WO2002099133A1

WO2002099133A1 - Procede ameliore de detection et d'identification de micro-organismes causes d'infections

Info

Publication number: WO2002099133A1
Application number: PCT/JP2002/005107
Authority: WO
Inventors: Tsuneya Ohno; Akio Matsuhisa
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2002-12-12
Also published as: US20060234219A1; US7651837B2; CA2447750C; DE60221126T2; JPWO2002099133A1; CA2447750A1; EP1403381A1; ATE366824T1; JP3934605B2; EP1403381A4; DE60221126D1; AU2002256921B2; EP1403381B1

Description

明細書感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法技術分野

本発明は、感染症原因微生物の検出および同定のための改良された方法に関する。また、感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキット、臨床検体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法および敗血症原因微生物または菌血症原因菌を特定する方法に関する。景技術

従来より、血液中に存在する菌の証明法として血液培養法が広く用いられているが、培養 ·分離同定の操作に 3〜14日程度の日数がかかる上、検出率が約 10%と低く、敗血症のような緊急を要する診断法としては、十分治療に寄与していないのが現状である。

そこで、本発明者らは上記問題を解決するために、貪食細胞によって貪食された外来微生物を検出または同定するための方法、すなわち、貪食細胞中に存在する外来微生物由来の遺伝子を、該遺伝子に特異的にハイブリダィゼーションすることのできるプローブを用いて in s i tuハイブリダィゼーションを施すことで、その検出を図る方法を発明した（特公平 7— 40号)。

特公平 7— 40号に記載された方法に従って、敗血症が疑われた患者血液を用いて検査したところ、血液培養法と比較して約 4倍の感度で菌を検出し、さらに 24時間以内に判定できたことなどから、感染症分野において脚光を浴びるに至っている。

本願発明は、特公平 7— 40号に記載された発明、すなわち、生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因菌の D NAを露出させる処理を施し、この露出 D NAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ一ションできる検出用 D N Aプロ一ブを用いて in s i tuハイブリダィゼーシヨンを行い、得られたシグナルにより感染症原因菌を検出および Zまたは同定するための方法について、この方法による検出効率 ·検出感度をさらに高めることを目的とする。発明の開示

本発明は、以上詳説した現状に鑑みて成し遂げられたものであり、その要旨とするところは、以下のとおりである。

生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物の D N Aを露出させる処理を施し、該 D NAにストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーションできる検出用 D NAプローブを用いて in s i tuハイブリダィゼ一シヨンを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するための方法であつて、下記（1)〜（8)の特徴、すなわち、

(1) 固定化する食細胞の密度 ( X個/ ml) が、約 5 X 10⁶個/ mlく X個/ ml <約 1 X 10⁸個 /mlであること、

(2) D NA露出工程においてリゾスタフインが使用され、その力価が、約 1単位/ ml〜約 1, 000単位 /mlであること、

(3) D NA露出工程においてリゾチームが使用され、その力価が、約

1， 000単位/ ml〜約 1 , 000, 000単位/ mlであること、

(4) D N A露出工程において N-ァセチルムラミダーゼが使用され、その力価が、約 10単位/ ml〜約 10, 000単位/ mlであること、

(5) D N A露出工程においてザィモラーゼが使用され、その力価が、約 50単位/ ml〜約 500単位/ mlであること、

(6) in s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程において界面活性剤を使用すること、

(7) 検出用 D NAプローブが、約 350〜約 600塩基長の鎖長を有する 1種以上の D NAプローブであること、および

(8) 検出用 D NAプローブの濃度が、約 0. lng/ i l〜約 2. 2ng/^ lの濃度であること、

の少なくとも 1つ以上の特徴を有する、感染症原因微生物を検出および Z または同定するための方法である。

D N A露出工程にあっては、好ましくは、リゾスタフイン、リゾチーム、 N -ァセチルムラミダーゼおよびザィモラーゼより選択される 1つ以上の酵素が使用され、そして、リゾスタフインの力価が、約 10単位/ ml〜約 100単位/ ml、リゾチームの力価が約 10， 000単位 /ml〜約 100， 000単位/ ml、 N -ァセチルムラミダ一ゼのカ価が約 100単位 /ml〜約 1, 000単位 /ml、ザィモラ一ゼのカ価が約 100単位/ ml〜約 500単位 /mlであるものを使用する。

D NA露出工程にあっては、好ましくは、酵素を使用し、そして、この酵素を反応させる温度を約 26°C〜約 59°Cとし、また、この酵素を反応させる反応時間を約 15分〜約 120分とする。

D NA露出工程にあっては、好ましくは、さらに食細胞の形態を保持させる物質、特に、フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィドを、好ましくは、約 10 mo l/l〜約 10讓 o l/lの濃度で使用する。食細胞の形態を保持させる物質として、好ましくは、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質を使用する。

食細胞の形態を保持させる物質を、好ましくは、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質とし、そして、ジメチルスルフォキシドは D NA露出ェ程で用いられる溶液において 5 %未満の濃度で調製する。

In s i tuハイブリダィゼーシヨンの工程にあっては、 D NAと D NAプロ —ブとが、界面活性剤、特に、ァニオン界面活性剤、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリゥム（SDS)の存在下でハイプリダイズされる。

In s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程にあっては、好ましくは、ハイブリダィズ反応させる温度を約 25°C〜約 50°Cとし、そして、ハイブリダィズ反応させる反応時間を約 30分〜約 900分とする。固定工程の前に、得られた食細胞を支持担体上に支持させる工程をさらに含み、なおかつ、その支持担体を、 3-ァミノプロピルトリエトキシシランをコートしたスライドグラスとする。

シグナルの検出の際に、シグナルと細胞のコントラストを明確にさせるための色素を使用する。また、臨床検体を、好ましくは、血液とする。

さらに、本発明によれば、食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、その細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、その食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物の D NAを露出させる処理を施し、該 D NAにストリンジェントな条件下 Λィブリダイゼ一ションできる検出用 D N Aプローブを用いて界面活性剤の存在下で in s i tuハイブリダィゼーションを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキットであって、

(1) D N A露出工程において使用される酵素が、少なくとも、リゾス夕フィン、リゾチーム、 N-ァセチルムラミダ一ゼ、ザィモラ一ゼからなる群より選択される 1種以上の酵素であり、および

(2) 少なくとも 1種以上の検出用 D NAプローブを含む、

感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキットも提供される。

また、本発明によれば、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法であって、前出の感染症原因微生物の検出および/または同定方法における in s i tuハイブリダィゼ一シヨン法を用いて該遺伝子を検出する工程を含み、該臨床検体中の外来微生物の遺伝子をモニターする方法が提供される。

そして、敗血症または菌血症の診断方法であって、前出の感染症原因微生物の検出および Zまたは同定方法における in si tuハイブリダィゼ一シヨン法を用いて原因微生物の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因微生物または菌血症原因菌を特定する方法も、本願発明によって提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンを（a) 界面活性剤（SDS)不使用下および (b) 界面活性剤 (SDS)使用下で実施した結果を示す図である。

第 2図は、種々の白血球細胞密度で固定した際の様子を示す図である。第 3図は、 a) Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidi s、 (b) Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia col i、ならびに (c) Ent erococcus faecal isに対する溶菌酵素の活性を経時的に示す図である。第 4図は、（a) N-ァセチルムラミダ一ゼ 300単位/ ml、 (b) リゾチーム 10, 000単位/1111、および（c) リゾス夕フィン 50単位/ mlの溶菌活性に対する DMS0の添加による濃度依存的効果を示す図である。

第 5図は、白血球に形態劣化をもたらすプロテア一ゼの作用を抑制するために用いる PMSFの添加効果を、（a) プロテア一ゼ 0. 2単位/] nlのみ、（b) PMSF 1 mol/ml添加、 (c) PMSF 10 mol/ml添加、 (d) PMSF O. lmmol/ml添加、および（e)PMSF 1匪 ol/ml添加について示す図である。

第 6図は、本発明に従って調製した貪食サンプルにおいて、食細胞が細菌を貪食して形態変化を起こしていることを示す図である。

第 7図は、貪食サンプルに対する酵素処理の効果を示す図で、（a) 酵素処理前の Staphylococcus aureusの貪食サンプル、（b) 酵素処理前の Enterococ cus f aecal i sの貪食サンプル、（c) サンプル（a)を酵素処理した後の様子、および (d) サンプル（b)を酵素処理した後の様子を示す図である。

第 8図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンでの至適プローブ濃度の検討のために用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。第 9図は、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンでの至適温度の検討のために用いた貪食サンプル塗抹用のスライドグラスを示す概略図である。

第 10図は、（a) SAプロ一ブおよび (b) PAプローブのジゴキシゲニンラベル化で得られる検出用プローブの鎖長とラベルによるシグナル強度を示すサザンブロット（上段）および電気泳動（下段）の図である。

第 11図は、 Escher i chi a col i貪食サンプルに関する in s i tu八イブリダィゼ一シヨンにおいて、検出用プローブとして、（a) EC- 24、 (b) EC- 34、 (c) EC - 39、および (d)プローブ（a)〜（c)の混合プロ一ブ (M I X)を用いた場合に認められたシグナル検出の結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本実施態様において使用することができる臨床検体としては、生体由来の食細胞が含まれる臨床検体であればいずれでも良く、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、痰などの体液が挙げられる。また、糖尿病、腎障害、肝障害などの病態によっては、尿、腹水、透析排液など、その他、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨などを洗浄した後の洗浄液にも生体由来の食細胞が含有されるため、これらも本発明の臨床検体とすることができる。

加えて、皮膚、肺、腎、粘膜などの組織も本発明の臨床検体として用いることができる。これは、食細胞の一つであるマクロファージには、単球、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファ一ジ、固定マクロファージ、遊離マク口ファージ、ハンゼマンマクロファ一ジ、炎症性マクロファージ、肝クッパ —細胞、脳ミクログリア細胞などの様々な形態に変化するため、血液のみならず、これらを含む組織も本発明の臨床検体として用いることができる。例えば、腎炎が疑われる患者より腎生検により腎組織を採取し、トリプシン等の酵素を用いることにより細胞を剥離して該組織中に存在する食細胞を得、得られた食細胞を用いることによって、腎炎の原因微生物を検出および同定することができる。

