすること ができる。
加えて、 皮膚、 肺、 腎、 粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いる ことができる。 これは、 食細胞の一つであるマクロファージには、 単球、 肺胞マクロファージ、 腹腔マクロファ一ジ、 固定マクロファージ、 遊離マク 口ファージ、 ハンゼマンマクロファ一ジ、 炎症性マクロファージ、 肝クッパ —細胞、 脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、 血液のみな らず、 これらを含む組織も本発明の臨床検体として用いることができる。 例えば、 腎炎が疑われる患者より腎生検により腎組織を採取し、 トリプシン 等の酵素を用いることにより細胞を剥離して該組織中に存在する食細胞を 得、 得られた食細胞を用いることによって、 腎炎の原因微生物を検出および 同定することができる。
本明細書で使用する 「食細胞」 の語は、 外来微生物をはじめとする異物を 自身の細胞内に取り込むことのできる細胞であれば特に限定されるものでは なく、 例えば、 マクロファージ、 単球、 好中球、 好酸球などが挙げられる。 また、 U937細胞、 HL60細胞などの食細胞系も使用できる。 感染症の原因 ともなる外来微生物としては、 食細胞によって貪食される微生物であれば特 に制限はなく、 細菌、 真菌、 ウィルス、 原虫、 寄生虫等が含まれる。 としては、 例えば、 ブドウ球菌、 緑膿菌、 腸球菌、 大腸菌、 連鎖球菌、 肺炎 球菌、 結核菌、 へリコパクター 'ピロリ菌、 リステリア、 エルシニア、 ブル セラ等が挙げられる。 真菌としては、例えば、 カンジダ、 ァスペルギルス、 ァクチノミセス、 コクシジオイデス、 ブラスミセス等が挙げられる。 ウイ ルスとしては、 例えば、 インフルエンザウイルス、 ポリオウイルス、 ヘルべ スウィルス、 肝炎ウィルス、 エイズウイルス等が挙げられる。 原虫として は、 例えば、 アメーバ赤痢、 膣トリコモナス、 マラリア、 トキソプラズマ等 が挙げられる。 寄生虫としては、 トリパノゾーマ等が挙げられる。 特に、 敗血症または菌血症の原因菌としては、 例えば、 グラム陽性菌であるスタフ イロコッカス属 (Staphylococcus aureus^ Staphylococcus epidermidis)、 ェンテロコッカス属 (Enterococcus faecalis、 Enterococcus faecium、 Stre ptococcus pne画 niae、 Streptococcus pyogenes、 Streptociccus agalaci i ae)、 グラム陰性菌である大腸菌 (Escherichia coli)、 ェンテロパクター (Enterobacter cloacae八 クレブシエラ (Klebsiel la pneumoniae) 等の: 腸 菌類縁腸内細菌群 (Klebsiella oxytoca、 Serratia marcesens、 Proteus vulgaris, Citrobacter freundii), 好気性桿菌であるシユードモナス属
(Pseudomonas aeruginosa), 嫌気性菌であるクロストリジゥム菌 (Clostri dium perfringens)^ パクテロイデス菌 (Bacteroides fragilis) 等が挙げ られる。 まれに、 Acinetobacter calcoaceticus、: Aeromonas hydrophi 1 ia Flavobacterium meningosept icum. Bacillus cereus等が、 原因菌となるこ ともある。
臨床検体からの食細胞 (白血球) 画分の取得には、 公知の方法を使用する ことができる。 例えば、 へパリン加静脈血約 5ml (白血球数の少ない場合 には 10ml) を採取し、 この血液と血液分離試薬 (塩化ナトリウム 225mg、 デ キストラン (分子量 200,000〜300,000) 1.5 g、 滅菌精製水にて全量 25mlに 調製したもの) とを 4 : 1程度の割合で混和した後、 約 10°C〜約 40°Cで、 約 15分〜約 120分間、 好ましくは、 約 37 で、 約 30分間静置することにより、 白血球画分 (上層) を取得することができる。 このようにして得た白血球画分を、 0 °C〜約 20°Cにて、 約 lOO X g〜約 500 X gで、 約 3分〜約 60分間、 好ましくは、 約 4 °Cにて、 約 140 X g〜約 180 X gで、 約 10分間遠心分離することによって、 白血球を得ることができる。 この際に赤血球が混入した場合、 溶血操作を行うのが好ましい。 例えば、 白血球のペレツトに滅菌精製水 l mlを加えて懸濁し、 直ちに過剰量の PBS (塩 化ナトリウム 18. 24 g、 リン酸一水素ナトリウム 12水和物 6. 012 g、 リン酸二 水素ナトリウム 2水和物 1. 123 g、 滅菌精製水にて全量 120mlにしたもの
(PBS原液;以下、 単に 「PBS原液」 と称する) を滅菌精製水にて 20倍に希釈 したもの;以下、 単に 「PBS」 と称する) を加えて等張化した後、 再度 4 °C 下、 約 O X g〜約 180 X gで、 約 10分間遠心分離すれば良い。 また、 上記 遠心分離を行わなくとも、 貪食細胞が本来保有する接着能力を利用して、 後 述するスライドグラスに接着させることもできる。
白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。 具体的には、 白血球を支持できる担体 (支持担体) に白血球を支持せしめ、 カルノア固定液 (エタノール:クロ口ホルム:酢酸 = 6 : 3 : 1の容量比で 混合した液) に約 20分間程度浸した後、 約 50%〜約 90%、 好ましくは、 約 75 %エタノール液に約 5分間浸し、 完全に風乾する。
前記支持担体は、 不溶性素材のものが好ましく、 例えば、 ガラス、 金属、 合成樹脂(ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、 ポリ塩化ビニル、 ポリエステル、 ポリアクリル酸エステル、 ナイロン、 ポリアセタール、 フッ 素樹脂など)、 多糖類 (セルロース、 ァガロースなど) が好ましい。
不溶性支持担体の形状としては、例えば、 板状、 トレィ状、球状、 繊維状、 棒状、 盤状、 容器状、 セル、 試験管等の種々の形状を用いることができる。 特に、 本発明の実施態様として好ましい支持担体は、 スライドグラスを使 用するのが好ましい。 このようなスライドグラスとして、 例えば、 日本ェ ァ一ブラウン社製のスライドグラス (商品番号 MS31 1BL) が挙げられる。 このスライドグラス (商品番号 MS31 1BL) には、 直径 5 nunの円形ゥエルが 14 個設けられている。 また、 実際に使用する際には、 細胞の接着性を上げる ため、 3 -ァミノプロピルトリエトキシシラン (APS、 SIGMA社) をスライドグ ラスにコートした APSコートスライドグラスを使用するのが好ましい。 そ の他、 ポリ- L-リジンやゼラチンをコートしたスライドグラスも使用するこ とができる。
APSコートスライドグラスを作製するには、 まず、 スライドホルダーにス ライドグラス (商品番号 MS311BL) を固定した後、 希釈した中性洗剤で 30分 以上浸して洗浄し、 水道水で洗剤を十分に取り除き、 次に、 スライドグラス を精製水にて洗浄し、 高温 (100°C以上) で十分に乾燥させた後、 室温で放 置冷却する。 その後、 スライドグラスを 2 %APS含有アセトンに 1分間浸 し、 直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、 風乾する。 さらに再度、 スライドグラスを約 1〜約 10% APS含有アセトンに 1分間浸し、 直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、 風乾する操作を 行った後、 約 20°C〜約 60 、 好ましくは約 42°Cで乾燥させることにより作製 することができる。
白血球を APSコートスライドグラスに支持させる際には、 各ゥエルに白血 球が単層に広がるように塗抹し風乾するのが好ましい。 固定化する食細胞 の密度 (X個/ ml) が、 約 5 X106個 /ml<x個/ mlく約 1 X 個 /ml、 好まし くは、 約 1 X107個/ ml≤x個/ 1111≤約5 X107個 /mlに調製されたものを使用す ることが好ましい。
また、 このような lml当たりの食細胞の密度の変化に対応して、 APSコー トスライドグラスに固定される 1ゥエル当たりの白血球の細胞数 (y個/ゥ エル(直径 5mm)) は、 約 2.5X104個/ゥエルく y個/ゥエルく約 5 X105個/ゥ エル、 好ましくは、 約 5 X104個/ゥエル≤y個/ゥヱル≤約 2.5X105個/ゥェ ルとなるように調製するのが好ましい。 具体的には、 白血球画分を、 4°C にて、 約 OXg〜約 180Xgで、 約 10分間遠心分離することによって得た白 血球ペレットに、 少量の PBSを加えて懸濁し、 血球計算盤を用いて白血球数 を計測する。 細胞数が、 約 5 X104個/ゥエル〜約 2.5X105個/ゥエルとな るように PBSで調製した白血球懸濁液 5 lを、 APSコートスライドグラスの 各ゥエルに白血球が単層に広がるように塗抹し、 完全に風乾することにより 調製することができる。
食細胞膜の透過性を宂進させる処理として、 約 3〜約 30分間 PBSに浸し、 その後、 酵素前処理試薬 (サポニン 1. 25g、 t-ォクチルフエノキシポリエト キシエタノール(比重 1. 068〜1. 075 (20/4°C), pH ( 5 w/v ) 5. 5〜7. 5) 1. 25ml、 PBS原液 25mlを混合し、 滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの) を、 滅菌 精製水で約 2〜約 50倍に希釈した溶液に浸し、 振とう機で約 3〜約 30分間浸 透する方法を用いることができる。
食細胞中に存在する感染症原因菌の D N Aを露出させる処理として、 スラ イドグラス 1枚につき酵素試薬 (N-ァセチルムラミダ一ゼ、 リゾチームおよ び Zまたはリゾスタフイン) に酵素試薬溶解液 (フエ二ルメチルスルフォ二 ルフルオラィド(PMSF)含有ジメチルスルフォキシド(DMS0)を PBSで約 100倍希 釈して調製したもの)を l ml加えて酵素試液を調製した後、約 20°C〜約 60°C、 好ましくは、 約 37°C〜約 42°Cの湿潤箱内で、 この酵素試液 l mlを白血球塗抹 部位に滴下し、 約 10〜約 60分間静置する。 その後、 0. 2mo l/l塩酸含有 PBS (PBS原液に塩酸を加え、 滅菌精製水にて 20倍希釈し、 塩酸の終濃度を 0. 2 mo l/lに調製したもの) に浸し、 そのまま振とう機上で 3〜30分間浸透する ことによって目的を達成できる。 DMS0は 5 %以上の濃度でリゾチームおよ びリゾスタフインの活性を低下させる可能性があるため、 5 %未満の濃度で 使用するのが好ましい。 食細胞の形態を保持させる物質としての PMSF以外 に他の公知のプロテアーゼ阻害剤、 例えば、 トシルリジンクロロメチルケ卜 ン(TLCK)およびそれらの混合物などを用いることもできる。 その際には、 適宜 DMS0などの溶解剤を変更すれば良い。
酵素試薬として用いる各酵素の好ましい力価範囲は、 S taphyl ococcus aur eusの溶菌においては、 リゾスタフインの力価は 1単位/ mlで十分効果を示す が、 S t aphyl ococcus epi dermi d i sの溶菌においては、 10単位/ ml以上のリゾ スタフィンカ価が必要であった。 ゆえに、 リゾス夕フィンの至適力価は、 約 1単位/ ml〜約 1 , 000単位/ ml、 好ましくは、 約 10単位/ ml〜約 100単位/ mlに 設定するのが良い。 また、 Enterococcus faecal isの溶菌においては、 リ ゾチームの力価を約 10, 000単位/ mlで固定したとき、 N-ァセチルムラミダ一 ゼカ価が約 10単位/ ml以下では溶菌されなかった。 リゾチームについては、 N -ァセチルムラミダーゼ力価を 100単位/ mlに固定したとき、 リゾチーム力価 が 1, 000単位/ ml以下では溶菌されなかった。 ゆえに、 N -ァセチルムラミダ 一ゼの至適力価は、 約 10単位/ ml〜約 10, 000単位 /ml、 好ましくは、 約 100単 位/ ml〜約 1,000単位/ ml、 リゾチームの至適力価は、 約 1, 000単位 /ml〜約 1,000, 000単位/ ml、 好ましくは、 約 10, 000単位/ ml〜約 100, 000単位/ mlに設 定すると良い。 また、原因菌が Candida albicans等の真菌である場合には、 ザィモラーゼ約 50単位 /ml〜約 500単位/ ml、 好ましくは、 約 100単位/ ml〜約 500単位/ mlの力価範囲にすると良い。 また、 ザィモラーゼを使用する際に は、 特に、 PMSFまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を使用するのが好ましい。 また、 グラム陽性菌とグラム陰性菌の成分の違い、 すなわち、 ペプチドグ リカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、 適宜使用酵素を選択する ことができる。 特に、 グラム陽性菌、 グラム陰性菌にかかわらず、 より効 果的に溶菌させるには、 2種類以上の酵素を併用すればよい。 本発明にお いては、 リゾチーム、 リゾス夕フィンおよび N-ァセチルムラミダ一ゼの 3種 を混合したものを使用することにより、 単独の酵素によった場合と比較して 溶菌活性が高まることが明らかとなった。
酵素処理温度は、 Staphylococcus aureusは、 好ましくは約 4°C〜約 60 :、 Staphylococcus epidermidisは、 約 25°Cより高く、 好ましくは約 37°C以上、 また、 Enterococcus faecalisでは、 約 25°Cより高く約 60°C未満、 好ましく は約 37°C〜約 42°Cとすれば良い。 ゆえに、 至適酵素処理温度を、 約 37° (:〜 約 42 に設定するのが最も好ましい。 また、 3種類の菌に対する共通の範 囲の内、 限界とされる温度は約 26°C〜約 59°Cと予想できる。
また、 酵素処理時間は、 Staphylococcus aureus. Staphylococcus epider midis、 Enterococcus faecal isのいずれの貪食サンプルでも酵素処理時間 20 分以上 (0分および 10分においては不適であった) であり、 また、 白血球中 に菌体は確認されなかったことから、 少なくとも約 15分以上、 好ましくは約 20分以上、 さらに至適酵素処理時間を約 30分〜約 60分とするのが好ましい。 また、 酵素処理時間を約 15分〜約 120分としてもよい。