本明細書で使用する「食細胞」の語は、外来微生物をはじめとする異物を自身の細胞内に取り込むことのできる細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、マクロファージ、単球、好中球、好酸球などが挙げられる。また、 U937細胞、 HL60細胞などの食細胞系も使用できる。感染症の原因ともなる外来微生物としては、食細胞によって貪食される微生物であれば特に制限はなく、細菌、真菌、ウィルス、原虫、寄生虫等が含まれる。としては、例えば、ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌、連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、へリコパクター 'ピロリ菌、リステリア、エルシニア、ブルセラ等が挙げられる。真菌としては、例えば、カンジダ、ァスペルギルス、ァクチノミセス、コクシジオイデス、ブラスミセス等が挙げられる。ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ヘルべスウィルス、肝炎ウィルス、エイズウイルス等が挙げられる。原虫としては、例えば、アメーバ赤痢、膣トリコモナス、マラリア、トキソプラズマ等が挙げられる。寄生虫としては、トリパノゾーマ等が挙げられる。特に、敗血症または菌血症の原因菌としては、例えば、グラム陽性菌であるスタフイロコッカス属 (Staphylococcus aureus^ Staphylococcus epidermidis)、ェンテロコッカス属 (Enterococcus faecalis、 Enterococcus faecium、 Stre ptococcus pne画 niae、 Streptococcus pyogenes、 Streptociccus agalaci i ae)、グラム陰性菌である大腸菌（Escherichia coli)、ェンテロパクター (Enterobacter cloacae八クレブシエラ (Klebsiel la pneumoniae) 等の: 腸菌類縁腸内細菌群 (Klebsiella oxytoca、 Serratia marcesens、 Proteus vulgaris, Citrobacter freundii), 好気性桿菌であるシユードモナス属

(Pseudomonas aeruginosa), 嫌気性菌であるクロストリジゥム菌 (Clostri dium perfringens)^ パクテロイデス菌 (Bacteroides fragilis) 等が挙げられる。まれに、 Acinetobacter calcoaceticus、： Aeromonas hydrophi 1 ia Flavobacterium meningosept icum. Bacillus cereus等が、原因菌となることもある。

臨床検体からの食細胞（白血球）画分の取得には、公知の方法を使用することができる。例えば、へパリン加静脈血約 5ml (白血球数の少ない場合には 10ml) を採取し、この血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム 225mg、デキストラン（分子量 200，000〜300,000) 1.5 g、滅菌精製水にて全量 25mlに調製したもの）とを 4 ： 1程度の割合で混和した後、約 10°C〜約 40°Cで、約 15分〜約 120分間、好ましくは、約 37 で、約 30分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得することができる。このようにして得た白血球画分を、 0 °C〜約 20°Cにて、約 lOO X g〜約 500 X gで、約 3分〜約 60分間、好ましくは、約 4 °Cにて、約 140 X g〜約 180 X gで、約 10分間遠心分離することによって、白血球を得ることができる。この際に赤血球が混入した場合、溶血操作を行うのが好ましい。例えば、白血球のペレツトに滅菌精製水 l mlを加えて懸濁し、直ちに過剰量の PBS (塩化ナトリウム 18. 24 g、リン酸一水素ナトリウム 12水和物 6. 012 g、リン酸二水素ナトリウム 2水和物 1. 123 g、滅菌精製水にて全量 120mlにしたもの

(PBS原液；以下、単に「PBS原液」と称する）を滅菌精製水にて 20倍に希釈したもの；以下、単に「PBS」と称する）を加えて等張化した後、再度 4 °C 下、約 O X g〜約 180 X gで、約 10分間遠心分離すれば良い。また、上記遠心分離を行わなくとも、貪食細胞が本来保有する接着能力を利用して、後述するスライドグラスに接着させることもできる。

白血球を固定する方法として、例えば、カルノア固定を行うことができる。具体的には、白血球を支持できる担体（支持担体）に白血球を支持せしめ、カルノア固定液（エタノール：クロ口ホルム：酢酸 = 6 ： 3 ： 1の容量比で混合した液）に約 20分間程度浸した後、約 50%〜約 90%、好ましくは、約 75 %エタノール液に約 5分間浸し、完全に風乾する。

前記支持担体は、不溶性素材のものが好ましく、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂など）、多糖類（セルロース、ァガロースなど）が好ましい。

不溶性支持担体の形状としては、例えば、板状、トレィ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。特に、本発明の実施態様として好ましい支持担体は、スライドグラスを使用するのが好ましい。このようなスライドグラスとして、例えば、日本ェァ一ブラウン社製のスライドグラス（商品番号 MS31 1BL) が挙げられる。このスライドグラス（商品番号 MS31 1BL) には、直径 5 nunの円形ゥエルが 14 個設けられている。また、実際に使用する際には、細胞の接着性を上げるため、 3 -ァミノプロピルトリエトキシシラン（APS、 SIGMA社）をスライドグラスにコートした APSコートスライドグラスを使用するのが好ましい。その他、ポリ- L-リジンやゼラチンをコートしたスライドグラスも使用することができる。

APSコートスライドグラスを作製するには、まず、スライドホルダーにスライドグラス（商品番号 MS311BL) を固定した後、希釈した中性洗剤で 30分以上浸して洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（100°C以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却する。その後、スライドグラスを 2 %APS含有アセトンに 1分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する。さらに再度、スライドグラスを約 1〜約 10% APS含有アセトンに 1分間浸し、直ちにアセトンおよび滅菌精製水で順次軽く洗浄した後に、風乾する操作を行った後、約 20°C〜約 60 、好ましくは約 42°Cで乾燥させることにより作製することができる。

白血球を APSコートスライドグラスに支持させる際には、各ゥエルに白血球が単層に広がるように塗抹し風乾するのが好ましい。固定化する食細胞の密度（X個/ ml) が、約 5 X10⁶個 /ml<x個/ mlく約 1 X 個 /ml、好ましくは、約 1 X10⁷個/ ml≤x個/ 1111≤約5 X10⁷個 /mlに調製されたものを使用することが好ましい。

また、このような lml当たりの食細胞の密度の変化に対応して、 APSコートスライドグラスに固定される 1ゥエル当たりの白血球の細胞数（y個/ゥエル（直径 5mm)) は、約 2.5X10⁴個/ゥエルく y個/ゥエルく約 5 X10⁵個/ゥエル、好ましくは、約 5 X10⁴個/ゥエル≤y個/ゥヱル≤約 2.5X10⁵個/ゥェルとなるように調製するのが好ましい。具体的には、白血球画分を、 4°C にて、約 OXg〜約 180Xgで、約 10分間遠心分離することによって得た白血球ペレットに、少量の PBSを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。細胞数が、約 5 X10⁴個/ゥエル〜約 2.5X10⁵個/ゥエルとなるように PBSで調製した白血球懸濁液 5 lを、 APSコートスライドグラスの各ゥエルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより調製することができる。

食細胞膜の透過性を宂進させる処理として、約 3〜約 30分間 PBSに浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン 1. 25g、 t-ォクチルフエノキシポリエトキシエタノール（比重 1. 068〜1. 075 (20/4°C)， pH ( 5 w/v ) 5. 5〜7. 5) 1. 25ml、 PBS原液 25mlを混合し、滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの）を、滅菌精製水で約 2〜約 50倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で約 3〜約 30分間浸透する方法を用いることができる。

食細胞中に存在する感染症原因菌の D N Aを露出させる処理として、スライドグラス 1枚につき酵素試薬（N-ァセチルムラミダ一ゼ、リゾチームおよび Zまたはリゾスタフイン）に酵素試薬溶解液（フエ二ルメチルスルフォ二ルフルオラィド（PMSF)含有ジメチルスルフォキシド（DMS0)を PBSで約 100倍希釈して調製したもの）を l ml加えて酵素試液を調製した後、約 20°C〜約 60°C、好ましくは、約 37°C〜約 42°Cの湿潤箱内で、この酵素試液 l mlを白血球塗抹部位に滴下し、約 10〜約 60分間静置する。その後、 0. 2mo l/l塩酸含有 PBS (PBS原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて 20倍希釈し、塩酸の終濃度を 0. 2 mo l/lに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で 3〜30分間浸透することによって目的を達成できる。 DMS0は 5 %以上の濃度でリゾチームおよびリゾスタフインの活性を低下させる可能性があるため、 5 %未満の濃度で使用するのが好ましい。食細胞の形態を保持させる物質としての PMSF以外に他の公知のプロテアーゼ阻害剤、例えば、トシルリジンクロロメチルケ卜ン（TLCK)およびそれらの混合物などを用いることもできる。その際には、適宜 DMS0などの溶解剤を変更すれば良い。

酵素試薬として用いる各酵素の好ましい力価範囲は、 S taphyl ococcus aur eusの溶菌においては、リゾスタフインの力価は 1単位/ mlで十分効果を示すが、 S t aphyl ococcus epi dermi d i sの溶菌においては、 10単位/ ml以上のリゾスタフィンカ価が必要であった。ゆえに、リゾス夕フィンの至適力価は、約 1単位/ ml〜約 1 , 000単位/ ml、好ましくは、約 10単位/ ml〜約 100単位/ mlに設定するのが良い。また、 Enterococcus faecal isの溶菌においては、リゾチームの力価を約 10, 000単位/ mlで固定したとき、 N-ァセチルムラミダ一ゼカ価が約 10単位/ ml以下では溶菌されなかった。リゾチームについては、 N -ァセチルムラミダーゼ力価を 100単位/ mlに固定したとき、リゾチーム力価が 1, 000単位/ ml以下では溶菌されなかった。ゆえに、 N -ァセチルムラミダ一ゼの至適力価は、約 10単位/ ml〜約 10， 000単位 /ml、好ましくは、約 100単位/ ml〜約 1,000単位/ ml、リゾチームの至適力価は、約 1, 000単位 /ml〜約 1,000, 000単位/ ml、好ましくは、約 10, 000単位/ ml〜約 100， 000単位/ mlに設定すると良い。また、原因菌が Candida albicans等の真菌である場合には、ザィモラーゼ約 50単位 /ml〜約 500単位/ ml、好ましくは、約 100単位/ ml〜約 500単位/ mlの力価範囲にすると良い。また、ザィモラーゼを使用する際には、特に、 PMSFまたは公知のプロテアーゼ阻害剤を使用するのが好ましい。また、グラム陽性菌とグラム陰性菌の成分の違い、すなわち、ペプチドグリカンまたはリポポリサッカライドの違いにより、適宜使用酵素を選択することができる。特に、グラム陽性菌、グラム陰性菌にかかわらず、より効果的に溶菌させるには、 2種類以上の酵素を併用すればよい。本発明においては、リゾチーム、リゾス夕フィンおよび N-ァセチルムラミダ一ゼの 3種を混合したものを使用することにより、単独の酵素によった場合と比較して溶菌活性が高まることが明らかとなった。

酵素処理温度は、 Staphylococcus aureusは、好ましくは約 4°C〜約 60 :、 Staphylococcus epidermidisは、約 25°Cより高く、好ましくは約 37°C以上、また、 Enterococcus faecalisでは、約 25°Cより高く約 60°C未満、好ましくは約 37°C〜約 42°Cとすれば良い。ゆえに、至適酵素処理温度を、約 37° (：〜約 42 に設定するのが最も好ましい。また、 3種類の菌に対する共通の範囲の内、限界とされる温度は約 26°C〜約 59°Cと予想できる。

また、酵素処理時間は、 Staphylococcus aureus. Staphylococcus epider midis、 Enterococcus faecal isのいずれの貪食サンプルでも酵素処理時間 20 分以上（0分および 10分においては不適であった）であり、また、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも約 15分以上、好ましくは約 20分以上、さらに至適酵素処理時間を約 30分〜約 60分とするのが好ましい。また、酵素処理時間を約 15分〜約 120分としてもよい。