また、 N-ァセチルムラミダ一ゼとは、 Enterococcus iaecalisの熱処理乾 燥粉末と N-ァセチルムラミダーゼを、 2顧 ol/l 塩化マグネシウムを含む 5 顏 ol/l トリス塩酸緩衝液 (pH 6.0) 中で、 37°Cで、 5分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。 また、 Streptococcus salivarius
(IF0 3350)の熱処理細胞を、 37。C、 pH 7.0で 1分間に 1 ug溶菌する酵素活性 を 1単位とした場合、 2, 000単位/ mg以上のものを使用するのが好ましい。 リゾチームは、 Micrococcus luteusとリゾチ一ムを PBS内で、 37°Cで、 5 分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。 また、 Microco ecus luteusを、 35° (:、 pH 6.2で 1分間に 540nmの吸収を 0.001下げるときの 酵素活性を 1単位とした場合、 50, 000単位/ mg以上のものを使用するのが好 ましい。
リゾスタフインは、 Staphylococcus epidermidisとリゾスタフインを PBS 内にて 37°Cで 5分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。 また、 Staphylococcus aureusを、 37° (:、 ρΗ 7.5で、 10分間に 620nmの吸収を 0.240から 0.125に下げるときの酵素活性を 1単位とした場合、 500単位/ mg以 上のものを使用するのが好ましい。
ザィモラーゼ (商品名:ザィモリエイス、 生化学工業) とは、 Arthrobact er lutesulの培養液から調製された酵素であり、 酵母生細胞の細胞壁に対し て強い溶解活性を有している。 ザィモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関わ る必須酵素は) 3- 1, 3 -グルカン ·ラミナリペン夕ォヒドロラ一ゼ (lanimari - pentaohydrolase) であり、 /3 -1, 3-結合のグルコースポリマ一に作用して、 主生産物としてラミナリペン夕オースを生成する。 ザィモリエイス- 100T は硫安分画により精製され、 さらにァフィ二ティ一クロマトグラフィ一によ り精製され (Kitamura, . et al. ; J. Ferment. Technol., 60, 257, 1982)、 100, 000単位/ gの活性を有している。 しかしながら、 この酵素の 活性は、 基質となる酵母の種類、 培養条件および生育時期により変化するこ とが知られている (Kitamura, K. et al. ; J. Gen. Appl. Microbiol., 20, 323, 1974、 Kitamura, K. et al. ; Agric. Biol. Chem. , 45, 1761, 1981、 Kitamura, K. et al. ; Agric. Biol. Chem. , 46, 553, 1982)。 ザィモリ ェイス- 100Tには、 ]3- 1,3 -ダルカナ一ゼを約 1.0X107単位/ g、 プロテア一 ゼを約 1.7X104単位/ g、 マンナ一ゼを約 6.0 X104単位/ g含み、 DNaseおよ び RNaseは認められない (Kitamura, K. et al. ; J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 57, 1972)。 また、ザィモリエイスの至適 pHは、約 5.5〜約 8.5、 好ましくは、 約 6.5〜約 7.5であり、 至適温度は、 約 25°C〜約 55°C、 好ましく は約 35°C〜約 45 である。 さらに、 酵母 (対数増殖期細胞) に対する溶菌 スぺク卜ラム (属名) は、 Ashbya, Candida、 Debaryomyces、 Eremotheci亂 Endomyces、 Hansenula、 Hanseniaspora^ Kloekera、 KIuyveromyces、 Lipomy ces、 Helschkowia、 Pichia、 Pullularia、 Torulopsis、 Saccharomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes Schwanniomycesなどが挙げられる。 特に、 カンジダ属として、 カンジダ ·アルビカンス(Candida albicans), カンジダ · トロピカリス(Candida tropicalis), カンジダ ·パラシロシス (Candida parasi losis) ^ カンジダ ·ガラクタ(Candida galacta)、 カンジダ 'ギリエルモンジ(Candida gui 11 iermondi i)、 カンジダ'クルセィ(Candida krusei)、 クリフトコッカス,ネオフォーマンス (Cryptococcus neoformans) 等が挙げられる。 本酵素の賦活剤として、 SH化合物、例えば、 システィン、 2 -メルカプトエタノール、 ジチオスレィトールなどを用いることができる。 これらの属に属する菌も、 本発明に使用できる。 この酵素は、 ビール酵 母懸濁液を基質として、 約 25°Cで、 2時間の内に、 反応液 (酵素: 0.05〜 O.lmg/ml溶液 lml、 基質: ビール酵母懸濁液 (2mg乾燥重量 Zml) 3ml、 緩衝液: M/15リン酸緩衝液 (pH 7.5) 5 ml、 滅菌精製水 lmlで全量 10mlに調 製したもの) の Α8ϋ()が約 30%減少するために必要な酵素活性を 1単位とする。 ザィモリエイス- 100Tは、 100, 000単位/ gの活性を有している。
酵素試薬溶解液として用いる PMSF (プロテア一ゼから白血球を保護してそ の形態を保持させるために添加) の濃度として、 10 mol/l 以上の濃度で効 果が認められ、 0. lmmol/1 以上の PMSF濃度では、 白血球の形態の劣化が完全 に抑制されていたことから、 約 lO /zmol/l〜約 10匪 oI/l、 好ましくは約 0. 1 mmol/1〜約 1 謹 ol/lの範囲であることが好ましい。 また、 DMS0の濃度とし て、 5 %未満、 好ましくは 2 %以下、 さらには 1 %程度の濃度であることが 好ましい。 ゆえに、 酵素試薬溶解液は、 0. lmol/1 フエ二ルメチルスルフ ォニルフルオラィド(PMSF)含有ジメチルスルフォキシド (DMS0)を PBSで 100〜 1 , 000倍希釈して調製したものであることが好ましい。
' 感染症原因菌の D N Aを露出させる工程の後に、 細胞膜タンパク質のァセ チル化の工程を揷入しても良い。 具体的には、 ァセチル化試薬 (トリエタ ノールァミン 7. 46 g、 塩酸適量、 滅菌精製水適量にて全量 50mlとしたもの) に無水酢酸を加え、 滅菌精製水で約 2倍〜約 50倍希釈、 好ましくは約 10倍希 釈し、 無水酢酸の終濃度を 0. 1〜3. 0%、 好ましくは 0. 8%に調製したァセチ レ一シヨン試薬にスライドグラスを浸し、 振とう機上で 5〜30分間振とうす ることにより行うことができる。 その後、 75%、 85%、 98%エタノールに、 順次、 2〜 5分間ずつ浸し、 完全に風乾させる。
また、 細胞膜タンパク質のァセチル化工程の後に、 感染症原因菌の D N A をアル力リ処理することにより一本鎖 D N Aとする工程を挿入することもで きる。 具体的には、 スライドグラスを、 約 10腿 ol/l〜約 300mmo l/l、 好ま しくは、 約 70腿 ol/l水酸化ナトリウム含有 PBS (PBS原液に水酸化ナトリウム を加え、 滅菌精製水で 20倍希釈し、 水酸化ナトリウムの終濃度を 70匪 ol/lに 調製したもの) に約 2〜約 5分間浸すことにより行うことができる。 その 後、 75%、 85%、 98%エタノールに、 順次、 2〜 5分間ずつ浸し、 完全に風 乾させる。
露出された感染症原因菌の D NAとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイゼ—ションできる検出用 D N Aプローブを用いて in s i tuハイブリダィ ゼ一シヨンを行うには、 例えば、 プローブ希釈液にて調製した検出用 D NA プローブを含有する液(プローブ液) を塗抹部位に塗布し、約 25 〜約 50°C、 好ましくは、 約 37°C〜約 42°Cの湿潤箱内で約 1〜約 3時間、 好ましくは、 約 2時間静置させる。
その後、ハイブリダィゼ一ション洗浄液(ハイブリダィゼ一ション原液(塩 化ナトリウム 13.15g、 クェン酸三ナトリウム 2水和物 6.615g、 滅菌精製水 にて全量 75mlに調製したもの:以下、 単に 「ハイブリダィゼ一シヨン原液」 と称する) を、 ハイブリダィゼーシヨン原液:滅菌精製水:ホルムアミド= 5 : 45: 50の割合で混合して調製したもの) を 3つの染色ビンに用意し、 順 次、 約 35〜約 45°C、 好ましくは、 約 42°Cで 10分間ずつ浸す。 その後、 PBS に浸し、 そのまま振とう機上で約 5〜約 30分間振とうさせる。 詳細には、 プロ一ブ希釈液には、 サケ精子 DNA 600^1、 100Xデンハート溶液 50 1、 ハ イブリダィゼーシヨン原液 500 1、 ホルムアミド 2250 1、 50%硫酸デキス トラン 1000 1が含まれる。 プロ一ブ液は各検出用 DNAプローブ 15ngを 含むのが好ましく、 プローブ希釈液にて全量 50 1とするのが良い。
SA、 SE、 PA、 EF、 EKのプローブ濃度は、 約 0.6ng/ 1〜約 1. Sng/^ 1、 好ま しくは約 0.6ng/ l〜約 1.2ng/ lとするのが良い。 また、 0.06ng/ lにお いては不適であり、 0.6ng/ zlにおいては適であったことから、 少なくとも O.lng/ ΐ以上とするのが好ましい。 さらに、 2.4ng/ lにおいては不適で あり、 1.8ng/ xlにおいては適であったことから、 2.2ng/ zl以下とするのが 好ましい。 また、陽性コントロールおよび陰性コント口一ルの至適濃度を、 それぞれ 0.4〜2.0ng/ Ailおよび 0.6〜2.0ng/ i 1、 好ましくは共通して 0.6〜 1.0ng/ 1とするのが良い。
また、 ハイブリダィゼーシヨンを行う時間は、 少なくとも 30分以上、 好ま しくは 60分以上、 より好ましくは 90分以上とするのが好ましい。 さらに好 ましい至適ハイブリダィゼーション時間は、 約 120分〜約 900分に設定すると 良い。
また、 in situハイブリダィゼーシヨンの工程においてドデシル硫酸ナト リウム(SDS)などの界面活性剤を使用するのが、 検出感度を高めることがで きる点から好ましい。 SDSの濃度は、 1 %以下が好ましく、 より好ましく は約 0. 1 %〜約 0. 5 %、 さらに好ましくは約 0. 25 %とする。 SDSは、 ハイブ リダィゼーシヨンの際に用いる溶液に添加されていればよく、 プローブ希釈 液またはプローブ液に事前に混合したものを用いてもよい。
さらに、 検出用 D NAプロ一ブを、 約 350〜約 600塩基長、 好ましくは、 約 350〜約 550塩基長の鎖長を有する 1種以上の D N Aプローブとすることで、 食細胞内にプローブを円滑に導入し、 取り込まれている外来微生物の遺伝子 への確実な接触が許容されるので好ましい。 対象となるプローブの塩基長 (塩基対の数) が、 必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意 味するものではなく、 プローブの塩基長の分布に、 上記範囲の塩基長が含ま れていればよいこととする。 これらプロ一ブは、 1種で用いても数種 (1 種以上) で用いても良い。 1種以上のプローブとは、 ー菌種に対しハイブ リダィズできる複数種のプローブであっても良く、 また、 ー菌種に対してプ ローブは 1つであるが、 菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数 種となっていても良く、 プローブの種類が 1種以上であれば特に限定されな い。
これらプローブは、 食細胞自体といかようにもハイブリダィズしない配列 を有する DNA断片を含むものとすることが好ましく、 また他の種の菌に由来 する遺伝子と交差ハイブリダィズするものであってはならない。 例えば、 サブトラクシヨン法を用いれば、 短時間で特異プローブを作成することがで きる。 これらプローブは、 フルォレセインイソチオシァネート(FITC)、 ビ 才チン、 ジゴキシゲニン(ジゴキシゲニン(DIG) - 1 1 -dUTP)等の非放射性同位 体標識用物質を用い、 定法のニックトランスレーションに従って、 調製およ びラベルするとよい。 プローブの鎖長は、 ニックトランスレーション反応 において添加する DNase Iと D N Aポリメラ一ゼ Iの量比を変化させること により、最も効率よくラベルできるように制御することができる。 例えば、 D NAプローブ (SA-24) 2 を効率よくラベル化し、 また、 外来微生物 D NAと効率よく in s i tuハイブリダィゼーションできるプローブ鎖長(約 350〜約 600の塩基長)に調節するには、 全量 100 /z lの反応液中に、 10U/ 1 の DNAポリメラ一ゼ Iの 2 lに対し、 全量 IOO I中に約 10〜約 350mU、 好 ましくは、 約 25〜約 200mU、 より好ましくは約 50〜約 150mUとなるように調製 された DNase Iの 6 1が存在するようにすればよい。 このとき、 各酵素の 容量および反応液全量などは、 上記必須至適反応条件の比率が一定である限 り、 適宜変更しても良い。 また、 換言すれば、 全量 中に DNAポリ メラ一ゼ Iを 20Uに対し、 DNase Iを約 10〜約 350mU、 好ましくは、 約 25〜約 200mU、 より好ましくは、 約 50〜約 150mUに調製すればよい。 さらに換言す れば、 1単位の DNAポリメラ一ゼ Iに対し、約 0.5/1, 000〜約 17.5/1, 000、 好ましくは、 約 1.25/1, 000〜約 10/1, 000、 より好ましくは、 約 2.5/1,000〜 約 7.5/1, 000単位の DNase Iを用いてニックトランスレーション反応を行うと 良い。 また、 DNA 1 に対してみれば、 DNAポリメラ一ゼ Iを約 10 U、 DNase Iを約 5〜約 175mU、 好ましくは、 約 12.5〜約 100mU、 より好まし くは、 約 25〜約 75mUに調製すれば良い。 他のプローブについては、 上記至 適反応条件を参考にして DN A量、 DN Aポリメラ一ゼ Iおよび DNase Iの 至適反応条件を決定することができ、 また、 効率よくラベル化し、 外来微生 物 DNAと効率よく in situハイブリダィゼーションできるプローブ鎖長(約 350〜約 600の塩基長) に調節することができる。
In situハイブリダィゼーションを行う際のストリンジェントな条件とは、 例えば、 ホルムアミドが約 30%〜約 60%、 好ましくは、 約 50%の存在下、 約 30〜約 50で、 好ましくは、 約 38〜約 42°Cでインキュベートし、 その後、 洗浄 する条件である。
In situハイブリダィゼ一シヨンを行った後、 ブロッキングの操作を行つ ても良い。 具体的には、 湿潤箱内でスライドグラス 1枚につきブロッキン グ試薬 (ゥサギ正常血清 2ml、 PBS原液 0.5ml、 滅菌精製水にて全量 10mlに調 製したもの) 1mlを塗抹部位に滴下し、 15〜60分間静置する。 その後、 ブ ロッキング試薬を除去する。
菌由来の遺伝子(ゲノム DNAまたは RNA)とハイブリダイズした結果に生じる シグナルの検出のためには、 定法の抗原一抗体反応等を利用した呈色反応を 行うとよい。 すなわち、 ハイブリダィゼーシヨンを終えた試料を充分に洗 浄した後に、 ブロッキング操作を行い、 次いで、 抗 FITC抗体、 抗ジゴキシゲ ニン抗体などの接合物、 例えば、 アルカリホスファターゼ接合物を用いて処 理し、 次いで、 接合物の発色系にてシグナルを発色し、 八イブリダィゼ一シ ヨンの状況を確認する。 例えば、 プローブとして前記のジゴキシゲニン - 1 1 -dUTPでラベルしたものを用いた場合、 抗ジゴキシゲニン―アル力リホス ファターゼ接合物を用い、 一般に使用されるアルカリホスファタ一ゼに対す る基質 (二卜ロブルーテトラゾリゥムおよび 5_ブロモ -4-クロ口- 3-ィンドリ ルホスフエ ト等) を利用して検出すればよい。 次いで、 呈色反応を行つ た後に洗浄した塗沫標本は、 ナフ! ルブラック、 Fas t Green (20mg/50mK Wako Chemi cal s社製) 等で対比染色を行い、 光学顕微鏡によって細胞内シグ ナルが観察される。
詳細には、 ハイブリダィゼーシヨンによるシグナルを得るには、 例えば、 検出用 D N Aプローブとしてジゴキシゲニン標識 D N Aプロ一ブを用いる場 合には、 標識抗体 (アルカリフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶 液 1. 05単位、 バッファ一 A (トリエタノ一ルァミン 746mg、 塩化ナトリウム 17. 5mg、 塩化マグネシウム 6水和物 20. 3mg、 塩化亜鉛 1. 36mg、 ゥシ血清アル ブミン 1000mg、 塩酸適量、 滅菌精製水適量にて全量 100mlに調製したもの) 12. 6 z lにて全量を 14 n 1に調製したもの) を標識抗体希釈液(トリス-(ヒド 口キシメチル) -ァミノメタン 8. 48mg、 塩化ナトリウム 6. 14mg、 塩酸適量、 滅 菌精製水適量にて全量 0. 7mlに調製したもの) で 1.0〜200倍希釈、 好ましくは 50倍希釈した標識抗体液を調製し、 この標識抗体液を塗抹部位に 10 1ずつ 滴下し、 15〜60分間静置すると良い。 その後、 標識抗体洗浄液 (ポリソル ベ一ト 20 l ml、 PBS原液 50ml、 滅菌精製水にて全量 100mlに調製したもの) を 2〜50倍、 好ましくは、 10倍に希釈した溶液に浸し、 そのまま振とう機上 で 5〜30分間浸透する。 この操作を 2回繰り返した後、発色前処理液 1 (ト リス-(ヒドロキシメチル) -ァミノメタン 6. 06 g、 塩化ナトリウム 2. 92 g、 塩 酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの)と発色前処理液 2 (塩 化マグネシウム 6水和物 5. 08 g、 滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの) を等量混合し、 滅菌精製水で 5倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、 その まま振とう機上で 5〜30分間振とうすれば良い。 その後、 スライドグラス 1枚につき発色試薬 (二トロブル一テトラゾリゥム(NBT) /5-ブロモ -4-ク口 口- 3 -インドリルフォスフェイト(BCIP) ) 1 mlを 0. 2 mシリンジトップフイリレ ターを装着したデイスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、 スライド グラスの塗抹部位に滴下し、 湿潤箱内で約 1 (TC〜約 45°C、 好ましくは、 約 37 °Cで、約 15〜約 60分間遮光静置する。 その後、発色試薬洗浄液(トリス -(ヒ ドロキシメチル) -ァミノメタン 606mg、 エチレンジァミン四酢酸ニナトリウ ム 2水和物 186mg、 塩酸適量、 .滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの) を約 2〜約 50倍、好ましくは、約 10倍に希釈した溶液に約 2〜約 10分間浸し、 風乾した後、 対比染色液 (ファストグリーン FCF (食用緑色 3号) 50mg、 滅菌 精製水適量にて全量 50mlに調製したもの) を 2〜50倍、 好ましくは 10倍に希 釈した溶液および、 約 0. 1〜約 5 %、 好ましくは約 1 %の酢酸溶液に浸す。 その後、 前記発色試薬洗浄液を約 2〜約 50倍、 好ましくは約 10倍に希釈した, 溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗い流し、完全に風乾すると良い。 また、 上記発色試薬は、 別々に調製したものであっても良い。
アル力リフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、 ブロッティ ング用メンブレンにジゴキシゲニンラベルした D NAの l ngをブロットし、 ブロッキング後、 10, 000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴ キシゲニン抗体溶液で処理し、 発色基質 (NBT/BC IP)を反応させると D NA ブロッティング部位が発色し、 ジゴキシゲニンラベルしていない D N Aで同 様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが好ましい。 また、 抗ジゴキシゲニン抗体は、 ヒッジ由来のものが好ましい。 詳細には、 免疫 したヒッジ血清より、 イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマト グラフィ一で精製すると良い。
発色試薬 (NBT/BCIP溶液、 pH 9. 0〜10. 0) は、 ニトロテトラゾリゥムブル — (NBT) 3. 3mg、 5-ブロモ -4-ク口口- 3-ィンドリルフォスフェイト(BCIP) 1. 65 mg、 N,N_ジメチルホルムアミド 99 g、 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメ タン 121mg、 塩酸適量、 塩化ナトリウム 58. 4mg、 塩化マグネシウム 6水和物
101. 6mg、 滅菌精製水適量にて全量 10mlに調製したものであるのが好ましい。 この発色試薬としては、 アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク 質をブロッテイング用メンブレンにプロットし、 当該発色試薬でメンブレン を遮光室温で処理すると、 ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れるものを 使用するのが好ましい。
上記した対比染色を行う場合に、 シグナルと細胞のコントラストをさらに 明確にさせるため、 食用色素、 例えば、 黄色 4号(タートラジン)を使用する ことができる。 その理由は、 基質によって紫色が呈色し、 ナフトールブラ ックによって青色に呈色することから、 類似色のために対比染色しづらいこ とが挙げられる。 この方法を本発明に応用したところ、 対比染色を行う際 に有用であることが判明した。 食用色素を用いるという手法は、 これまで に無かった方法である。
ジゴキシゲニンを標識化する方法として、 ニックトランスレ一ション法を 用いることができる。 その他に、 PCR法、 ランダムプライマーラベリング 法、 i n v i t roトランスクリプシヨンラベリング法、 ターミナルトランスフエ ラーゼラベリング法などを使用することができる。
判定は、 光学顕微鏡で鏡検(X I , 000)するときに、 上述した対比染色液に より染まった単一ゥエル内の細胞に於いて、 青紫色の発色が 1つでも認めら れた場合に陽性と判定するのがよい。
また、 検出用プローブの作成方法として、 日本国特許第 2558420号、 特許 第 2798499号、 特許第 2965543号、 特許第 2965544号および特許第 3026789号な どを参照することができる。
例えば、 ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、 ワーキングセ ルバンク(SA- 24)を滅菌シャーレに作製した 50 μ g/mlアンピシリン含有の L - ブロス固形培地に、 白金耳または使い捨てプラスチックループ等で画線塗抹 する (釣菌)。 ー晚培養した後に、 シングルコロニ一を採取し、 50 ig/mlアンピシリン含 有の L-ブロス培地 5mlに植菌して、 37°Cで終夜振とう培養する (前培養)。 前記培地 400ml入り培養用フラスコに、 前培養液を 2.5mlずつ植菌して、 約 37°Cで終夜振とう培養する (本培養)。
次に、 SA- 24プラスミド DNAを抽出するために、本培養した培養液を、 4° (:、 4, OOOXgで 10分間遠心分離して集菌する。 培養上清を取り除き、 STE (10 mmol/1 トリス塩酸(pH 8.0)、 1 mmol/1 エチレンジァミン-四酢酸 2ナトリ ゥム塩 (EDTA)、 0. lmmol/1 塩化ナトリウム) を 20ml加えて菌体を再懸濁し、 4°C、 4, 000 X gで 10分間遠心分離して集菌する。 10mg/mlリゾチームを含 む溶液 _ 1 (50匪 ol/l ダルコ一ス、 25腿 ol/l トリス塩酸(pH 8.0)、 10誦 ol /1 EDTA) 5 mlを加え、 菌体を懸濁して室温で 5分間放置する。 溶液一 2 (0.2腿 ol/l 水酸化ナトリウム、 1 %ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)) 10mlを 加え、 転倒混和して氷上で 10分間放置する。 氷冷した溶液一 3 (3mol/l 酢酸カリウム(pH 4.8)) 7.5mlを加え、 転倒混和して氷上で 10分間放置する。 高速冷却遠心機により、 4° (:、 45,000X gで 30分間遠心分離した後、 上清 を回収し、 室温になるまで放置する。 放置した後、 0.6容量 (約 24ml)のィ ソプロパノールを加え、 転倒混和して室温で 15分以上放置する。 高速冷却 遠心機により、 25° (:、 28,000X gで 30分間遠心分離した後、 上清を捨て、 70 %エタノールでペレットを洗浄して風乾する。 風乾後、 TE (10画 ol/l ト リス塩酸(pH 8.0)、 lmmol/1 EDTA)を 8 ml加えて溶解する (プラスミド DNAの 抽出)。
次に、 SA-24含有プラスミド DNAを精製するために、 得られたプラスミ ド DNAに、 lOfflg/mlェチジゥムブ口マイド 800 1および塩化セシウム 8.6 g を加え、転倒混和して溶解させる。 その溶解液を超遠心用チューブに入れ、 キャップまたはシールをする。 垂直型口一夕一により、 20°C、 500,000X gで 5時間超遠心した後、 紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用 してプラスミド DNAのバンドを分取する。 分取したプラスミド DNA溶 液に、 等量の TE飽和 卜ブ夕ノールを加えて転倒混和し、 微量高速遠心機に より、 15,000Xgで 5分間遠心分離し、 上清を取り除く。 この操作を繰り 返し、プラスミド DNA溶液中のェチジゥムブ口マイドを取り除く。 次に、 TEを加えて 1.5mlとし、 脱塩カラム(NAP- 10)で脱塩する。 脱塩したプラス ミド DNA溶液に 3mol/l酢酸ナトリゥム溶液を 30 1加えて混和した後、 3 倍量の 99.5%エタノールを加えて転倒混和し、 一 20°Cで 30分以上放置する。 放置後、 微量冷却高速遠心機により、 4°C、 15,000Xgで 20分間遠心分離 して上清を除いた後、 冷 70%エタノールを加えて懸濁し、 再度、 微量冷却高 速遠心機により、 4°C、 15, OOOXgで 20分間遠心分離して上清を除き、 ブラ スミド DNAの沈渣を減圧下乾固させる。 プラスミド DNAに IOO Iの TE を加えて完全に溶解させ、 260mnの吸光度で濃度を測定する (SA- 24含有ブラ スミド DNAの精製)。 その後、 SA-24含有プラスミド DNAの制限酵素処 理およびァガロース電気泳動による SA-24のサイズチエックを行う。
SA-24含有プラスミド DNAの制限酵素処理およびァガロース電気泳動による SA-24の精製を行うには、 分子量チェックの終了した SA- 24含有プラスミド DNA lmgを、 制限酵素 Hindi II単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、 37°Cで 1.5時間以上の反応により消化する。 プラスミド DNAを消化した後、 反応液の一部を 0.8 %ァガロースで電気泳動して、 消化が完全に終了したこ とを確認する。 消化を確認した後、 分取用の 0.8%ァガロースゲルで電気 泳動し、 SA-24のバンドを採取する。 採取した SA-24をァガロースゲルから 抽出、 精製して、 吸光度計にて濃度を測定する。 精製した SA-24の一部を 0.8 %ァガロースゲルで電気泳動し、 シングルバンドであることを確認する。
SA - 24のラベル化を行うには、 精製した SA-24の 2 gを用い、 以下の表 1 に記載の組成を有する反応液において、ジゴキシゲニンラベルを施すとよい。 表 1 :標識付用反応液の組成
Figure imgf000024_0001
[凡例]
(a) 10XL.B. : 0.5mol/L トリス塩酸 (pH 7.5),
50mmol/L塩化マグネシウム、
0.5mg/mL ゥシ血清アルブミン
(b) dNTPs: 0.5腿 ol/L 2'-デォキシアデノシン - 5'-三リン酸、
0.5mmol/L 2' -デォキシグアノシン- 5' -三リン酸、
0.5mmol/L 2' -デォキシシチジン- 5' -三リン酸
(c) ジゴキシゲニン dUTP: 0.4IMO1/L ジゴキシゲニン- 11- 2'-デォキシ- ゥリジン- 5'-三リン酸
(d) DNase I :デォキシリポヌクレア一ゼ Iを、 全量 lOO^iLあたり 50〜150mUの 使用量となるよう 25mmol/L トリス塩酸 (pH 7.5)、 50%グリセ リン溶液で希釈して上記配合量とする。 表 1において、 Xは、 プローブ原液の濃度に応じて上記好ましいプローブ 濃度となるように添加することができる容量であり、 この容量に伴い精製水 量 Yを決定して最終容量を調整する。.