また、 N-ァセチルムラミダ一ゼとは、 Enterococcus iaecalisの熱処理乾燥粉末と N-ァセチルムラミダーゼを、 2顧 ol/l 塩化マグネシウムを含む 5 顏 ol/l トリス塩酸緩衝液（pH 6.0) 中で、 37°Cで、 5分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。また、 Streptococcus salivarius

(IF0 3350)の熱処理細胞を、 37。C、 pH 7.0で 1分間に 1 ug溶菌する酵素活性を 1単位とした場合、 2, 000単位/ mg以上のものを使用するのが好ましい。リゾチームは、 Micrococcus luteusとリゾチ一ムを PBS内で、 37°Cで、 5 分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。また、 Microco ecus luteusを、 35° (：、 pH 6.2で 1分間に 540nmの吸収を 0.001下げるときの酵素活性を 1単位とした場合、 50， 000単位/ mg以上のものを使用するのが好ましい。

リゾスタフインは、 Staphylococcus epidermidisとリゾスタフインを PBS 内にて 37°Cで 5分間反応させた場合、 600nmの吸光度を下げる酵素である。また、 Staphylococcus aureusを、 37° (：、 ρΗ 7.5で、 10分間に 620nmの吸収を 0.240から 0.125に下げるときの酵素活性を 1単位とした場合、 500単位/ mg以上のものを使用するのが好ましい。

ザィモラーゼ（商品名：ザィモリエイス、生化学工業）とは、 Arthrobact er lutesulの培養液から調製された酵素であり、酵母生細胞の細胞壁に対して強い溶解活性を有している。ザィモラーゼに含まれる細胞壁溶解に関わる必須酵素は) 3- 1， 3 -グルカン ·ラミナリペン夕ォヒドロラ一ゼ（lanimari - pentaohydrolase) であり、 /3 -1, 3-結合のグルコースポリマ一に作用して、主生産物としてラミナリペン夕オースを生成する。ザィモリエイス- 100T は硫安分画により精製され、さらにァフィ二ティ一クロマトグラフィ一により精製され（Kitamura, . et al. ； J. Ferment. Technol., 60, 257, 1982)、 100, 000単位/ gの活性を有している。しかしながら、この酵素の活性は、基質となる酵母の種類、培養条件および生育時期により変化することが知られている (Kitamura, K. et al. ； J. Gen. Appl. Microbiol., 20, 323, 1974、 Kitamura, K. et al. ； Agric. Biol. Chem. , 45, 1761, 1981、 Kitamura, K. et al. ； Agric. Biol. Chem. , 46, 553, 1982)。ザィモリェイス- 100Tには、 ]3- 1，3 -ダルカナ一ゼを約 1.0X10⁷単位/ g、プロテア一ゼを約 1.7X10⁴単位/ g、マンナ一ゼを約 6.0 X10⁴単位/ g含み、 DNaseおよび RNaseは認められない（Kitamura, K. et al. ； J. Gen. Appl. Microbiol., 18， 57, 1972)。また、ザィモリエイスの至適 pHは、約 5.5〜約 8.5、好ましくは、約 6.5〜約 7.5であり、至適温度は、約 25°C〜約 55°C、好ましくは約 35°C〜約 45 である。さらに、酵母（対数増殖期細胞）に対する溶菌スぺク卜ラム (属名) は、 Ashbya, Candida、 Debaryomyces、 Eremotheci亂 Endomyces、 Hansenula、 Hanseniaspora^ Kloekera、 KIuyveromyces、 Lipomy ces、 Helschkowia、 Pichia、 Pullularia、 Torulopsis、 Saccharomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes Schwanniomycesなどが挙げられる。特に、カンジダ属として、カンジダ ·アルビカンス（Candida albicans), カンジダ · トロピカリス（Candida tropicalis), カンジダ ·パラシロシス (Candida parasi losis) ^ カンジダ ·ガラクタ（Candida galacta)、カンジダ 'ギリエルモンジ（Candida gui 11 iermondi i)、カンジダ'クルセィ（Candida krusei)、クリフトコッカス，ネオフォーマンス (Cryptococcus neoformans) 等が挙げられる。本酵素の賦活剤として、 SH化合物、例えば、システィン、 2 -メルカプトエタノール、ジチオスレィトールなどを用いることができる。これらの属に属する菌も、本発明に使用できる。この酵素は、ビール酵母懸濁液を基質として、約 25°Cで、 2時間の内に、反応液（酵素： 0.05〜 O.lmg/ml溶液 lml、基質：ビール酵母懸濁液（2mg乾燥重量 Zml) 3ml、緩衝液： M/15リン酸緩衝液（pH 7.5) 5 ml、滅菌精製水 lmlで全量 10mlに調製したもの）の Α8ϋ()が約 30%減少するために必要な酵素活性を 1単位とする。ザィモリエイス- 100Tは、 100, 000単位/ gの活性を有している。

酵素試薬溶解液として用いる PMSF (プロテア一ゼから白血球を保護してその形態を保持させるために添加）の濃度として、 10 mol/l 以上の濃度で効果が認められ、 0. lmmol/1 以上の PMSF濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていたことから、約 lO /zmol/l〜約 10匪 oI/l、好ましくは約 0. 1 mmol/1〜約 1 謹 ol/lの範囲であることが好ましい。また、 DMS0の濃度として、 5 %未満、好ましくは 2 %以下、さらには 1 %程度の濃度であることが好ましい。ゆえに、酵素試薬溶解液は、 0. lmol/1 フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィド（PMSF)含有ジメチルスルフォキシド (DMS0)を PBSで 100〜 1 , 000倍希釈して調製したものであることが好ましい。

' 感染症原因菌の D N Aを露出させる工程の後に、細胞膜タンパク質のァセチル化の工程を揷入しても良い。具体的には、ァセチル化試薬（トリエタノールァミン 7. 46 g、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で約 2倍〜約 50倍希釈、好ましくは約 10倍希釈し、無水酢酸の終濃度を 0. 1〜3. 0%、好ましくは 0. 8%に調製したァセチレ一シヨン試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で 5〜30分間振とうすることにより行うことができる。その後、 75%、 85%、 98%エタノールに、順次、 2〜 5分間ずつ浸し、完全に風乾させる。

また、細胞膜タンパク質のァセチル化工程の後に、感染症原因菌の D N A をアル力リ処理することにより一本鎖 D N Aとする工程を挿入することもできる。具体的には、スライドグラスを、約 10腿 ol/l〜約 300mmo l/l、好ましくは、約 70腿 ol/l水酸化ナトリウム含有 PBS (PBS原液に水酸化ナトリウムを加え、滅菌精製水で 20倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を 70匪 ol/lに調製したもの）に約 2〜約 5分間浸すことにより行うことができる。その後、 75%、 85%、 98%エタノールに、順次、 2〜 5分間ずつ浸し、完全に風乾させる。

露出された感染症原因菌の D NAとストリンジェントな条件下でハイプリダイゼ—ションできる検出用 D N Aプローブを用いて in s i tuハイブリダィゼ一シヨンを行うには、例えば、プローブ希釈液にて調製した検出用 D NA プローブを含有する液（プローブ液）を塗抹部位に塗布し、約 25 〜約 50°C、好ましくは、約 37°C〜約 42°Cの湿潤箱内で約 1〜約 3時間、好ましくは、約 2時間静置させる。

その後、ハイブリダィゼ一ション洗浄液（ハイブリダィゼ一ション原液（塩化ナトリウム 13.15g、クェン酸三ナトリウム 2水和物 6.615g、滅菌精製水にて全量 75mlに調製したもの：以下、単に「ハイブリダィゼ一シヨン原液」と称する）を、ハイブリダィゼーシヨン原液：滅菌精製水：ホルムアミド= 5 ： 45： 50の割合で混合して調製したもの）を 3つの染色ビンに用意し、順次、約 35〜約 45°C、好ましくは、約 42°Cで 10分間ずつ浸す。その後、 PBS に浸し、そのまま振とう機上で約 5〜約 30分間振とうさせる。詳細には、プロ一ブ希釈液には、サケ精子 DNA 600^1、 100Xデンハート溶液 50 1、ハイブリダィゼーシヨン原液 500 1、ホルムアミド 2250 1、 50%硫酸デキストラン 1000 1が含まれる。プロ一ブ液は各検出用 DNAプローブ 15ngを含むのが好ましく、プローブ希釈液にて全量 50 1とするのが良い。

SA、 SE、 PA、 EF、 EKのプローブ濃度は、約 0.6ng/ 1〜約 1. Sng/^ 1、好ましくは約 0.6ng/ l〜約 1.2ng/ lとするのが良い。また、 0.06ng/ lにおいては不適であり、 0.6ng/ zlにおいては適であったことから、少なくとも O.lng/ ΐ以上とするのが好ましい。さらに、 2.4ng/ lにおいては不適であり、 1.8ng/ xlにおいては適であったことから、 2.2ng/ zl以下とするのが好ましい。また、陽性コントロールおよび陰性コント口一ルの至適濃度を、それぞれ 0.4〜2.0ng/ Ailおよび 0.6〜2.0ng/ i 1、好ましくは共通して 0.6〜 1.0ng/ 1とするのが良い。

また、ハイブリダィゼーシヨンを行う時間は、少なくとも 30分以上、好ましくは 60分以上、より好ましくは 90分以上とするのが好ましい。さらに好ましい至適ハイブリダィゼーション時間は、約 120分〜約 900分に設定すると良い。

また、 in situハイブリダィゼーシヨンの工程においてドデシル硫酸ナトリウム（SDS)などの界面活性剤を使用するのが、検出感度を高めることができる点から好ましい。 SDSの濃度は、 1 %以下が好ましく、より好ましくは約 0. 1 %〜約 0. 5 %、さらに好ましくは約 0. 25 %とする。 SDSは、ハイブリダィゼーシヨンの際に用いる溶液に添加されていればよく、プローブ希釈液またはプローブ液に事前に混合したものを用いてもよい。

さらに、検出用 D NAプロ一ブを、約 350〜約 600塩基長、好ましくは、約 350〜約 550塩基長の鎖長を有する 1種以上の D N Aプローブとすることで、食細胞内にプローブを円滑に導入し、取り込まれている外来微生物の遺伝子への確実な接触が許容されるので好ましい。対象となるプローブの塩基長 (塩基対の数）が、必ず上記塩基長範囲に収まらなければならないことを意味するものではなく、プローブの塩基長の分布に、上記範囲の塩基長が含まれていればよいこととする。これらプロ一ブは、 1種で用いても数種（1 種以上）で用いても良い。 1種以上のプローブとは、ー菌種に対しハイブリダィズできる複数種のプローブであっても良く、また、ー菌種に対してプローブは 1つであるが、菌種が複数種存在するためにプローブの種類が複数種となっていても良く、プローブの種類が 1種以上であれば特に限定されない。

これらプローブは、食細胞自体といかようにもハイブリダィズしない配列を有する DNA断片を含むものとすることが好ましく、また他の種の菌に由来する遺伝子と交差ハイブリダィズするものであってはならない。例えば、サブトラクシヨン法を用いれば、短時間で特異プローブを作成することができる。これらプローブは、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ビ才チン、ジゴキシゲニン（ジゴキシゲニン（DIG) - 1 1 -dUTP)等の非放射性同位体標識用物質を用い、定法のニックトランスレーションに従って、調製およびラベルするとよい。プローブの鎖長は、ニックトランスレーション反応において添加する DNase Iと D N Aポリメラ一ゼ Iの量比を変化させることにより、最も効率よくラベルできるように制御することができる。例えば、 D NAプローブ (SA-24) 2 を効率よくラベル化し、また、外来微生物 D NAと効率よく in s i tuハイブリダィゼーションできるプローブ鎖長（約 350〜約 600の塩基長）に調節するには、全量 100 /z lの反応液中に、 10U/ 1 の DNAポリメラ一ゼ Iの 2 lに対し、全量 IOO I中に約 10〜約 350mU、好ましくは、約 25〜約 200mU、より好ましくは約 50〜約 150mUとなるように調製された DNase Iの 6 1が存在するようにすればよい。このとき、各酵素の容量および反応液全量などは、上記必須至適反応条件の比率が一定である限り、適宜変更しても良い。また、換言すれば、全量中に DNAポリメラ一ゼ Iを 20Uに対し、 DNase Iを約 10〜約 350mU、好ましくは、約 25〜約 200mU、より好ましくは、約 50〜約 150mUに調製すればよい。さらに換言すれば、 1単位の DNAポリメラ一ゼ Iに対し、約 0.5/1, 000〜約 17.5/1， 000、好ましくは、約 1.25/1, 000〜約 10/1， 000、より好ましくは、約 2.5/1,000〜約 7.5/1, 000単位の DNase Iを用いてニックトランスレーション反応を行うと良い。また、 DNA 1 に対してみれば、 DNAポリメラ一ゼ Iを約 10 U、 DNase Iを約 5〜約 175mU、好ましくは、約 12.5〜約 100mU、より好ましくは、約 25〜約 75mUに調製すれば良い。他のプローブについては、上記至適反応条件を参考にして DN A量、 DN Aポリメラ一ゼ Iおよび DNase Iの至適反応条件を決定することができ、また、効率よくラベル化し、外来微生物 DNAと効率よく in situハイブリダィゼーションできるプローブ鎖長（約 350〜約 600の塩基長）に調節することができる。

In situハイブリダィゼーションを行う際のストリンジェントな条件とは、例えば、ホルムアミドが約 30%〜約 60%、好ましくは、約 50%の存在下、約 30〜約 50で、好ましくは、約 38〜約 42°Cでインキュベートし、その後、洗浄する条件である。

In situハイブリダィゼ一シヨンを行った後、ブロッキングの操作を行つても良い。具体的には、湿潤箱内でスライドグラス 1枚につきブロッキング試薬（ゥサギ正常血清 2ml、 PBS原液 0.5ml、滅菌精製水にて全量 10mlに調製したもの） 1mlを塗抹部位に滴下し、 15〜60分間静置する。その後、ブロッキング試薬を除去する。

菌由来の遺伝子（ゲノム DNAまたは RNA)とハイブリダイズした結果に生じるシグナルの検出のためには、定法の抗原一抗体反応等を利用した呈色反応を行うとよい。すなわち、ハイブリダィゼーシヨンを終えた試料を充分に洗浄した後に、ブロッキング操作を行い、次いで、抗 FITC抗体、抗ジゴキシゲニン抗体などの接合物、例えば、アルカリホスファターゼ接合物を用いて処理し、次いで、接合物の発色系にてシグナルを発色し、八イブリダィゼ一シヨンの状況を確認する。例えば、プローブとして前記のジゴキシゲニン - 1 1 -dUTPでラベルしたものを用いた場合、抗ジゴキシゲニン―アル力リホスファターゼ接合物を用い、一般に使用されるアルカリホスファタ一ゼに対する基質（二卜ロブルーテトラゾリゥムおよび 5_ブロモ -4-クロ口- 3-ィンドリルホスフエト等）を利用して検出すればよい。次いで、呈色反応を行つた後に洗浄した塗沫標本は、ナフ！ルブラック、 Fas t Green (20mg/50mK Wako Chemi cal s社製）等で対比染色を行い、光学顕微鏡によって細胞内シグナルが観察される。

詳細には、ハイブリダィゼーシヨンによるシグナルを得るには、例えば、検出用 D N Aプローブとしてジゴキシゲニン標識 D N Aプロ一ブを用いる場合には、標識抗体（アルカリフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液 1. 05単位、バッファ一 A (トリエタノ一ルァミン 746mg、塩化ナトリウム 17. 5mg、塩化マグネシウム 6水和物 20. 3mg、塩化亜鉛 1. 36mg、ゥシ血清アルブミン 1000mg、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 100mlに調製したもの） 12. 6 z lにて全量を 14 n 1に調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス-（ヒド口キシメチル) -ァミノメタン 8. 48mg、塩化ナトリウム 6. 14mg、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 0. 7mlに調製したもの）で 1.0〜200倍希釈、好ましくは 50倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に 10 1ずつ滴下し、 15〜60分間静置すると良い。その後、標識抗体洗浄液（ポリソルベ一ト 20 l ml、 PBS原液 50ml、滅菌精製水にて全量 100mlに調製したもの）を 2〜50倍、好ましくは、 10倍に希釈した溶液に浸し、そのまま振とう機上で 5〜30分間浸透する。この操作を 2回繰り返した後、発色前処理液 1 (トリス-（ヒドロキシメチル) -ァミノメタン 6. 06 g、塩化ナトリウム 2. 92 g、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）と発色前処理液 2 (塩化マグネシウム 6水和物 5. 08 g、滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの）を等量混合し、滅菌精製水で 5倍程度に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で 5〜30分間振とうすれば良い。その後、スライドグラス 1枚につき発色試薬（二トロブル一テトラゾリゥム（NBT) /5-ブロモ -4-ク口口- 3 -インドリルフォスフェイト（BCIP) ) 1 mlを 0. 2 mシリンジトップフイリレターを装着したデイスポーザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で約 1 (TC〜約 45°C、好ましくは、約 37 °Cで、約 15〜約 60分間遮光静置する。その後、発色試薬洗浄液（トリス -（ヒドロキシメチル) -ァミノメタン 606mg、エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム 2水和物 186mg、塩酸適量、 .滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）を約 2〜約 50倍、好ましくは、約 10倍に希釈した溶液に約 2〜約 10分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーン FCF (食用緑色 3号） 50mg、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）を 2〜50倍、好ましくは 10倍に希釈した溶液および、約 0. 1〜約 5 %、好ましくは約 1 %の酢酸溶液に浸す。その後、前記発色試薬洗浄液を約 2〜約 50倍、好ましくは約 10倍に希釈した, 溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗い流し、完全に風乾すると良い。また、上記発色試薬は、別々に調製したものであっても良い。

アル力リフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液は、ブロッティング用メンブレンにジゴキシゲニンラベルした D NAの l ngをブロットし、ブロッキング後、 10, 000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液で処理し、発色基質 (NBT/BC IP)を反応させると D NA ブロッティング部位が発色し、ジゴキシゲニンラベルしていない D N Aで同様の操作をしても発色は認められないものを使用するのが好ましい。また、抗ジゴキシゲニン抗体は、ヒッジ由来のものが好ましい。詳細には、免疫したヒッジ血清より、イオン交換クロマトグラフィーと抗体カラムクロマトグラフィ一で精製すると良い。

発色試薬（NBT/BCIP溶液、 pH 9. 0〜10. 0) は、ニトロテトラゾリゥムブル — (NBT) 3. 3mg、 5-ブロモ -4-ク口口- 3-ィンドリルフォスフェイト（BCIP) 1. 65 mg、 N，N_ジメチルホルムアミド 99 g、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 121mg、塩酸適量、塩化ナトリウム 58. 4mg、塩化マグネシウム 6水和物

101. 6mg、滅菌精製水適量にて全量 10mlに調製したものであるのが好ましい。この発色試薬としては、アルカリフォスファターゼをラベルしたタンパク質をブロッテイング用メンブレンにプロットし、当該発色試薬でメンブレンを遮光室温で処理すると、ブロット部位に暗紫色のシグナルが現れるものを使用するのが好ましい。

上記した対比染色を行う場合に、シグナルと細胞のコントラストをさらに明確にさせるため、食用色素、例えば、黄色 4号（タートラジン）を使用することができる。その理由は、基質によって紫色が呈色し、ナフトールブラックによって青色に呈色することから、類似色のために対比染色しづらいことが挙げられる。この方法を本発明に応用したところ、対比染色を行う際に有用であることが判明した。食用色素を用いるという手法は、これまでに無かった方法である。

ジゴキシゲニンを標識化する方法として、ニックトランスレ一ション法を用いることができる。その他に、 PCR法、ランダムプライマーラベリング法、 i n v i t roトランスクリプシヨンラベリング法、ターミナルトランスフエラーゼラベリング法などを使用することができる。

判定は、光学顕微鏡で鏡検（X I , 000)するときに、上述した対比染色液により染まった単一ゥエル内の細胞に於いて、青紫色の発色が 1つでも認められた場合に陽性と判定するのがよい。

また、検出用プローブの作成方法として、日本国特許第 2558420号、特許第 2798499号、特許第 2965543号、特許第 2965544号および特許第 3026789号などを参照することができる。

例えば、ワーキングセルバンクから釣菌して培養するには、ワーキングセルバンク（SA- 24)を滅菌シャーレに作製した 50 μ g/mlアンピシリン含有の L - ブロス固形培地に、白金耳または使い捨てプラスチックループ等で画線塗抹する（釣菌)。ー晚培養した後に、シングルコロニ一を採取し、 50 ig/mlアンピシリン含有の L-ブロス培地 5mlに植菌して、 37°Cで終夜振とう培養する（前培養）。前記培地 400ml入り培養用フラスコに、前培養液を 2.5mlずつ植菌して、約 37°Cで終夜振とう培養する（本培養)。