ラベル化後、 反応液に TEを 100 1加えて反応を停止させる。 反応停止液 をスピンカラムに注入し、 4°C、 380X gで 10分間遠心分離して、 遊離のヌ クレオチドを除く。 次に、 溶出液の濃度を吸光度計により測定し、 TEで 10 ng / 1に調製する。
ラベル化を確認するために、 ラベルした SA- 24の 0.5 1をメンブレンに滴 下し、 風乾する。 ブロッキング試薬にメンブレンを浸し、 室温で 30分間ブ ロッキングする。 0.1mol/l トリス塩酸 (pH 7.5)、 0.15mo 1/1塩化ナトリウ ムで 5, 000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗 体溶液に、 メンブレンを室温で 30分間浸す。 0. lmol/1トリス塩酸 (pH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、 室温で 10分間振とうして 2 回洗浄する。 0.5mol/lトリス塩酸 (pH 9.5)、 0.15mol/l塩化ナトリウム、 50腿 ol/l塩化マグネシウムに、 メンブレンを室温で 10分間浸す。 発色試薬 にメンブレンを室温で遮光下、 10分間浸す。 メンブレンを TEに浸し、 発色 を停止させる。 スポット下部分の青紫色の発色で、 ラベル化の確認を行う。 スピンカラムを作製するには、 1mlのディスポ一ザブルシリンジに、 少量 の滅菌済みグラスウールを充填する。 lmmol/1 トリス塩酸 (pH 7.5)、 1 腿 ol/lの EDTA、 0.1%SDSで膨潤させたセフアデックス G- 50をシリンジにつめ る。 15mlのディスポ一ザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、 4°C、 320X gで 10分間遠心分離し、 余分の緩衝液を落とす。 デイスポーザブル コニカルチューブからシリンジを抜き、 排出された緩衝液を捨てた後、 1.5 mlのエツペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に 入れ、 その上にシリンジを入れて作製する。
プローブの特異性を確認するため、 以下の手順に従って、 ドットプロット ハイブリダイゼーシヨンを行うとよい。
まず、 スポットした各ゲノム DNAを変性するために、 定法に従い 0.5mol/I 水酸化ナトリウム、 1.5mol/l 塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙 (ワット マン社製 3匪) 上に、 調製した各種細菌ゲノム lOOngをナイロンメンブレン (ポールバイオダインタイプ B、 日本ポール社製) にスポットし、 風乾した メンブレンを 10分間静置する。 次に、 0.5mol/l 卜リス塩酸 (pH 7.5)、 1.5mol/l 塩化ナトリゥム溶液で飽和した前出の濾紙上に 10分間静置して変 性 DN Aを中和する。 さらに、 2XSSC (Standard Saline Citrate) 溶液 で飽和した前記濾紙上に 5分間静置し、 リンスする。 その後、 メンブレン を風乾し、 2 XSSC溶液にメンブレンを浸し、 5分間浸透する。 定法に従 い、 プラスチックバッグ内でプレハイプリタイゼーション溶液にメンブレン を浸し、 42 、 60分間親和させる。 プラスチックバッグ内で、 プローブ 40 Ongを含むハイプリタイゼ一ション溶液 15m 1内にメンブレンを浸し、 42 °C で、 ー晚反応させる。 次に、 2 XSSC、 0.1%SDS (ドデシル硫酸ナトリウ ム) 溶液にメンブレンを浸し、 5分間洗浄する (2回繰り返す)。 その後、 0.1XSS 0.1%SDS溶液にメンブレンを浸し、 60°C、 10分間洗浄する (3回 繰り返す)。 2 XSSC溶液にメンブレンを浸し、 5分間洗浄する。 メンブ レンを 3%ゥシ血清アルブミン、 1 %ブロッキングバッファー (ベーリンガ 一社製)、 O.lmol/1 トリス塩酸 (pH 7.5), 0.15mol/l塩化ナトリウム溶液に メンブレンを浸し、 30分間おだやかに振とうする。 その後、 アルカリフォ スファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体 (ベ一リンガー社製) を、 0.1mol/l トリス塩酸(pH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液で 5, 000倍希釈した溶 液にメンブレンを浸し、 30分間おだやかに振とうする。 次に、 O.lraol/1ト リス塩酸 (PH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、 15 分間振とうする (2回)。 0.1mol/l トリス塩酸 (pH 9· 5)、 0. lmol/I 塩ィ匕 ナトリウム、 5匪 ol/l 塩化マグネシウム溶液にメンブレンを浸し、 5分間 振とうする。 NBT- BCIP溶液 (GIBCO BRL社製) にメンブレンを浸し、 遮光 下で発色反応させる。 TE (10mmol/l トリス塩酸 (pH 8.0)、 1醒 ol/I EDTA) にメンブレンを浸し、 発色反応を止め、 風乾する。 プレハイブリダ ィゼーション溶液およびハイブリダイゼ一ション溶液を、以下の表 2に示す。
表 2
[単位: ml]
Figure imgf000027_0001
In s i tuハイブリダィゼ一ションの工程において使用される界面活性剤と しては、 公知の界面活性剤が使用できる。 界面活性剤は、 ァニオン界面活 性剤、 非イオン性界面活性剤、 カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に 大別される。
ァニオン界面活性剤は、 陰イオン界面活性剤とも呼ばれ、 水中で電離して 有機陰イオンとなるものである。 界面活性剤の分子中の親油基を Rとして 表現すると、 RC00Na、 RS03Na、 RS04Naなどがある。 RCOONaのように弱酸性 基を含有する界面活性剤の水溶液は加水分解しゃすく弱アル力リ性である が、 RS03Na、 RS04Naなどの強酸性基を有する界面活性剤の水溶液は加水分解 を受けにくく、 中性となる。 陰イオン性であるから、 多量の陽イオン性物 質の存在で界面活性を失うことがあり、 また強酸性にした時にも失活する。 非ィォン性界面活性剤は、 親水基が非ィォン性のものをいう。 親水基と して酸化エチレン基 (-C ¾0-)が多用され、 この基の数が多くなる程親水性 ' が増す。 反対に、 親油基の炭素数が増加すると、 親油性が増加する。 従 つて、 親水性 ·親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴で ある。 非イオン性界面活性剤は、 水中で電離せず、 無機塩の影響も受けに くいため、 生体に及ぼす作用も少ない。 しかも、 洗浄作用は、 強力で、 泡 立ちは比較的少ない為、 洗剤のみならず、 医薬品、 化粧品、 食品などに広く 使用される。 水溶性の非イオン性界面活性剤は温度が上昇すると、 ある温 度で水に溶解しにくくなり、 水溶液が濁り出すが、 これは親水基と水との水 素結合が切断されるために生じる。
カチオン界面活性剤は、 陽イオン界面活性剤ともいう。 水中で、 電離し て有機陽イオンとなるものである。 カチオン界面活性剤は、 一般に洗浄作 用は大きくはないが、 細菌などのァニオン性のものと強く結合するため、 殺 菌作用が大きい。 また、 繊維やプラスチックの帯電防止能もある。 カチ オン界面活性剤の代表的なもので、 ドデシルトリメチルク口リド
[C12Ik (CH3) 3N] C1は水溶性であるが、 ジドデシルジメチルアンモニゥムクロ リド [ (C12 5) 2 (CH3) 2N] C1は水に溶解しにくく、 水中では 2分子膜状のべシ クルを形成し、 ベンゼンには溶解する。
両性界面活性剤は、 分子内にァニオン基とカチオン基の両者を併せ持って いる界面活性剤である。 水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、 両性界面活性剤には、 アミノ酸誘導体が多く存在する。 従って、 アミノ酸 と同様に等電点を有し、 等電点よりアル力リ性側ではァニオン界面活性剤と して、 酸性側ではカチオン界面活性剤として作用する。 等電点で水溶性は 最低となり、 表面張力も最も低下する。 両性界面活性剤は、 殺菌剤、 帯電 防止剤などに用いられる。
また、 ァニオン界面活性剤は、 カルボン酸型、 スルホン酸型、 硫酸エステ ル型およびリン酸エステル型に分けられ、 非イオン性界面活性剤は、 エステ ル型、 エーテル型、 エステルエ一テル型およびアルカノ一ルアミド型に分け られる。 カチオン界面活性剤は、 アルキルアミン塩型および第四級アンモ 二ゥム塩型に分けられ、 両性界面活性剤は、 カルポキシベタイン型、 2 -ァ ルキルイミダゾリンの誘導型およびダリシン型に分けられる。
さらに、ァニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、 N -ァシルサルコシン塩および N-ァシルグルタミン酸塩に細分される。 それ ぞれの代表例として、 脂肪酸モノカルボン酸塩には、 ラウリン酸ナトリウム および薬用せっけんがあり、 N-ァシルサルコシン塩は、 N-ラウロイルサルコ シンナトリゥム、 N-ァシルグルタミン酸塩に N-ラウロイルグルタミン酸ニナ トリウムがある。 また、 スルホン酸型は、 ジアルキルスルホコハク酸塩、 アルカンスルホン酸塩、 アルファオレフインスルホン酸塩、 直鎖アルキルべ ンゼンスルホン酸塩、 アルキル(分岐鎖) ベンゼンスルホン酸塩、 アルキル ナフ夕レンスルホン酸塩、 ナフタレンスルホン酸塩-ホルムアルデヒド縮合 物および N-メチル - N-ァシルタウリン塩に細分される。 代表例として、 ジ アルキルスルホコハク酸塩は、 ジォクチルスルホコハク酸ナトリウム、 アル カンスルホン酸塩は、 ドデカンスルホン酸ナトリウム、 直鎖アルキルべンゼ ンスルホン酸塩には直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、 アルキル (分岐鎖) ベンゼンスルホン酸塩はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリゥム、 アルキルナフタレンスルホン酸塩はプチルナフタレンスルホン酸ナトリウ ム、 N-メチル-- N-ァシルタウリン塩には N-メチル- N-ステアロイルタウリン ナトリウムがある。 また、 硫酸エステル型は、 アルキル硫酸塩、 ポリオキ シエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分され る。 代表例として、 アルキル硫酸塩は、 ドデシル硫酸ナトリウム、 ラウリ ル硫酸ナトリゥムおよびセチル硫酸ナトリゥム、 ポリォキシエチレンアルキ ルェ一テル硫酸塩はポリォキシェチレンラウリルェ一テル硫酸トリエタノ一 ルァミンがある。 また、 リン酸エステル型は、 アルキルリン酸塩、 ポリオ キシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキル フエニルエーテルリン酸塩に細分される。 代表例を挙げると、 アルキルリ ン酸塩には、 モノラウリルリン酸ニナトリウムがある。 ポリオキシェチレ ンアルキルエーテルリン酸塩には、 リン酸ナトリゥムポリオキシエチレンラ ゥリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンォレイルエーテル(8M0L)が ある。
非イオン性界面活性剤のエステル型は、 脂肪酸グリセリン、 脂肪酸ソルビ タンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。 それぞれの代表例として、 脂肪酸グリセリンは、 モノステアリン酸グリセリン、 脂肪酸ソルビタンは、 モノステアリン酸ソルビタン、 トリオレイン酸ソルビタン、 セスキォレイン 酸ソルビタン、 モノラウリン酸ソルビタン、 ポリソルべ一ト 20 (ポリオキシ エチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル)、 ポリソルべ一ト 60およびポリソルべ ート 80、 脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。 ま た、 エーテル型は、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシェチ レンアルキルフエニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピ レングリコールに細分される。 代表例を挙げると、 ポリオキシエチレンァ ルキルエーテルとして、 ポリオキシエチレンラウリルエーテル、 ポリオキシ エチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルェ一テルがあ り、 また、 ポリオキシエチレンアルキルフエ二ルェ一テルとして、 ポリオキ シエチレンノニルフ Xニルエーテルおよびポリ才キシェチレンォクチルフェ 二ルェ一テルがある。 また、 エステルエーテル型は、 脂肪酸ポリエチレン グリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。 そ れそれの代表例は、 脂肪酸ポリエチレングリコールは、 ォレイン酸ポリェチ レングリコール、 脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、 パルミチン酸 ウレ一トがある。 また、 アルカノ一ルアミド型は、 脂肪酸アルカノールァ ミドの 1つのみである。 代表例は、 ラウリン酸ジエタノールアミドである。 力チォン界面活性剤のアルキルァミン塩型には、 モノアルキルアミン塩、 ジアルキルァミン塩およびトリアルキルァミン塩があり、 代表例は、 モノス テアリルアミン塩酸塩である。 また、 第四級アンモニゥム塩型は、 塩化(ま たは臭化、 沃化)アルキルトリメチルアンモニゥム、 塩化(または臭化、 沃化) ジアルキルジメチルアンモニゥムおよび塩化アルキルベンザルコニゥムに細 分される。 それぞれの代表例は、 塩化(または臭化、 沃化)アルキルトリメ チルアンモニゥムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニゥム、塩化(ま たは臭化、 沃化)ジアルキルジメチルァンモニゥムとして、 塩化ジステアリ ルジメチルアンモニゥム、 塩ィ匕アルキルべンザルコニゥムは塩化ラウリルべ ンザルコニゥムがある。 両性界面活性剤の力ルポキシべタイン型は、 アルキルべタインの 1つのみ である。 代表例は、 ラウリルべタインである。 また、 2-アルキルイミダ ゾリンの誘導型は、 2-アルキル- N -カルボキシメチル- N-ヒドロキシェチルイ ミダゾリ二ゥムべ夕インの 1つのみである。 代表例として、 2-ゥンデシル -N-力ルポキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ二ゥムべタインが挙げ られる。 また、 グリシン型は、 アルキル (又はジアルキル)ジェチレントリ ァミノ酢酸があり、 代表例として、 ジォクチルジェチレントリアミノ酢酸が 挙げられる。
さらに、 上記代表例に加えて、 Tr i t on X- 100、 ラウリルサルコシン、 サボ ニン、 BRI J35, アルキルァリルポリエーテルアルコール、 高級アルコール硫 酸化物、 N-ココイル -L-アルギニンェチルエステル DL -ピロリドンカルボン酸 塩、 N-ココイル- N-メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、 コレステロ ール、 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、 スクヮラン、 ステアリルァ ルコール、 ステアリン酸ポリオキシル 40、 セタノール、 セトマクロゴール 1000、 セバシン酸ジェチル、 ノニルフエノキシポリオキシエチレンエタン硫 酸エステルアンモニゥム、 ポリオキシエチレンォレイルァミン、 ポリオキシ エチレンソルビットミツロウ、 ポリオキシル 35ヒマシ油、 マクロゴール 400、 N -ヤシ油脂肪酸ァシル L-アルギニンェチル · DL-ピロリドンカルボン酸塩、 ラウリルジメチルアミンォキシド液、 ラウロマクロゴ一ル、 メチルセルロー ス、 CMC (カルポキシメチルセルロース)、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 20およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 CHAPS, デォキシコ一ル酸、 ジギトニン、 n-ドデシルマルトシド、 ノニデット P40、 n-ォクチルダルコシ ド、 ォクチルチオダルコシド、 ラウリル酸シュクロース、 ドデシルポリ (ェ チレングリコールエーテル) n, n-ドデシル N, N-ジメチル- 3 -ァンモニォ -1 - プロパンスルフォネート等も挙げることができる。