次に、 SA- 24プラスミド DNAを抽出するために、本培養した培養液を、 4° (：、 4, OOOXgで 10分間遠心分離して集菌する。培養上清を取り除き、 STE (10 mmol/1 トリス塩酸（pH 8.0)、 1 mmol/1 エチレンジァミン-四酢酸 2ナトリゥム塩（EDTA)、 0. lmmol/1 塩化ナトリウム）を 20ml加えて菌体を再懸濁し、 4°C、 4, 000 X gで 10分間遠心分離して集菌する。 10mg/mlリゾチームを含む溶液 _ 1 (50匪 ol/l ダルコ一ス、 25腿 ol/l トリス塩酸（pH 8.0)、 10誦 ol /1 EDTA) 5 mlを加え、菌体を懸濁して室温で 5分間放置する。溶液一 2 (0.2腿 ol/l 水酸化ナトリウム、 1 %ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)) 10mlを加え、転倒混和して氷上で 10分間放置する。氷冷した溶液一 3 (3mol/l 酢酸カリウム（pH 4.8)) 7.5mlを加え、転倒混和して氷上で 10分間放置する。高速冷却遠心機により、 4° (：、 45,000X gで 30分間遠心分離した後、上清を回収し、室温になるまで放置する。放置した後、 0.6容量 (約 24ml)のィソプロパノールを加え、転倒混和して室温で 15分以上放置する。高速冷却遠心機により、 25° (：、 28,000X gで 30分間遠心分離した後、上清を捨て、 70 %エタノールでペレットを洗浄して風乾する。風乾後、 TE (10画 ol/l トリス塩酸（pH 8.0)、 lmmol/1 EDTA)を 8 ml加えて溶解する（プラスミド DNAの抽出)。

次に、 SA-24含有プラスミド DNAを精製するために、得られたプラスミド DNAに、 lOfflg/mlェチジゥムブ口マイド 800 1および塩化セシウム 8.6 g を加え、転倒混和して溶解させる。その溶解液を超遠心用チューブに入れ、キャップまたはシールをする。垂直型口一夕一により、 20°C、 500,000X gで 5時間超遠心した後、紫外線ライト照射下で注射筒または注射針を使用してプラスミド DNAのバンドを分取する。分取したプラスミド DNA溶液に、等量の TE飽和卜ブ夕ノールを加えて転倒混和し、微量高速遠心機により、 15，000Xgで 5分間遠心分離し、上清を取り除く。この操作を繰り返し、プラスミド DNA溶液中のェチジゥムブ口マイドを取り除く。次に、 TEを加えて 1.5mlとし、脱塩カラム（NAP- 10)で脱塩する。脱塩したプラスミド DNA溶液に 3mol/l酢酸ナトリゥム溶液を 30 1加えて混和した後、 3 倍量の 99.5%エタノールを加えて転倒混和し、一 20°Cで 30分以上放置する。放置後、微量冷却高速遠心機により、 4°C、 15，000Xgで 20分間遠心分離して上清を除いた後、冷 70%エタノールを加えて懸濁し、再度、微量冷却高速遠心機により、 4°C、 15， OOOXgで 20分間遠心分離して上清を除き、ブラスミド DNAの沈渣を減圧下乾固させる。プラスミド DNAに IOO Iの TE を加えて完全に溶解させ、 260mnの吸光度で濃度を測定する（SA- 24含有ブラスミド DNAの精製）。その後、 SA-24含有プラスミド DNAの制限酵素処理およびァガロース電気泳動による SA-24のサイズチエックを行う。

SA-24含有プラスミド DNAの制限酵素処理およびァガロース電気泳動による SA-24の精製を行うには、分子量チェックの終了した SA- 24含有プラスミド DNA lmgを、制限酵素 Hindi II単独もしくは他の制限酵素と組み合わせて、 37°Cで 1.5時間以上の反応により消化する。プラスミド DNAを消化した後、反応液の一部を 0.8 %ァガロースで電気泳動して、消化が完全に終了したことを確認する。消化を確認した後、分取用の 0.8%ァガロースゲルで電気泳動し、 SA-24のバンドを採取する。採取した SA-24をァガロースゲルから抽出、精製して、吸光度計にて濃度を測定する。精製した SA-24の一部を 0.8 %ァガロースゲルで電気泳動し、シングルバンドであることを確認する。

SA - 24のラベル化を行うには、精製した SA-24の 2 gを用い、以下の表 1 に記載の組成を有する反応液において、ジゴキシゲニンラベルを施すとよい。表 1 ：標識付用反応液の組成

[凡例]

(a) 10XL.B. ： 0.5mol/L トリス塩酸 (pH 7.5),

50mmol/L塩化マグネシウム、

0.5mg/mL ゥシ血清アルブミン

(b) dNTPs： 0.5腿 ol/L 2'-デォキシアデノシン - 5'-三リン酸、

0.5mmol/L 2' -デォキシグアノシン- 5' -三リン酸、

0.5mmol/L 2' -デォキシシチジン- 5' -三リン酸

(c) ジゴキシゲニン dUTP： 0.4IMO1/L ジゴキシゲニン- 11- 2'-デォキシ- ゥリジン- 5'-三リン酸

(d) DNase I ：デォキシリポヌクレア一ゼ Iを、全量 lOO^iLあたり 50〜150mUの使用量となるよう 25mmol/L トリス塩酸（pH 7.5)、 50%グリセリン溶液で希釈して上記配合量とする。表 1において、 Xは、プローブ原液の濃度に応じて上記好ましいプローブ濃度となるように添加することができる容量であり、この容量に伴い精製水量 Yを決定して最終容量を調整する。.

ラベル化後、反応液に TEを 100 1加えて反応を停止させる。反応停止液をスピンカラムに注入し、 4°C、 380X gで 10分間遠心分離して、遊離のヌクレオチドを除く。次に、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、 TEで 10 ng / 1に調製する。

ラベル化を確認するために、ラベルした SA- 24の 0.5 1をメンブレンに滴下し、風乾する。ブロッキング試薬にメンブレンを浸し、室温で 30分間ブロッキングする。 0.1mol/l トリス塩酸 (pH 7.5)、 0.15mo 1/1塩化ナトリウムで 5， 000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液に、メンブレンを室温で 30分間浸す。 0. lmol/1トリス塩酸 (pH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウムにメンブレンを浸し、室温で 10分間振とうして 2 回洗浄する。 0.5mol/lトリス塩酸（pH 9.5)、 0.15mol/l塩化ナトリウム、 50腿 ol/l塩化マグネシウムに、メンブレンを室温で 10分間浸す。発色試薬にメンブレンを室温で遮光下、 10分間浸す。メンブレンを TEに浸し、発色を停止させる。スポット下部分の青紫色の発色で、ラベル化の確認を行う。スピンカラムを作製するには、 1mlのディスポ一ザブルシリンジに、少量の滅菌済みグラスウールを充填する。 lmmol/1 トリス塩酸（pH 7.5)、 1 腿 ol/lの EDTA、 0.1%SDSで膨潤させたセフアデックス G- 50をシリンジにつめる。 15mlのディスポ一ザブルコニカルチューブにシリンジを入れ、 4°C、 320X gで 10分間遠心分離し、余分の緩衝液を落とす。デイスポーザブルコニカルチューブからシリンジを抜き、排出された緩衝液を捨てた後、 1.5 mlのエツペンドルフ型チューブをディスポーザブルコニカルチューブの底に入れ、その上にシリンジを入れて作製する。

プローブの特異性を確認するため、以下の手順に従って、ドットプロットハイブリダイゼーシヨンを行うとよい。

まず、スポットした各ゲノム DNAを変性するために、定法に従い 0.5mol/I 水酸化ナトリウム、 1.5mol/l 塩化ナトリウム溶液で飽和した濾紙（ワットマン社製 3匪）上に、調製した各種細菌ゲノム lOOngをナイロンメンブレン (ポールバイオダインタイプ B、日本ポール社製）にスポットし、風乾したメンブレンを 10分間静置する。次に、 0.5mol/l 卜リス塩酸（pH 7.5)、 1.5mol/l 塩化ナトリゥム溶液で飽和した前出の濾紙上に 10分間静置して変性 DN Aを中和する。さらに、 2XSSC (Standard Saline Citrate) 溶液で飽和した前記濾紙上に 5分間静置し、リンスする。その後、メンブレンを風乾し、 2 XSSC溶液にメンブレンを浸し、 5分間浸透する。定法に従い、プラスチックバッグ内でプレハイプリタイゼーション溶液にメンブレンを浸し、 42 、 60分間親和させる。プラスチックバッグ内で、プローブ 40 Ongを含むハイプリタイゼ一ション溶液 15m 1内にメンブレンを浸し、 42 °C で、ー晚反応させる。次に、 2 XSSC、 0.1%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）溶液にメンブレンを浸し、 5分間洗浄する（2回繰り返す)。その後、 0.1XSS 0.1%SDS溶液にメンブレンを浸し、 60°C、 10分間洗浄する（3回繰り返す）。 2 XSSC溶液にメンブレンを浸し、 5分間洗浄する。メンブレンを 3%ゥシ血清アルブミン、 1 %ブロッキングバッファー (ベーリンガ一社製）、 O.lmol/1 トリス塩酸 (pH 7.5), 0.15mol/l塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、 30分間おだやかに振とうする。その後、アルカリフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ベ一リンガー社製）を、 0.1mol/l トリス塩酸（pH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液で 5， 000倍希釈した溶液にメンブレンを浸し、 30分間おだやかに振とうする。次に、 O.lraol/1トリス塩酸 (PH 7.5)、 0.15mol/l 塩化ナトリウム溶液にメンブレンを浸し、 15 分間振とうする（2回）。 0.1mol/l トリス塩酸 (pH 9· 5)、 0. lmol/I 塩ィ匕ナトリウム、 5匪 ol/l 塩化マグネシウム溶液にメンブレンを浸し、 5分間振とうする。 NBT- BCIP溶液（GIBCO BRL社製）にメンブレンを浸し、遮光下で発色反応させる。 TE (10mmol/l トリス塩酸（pH 8.0)、 1醒 ol/I EDTA) にメンブレンを浸し、発色反応を止め、風乾する。プレハイブリダィゼーション溶液およびハイブリダイゼ一ション溶液を、以下の表 2に示す。

表 2

[単位： ml]

In s i tuハイブリダィゼ一ションの工程において使用される界面活性剤としては、公知の界面活性剤が使用できる。界面活性剤は、ァニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤に大別される。

ァニオン界面活性剤は、陰イオン界面活性剤とも呼ばれ、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。界面活性剤の分子中の親油基を Rとして表現すると、 RC00Na、 RS0₃Na、 RS0₄Naなどがある。 RCOONaのように弱酸性基を含有する界面活性剤の水溶液は加水分解しゃすく弱アル力リ性であるが、 RS0₃Na、 RS0₄Naなどの強酸性基を有する界面活性剤の水溶液は加水分解を受けにくく、中性となる。陰イオン性であるから、多量の陽イオン性物質の存在で界面活性を失うことがあり、また強酸性にした時にも失活する。非ィォン性界面活性剤は、親水基が非ィォン性のものをいう。親水基として酸化エチレン基 (-C ¾0-)が多用され、この基の数が多くなる程親水性 ' が増す。反対に、親油基の炭素数が増加すると、親油性が増加する。従つて、親水性 ·親油性を様々に変化させた界面活性剤が得られるのが特徴である。非イオン性界面活性剤は、水中で電離せず、無機塩の影響も受けにくいため、生体に及ぼす作用も少ない。しかも、洗浄作用は、強力で、泡立ちは比較的少ない為、洗剤のみならず、医薬品、化粧品、食品などに広く使用される。水溶性の非イオン性界面活性剤は温度が上昇すると、ある温度で水に溶解しにくくなり、水溶液が濁り出すが、これは親水基と水との水素結合が切断されるために生じる。

カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤ともいう。水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。カチオン界面活性剤は、一般に洗浄作用は大きくはないが、細菌などのァニオン性のものと強く結合するため、殺菌作用が大きい。また、繊維やプラスチックの帯電防止能もある。カチオン界面活性剤の代表的なもので、ドデシルトリメチルク口リド

[C₁₂Ik (CH₃) ₃N] C1は水溶性であるが、ジドデシルジメチルアンモニゥムクロリド [ (C_{12 5}) ₂ (CH₃) ₂N] C1は水に溶解しにくく、水中では 2分子膜状のべシクルを形成し、ベンゼンには溶解する。

両性界面活性剤は、分子内にァニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアル力リ性側ではァニオン界面活性剤として、酸性側ではカチオン界面活性剤として作用する。等電点で水溶性は最低となり、表面張力も最も低下する。両性界面活性剤は、殺菌剤、帯電防止剤などに用いられる。

また、ァニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型およびリン酸エステル型に分けられ、非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエ一テル型およびアルカノ一ルアミド型に分けられる。カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型および第四級アンモ二ゥム塩型に分けられ、両性界面活性剤は、カルポキシベタイン型、 2 -ァルキルイミダゾリンの誘導型およびダリシン型に分けられる。

さらに、ァニオン界面活性剤のカルボン酸型は、脂肪酸モノカルボン酸塩、 N -ァシルサルコシン塩および N-ァシルグルタミン酸塩に細分される。それぞれの代表例として、脂肪酸モノカルボン酸塩には、ラウリン酸ナトリウムおよび薬用せっけんがあり、 N-ァシルサルコシン塩は、 N-ラウロイルサルコシンナトリゥム、 N-ァシルグルタミン酸塩に N-ラウロイルグルタミン酸ニナトリウムがある。また、スルホン酸型は、ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフインスルホン酸塩、直鎖アルキルべンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフ夕レンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩-ホルムアルデヒド縮合物および N-メチル - N-ァシルタウリン塩に細分される。代表例として、ジアルキルスルホコハク酸塩は、ジォクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルカンスルホン酸塩は、ドデカンスルホン酸ナトリウム、直鎖アルキルべンゼンスルホン酸塩には直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル (分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリゥム、アルキルナフタレンスルホン酸塩はプチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、 N-メチル-- N-ァシルタウリン塩には N-メチル- N-ステアロイルタウリンナトリウムがある。また、硫酸エステル型は、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩および油脂硫酸エステル塩に細分される。代表例として、アルキル硫酸塩は、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリゥムおよびセチル硫酸ナトリゥム、ポリォキシエチレンアルキルェ一テル硫酸塩はポリォキシェチレンラウリルェ一テル硫酸トリエタノ一ルァミンがある。また、リン酸エステル型は、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩およびポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルリン酸塩に細分される。代表例を挙げると、アルキルリン酸塩には、モノラウリルリン酸ニナトリウムがある。ポリオキシェチレンアルキルエーテルリン酸塩には、リン酸ナトリゥムポリオキシエチレンラゥリルエーテルおよびリン酸ポリオキシエチレンォレイルエーテル（8M0L)がある。

非イオン性界面活性剤のエステル型は、脂肪酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンおよび脂肪酸ショ糖エステルに細分される。それぞれの代表例として、脂肪酸グリセリンは、モノステアリン酸グリセリン、脂肪酸ソルビタンは、モノステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキォレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルべ一ト 20 (ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル）、ポリソルべ一ト 60およびポリソルべート 80、脂肪酸ショ糖エステルはステアリン酸ショ糖エステルがある。また、エーテル型は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシェチレンアルキルフエニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールに細分される。代表例を挙げると、ポリオキシエチレンァルキルエーテルとして、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンセチルェ一テルがあり、また、ポリオキシエチレンアルキルフエ二ルェ一テルとして、ポリオキシエチレンノニルフ Xニルエーテルおよびポリ才キシェチレンォクチルフェ二ルェ一テルがある。また、エステルエーテル型は、脂肪酸ポリエチレングリコールおよび脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンに細分される。それそれの代表例は、脂肪酸ポリエチレングリコールは、ォレイン酸ポリェチレングリコール、脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタンには、パルミチン酸ウレ一トがある。また、アルカノ一ルアミド型は、脂肪酸アルカノールァミドの 1つのみである。代表例は、ラウリン酸ジエタノールアミドである。力チォン界面活性剤のアルキルァミン塩型には、モノアルキルアミン塩、ジアルキルァミン塩およびトリアルキルァミン塩があり、代表例は、モノステアリルアミン塩酸塩である。また、第四級アンモニゥム塩型は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニゥム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルアンモニゥムおよび塩化アルキルベンザルコニゥムに細分される。それぞれの代表例は、塩化（または臭化、沃化）アルキルトリメチルアンモニゥムとして、塩化ステアリルトリメチルアンモニゥム、塩化（または臭化、沃化）ジアルキルジメチルァンモニゥムとして、塩化ジステアリルジメチルアンモニゥム、塩ィ匕アルキルべンザルコニゥムは塩化ラウリルべンザルコニゥムがある。両性界面活性剤の力ルポキシべタイン型は、アルキルべタインの 1つのみである。代表例は、ラウリルべタインである。また、 2-アルキルイミダゾリンの誘導型は、 2-アルキル- N -カルボキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ二ゥムべ夕インの 1つのみである。代表例として、 2-ゥンデシル -N-力ルポキシメチル- N-ヒドロキシェチルイミダゾリ二ゥムべタインが挙げられる。また、グリシン型は、アルキル (又はジアルキル）ジェチレントリァミノ酢酸があり、代表例として、ジォクチルジェチレントリアミノ酢酸が挙げられる。

さらに、上記代表例に加えて、 Tr i t on X- 100、ラウリルサルコシン、サボニン、 BRI J35, アルキルァリルポリエーテルアルコール、高級アルコール硫酸化物、 N-ココイル -L-アルギニンェチルエステル DL -ピロリドンカルボン酸塩、 N-ココイル- N-メチルアミノエチルスルホン酸ナトリウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、スクヮラン、ステアリルァルコール、ステアリン酸ポリオキシル 40、セタノール、セトマクロゴール 1000、セバシン酸ジェチル、ノニルフエノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルアンモニゥム、ポリオキシエチレンォレイルァミン、ポリオキシエチレンソルビットミツロウ、ポリオキシル 35ヒマシ油、マクロゴール 400、 N -ヤシ油脂肪酸ァシル L-アルギニンェチル · DL-ピロリドンカルボン酸塩、ラウリルジメチルアミンォキシド液、ラウロマクロゴ一ル、メチルセルロース、 CMC (カルポキシメチルセルロース）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 20およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 CHAPS, デォキシコ一ル酸、ジギトニン、 n-ドデシルマルトシド、ノニデット P40、 n-ォクチルダルコシド、ォクチルチオダルコシド、ラウリル酸シュクロース、ドデシルポリ（ェチレングリコールエーテル) n， n-ドデシル N, N-ジメチル- 3 -ァンモニォ -1 - プロパンスルフォネート等も挙げることができる。

上掲の各種界面活性剤は、 i n s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程で使用されることが重要であり、その使用方法は特に限定されない。例えば、プ口一ブ液またはプロ一ブ希釈液中に混合されていても良いし、プロ一ブ液とは別に調製した界面活性剤を含有する溶液を、プローブ液を塗抹部位に塗布する前、同時または後に添加しても良いし、当業者は適宜変更することがでさる。

なお、本発明において、陽性コントロールプローブが必要であれば、次のように作製することができる。例えば、まず、 U937細胞（ATCC CRL-1593. 2) のゲノム DNAの抽出と精製を行うには、 37° (：、 5 %炭酸ガスインキュべ一夕一内で、細胞培養フラスコ（175cm²) 内の RPMI 1640培地（25ml) を用い、 U937細胞を培養する。 U937培養液を 50mlの遠沈管に入れ、 4 °C、 220 X gで 10分間遠心分離し、 U937細胞を回収する。細胞を 10mlの PBSで懸濁洗浄し、再度 4 °C、 180 X gで 10分間遠心分離し、細胞を回収する。その後、上清を捨て、細胞を 1 mlの 200 i g/mlプロテネース K含有 1 %SDS含有 TE溶液で懸濁し、 37°Cで 30分間放置する。フエノール抽出を 3〜4回線り返し、除蛋白を行う。エタノール沈殿により析出したゲノムを回収し、の 2. 5 gリポヌクレア一ゼ含有滅菌精製水に溶解し、 42°Cで 30分間放置する。フエノール抽出を 2〜3回繰り返し、除蛋白を行う。エタノール沈殿により析出したゲノムを回収し、 500 ^ 1の TEに溶解する。その後、吸光度計により濃度を測定し、ジゴキシゲニンラベルに供することにより、陽性コント口一ルプローブを作製することができる。また、陽性コントロールプロ一ブは、 U 937ゲノムを 1 OOngスポットしたメンブレンに、陽性コントロールプローブをドットハイブリダイゼ一ションするとき、ハイプリッド形成が確認できるものを用いるのがよい。陰性コントロールプローブが必要であれば、公知の方法で作製することができる。

また、本発明には、食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因菌の D NAを露出させる処理を施し、この D N Aにス卜リンジェン卜な条件下ハイブリダイゼ一シヨンできる検出用 D N Aプロ一ブを用いて in s i tuハイブリダィゼ一シヨンを行い、得られたシグナルにより感染症原因菌を検出および/または同定するためのキットであって、 D N A露出工程で使用される酵素が、リゾス夕フィン、リゾチーム、 N-ァセチルムラミダ一ゼ、ザィモラ一ゼからなる群より選択される少なくとも 1種以上の酵素、界面活性剤が添加されたプローブ液、 1種以上の検出用 D N Aプローブを有することを特徴とする、感染症原因菌を検出および/または同定するためのキットも含まれる。キットには、後出の実施例に示す、血液分離試薬、酵素前処理試薬、酵素試薬、ァセチル化試薬、プローブ液、ブロッキング試薬、標識抗体、標識抗体希釈液、発色前処理液一 1、発色前処理液一 2、発色試薬、対比染色液、 PBS原液、ハイブリダィゼーシヨン原液、標識抗体洗浄液、発色試薬洗浄液、 APSコートスライドダラス、プローブ希釈液、バッファー A等が含まれる。これらのうち、少なくとも酵素試薬とプローブ液を具備することが好ましい。また、本発明に使用する各種試薬、例えば、クロ口ホルム、エタノール、無水酢酸、 DMS0、 PM SF、ホルムアミド、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム等を含んでいても良い。さらに、低速遠心機、恒温機、血球計算盤、振とう機、湿潤箱、恒温槽、光学顕微鏡、可変式ピペット、採血管、チップ、ピペット、染色ビン、メスシリンダー、注射筒、 0. 2 mシリンジトップフィルターの機械や器具を含んでいても良い。