上掲の各種界面活性剤は、 i n s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程で使用 されることが重要であり、 その使用方法は特に限定されない。 例えば、 プ 口一ブ液またはプロ一ブ希釈液中に混合されていても良いし、 プロ一ブ液と は別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、 プローブ液を塗抹部位に塗布 する前、 同時または後に添加しても良いし、 当業者は適宜変更することがで さる。
なお、 本発明において、 陽性コントロールプローブが必要であれば、 次の ように作製することができる。 例えば、 まず、 U937細胞 (ATCC CRL-1593. 2) のゲノム DNAの抽出と精製を行うには、 37° (:、 5 %炭酸ガスインキュべ一 夕一内で、 細胞培養フラスコ (175cm2) 内の RPMI 1640培地 (25ml) を用い、 U937細胞を培養する。 U937培養液を 50mlの遠沈管に入れ、 4 °C、 220 X gで 10分間遠心分離し、 U937細胞を回収する。 細胞を 10mlの PBSで懸濁洗 浄し、 再度 4 °C、 180 X gで 10分間遠心分離し、 細胞を回収する。 その後、 上清を捨て、 細胞を 1 mlの 200 i g/mlプロテネース K含有 1 %SDS含有 TE溶液 で懸濁し、 37°Cで 30分間放置する。 フエノール抽出を 3〜4回線り返し、 除蛋白を行う。 エタノール沈殿により析出したゲノムを回収し、 の 2. 5 gリポヌクレア一ゼ含有滅菌精製水に溶解し、 42°Cで 30分間放置する。 フエノール抽出を 2〜3回繰り返し、 除蛋白を行う。 エタノール沈殿によ り析出したゲノムを回収し、 500 ^ 1の TEに溶解する。 その後、 吸光度計に より濃度を測定し、 ジゴキシゲニンラベルに供することにより、 陽性コント 口一ルプローブを作製することができる。 また、 陽性コントロールプロ一 ブは、 U 937ゲノムを 1 OOngスポットしたメンブレンに、 陽性コントロールプ ローブをドットハイブリダイゼ一ションするとき、 ハイプリッド形成が確認 できるものを用いるのがよい。 陰性コントロールプローブが必要であれば、 公知の方法で作製することができる。
また、 本発明には、 食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、 得 られた食細胞を固定し、 該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、 該食 細胞中に存在すると予想される感染症原因菌の D NAを露出させる処理を施 し、 この D N Aにス卜リンジェン卜な条件下ハイブリダイゼ一シヨンできる 検出用 D N Aプロ一ブを用いて in s i tuハイブリダィゼ一シヨンを行い、 得 られたシグナルにより感染症原因菌を検出および/または同定するためのキ ットであって、 D N A露出工程で使用される酵素が、 リゾス夕フィン、 リゾ チーム、 N-ァセチルムラミダ一ゼ、 ザィモラ一ゼからなる群より選択される 少なくとも 1種以上の酵素、 界面活性剤が添加されたプローブ液、 1種以上 の検出用 D N Aプローブを有することを特徴とする、 感染症原因菌を検出お よび/または同定するためのキットも含まれる。 キットには、 後出の実施 例に示す、 血液分離試薬、 酵素前処理試薬、 酵素試薬、 ァセチル化試薬、 プ ローブ液、 ブロッキング試薬、 標識抗体、 標識抗体希釈液、 発色前処理液一 1、 発色前処理液一 2、 発色試薬、 対比染色液、 PBS原液、 ハイブリダィゼ ーシヨン原液、 標識抗体洗浄液、 発色試薬洗浄液、 APSコートスライドダラ ス、 プローブ希釈液、 バッファー A等が含まれる。 これらのうち、 少なく とも酵素試薬とプローブ液を具備することが好ましい。 また、 本発明に使 用する各種試薬、 例えば、 クロ口ホルム、 エタノール、 無水酢酸、 DMS0、 PM SF、 ホルムアミド、 酢酸、 塩酸、 水酸化ナトリウム等を含んでいても良い。 さらに、 低速遠心機、 恒温機、 血球計算盤、 振とう機、 湿潤箱、 恒温槽、 光学顕微鏡、 可変式ピペット、 採血管、 チップ、 ピペット、 染色ビン、 メス シリンダー、 注射筒、 0. 2 mシリンジトップフィルターの機械や器具を含ん でいても良い。
また、 本発明は、 生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食細胞に よって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法を提供する。 さ らに、本発明は、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、 同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌が特定されるこ とを特徴とする方法を提供する。
この方法を、 様々なセプシスが疑われた患者血液の診断に実際に応用した ところ、 投与された抗菌薬の影響を受けることなく、 血液培養法に比べて約 4倍の感度で起因菌を検出することができ、 検出菌株の一致率は良好である ことが明らかになつている。 そして、 血液培養では檢査に 3日以上 14日程 度を要するのに比較して、 本発明の方法では全操作完了までに約 8時間と極 めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができるので、 特に 敗血症または菌血症など、 速やかな善処が必要とされる感染症の診断や予後 診断の 'モニター等において有用マーカ一となり得る。
実 施 例
以下に、 本発明を実施例に沿って具体的に説明するが、 これら実施例の開 示によって本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
実施例 1 :採血 ·血液検体の処理
臨床検体として、 敗血症が疑われた患者より採取した血液 12検体 (検体 A 〜L ) を用いた。 各患者からへパリン加静脈血 10mlを採取し、 これら血液 と血液分離試薬 (塩化ナトリウム 225mg、 デキストラン (分子量: 200, 000〜 300, 000) 1. 5 g、 滅菌精製水にて全量 25mlに調製したもの) を 4 : 1の割合 で混和した後、 37°Cで、 30分間静置することにより、 白血球画分 (上層) を 取得した。 この白血球画分を、 4 °Cにて 160 X gで 10分間遠心分離するこ とで、 白血球を得た。 次に、 得られた白血球のペレットに滅菌精製水 l ml を加えて懸濁し、 直ちに過剰量の PBS (塩化ナトリウム 18. 24 g、 リン酸一水 素ナトリウム 12水和物 6. 012 g、 リン酸二水素ナトリウム 2水和物 1. 123 g、 滅菌精製水にて全量 120mlにしたもの (PBS原液) を、 滅菌精製水にて 20倍に 希釈したもの) を加えて等張化した後、 再度 4 °Cで、 160 X gで 10分間遠心 分離した。
実施例 2 :白血球の固定
3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APS、 SIGMA社) がスライドグラス (日本エアーブラウン社製、 商品番号 MS31 1BL) にコートされた APSコートス ライドグラスを使用した。 APSコ一トスライドグラスの作製は、 まず、 ス ライドホルダーにスライドグラス (商品番号 MS311BL) を固定した後、 希釈 した中性洗剤で 30分以上浸すことにより洗浄し、 水道水で洗剤を十分に取り 除き、 次に、 スライドグラスを精製水にて洗浄し、 高温 (100°C以上) で十 分に乾燥させた後、 室温で放置冷却した。 その後、 このスライドグラスを 2 %APS含有ァセトンに 1分間浸し、 直ちにァセトン及び滅菌精製水で順次 軽く洗浄した後、 風乾した。 さらに、 再度、 スライドグラスを 2 %APS含 有アセトンに 1分間浸し、 直ちにアセトン及び滅菌精製水で、 順次軽く洗浄 した後、 風乾する操作を行った後、 42°Cで乾燥させることにより作製した。 白血球画分を、 4°Cにて、 160X gで 10分間遠心分離して得た白血球ペレ ットに、 少量の PBSを加えて懸濁し、 血球計算盤を用いて白血球数を計測す る。 細胞数が 1 X105個/ゥエルとなるように PBSで調製した白血球懸濁液 5 1を、 APSコ一トスライドグラスの各ゥエルに白血球が単層に広がるよう に塗抹し、 完全に風乾することにより、 白血球を APSコ一トスライドグラス に支持させた。 その後、 カルノア固定液 (エタノール:クロ口ホルム:酢 酸 =6 : 3 : 1の容量比で混合した液) に 20分間浸した後、 75%エタノール 液に 5分間浸し、 完全に風乾させた。
実施例 3 :白血球細胞膜の透過性宂進処理
PBSに 10分間浸し、 その後、 酵素前処理試薬 (サポニン 1.25g、 t-ォクチ ルフエノキシポリエトキシエタノール (比重 1.068〜1.075(20/4°C)、 pH(5 /v%)5.5〜7.5) 1.25mK PBS原液 25mlを混合し、 滅菌精製水にて全量 50mlに 調製したもの) を滅菌精製水で 10倍に希釈した溶液に浸し、 振とう機で 10分 間浸透させた。
実施例 4 :菌体壁の溶菌酵素処理
感染症原因菌の DNAを露出させるため、 スライドグラス 1枚につき酵素 試薬 (N-ァセチルムラミダーゼ 1,000単位 /ml、 リゾチーム 100, 000単位/ mlお よび/またはリゾスタフイン 100単位/ inl) に酵素試薬溶解液 (PBSで 0. lmol/ 1フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィド (PMSF) 含有ジメチルスルフォ キシド (DMS0) を 100倍希釈して製したもの) を lml加えて酵素試液を調製 した後、 37°C〜42°Cの湿潤箱内で、酵素試液 lmlを白血球塗抹部位に滴下し、 30分間静置した。 その後、 0.2mol/l 塩酸含有 PBS (PBS原液に塩酸を加え、 滅菌精製水にて 20倍希釈し、 塩酸の終濃度を 0.2mol/lに調製したもの) に浸 し、 そのまま振とう機上で 10分間浸透させた。
実施例 5 :細胞膜タンパク質のァセチル化
ァセチル化試薬 (トリエタノールァミン 7.46 g、 塩酸適量、 滅菌精製水適 量にて全量 50mlとしたもの) に無水酢酸を加え、 滅菌精製水で 10倍希釈し、 無水酢酸の終濃度を 0.8%に調製したァセチレ一ション試薬にスライドグラ スを浸し、 振とう機上で 10分間振とうすることにより行った。 その後、 75 %、 85%、 98%エタノールに、 順次、 3分間ずつ浸し、 完全に風乾させた。
実施例 6 :菌体 DNAのアルカリ処理 (二本鎖 DN Aを一本鎖に変性) スライドグラスを、 70mmol/l 水酸化ナトリウム含有 PBS (PBS原液に水酸 ィ匕ナトリウムを加え、 滅菌精製水で 20倍希釈し、 水酸化ナトリウムの終濃度 を 70醒 ol/lに調製したもの) に 3分間浸すことにより行った。 その後、 75 %、 85%、 98%エタノールに、 順次、 3分間ずつ浸し、 完全に風乾させた。
実施例 7 :ハイプリダイゼ一シヨン
プローブ希釈液 (0.25%SDS、 サケ精子 DNA 600 K 100Χデンハート溶液 50 1、 ハイブリダィゼ一シヨン原液 500 xl、 ホルムアミド 2250 1、 50%硫 酸デキストラン 1000 1が含まれる) で調製したジゴキシゲニン標識 DNA プローブ 15ngを含有する液(プロ一ブ液; l.Ong/^ l) を塗抹部位に塗布し、 37°C〜42°Cの湿潤箱中で 2時間静置させた。 SDS無添加のプローブ液を対 照とした。 ジゴキシゲニン標識 DNAプロ一ブは、 ニックトランスレーシ ヨン法にて作製した。 その後、 ハイブリダィゼ一シヨン洗浄液 (ハイプリ ダイゼ一シヨン原液 (塩化ナトリウム 13.15g、 クェン酸三ナトリウム 2水 和物 6.615g、 滅菌精製水にて全量 75mlに調製したもの) を、 八ィプリダイ ゼ一シヨン原液:滅菌精製水:ホルムアミド = 5 : 45: 50の割合で混合して 調製したもの) を 3つの染色ビンに用意し、順次、 42°Cで 10分間ずつ浸した。 その後、 PBSに浸して、 そのまま振とう機上で 10分間振とうさせた。 ジ ゴキシゲニン標識 DN Aプローブとして、 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidisに対するプロ一ブとして、 SA-24 (配列番号: 1)、 SA-36 (配列番号: 2)および SA - 77 (配列番号: 3) ならびに SE-22 (配 列番号: 4)、 SE-3 (配列番号: 5) および SE-32 (配列番号: 6) (日本国特 許第 2798499号参照) の各プローブを利用した。 また、 Pseudomonas aerug inosaに対するプローブとして、 Π-2 (配列番号: 7 ) (日本国特許第 2965544 号参照) のプローブを利用した。 また、 Enterococcus faecal isに対する プローブとして、 EF-1 (配列番号: 8)、 EF-27 (配列番号: 9) および EF - 7
(配列番号: 10) (日本国特許第 2965543号参照) を利用した。 そして、 Escherichia coli、 Enterobacter cloacaeおよび Klebsiella pneumoniae^ 対するプローブとして、 EC- 24 (配列番号: 11)、 EC- 34 (配列番号: 12) お よび EC- 39 (配列番号: 13) ならびに ET-49 (配列番号: 14) および Kト 50 (配 列番号: 15) (日本国特許第 3026789号参照) を利用した。 さらに、 Candida albicansに対するプローブとして、 CA-26 (配列番号: 16)、 CA-26-1 (配列 番号: 17)、 CA-26-2 (配列番号: 18) および CA- 26-3 (配列番号: 19) (日本 国特許第 2558420号参照) を利用した。 これらプローブの配列を用いて、 ニックトランスレ一ション法によりプローブの作製を行った。
実施例 8
In situハイブリダィゼーシヨンを行った後、 ブロッキングの操作を行つ た。 湿潤箱内でスライドグラス 1枚につきブロッキング試薬 (ゥサギ正常 血清 2ml、 PBS原液 0.5ml、 滅菌精製水にて全量 10mlに調製したもの) 1mlを 塗抹部位に滴下し、 30分間静置した。 その後、 ブロッキング試薬を除去し た。
実施例 9 :標識抗体との反応
標識抗体 (アル力リフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液 1.05 単位、 バッファー A (トリエタノールァミン 746mg、 塩化ナトリウム 17.5mg、 塩化マグネシウム 6水和物 20.3mg、 塩化亜鉛 1.36mg、 ゥシ血清アルブミン lOOOmg, 塩酸適量、 滅菌精製水適量にて全量 100mlに調製したもの) 12.6 1 にて全量を 14 1に調製したもの) を標識抗体希釈液 (トリス-(ヒドロキシ メチル)-ァミノメタン 8.48mg、 塩化ナトリウム 6.14mg、 塩酸適量、 滅菌精製 水適量にて全量 0.7mlに調製したもの) で 50倍希釈した標識抗体液を調製し、 この標識抗体液を塗抹部位に 10 1ずつ滴下し、 30分間静置させた。 その 後、 標識抗体洗浄液 (ポリソルベート 20 ImK PBS原液 50ml、 滅菌精製水に て全量 100mlに調製したもの) を 10倍に希釈した溶液に浸して、 そのまま振 とう機上で 10分間浸透させた。 この操作を 2回繰り返した後、 発色前処理 液 1 (トリス -(ヒドロキシメチル) -ァミノメタン 6. 06 g、 塩ィ匕ナトリウム 2. 92 g、 塩酸適量、 滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの) と発色前 処理液 2 (塩化マグネシウム 6水和物 5. 08 g、 滅菌精製水にて全量 50mlに調 製したもの) とを等量混合し、 滅菌精製水で 5倍に希釈した発色前処理液に 浸し、 そのまま振とう機上で 10分間振とうさせた。
実施例 10 :検 出