また、本発明は、生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニターする方法を提供する。さらに、本発明は、原因菌の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因菌または菌血症原因菌が特定されることを特徴とする方法を提供する。

この方法を、様々なセプシスが疑われた患者血液の診断に実際に応用したところ、投与された抗菌薬の影響を受けることなく、血液培養法に比べて約 4倍の感度で起因菌を検出することができ、検出菌株の一致率は良好であることが明らかになつている。そして、血液培養では檢査に 3日以上 14日程度を要するのに比較して、本発明の方法では全操作完了までに約 8時間と極めて短時間の簡便な操作によって正確な結果を得ることができるので、特に敗血症または菌血症など、速やかな善処が必要とされる感染症の診断や予後診断の 'モニター等において有用マーカ一となり得る。

実施例

以下に、本発明を実施例に沿って具体的に説明するが、これら実施例の開示によって本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

実施例 1 ：採血 ·血液検体の処理

臨床検体として、敗血症が疑われた患者より採取した血液 12検体（検体 A 〜L ) を用いた。各患者からへパリン加静脈血 10mlを採取し、これら血液と血液分離試薬（塩化ナトリウム 225mg、デキストラン（分子量： 200, 000〜 300, 000) 1. 5 g、滅菌精製水にて全量 25mlに調製したもの）を 4 ： 1の割合で混和した後、 37°Cで、 30分間静置することにより、白血球画分（上層）を取得した。この白血球画分を、 4 °Cにて 160 X gで 10分間遠心分離することで、白血球を得た。次に、得られた白血球のペレットに滅菌精製水 l ml を加えて懸濁し、直ちに過剰量の PBS (塩化ナトリウム 18. 24 g、リン酸一水素ナトリウム 12水和物 6. 012 g、リン酸二水素ナトリウム 2水和物 1. 123 g、滅菌精製水にて全量 120mlにしたもの（PBS原液）を、滅菌精製水にて 20倍に希釈したもの）を加えて等張化した後、再度 4 °Cで、 160 X gで 10分間遠心分離した。

実施例 2 ：白血球の固定

3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APS、 SIGMA社）がスライドグラス (日本エアーブラウン社製、商品番号 MS31 1BL) にコートされた APSコートスライドグラスを使用した。 APSコ一トスライドグラスの作製は、まず、スライドホルダーにスライドグラス（商品番号 MS311BL) を固定した後、希釈した中性洗剤で 30分以上浸すことにより洗浄し、水道水で洗剤を十分に取り除き、次に、スライドグラスを精製水にて洗浄し、高温（100°C以上）で十分に乾燥させた後、室温で放置冷却した。その後、このスライドグラスを 2 %APS含有ァセトンに 1分間浸し、直ちにァセトン及び滅菌精製水で順次軽く洗浄した後、風乾した。さらに、再度、スライドグラスを 2 %APS含有アセトンに 1分間浸し、直ちにアセトン及び滅菌精製水で、順次軽く洗浄した後、風乾する操作を行った後、 42°Cで乾燥させることにより作製した。白血球画分を、 4°Cにて、 160X gで 10分間遠心分離して得た白血球ペレットに、少量の PBSを加えて懸濁し、血球計算盤を用いて白血球数を計測する。細胞数が 1 X10⁵個/ゥエルとなるように PBSで調製した白血球懸濁液 5 1を、 APSコ一トスライドグラスの各ゥエルに白血球が単層に広がるように塗抹し、完全に風乾することにより、白血球を APSコ一トスライドグラスに支持させた。その後、カルノア固定液（エタノール：クロ口ホルム：酢酸 =6 ： 3 ： 1の容量比で混合した液）に 20分間浸した後、 75%エタノール液に 5分間浸し、完全に風乾させた。

実施例 3 ：白血球細胞膜の透過性宂進処理

PBSに 10分間浸し、その後、酵素前処理試薬（サポニン 1.25g、 t-ォクチルフエノキシポリエトキシエタノール（比重 1.068〜1.075(20/4°C)、 pH(5 /v%)5.5〜7.5) 1.25mK PBS原液 25mlを混合し、滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの）を滅菌精製水で 10倍に希釈した溶液に浸し、振とう機で 10分間浸透させた。

実施例 4 ：菌体壁の溶菌酵素処理

感染症原因菌の DNAを露出させるため、スライドグラス 1枚につき酵素試薬（N-ァセチルムラミダーゼ 1,000単位 /ml、リゾチーム 100, 000単位/ mlおよび/またはリゾスタフイン 100単位/ inl) に酵素試薬溶解液（PBSで 0. lmol/ 1フエ二ルメチルスルフォニルフルオラィド (PMSF) 含有ジメチルスルフォキシド（DMS0) を 100倍希釈して製したもの）を lml加えて酵素試液を調製した後、 37°C〜42°Cの湿潤箱内で、酵素試液 lmlを白血球塗抹部位に滴下し、 30分間静置した。その後、 0.2mol/l 塩酸含有 PBS (PBS原液に塩酸を加え、滅菌精製水にて 20倍希釈し、塩酸の終濃度を 0.2mol/lに調製したもの）に浸し、そのまま振とう機上で 10分間浸透させた。

実施例 5 ：細胞膜タンパク質のァセチル化

ァセチル化試薬（トリエタノールァミン 7.46 g、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlとしたもの）に無水酢酸を加え、滅菌精製水で 10倍希釈し、無水酢酸の終濃度を 0.8%に調製したァセチレ一ション試薬にスライドグラスを浸し、振とう機上で 10分間振とうすることにより行った。その後、 75 %、 85%、 98%エタノールに、順次、 3分間ずつ浸し、完全に風乾させた。

実施例 6 ：菌体 DNAのアルカリ処理（二本鎖 DN Aを一本鎖に変性）スライドグラスを、 70mmol/l 水酸化ナトリウム含有 PBS (PBS原液に水酸ィ匕ナトリウムを加え、滅菌精製水で 20倍希釈し、水酸化ナトリウムの終濃度を 70醒 ol/lに調製したもの）に 3分間浸すことにより行った。その後、 75 %、 85%、 98%エタノールに、順次、 3分間ずつ浸し、完全に風乾させた。

実施例 7 ：ハイプリダイゼ一シヨン

プローブ希釈液（0.25%SDS、サケ精子 DNA 600 K 100Χデンハート溶液 50 1、ハイブリダィゼ一シヨン原液 500 xl、ホルムアミド 2250 1、 50%硫酸デキストラン 1000 1が含まれる）で調製したジゴキシゲニン標識 DNA プローブ 15ngを含有する液（プロ一ブ液； l.Ong/^ l) を塗抹部位に塗布し、 37°C〜42°Cの湿潤箱中で 2時間静置させた。 SDS無添加のプローブ液を対照とした。ジゴキシゲニン標識 DNAプロ一ブは、ニックトランスレーシヨン法にて作製した。その後、ハイブリダィゼ一シヨン洗浄液（ハイプリダイゼ一シヨン原液（塩化ナトリウム 13.15g、クェン酸三ナトリウム 2水和物 6.615g、滅菌精製水にて全量 75mlに調製したもの）を、八ィプリダイゼ一シヨン原液：滅菌精製水：ホルムアミド = 5 ： 45： 50の割合で混合して調製したもの）を 3つの染色ビンに用意し、順次、 42°Cで 10分間ずつ浸した。その後、 PBSに浸して、そのまま振とう機上で 10分間振とうさせた。ジゴキシゲニン標識 DN Aプローブとして、 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidisに対するプロ一ブとして、 SA-24 (配列番号： 1)、 SA-36 (配列番号： 2)および SA - 77 (配列番号： 3) ならびに SE-22 (配列番号： 4)、 SE-3 (配列番号： 5) および SE-32 (配列番号： 6) (日本国特許第 2798499号参照）の各プローブを利用した。また、 Pseudomonas aerug inosaに対するプローブとして、 Π-2 (配列番号： 7 ) (日本国特許第 2965544 号参照）のプローブを利用した。また、 Enterococcus faecal isに対するプローブとして、 EF-1 (配列番号： 8)、 EF-27 (配列番号： 9) および EF - 7

(配列番号： 10) (日本国特許第 2965543号参照）を利用した。そして、 Escherichia coli、 Enterobacter cloacaeおよび Klebsiella pneumoniae^ 対するプローブとして、 EC- 24 (配列番号： 11)、 EC- 34 (配列番号： 12) および EC- 39 (配列番号： 13) ならびに ET-49 (配列番号： 14) および Kト 50 (配列番号： 15) (日本国特許第 3026789号参照）を利用した。さらに、 Candida albicansに対するプローブとして、 CA-26 (配列番号： 16)、 CA-26-1 (配列番号： 17)、 CA-26-2 (配列番号： 18) および CA- 26-3 (配列番号： 19) (日本国特許第 2558420号参照）を利用した。これらプローブの配列を用いて、ニックトランスレ一ション法によりプローブの作製を行った。

実施例 8

In situハイブリダィゼーシヨンを行った後、ブロッキングの操作を行つた。湿潤箱内でスライドグラス 1枚につきブロッキング試薬（ゥサギ正常血清 2ml、 PBS原液 0.5ml、滅菌精製水にて全量 10mlに調製したもの） 1mlを塗抹部位に滴下し、 30分間静置した。その後、ブロッキング試薬を除去した。

実施例 9 ：標識抗体との反応

標識抗体（アル力リフォスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体溶液 1.05 単位、バッファー A (トリエタノールァミン 746mg、塩化ナトリウム 17.5mg、塩化マグネシウム 6水和物 20.3mg、塩化亜鉛 1.36mg、ゥシ血清アルブミン lOOOmg, 塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 100mlに調製したもの） 12.6 1 にて全量を 14 1に調製したもの）を標識抗体希釈液（トリス-（ヒドロキシメチル)-ァミノメタン 8.48mg、塩化ナトリウム 6.14mg、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 0.7mlに調製したもの）で 50倍希釈した標識抗体液を調製し、この標識抗体液を塗抹部位に 10 1ずつ滴下し、 30分間静置させた。その後、標識抗体洗浄液（ポリソルベート 20 ImK PBS原液 50ml、滅菌精製水にて全量 100mlに調製したもの）を 10倍に希釈した溶液に浸して、そのまま振とう機上で 10分間浸透させた。この操作を 2回繰り返した後、発色前処理液 1 (トリス -（ヒドロキシメチル) -ァミノメタン 6. 06 g、塩ィ匕ナトリウム 2. 92 g、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）と発色前処理液 2 (塩化マグネシウム 6水和物 5. 08 g、滅菌精製水にて全量 50mlに調製したもの）とを等量混合し、滅菌精製水で 5倍に希釈した発色前処理液に浸し、そのまま振とう機上で 10分間振とうさせた。