スライドグラス 1枚につき発色試薬 (ニトロブル一テトラゾリゥム(NBT) / 5_ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルフォスフェイト(BCIP)溶液、 pH 9. 0〜10. 0 : NBT 3. 3mg、 BCIP 1. 65mg、 N,N-ジメチルホルムアミド 99 g、 トリス(ヒド ロキシメチル)ァミノメタン 121mg、 塩酸適量、 塩ィ匕ナトリウム 58. 4mg、 塩化 マグネシウム 6水和物 101. 6mg、 滅菌精製水適量にて全量 10mlに調製したも の) 1 m 1を 0 · 2 mシリンジトップフィルタ一を装着したディスポ一ザブルシ リンジを用いてろ過しながら、 スライドグラスの塗抹部位に滴下し、 湿潤箱 内で、 37° (:、 30分間遮光静置した。 その後、 発色試薬洗浄液 (トリス-(ヒ ドロキシメチル) -ァミノメタン 606mg、 エチレンジァミン四酢酸ニナトリウ ム 2水和物 186mg、 塩酸適量、 滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの) を 10倍に希釈した溶液に 5分間浸し、 風乾した後、 対比染色液 (ファストグ リーン FCF (食用緑色 3号) 50mg、 滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したも の) を 10倍に希釈した溶液および 1 %酢酸溶液に浸した。 その後、 前記発 色試薬洗浄液を 10倍に希釈した溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗 い流し、 完全に風乾させた。
実施例 11:判 定
判定は、 光学顕微鏡で鏡検 (X I , 000) するとき、 単一ゥエル内で対比染 色液によって染まった細胞に於いて、 青紫色の発色シグナルが 1つでも認め られた場合に陽性と判定した。 その結果、 本発明の方法により、 12検体中 5検体で菌を検出した。 5検体の内訳は、 検体 A-SA (St aphyl ococcus aureus) , 検体 Fおよび G- SE (S t aphyl ococcus epi dermi di s)、 検体 J-SEおよ び EF (Enterococcus faecal is)、 検体 L-SAおよび CA (Candida albicans) で あった。 なお、 同じ検体を用いて、 公知の方法に従い血液培養を行ったと ころ、 検体 Aは SAを検出し同一の結果を示したが、 検体 F、 G、 Jおよび L は菌を検出することができなかった。 従って、 本発明の方法が、 血液培養 と比較して、 迅速に感度よく検出できることが判明した。
検体 A-SAにおける結果に関し、 プロ一ブ希釈液への SDSの添加の効果を、 第 1図に示した。 第 1図から、 SDSを 0.25%添加することで、 シグナルの 検出感度が格段に高められることが明らかである。 その他の検体について も同様に、 SDSを添加することで良好なシグナル検出が可能となった。 な お、 本実施例において使用したプローブは、 SA-24 (配列番号: 1)、 SA-36 (配列番号: 2) および SA- 77 (配列番号: 3) の塩基配列を組み合わせて 用い、 ニックトランスレーションによって作製したプローブである。
実施例 12:塗抹固定する至適白血球数の検討
APSコ一トスライドグラスのゥエル (直径 5匪の円形ゥエル) に塗抹する 至適白血球数を検討した。 へパリン加健常ヒト血液 10mlを採取し、 実施例 1に記載の手順に従って白血球を採取した。 次に、 得られた白血球を適量 の PBSで懸濁した後、血球計算盤を用いて lml当たりの白血球数を測定し、 (a) 1 X108個 /mlを始点として、 (b) 5 X107個/ ml、 (c) 1 X 107個/ ml、 (d) 5 X 106個 /ml、 (e) 1 X106個/ ml、 (f) 5 X 105個/ mlおよび (g) 1 X105個/ mlの希 釈系列を作成した後、 各々 5 lをスライドグラスに塗抹した。 風乾後、 カルノア固定 (実施例 2参照) を行い、 直ちに前記対比染色液で染色し、 実 施例 11に記載した方法を用いて判定した。 その結果、 細胞数が 1 X108個/ mlでは細胞数が過剰であり、 検出不適であった。 また、 5 X106個/ ml以下 では、 ゥエルに観察される細胞数が少なく、 検出不適であった。 よって、 固定化する食細胞の密度 (X個/ ml) としては、 約 5 X106個/ ml<x個/ ml< 約 1 X108個 /ml、 とりわけ、 約 1 X107個 /ml≤x個/ 1111≤約5 X107個 /mlが好 ましい。 また、 それに対応して、 APSコートスライドグラスに固定される 1ゥエル当たりの白血球の細胞数 (y個/ゥエル (直径 5mm)) は、 約 2.5X 104個/ゥエルく y個/ゥエル (直径 5 mm)く約 5 X 105個/ゥエル、 好ましくは、 約 5 X104個/ゥエル≤y個/ゥエル(直径 5mm)≤約 2.5X105個/ゥエルとなる ように調製するのが良いことが判明した。 試料 (a)〜(f)に関する実験結果 を、 第 2図(a)〜(f) にそれぞれ示した。
実施例 13:使用溶菌酵素の選択
Staphylococcus aureus (ATCC 12600)、 Staphylococcus epidermidis (AT CC 14990)、 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)、 Enterococcus faecali s (ATCC 19433)、 Escherichia coli (ATCC 11775) を溶菌する酵素条件を検 討した。 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidisでは、 溶菌酵素としてリゾスタフイン (Bur. J. Biochem. , 38, 293-300, 1973) を使用した。 Enterococcus faecalisには、 N-ァセチルムラミダ一ゼ
(Archs. Oral Biol., 23, 543-549, 1978)、 リゾチーム (生化学工業) を 使用した。 また、 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coliにつ いては、 70腿 ol/lの水酸化ナトリウム含有 PBSを使用した。 これら各種細 菌を 5mlの皿 I (ブレインハートインフユ一ジョン) 液体培地(DIFC0社製)に 植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。 培養した菌液を、 4°C、 2,000X g で 10分間遠心分離して集菌した。 集めた菌を PBSで懸濁して試料とした。 溶菌はマイクロプレ一ト リ一ダーを用い、 吸光度 600應における菌液の濁 度の減少により評価した。 その結果、 Staphylococcus aureusおよび Staph ylococcus epidermidisは、 リゾスタフインにより溶菌した。 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coliについては、 70imnol/lの水酸ィ匕ナ卜リウ ム含有 PBSで溶菌したため、 酵素処理は必要としなかった。 また、 Enteroc' occus faecal isについては、 N-ァセチルムラミダ一ゼ単独よりもリゾチーム と併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。 また、 貪食作 用を受けて取り込まれた菌が、 例えば、 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia col iなどである場合には、 アルカリ処理に際して菌の細胞壁が 溶解され、 遺伝子が露出した状態となるので、 必ずしもこの酵素処理を行う 必要はない。 本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処 理用の各酵素は、 前述した細菌株に対して有効であるのみならず、 他のスタ フイロコッカス属、 ストレプトコッカス属、 バシルス属およびミクロコッカ ス属を初めとする他の菌種等でも有効である。 また、 かような酵素は、 各 々単独で用いることもできるが、 混合した場合の方が有効である。 それら 結果を、 第 3図、 具体的には、 (a) Staphylococcus aureusおよび Staphyloc occus epidermidis、 (b) Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coli、 ならびに(c) Enterococcus faecalisについて示した。
実施例 14:酵素溶解液に関する検討 (DMS0の至適濃度の検討)
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、 白血球の形態を劣化させることか ら、 白血球の形態を保持させるために添加する PMSFの溶解剤である DMS0の酵 素活性に及ぼす影響を検討した。 Enterococcus faecal isを、 50mlの前記 BHI液体培地に植菌し、 37°Cで、 8時間以上培養した。 この培養液を、 4 °C、 2, OOOXgで 10分間遠心分離して集菌し、 PBSで懸濁した後、 ォ一トクレ ーブ (120°C、 10分) により熱処理を行った。 次に、 4°C、 2,000X gで 10 分間遠心分離し、 上清を捨て、 1mlの PBSで沈渣を懸濁させた後、 凍結乾燥 させた。 この凍結乾燥試料を O〜10%DMS0含有 5mmol/lトリス-塩酸 (pH 6.0), 2腿 ol/I塩化マグネシウムで懸濁し、 N-ァセチルムラミダーゼに対す る試料とした。 また、 Micrococcus luteus (JCM1464) を、 5mlの BHI液体 培地 (前出) に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。 培養した菌液を、 4 DC、 2, 000X gで 10分間遠心分離して集菌した。 上清を捨て、 菌のペレツ トを PBS 5mlで懸濁洗浄し、 再度 4°C、 2, 000X gで 10分間遠心分離して集 菌した。 このようにして集めた菌を、 O〜10%DMS0含有 PBSで懸濁し、 リ ゾチームに対する試料とした。 一方、 Staphylococcus epidermidisをリゾ チームの場合と同様に培養、 集菌し、 0〜10%DMSO含有 PBSで懸濁し、 リゾ ス夕フィンに対する試料とした。 酵素活性は、 マイクロプレートリーダ一 を用い、 吸光度 600nmにおける試料の濁度の減少により評価した。 ただし、 本試験中それぞれの酵素力価は、 (a) N-ァセチルムラミダーゼ 300単位 /ml、 (b) リゾチーム 10,000単位/1111、 (c) リゾス夕フィン 50単位 /mlとし、 酵素 活性に対する DMSOの影響を検討した。 それぞれの酵素活性を単位時間当た りにおける菌濁度 (O. D. = 600nm) の減少で評価した結果、 DMSOは、 N-ァセ チルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、 リゾチームお よびリゾス夕フィンに対しては、 共に 5 %以上の DMSOで活性の低下が認めら れた。 また、 2 %以下の DMSOの濃度では、 酵素活性の低下は認められなか つた。 ゆえに、 PMSFを溶解させる DMSO濃度は少なくとも 5 %未満、 好まし くは 2 %以下、 さらには 1 %程度とするのが好ましい。 その結果を、 第 4 図(a)〜(c)および下記表 3に示した。 表 3 :酵素活性 (菌濁度の減少) に対する DMSOの影
Figure imgf000042_0001
実施例 15:酵素溶解液に関する検討 (PMSFの至適濃度の検討)
酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させることか ら、 白血球の形態を保持させるために添加する PMSF (PIERCE社製) の効果を 検討した。 100 1の DMS0 (和光純薬社製) に PMSFを溶解し、 PMSFの終濃度が 無添加 (0讓 o l/l) 〜 1腿 ol/lとなるように PBSで 10mlに希釈した。 この 溶液に、プロテア一ゼのカ価が 0. 2単位/ mlとなるよう、プロティネース K (ベ —リンガーマンハイム社製) を添加した。 へパリン加健常ヒト血液 5 mlを 採取し、 実施例 1に記載の方法に従って白血球を採取した。 次に、 白血球 を適当量の PBSで懸濁して、 血球計算盤で細胞数を計測し、 細胞数を、 約 5 X 104個/ゥエル〜約 2. 5 X 105個/ゥエルに調製し、 その 5 1を APSコ一トス ライドグラスのゥエルに塗抹し、 風乾後、 実施例 2に記載のカルノア固定の 方法に従って固定した。 このサンプルを用いて、 実施例 3〜11に記載の方 法に従って試験を行った。 1 11101/1〜 lmmol/1の PMSFの濃度で試験を実 施した結果、 10 xmol/l以上の濃度で効果が認められ、 0. lmmo 1/1以上の PMSF 濃度では、 白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。 その結果を、 第 5図の(a) プロテアーゼ 0.2単位/ mlのみ、 (b) PMSF 1 mol/ml添加、 (c) PMSF 10/zmol/ml添加、 (d) PMSF 0. Immol/ml添加、 および(e) PMSF 1匪 ol/ m 1添加についてそれぞれ示した。
実施例 16:溶菌酵素ザィモラ一ゼの至適力価の検討
カンジダ 'アルビカンス(Candida albicans)を溶菌して D N Aを露出させ るためのザィモラ一ゼの至適力価を検討した。 カンジダ ·アルビカンスを YPD培地に植菌し、 30°Cで一昼夜培養した。 その後、 基質としてカンジダ •アルビカンスを PBSで懸濁した溶液 (基質 1)、 およびカルノア固定後、 70 %エタノールに浸し、 風乾し、 PBSにて懸濁した溶液 (基質 2) の 2種類を 調製した。 反応は、 ザィモラーゼ /PBS: 0.5ml、 基質: 1.5ml、 M/15リン酸 緩衝液: 2.5ml、滅菌精製水: 0.5mlにて全量 5. Omlに調製したものを用いた。 その後、 37°Cで、 2時間反応させ、 その 0D8Qを測定した。 また、 ザィ モラ一ゼ (ザィモリエイス- 100T) 濃度は、 Omg/ml、 O.Olmg/mK 0.025rag/ ml、 0.05mg/mK 0. lmg/mK 0. 5mg/mK 0.5mg/mK 1 mg/mK 2.5mg/mK 5 mg/mlを用いた。 その結果、 基質 1を用いた場合のそれぞれの 0D8。。値は、 0.533、 0.521、 0:553、 0.554、 0.548、 0.417、 0.394、 0.288、 0.163、 0.113 であり、 また、 基質 2を用いた場合のそれぞれの 0D8。。値は、 0.445、 0.411、 0.359、 0.282、 0.232、 0.146、 0.115、 0.096、 0.08、 0.057であった。 基 質 1および基質 2がともに、 0.5mg/ml〜 5mg/ml、 特に、 1 mg/ml〜 5 mg/ml の範囲で有効であることが判明した。 すなわち、ザィモラ一ゼの使用量は、 50単位/ ml〜 500単位 /ml、 特に 100単位 /ml〜500単位/ mlであることが好まし い。 実施例 17:至適酵素処理条件 (力価) の検討
(1) 貪食サンプルの作製
① U937細胞の調製
37°C, 5 %炭酸ガスインキュベーター内で、 細胞培養フラスコ (175cm2) 中の RPMI1640培地 (25ml) で U937細胞 (ヒト単球株化細胞、 ATCC CRL-1593. 2) を培養した。 次に、 U937細胞培養液を 50mlの遠沈管に入れ、 4°C、 220Xgで 10分間遠心分離し、 U937細胞を回収した。 その後、 回収した U937細胞を PBS200^1で懸濁し、 血球計算盤で細胞数を計算し、 細胞数を 1 ズ104個/ 1〜2ズ104個/^1に調製した。
②細菌貪食サンプルの調製
Staphylococcus aureus (ATCC 12600)、 Staphylococcus epideriidis (AT CC 14990)、 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)、 Enterococcus faecalis (ATCC 19433)および Escherichia coli (ATCC 11775) を、 各々 5mlの BHI培 養液に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。 培養した菌液を、 4t:、 2, OOOXgで 10分間遠心分離して集菌した。 上清を捨てた後、 菌のペレツ トを PBS 5mlで懸濁し、 再度、 4°C、 2, 000X gで 10分間遠心分離して集菌 した。 集菌した菌を PBS 5mlで懸濁した後、 PBSにて希釈して吸光度計によ り菌液の濁度 (O.D. =600nm) を、 Staphylococcus aureus (0.01〜0·03)、 Staphylococcus epidermidis (0.01〜0.03)、 Pseudomonas aeruginosa
(0.02〜0.03)、 Enterococcus faecalis (0·01〜0·03)、 Escherichia coli (0.02〜0.03) にそれぞれ調製したものを 15ml作製した。 作製した菌液は、 個別の 175cm2の培養用フラスコに移し、 30分間室温で静置した。 へパリン 加健常ヒト血液 50mlを採取し、 血球分離試薬を 4 : 1の割合で加え、 37°Cで 30分間静置し、 白血球画分を分取した。 分取した白血球画分を PBSで 50ml にした。 培養用フラスコ (前出) の上清を静かに捨て、 PBSで希釈した白 血球画分を 10mlずつフラスコに加え、 室温で 10分間静置した。 培養用フラ スコ内の上清を捨て、 フラスコの底に付着した白血球を 0.02%EDTA含有 PBS 10mlで 15mlの遠沈管に回収し、 4°C、 140X g〜180X gで 10分間遠心分離し、 白血球を収集した。 収集した白血球中に赤血球の混入が認められたので、 滅菌精製水 lmlにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、 PBSを 14ml加えて等張ィ匕を行い、 再度 4°C、 140X g〜180Xgで 10分間遠心分離を 行い、 白血球を収集した。 収集した白血球を PBSで懸濁し、 血球計算盤に て細胞数を計測し、 1 X104個 / 1〜5 X104個/ lに調製した。 この貪食 サンプルを、 それぞれ SA貪食サンプル、 SE貪食サンプル、 PA貪食サンプル、 EF貪食サンプル、 EK貪食サンプルとした。
③塗抹固定
実施例 17(1)①で調製した U937細胞と、 実施例 17(1)②で作製した各細菌 貪食サンプルとを APSコートスライドグラスの各ゥエルに 5 lずつ塗抹し、 風乾させた。 次に、 実施例 2に記載のカルノア固定液に 20分間浸した後、 75%エタノールに 5分間浸し、 カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、 試 験に使用するまで 4°Cで保存した (実施例 2参照)。 次いで、 固定サンプ ルの前処理を、 実施例 3に従って行った。
(2) 貪食サンプルの規格及び試験方法
①細 胞 数
各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定する細胞の数を、 5.0X 104〜2.5X105個/ゥエルとし、 また、 U937細胞の細胞の数を 5.0X104〜1.0 X105個/ゥエルとした。
②貪 食 率
スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルを、 ァクリジンオレンジ 染色液で染色し、 蛍光顕微鏡 (X1,000) で無作為に約 200個の細胞を計測し た。 計測した細胞の中で、 細胞内に細菌を貪食している細胞 (第 6図で矢 印にて示す、 貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞) を陽性細胞とし、 以下の数式に従ってその貪食率 (%) を算出した。 貪食率 (%) = [(陽性細胞数 Z計測細胞数) X 100] この時に算出した各細菌貪食サンプルの貪食率(%)は、 10%以上であった。 ③試験方法
実施例 17 (2)①および②で作成した貪食サンプルを検体とした。 使用し た SA貪食サンプルの貪食率は 23%であり、 1.98X 105個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 27%であり、 1.74X 105個/ゥエルであった。 ま た、 EF貪食サンプルの貪食率は 34%であり、 6.40X 104個/ゥエルであった。 各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、 実施例 3に記載の方 法に従って、 酵素前処理を行った。 次に、 酵素前処理済みのスライドダラ スを湿潤箱に置き、 各種力価に調製した各酵素溶液 1 mlを検体塗抹部位に滴 下して反応させた。 その後、 0.2mol/l塩酸含有 PBS、 70%エタノールにそ れぞれ 10分間浸し、 風乾させた。 このスライドグラスを、 70匪 ol/l水酸化 ナトリゥム含有 PBSに 3分間、 70%エタノールに 10分間浸した後に風乾し、 1%ァクリジンオレンジ染色液で染色した。 その後、 蛍光顕微鏡 (XI, 00 0) により評価した。 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epide rmidisは、 リゾス夕フィンで至適力価の検討を行った。 Enterococcus faecal isは、 N -ァセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討 するため、 N -ァセチルムラミダーゼを 100単位/ m 1に固定した場合のリゾチ一 ム至適力価の検討と、 リゾチ一ムを 10, 000単位/ mlに固定した場合の N-ァセ チルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。 判定は、 酵素処理により菌体 が白血球中に確認されなくなるとき 「適」 とした。
④結 果
Staphylococcus aureusの溶菌においては、 表 4に記載のように、 リゾス 夕フィンの力価は 1単位/ mlで十分効果を示すが、 Staphylococcus epidermi disの溶菌においては、 10単位/ ml以上のリゾスタフィンカ価が必要であった。 ゆえに、 リゾス夕フィンの至適力価を、 10単位/ ml〜100単位/ mlに設定した。 また、 Enterococcus faecal isの溶菌においては、 リゾチームの力価を
10, 000単位/ mlで固定したとき、 N-ァセチルムラミダーゼカ価が 10単位/] nl以 下では溶菌されなかった。 リゾチームについては、 表 5に記載の通り、 N - ァセチルムラミダーゼカ価を 100単位/ mlに固定したとき、 リゾチーム力価が 1,000単位/ ml以下では溶菌されなかった。 ゆえに、 N-ァセチルムラミダー ゼの至適力価は、 100単位/ ml〜l,000単位/ ml、 また、 リゾチームの至適力価 は、 10,000単位/1111〜100,000単位/1111に設定した。 その結果を、 第 7図に 示すが、 図中、 (a)は酵素処理前の Staphylococcus aureusの貪食サンプル、 (b)は処理前の Enterococcus faecal isの貪食サンプル、 (c)はサンプル(a)を 酵素処理した後、 および (d)はサンプル (b)を酵素処理した後の様子を示して いる。 表 4 : S. aureus、 S. epidermidisに対する
リゾスタフィンの至適酵素処理力価
Figure imgf000047_0002
表 5 : E. faecalisに対する N-ァセチルムラミダーゼおよび
リゾチームの至適酵素処理力価
Figure imgf000047_0001
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定における上記各酵素の至適力価も同一とした。
実施例 18:至適酵素処理条件 (温度) の検討
各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、 実施例 17 (2)③に記 載の方法に準じて検討した。 ただし、 本試験の酵素処理時間は 30分、 検討 温度は 4 ° (:、 25°C, 37°C、 42°C、 60°Cとし、 また、 各酵素力価は、 N-ァセチ ルムラミダ一ゼ (100単位 /ml、 生化学工業社製)、 リゾチーム (10, 000単位/ ml、 生化学工業社製)、 リゾス夕フィン (10単位 Ail、 S IGMA社製) とした。 判定は、 実施例 17 (2)③に記載の方法に準じて行った。 その結果、
St aphyl ococcus aureusは、 4 °C〜60°Cの温度範囲で白血球の菌体は確認さ れなかった。 Staphylococcus epi dermi di sは、 処理温度 4 °Cおよび 25°Cで は白血球中の菌体が残存していたが、 37°C以上では菌体が確認されなかった。 また、 Ent erococcus f aecal i sでは、 処理温度 4 ° (:、 25°Cおよび 60°Cで菌 体が残存していたが、 37°Cおよび 42°Cでは確認されなかった。 ゆえに、 至 適酵素処理温度を 37 :〜 42 に設定した。 その結果を、 表 6に示した。 表 6 :.酵素試薬の至適処理温度 処理温度 (。C)
4 25 37 42 60 貪食サンプル 、\
1回 適 適 適 適
S A貪食サンプル 2回 適 適 適 適
3回 適 適 適 適 適
1回 不適 不適 適 適 適
S E貪食サンプル 2回 不適 適 適 適
3回 不適 不適 適 適 適
1回 不適 適 適 不適
E F貪食サンプル 2回 不適 不適 適 適 不適
3回 不; I& 不適 適 適 不適 貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定における酵素処理の至適温度も同一とした。
実施例 19:至適酵素処理条件 (時間) の検討
実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とし た。 検討した時間は、 0分、 10分、 20分、 30分、 60分、 120分とした。 使用した SA貪食サンプルの貪食率は 18 %であり、 7. 80 X 104個/ゥエルであつ た。 SE貪食サンプルの貪食率は 34%であり、 1. 10 X 105個/ゥエルであった。 また、 EF貪食サンプルの貪食率は 28%であり、 1. 30 X 105個/ゥエルであった。 各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、 実施例 17 (2)③に記載 の方法に準じて検討した。 但し、 本試験の酵素処理温度は 37° (:、 各酵素力 価は N-ァセチルムラミダーゼ (100単位 /ml)、 リゾチーム (10, 000単位/ ml)、 リゾス夕フィン (10単位/ ml) とした。 判定は、 実施例 17 (2)③に記載の方 法に準じて行った。 その結果、 Staphyl ococcus aureus、 S taphylococcus epidermidi s, Enterococcus faecal i s貪食サンプルともに酵素処理時間 20分 以上 (0分および 10分においては不適であった) で、 白血球中に菌体は確認 されなかったことから、 少なくとも 15分以上、 好ましくは 20分以上、 さらに 至適酵素処理時間を 30分〜 60分とするのが好ましい。 その結果を、 表 7に 示した。
表 7 :酵素試薬の至適処理時間
Figure imgf000050_0001
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。
実施例 20:プローブ濃度の検討
本発明の in situハイブリダィゼ一シヨン反応において、 プローブ濃度は ハイプリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。 プローブ濃度が 低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。 また、 過剰量のプローブの使用は、 非特異的反応の原因に繋がる。
ゆえに、 各種プローブ液について、 至適濃度を検討した。 まず、 実施例 17(1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。 使 用した SA貪食サンプルの貪食率は 24%であり、 1.48X 105個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 28%であり、 2.07 X 105個/ゥエルであった。 ? A 貪食サンプルの貪食率は 11%であり、 1.59 X 105個/ゥエルであった。 また、 EF貪食サンプルの貪食率は 24%であり、 1.72X105個/ゥエルであった。 EK 貪食サンプルの貪食率は 12%であり、 1.63X 105個/ゥエルであった。 各貪 食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、 実施例 17(2)③に記載の方 法に準じて検討した。 プローブは、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、 Staphylococcus aureus、 Staphylococcus epidermidis、 Enterococcus f aec alis、 Pseudomonas aeruginosa, Escherichia col iに対する各プローブ濃度 を、 それぞれ、 0.06ng//iK 0.6ng/i K 1.2ng/ K 1.8ng/^l、 2.4ng/^K 3ng/ xlに調製した。 貪食サンプルを塗抹したスライドグラス (第 8図参 照) に、 上記各種濃度に調製したプローブ液を使用し、 実施例 3〜11に記載 の方法に従い検討した。
その結果、 低濃度(0.06ng/ l)ではシグナルが明確でなくなり、一方で、 高濃度 (2.4ng/ Hおよび 3ng / 1) ではバックグラウンドの増大が認めら れた。 ゆえに、 SA、 SE、 PA、 EF、 8 のプロ一ブ濃度を0.6〜1.8½/ 1、 好 ましくは 0.6〜1.2ng/ lとした。 また、 0.06ng/z 1においては不適であり、 0.6ng/ 1においては適であったことから、 少なくとも 0. lng/ l以上とする のが好ましい。
さらに、 2.4ng/ lにおいては不適であり、 1.8ng/ xlにおいては適であつ たことから、 2.2ng/ il以下とするのが好ましい。 その結果を、 以下の表 8〜表 12に示した。 表 8 : S Aプローブ 貪食サンプル プローブ濃度 (ngZ zL)
0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3
S A貪食サンプル + + + + +
SE貪食サンプル + +
P A貪食サンプル + +
EF貪食サンプル + +
EK貪食サンプル + + 表 9 : S Eプローブ
Figure imgf000052_0001
表 10 : P Aプローブ
Figure imgf000052_0002
表 11 : EFプロ一ブ 貪食サンプル プローブ濃度 (n g L)
0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3
S A貪食サンプル +
SE貪食サンプル + +
P A貪食サンプル + +
EF貪食サンプル + + + + +
EK貪食サンプル 表 12 : EKプローブ 貪食サンプル プローブ濃度 (ngZ zL)
0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3
S A貪食サンプル + +
SE貪食サンプル + +
P A貪食サンプル + +
EF貪食サンプル + +
EK貪食サンプル + + + + + 貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定にお る上記各プローブの至適濃度も同一とした。
実施例 21:ハイブリダィゼ一ション温度の検討
ハイブリダィゼーシヨン反応における反応温度は、 ハイブリッド形成速度 とハイプリッドの安定性に影響を与えるパラメータ一である。 ハイブリダ ィゼ一シヨン反応を高温にすると細胞の形態が劣化することが知られている ことから、 至適温度の検討 (4 °C、 25°C、 37°C、 42°C、 50°C、 60°C) を行つ た。
まず、 実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検 体とした。 使用した SA貪食サンプルの貪食率は 31 %であり、 1. 38 X 105個/ ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 42 %であり、 1. 95 X 105個/ゥ エルであった。 PA貪食サンプルの貪食率は 14%である、 1 . 27 X 105個/ゥェ ルであった。 また、 EF貪食サンプルの貪食率は 48 %であり、 1. 05 X 105個/ ゥエルであった。 EK貪食サンプルの貪食率は 17 %であり、 1. 85 X 105個/ゥ エルであった。
貪食サンプルおよび U937細胞を塗抹固定したスライドグラス (第 9図参 照) を使用して、 実施例 3〜1 1に記載の方法に従い検討した。 その結果、 ハイプリダイゼ一シヨン温度が 4 °C以下ではハイプリッド形成速度が低下 し、 各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。 また、 60°Cにお いては細胞形態の変化が認められ、 安定なシグナルが観察されなかった。 また、 25°Cおよび 50°Cでは 37°Cおよび 42°Cに比べ、 シグナルが明確でなか つたが検出することは可能であった。 ゆえに、 至適ハイプリダイゼーショ ンの温度は、 25°C〜50° (:、 より好ましくは 37〜42°Cに設定すると良い。 そ れら結果を、 以下の表 13〜表 17に示した。 表 13 : S Aプローブ
Figure imgf000054_0001
表 14 : S Eプローブ
Figure imgf000054_0002
表 1 5 : P Aプロ一ブ
Figure imgf000054_0003
表 16 : EFプローブ 貪食サンプル ハイブリダィゼーシヨン温度 (°C)
4 25 37 42 50 60
S A貪食サンプル
SE貪食サンプル
P A貪食サンプル
EF貪食サンプル + + + + +
EK貪食サンプル 表 1 7 : EKプロ一ブ
Figure imgf000055_0001
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同一とした。
実施例 22:ハイブリダィゼーション時間の検討
実施例 17 ( 1 )①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とし、 10分、 60分、 90分、 120分、 180分、 900分間のハイブリダィゼーシヨン時間 について検討した。 使用した SA貪食サンプルの貪食率は 47%であり、 1.45 X105個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 47%であり、 1.33X 105個/ゥエルであった。 PA貪食サンプルの貪食率は 15%である、 1.91X 105個/ゥヱルであった。 また、 EF貪食サンプルの貪食率は 41%であり、 1.45X 105個/ゥエルであった。 EK貪食サンプルの貪食率は 20%であり、 1.23 X 105個/ゥエルであった。
貪食サンプルおよび U937細胞を塗抹固定したスライドグラス (第 9図に 示すものに同じ) を使用して、 実施例 3〜11に記載の方法に従い検討した。 その結果、 ハイブリダィゼ一ション時間が 10分ではシグナルが観察されな かったが、 60分以上でシグナルが観察され、 90分以上で安定したシグナルが 観察された。 また、 ハイブリダィゼーシヨン時間が 900分においてもシグ ナルの検出には変化は認められなかった。 ゆえに、 少なくとも 30分以上、 好ましくは 60分以上、 より好ましくは 90分以上とするのが好ましい。 さら に好ましい至適ハイブリダィゼーシヨン時間は、 120分〜 900分に設定すると 良い。 それら結果を、 以下の表 18〜表 22に示した。 表 1 8 : S Aプローブ
Figure imgf000056_0001
表 1 9 : S Eプローブ
Figure imgf000056_0002
表 2 0 : S Eプローブ
Figure imgf000056_0003
表 2 1 : E Fプローブ
貪食サンプル 八イブリダィゼーシヨン時間 (分)
10 60 90 120 180 900
S A貪食サンプル
S E貪食サンプル
P A貪食サンプル
E F貪食サンプル + + + + + +
E K貪食サンプル 表 22 : EKプローブ
Figure imgf000057_0001
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明の臨床検体の感染症原因微 生物同定におけるハイブリダイゼ一ションの至適時間も同一とした。
実施例 23:ハイブリダィゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響 実施例 17(1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とし た。 プローブ希釈液に各種界面活性剤 (SDS、 ラウリスサルコシン、 サボ ニン、 BRIJ35、 Tween 20、 Triton X-100) を添加し、 実施例 7に従ってハイ ブリダィゼ一ションを行ったところ、 0.25%の SDSを添加することにより検 出感度が飛躍的に増強された。 また、 ラウリルサルコシン、 BRI〗 35、 ッ ィ一ン 20 (Tween 20) によって検出感度を高めることができた。 その結果 を、 以下の表 23に示した。 表 23 界面活性剤 シグナル検出 無添加 +
SDS
ラウリルサル: 1シン + +
サポニン
BRIJ 35 + +
Tween 20 + +
Triton X-100 + さらに、 SDSを種々の濃度で用いた結果、 好ましい濃度は、 1 %以下、 よ り好ましくは0.1%〜0.5%、 さらに好ましくは 0.25%であることが明らかに なった。
貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、 同 一の結果を得ることができた。 ゆえに、 本発明においても in situハイブ リダィゼーシヨンの工程に界面活性剤、 特に、 SDSを添加するのが好ましい。
実施例 24:ハイブリダィゼ一ションの際に使用するプローブ鎖長の検討 Staphylococcus aureusプローブ (SA-24 (配列番号: 1 ))および Pseudomo nas aeruginosaプロ一ブ (P 2-2 (配列番号: 7))を、 ジゴキシゲニンでラベ ル化した。
まず、 精製した各種 DNAプロ一ブ 1 を、 10XL.B. (0.5mol/l トリス 塩酸(pH 7.5) 5 50歷 οί/l 塩化マグネシウム、 0.5mgゥシ血清アルブミ ン) lOOmmol/1 ジチオスレィ 1 ル 5 1、 dNTPs (A、 G、 C) 各 InmoK ジゴキシゲニン -dUTP (Dig-dUTP) 0.5nmoK dTTP各 0.5nmol、 DNase 3 l (25mU、 75mUおよび 200mU相当量)、 10U/ 1 DNAポリメラ一ゼ 1 lおよび滅菌精製水適量にて全量 50 1となるように調製した。 15°C、 2 時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。 ラベル化後、 5分間煮沸し反応 を停止させた。 反応停止液をスピンカラム (CENTRI- SEP C0LUMUNS CS90K PRINCETON SEPARATIONS, INC.) に注入し、 25°Cで 2分間遠心分離 (3,000X g) を行い、 遊離のヌクレオチドを除去した。 その後、 溶出液の濃度を吸 光度計により測定し、 3 %ァガロースゲルにて電気泳動しサイズを確認した。 次に、 サザンブロッティング法によりァガ口一スゲル内の DNAをニトロ セルロース膜に転写させた。 その後、 2%ブロッキング試薬(ロシュ社製) に 30分間浸した後、 1 /5, 000量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシ ゲニン抗体を加え、 30分間浸した。 次に、 lOOmmol/1のトリス塩酸 (pH 7.5)、 150匪 ol/l 塩ィ匕ナトリウムにて 10分間振とうし、 2回洗浄した。 そ の後、 100匪 ol/lのトリス塩酸 (pH9.5)、 150mmol/l 塩化ナトリウムにて 10 分間振とうして洗浄した。 その後、 NBT/BCIP溶液に浸して発色させた。 最後に、 精製水に浸し発色を止めて乾燥させた。 その結果、 第 10図の ω
S Αプロ一ブ使用時および (b) PAプロ一ブ使用時についてそれぞれ示すように、 25mUの DNase (図中、 レーン 1 ) を用いて、 その鎖長が、 主として約 350〜約 600塩基長に分布するように切断した場合に、 ラベル効率が高いことが示さ れた。 こうして得られた検出用プローブを、 貪食サンプルや感染症患者か らの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用 し、 ハイプリダイゼーシヨンを行ったところ、 優れた感度でシグナルが検出 された。 従って、 ハイブリダィゼーシヨンに使用するプローブの鎖長は、 約 350〜約 600の塩基長、 好ましくは、 約 350〜約 550の塩基長とすることが良 いものと判明した。
実施例 25:ハイブリダィゼーシヨンの際に使用するプローブの検討
実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した、 Escher i ch i a co l iの貪 食サンプルを検体として、 検出用プローブについての検討を行った。
検出用プローブは、 EC-24 (配列番号: 1 1)、 EC- 34 (配列番号: 12) およ び EC- 39 (配列番号: 13) から、 実施例 24に記載したようにジゴキシゲニン ラベル化し、 約 350〜約 600塩基長を有するように調製したものを、 それぞれ 単独または 3種を組み合わせて使用した。 得られた結果から、 第 1 1図に示 すとおり、 (a) EC- 24、 (b) EC- 34または(c) EC- 39のそれぞれを単独で検出用プ ローブとして用いるよりも、 (d)これらを混合してなる混合プローブ 「MIX」 の方がシグナルが明瞭に検出され、感度が高められることが明らかであった。
産業上の利用可能性
本発明の方法における in s i tuハイプリダイゼーシヨンは、 2時間以下で も安定なシグナルを観察することができるので、 評価判定を非常に迅速に得 ることができる。 このような時間短縮は、 敗血症の迅速な診断に適用する 価値を実証するものに他ならない。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、 得られた食細胞 を固定し、 該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、 該食細胞中に存在 すると予想される感染症原因微生物の DN Aを露出させる処理を施し、 該露 出 DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ一シヨンできる検出 用 DNAプローブを用いて in situハイブリダィゼ一シヨンを行い、 得られ たシグナルにより感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するための方 法であって、 以下の特徴(1)〜(8)、 すなわち;
(1) 固定化する食細胞の密度 (X個/ ml) が、 5 106個/1111< 個/]111く 1 X108個/ mlであること、
(2) 前記 DNAを露出させる工程においてリゾスタフィンが使用され、 その力価が、 1単位/ ml〜l, 000単位/ mlであること、
(3) 前記 DNAを露出させる工程においてリゾチームが使用され、 その 力価が、 1,000単位/ ml〜l, 000, 000単位/ mlであること、
(4) 前記 D N Aを露出させる工程において N-ァセチルムラミダ一ゼが使 用され、 その力価が、 10単位/ ml〜10,000単位/ mlであること、
(5) 前記 DNAを露出させる工程においてザィモラ一ゼが使用され、 そ の力価が、 50単位 Ai 1〜 500単位/ mlであること、
(6) 前記 in situハイブリダィゼーシヨンの工程において界面活性剤を 使用すること、
(7) 前記検出用 DNAプローブが、 350〜600塩基長の鎖長を有する 1種 以上の DNAプローブであること、 および
(8) 前記検出用 DNAプローブの濃度が、 0.11½/ 1〜2.21¾/ 1でぁる ことの少なくとも 1つ以上の特徴を有する、
ことを特徴とする、 感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するため の方法。
2 . 前記 D NAを露出させる工程において、 リゾスタフイン、 リゾチ一 ム、 N-ァセチルムラミダーゼおよびザィモラ一ゼより選択される 1以上の酵 素が使用され、 そして、 リゾスタフインの力価が 10単位 /ml〜100単位/ ml、 リゾチームの力価が 10, 000単位/1111〜100,000単位/1111、 N-ァセチルムラミダ —ゼの力価が 100単位/ ml〜l,000単位 /ml、 ザィモラ一ゼのカ価が 100単位/ ml 〜500単位/ mlである請求の範囲第 1項に記載の方法。
3 . 前記 D NAを露出させる工程において、 酵素が使用され、 そして、 該酵素を反応させる温度が 26 〜 59°Cであり、 該酵素を反応させる時間が 15 分〜 120分である請求の範囲第 1項または第 2項に記載の方法。
4. 前記 D NAを露出させる工程において、 さらに食細胞の形態を保持 させる物質を使用する請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれかに記載の方 法。
5 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、 フエ二ルメチルスルフォ二 ルフルオラィドである請求の範囲第 4項に記載の方法。
6 . 前記フエ二ルメチルスルフォニルフルオライドが、 10 mo l/l〜10 讓 ol/lの濃度で使用される請求の範囲第 5項に記載の方法。
7 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、 ジメチルスルフォキシドに て溶解された物質である請求の範囲第 4項乃至第 6項のいずれかに記載の方 法。
8 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、 ジメチルスルフォキシドに て溶解された物質であり、 また、 当該ジメチルスルフォキシドが、 前記 D N Aを露出させる工程で用いられる溶液において 5 %未満の濃度に調製さ れる請求の範囲第 7項に記載の方法。
9 . 前記 in s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程において、 D NAと D N Aプローブとが、 界面活性剤の存在下で八イブリダィズされる請求の範 囲第 1項乃至第 8項のいずれかに記載の方法。
10. 前記界面活性剤が、 ァニオン界面活性剤である請求の範囲第 9項に 記載の方法。
11. 前記ァニオン界面活性剤が、 ドデシル硫酸ナトリウムである請求の 範囲第 10項に記載の方法。
12. 前記 in s i tuハイブリダィゼーシヨン工程において、 ハイブリダィ ズ反応させる温度が 25°C〜50°Cであり、 反応させる時間が 30分〜 900分であ る請求の範囲第 1項乃至第 11項のいずれかに記載の方法。
13. 前記固定工程の前に、 得られた食細胞を支持担体上に支持させるェ 程を含み、 当該支持担体が、 3—ァミノプロピル卜リエトキシシランをコ一 卜したスライドグラスである請求の範囲第 1項乃至第 12項のいずれかに記載 の方法。
14. 前記シグナルの検出の際に、 シグナルと細胞のコントラストを明確 にさせるための色素が使用される請求の範囲第 1項乃至第 13項のいずれかに 記載の方法。
15. 前記臨床検体が、 血液である請求の範囲第 1項乃至第 14項のいずれ かに記載の方法。
16. 食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、 得られた食細胞 を固定し、 該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、 該食細胞中に存在 すると予想される感染症原因微生物の D NAを露出させる処理を施し、 該 D N Aにストリンジエンドな条件下ハイブリダイゼ一ションすることのでき る検出用 D NAプロ一ブを用レて界面活性剤の存在下に i n s i t uハイブリダ ィゼ一シヨンを行い、 得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出およ び/または同定するためのキットであって、
(1) 前記 D NAを露出させる工程において使用される酵素が、 少なくと も、 リゾスタフィン、 リゾチ一ム、 N-ァセチルムラミダーゼ、 ザィモラーゼ からなる群より選択される 1種以上の酵素を含み、 および
(2) 少なくとも 1種以上の検出用 D NAプロ一ブを含む、
ことを特徴とする、 感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するため のキッ卜。
17. 生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、 食細胞によって貪 食された外来微生物の遺伝子をモニタ一する方法であって、 請求の範囲第 1 項乃至第 15項のいずれかに記載の方法における in s i tuハイブリダィゼ一シ ョン法を用いて該遺伝子を検出する工程を含み、 該臨床検体中の外来微生物 の遺伝子がモニターされることを特徴とする方法。
18. 敗血症または菌血症の診断方法であって、 請求の範囲第 1項乃至第 15項のいずれかに記載の方法における in s i tuハイブリダィゼ一シヨン法を 用いて原因微生物の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、 同定 された結果に基づいて敗血症原因微生物または菌血症原因菌が特定されるこ とを特徴とする方法。
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