実施例 10 :検出

スライドグラス 1枚につき発色試薬（ニトロブル一テトラゾリゥム（NBT) / 5_ブロモ -4-クロ口- 3-インドリルフォスフェイト（BCIP)溶液、 pH 9. 0〜10. 0 ： NBT 3. 3mg、 BCIP 1. 65mg、 N，N-ジメチルホルムアミド 99 g、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 121mg、塩酸適量、塩ィ匕ナトリウム 58. 4mg、塩化マグネシウム 6水和物 101. 6mg、滅菌精製水適量にて全量 10mlに調製したもの） 1 m 1を 0 · 2 mシリンジトップフィルタ一を装着したディスポ一ザブルシリンジを用いてろ過しながら、スライドグラスの塗抹部位に滴下し、湿潤箱内で、 37° (：、 30分間遮光静置した。その後、発色試薬洗浄液（トリス-（ヒドロキシメチル） -ァミノメタン 606mg、エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム 2水和物 186mg、塩酸適量、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）を 10倍に希釈した溶液に 5分間浸し、風乾した後、対比染色液（ファストグリーン FCF (食用緑色 3号） 50mg、滅菌精製水適量にて全量 50mlに調製したもの）を 10倍に希釈した溶液および 1 %酢酸溶液に浸した。その後、前記発色試薬洗浄液を 10倍に希釈した溶液に再度浸して余分の前記対比染色液を洗い流し、完全に風乾させた。

実施例 11：判定

判定は、光学顕微鏡で鏡検（X I , 000) するとき、単一ゥエル内で対比染色液によって染まった細胞に於いて、青紫色の発色シグナルが 1つでも認められた場合に陽性と判定した。その結果、本発明の方法により、 12検体中 5検体で菌を検出した。 5検体の内訳は、検体 A-SA (St aphyl ococcus aureus) , 検体 Fおよび G- SE (S t aphyl ococcus epi dermi di s)、検体 J-SEおよび EF (Enterococcus faecal is)、検体 L-SAおよび CA (Candida albicans) であった。なお、同じ検体を用いて、公知の方法に従い血液培養を行ったところ、検体 Aは SAを検出し同一の結果を示したが、検体 F、 G、 Jおよび L は菌を検出することができなかった。従って、本発明の方法が、血液培養と比較して、迅速に感度よく検出できることが判明した。

検体 A-SAにおける結果に関し、プロ一ブ希釈液への SDSの添加の効果を、第 1図に示した。第 1図から、 SDSを 0.25%添加することで、シグナルの検出感度が格段に高められることが明らかである。その他の検体についても同様に、 SDSを添加することで良好なシグナル検出が可能となった。なお、本実施例において使用したプローブは、 SA-24 (配列番号： 1)、 SA-36 (配列番号： 2) および SA- 77 (配列番号： 3) の塩基配列を組み合わせて用い、ニックトランスレーションによって作製したプローブである。

実施例 12：塗抹固定する至適白血球数の検討

APSコ一トスライドグラスのゥエル（直径 5匪の円形ゥエル）に塗抹する至適白血球数を検討した。へパリン加健常ヒト血液 10mlを採取し、実施例 1に記載の手順に従って白血球を採取した。次に、得られた白血球を適量の PBSで懸濁した後、血球計算盤を用いて lml当たりの白血球数を測定し、 (a) 1 X10⁸個 /mlを始点として、（b) 5 X10⁷個/ ml、（c) 1 X 10⁷個/ ml、 (d) 5 X 10⁶個 /ml、 (e) 1 X10⁶個/ ml、 (f) 5 X 10⁵個/ mlおよび (g) 1 X10⁵個/ mlの希釈系列を作成した後、各々 5 lをスライドグラスに塗抹した。風乾後、カルノア固定（実施例 2参照）を行い、直ちに前記対比染色液で染色し、実施例 11に記載した方法を用いて判定した。その結果、細胞数が 1 X10⁸個/ mlでは細胞数が過剰であり、検出不適であった。また、 5 X10⁶個/ ml以下では、ゥエルに観察される細胞数が少なく、検出不適であった。よって、固定化する食細胞の密度（X個/ ml) としては、約 5 X10⁶個/ ml<x個/ ml< 約 1 X10⁸個 /ml、とりわけ、約 1 X10⁷個 /ml≤x個/ 1111≤約5 X10⁷個 /mlが好ましい。また、それに対応して、 APSコートスライドグラスに固定される 1ゥエル当たりの白血球の細胞数（y個/ゥエル (直径 5mm)) は、約 2.5X 10⁴個/ゥエルく y個/ゥエル (直径 5 mm)く約 5 X 10⁵個/ゥエル、好ましくは、約 5 X10⁴個/ゥエル≤y個/ゥエル（直径 5mm)≤約 2.5X10⁵個/ゥエルとなるように調製するのが良いことが判明した。試料 (a)〜（f)に関する実験結果を、第 2図（a)〜（f) にそれぞれ示した。

実施例 13：使用溶菌酵素の選択

Staphylococcus aureus (ATCC 12600)、 Staphylococcus epidermidis (AT CC 14990)、 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)、 Enterococcus faecali s (ATCC 19433)、 Escherichia coli (ATCC 11775) を溶菌する酵素条件を検討した。 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epidermidisでは、溶菌酵素としてリゾスタフイン（Bur. J. Biochem. , 38, 293-300, 1973) を使用した。 Enterococcus faecalisには、 N-ァセチルムラミダ一ゼ

(Archs. Oral Biol., 23, 543-549, 1978)、リゾチーム（生化学工業）を使用した。また、 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coliについては、 70腿 ol/lの水酸化ナトリウム含有 PBSを使用した。これら各種細菌を 5mlの皿 I (ブレインハートインフユ一ジョン）液体培地（DIFC0社製）に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。培養した菌液を、 4°C、 2,000X g で 10分間遠心分離して集菌した。集めた菌を PBSで懸濁して試料とした。溶菌はマイクロプレ一トリ一ダーを用い、吸光度 600應における菌液の濁度の減少により評価した。その結果、 Staphylococcus aureusおよび Staph ylococcus epidermidisは、リゾスタフインにより溶菌した。 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coliについては、 70imnol/lの水酸ィ匕ナ卜リウム含有 PBSで溶菌したため、酵素処理は必要としなかった。また、 Enteroc' occus faecal isについては、 N-ァセチルムラミダ一ゼ単独よりもリゾチームと併用した方が優れた溶菌活性が得られることが判明した。また、貪食作用を受けて取り込まれた菌が、例えば、 Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia col iなどである場合には、アルカリ処理に際して菌の細胞壁が溶解され、遺伝子が露出した状態となるので、必ずしもこの酵素処理を行う必要はない。本発明において外来微生物を溶解するために使用される前処理用の各酵素は、前述した細菌株に対して有効であるのみならず、他のスタフイロコッカス属、ストレプトコッカス属、バシルス属およびミクロコッカス属を初めとする他の菌種等でも有効である。また、かような酵素は、各々単独で用いることもできるが、混合した場合の方が有効である。それら結果を、第 3図、具体的には、 (a) Staphylococcus aureusおよび Staphyloc occus epidermidis、 (b) Pseudomonas aeruginosaおよび Escherichia coli、ならびに（c) Enterococcus faecalisについて示した。

実施例 14：酵素溶解液に関する検討（DMS0の至適濃度の検討）

酵素試薬に含有されるプロテアーゼは、白血球の形態を劣化させることから、白血球の形態を保持させるために添加する PMSFの溶解剤である DMS0の酵素活性に及ぼす影響を検討した。 Enterococcus faecal isを、 50mlの前記 BHI液体培地に植菌し、 37°Cで、 8時間以上培養した。この培養液を、 4 °C、 2， OOOXgで 10分間遠心分離して集菌し、 PBSで懸濁した後、ォ一トクレーブ（120°C、 10分）により熱処理を行った。次に、 4°C、 2,000X gで 10 分間遠心分離し、上清を捨て、 1mlの PBSで沈渣を懸濁させた後、凍結乾燥させた。この凍結乾燥試料を O〜10%DMS0含有 5mmol/lトリス-塩酸（pH 6.0), 2腿 ol/I塩化マグネシウムで懸濁し、 N-ァセチルムラミダーゼに対する試料とした。また、 Micrococcus luteus (JCM1464) を、 5mlの BHI液体培地（前出）に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。培養した菌液を、 4 ^DC、 2， 000X gで 10分間遠心分離して集菌した。上清を捨て、菌のペレツトを PBS 5mlで懸濁洗浄し、再度 4°C、 2, 000X gで 10分間遠心分離して集菌した。このようにして集めた菌を、 O〜10%DMS0含有 PBSで懸濁し、リゾチームに対する試料とした。一方、 Staphylococcus epidermidisをリゾチームの場合と同様に培養、集菌し、 0〜10%DMSO含有 PBSで懸濁し、リゾス夕フィンに対する試料とした。酵素活性は、マイクロプレートリーダ一を用い、吸光度 600nmにおける試料の濁度の減少により評価した。ただし、本試験中それぞれの酵素力価は、（a) N-ァセチルムラミダーゼ 300単位 /ml、 (b) リゾチーム 10,000単位/1111、（c) リゾス夕フィン 50単位 /mlとし、酵素活性に対する DMSOの影響を検討した。それぞれの酵素活性を単位時間当たりにおける菌濁度（O. D. = 600nm) の減少で評価した結果、 DMSOは、 N-ァセチルムラミダーゼ活性に対しては殆ど影響を与えなかったが、リゾチームおよびリゾス夕フィンに対しては、共に 5 %以上の DMSOで活性の低下が認められた。また、 2 %以下の DMSOの濃度では、酵素活性の低下は認められなかつた。ゆえに、 PMSFを溶解させる DMSO濃度は少なくとも 5 %未満、好ましくは 2 %以下、さらには 1 %程度とするのが好ましい。その結果を、第 4 図（a)〜（c)および下記表 3に示した。表 3 ：酵素活性（菌濁度の減少）に対する DMSOの影

実施例 15：酵素溶解液に関する検討（PMSFの至適濃度の検討）

酵素試薬に含有されるプロテアーゼは白血球の形態を劣化させることから、白血球の形態を保持させるために添加する PMSF (PIERCE社製）の効果を検討した。 100 1の DMS0 (和光純薬社製）に PMSFを溶解し、 PMSFの終濃度が無添加（0讓 o l/l) 〜 1腿 ol/lとなるように PBSで 10mlに希釈した。この溶液に、プロテア一ゼのカ価が 0. 2単位/ mlとなるよう、プロティネース K (ベ —リンガーマンハイム社製）を添加した。へパリン加健常ヒト血液 5 mlを採取し、実施例 1に記載の方法に従って白血球を採取した。次に、白血球を適当量の PBSで懸濁して、血球計算盤で細胞数を計測し、細胞数を、約 5 X 10⁴個/ゥエル〜約 2. 5 X 10⁵個/ゥエルに調製し、その 5 1を APSコ一トスライドグラスのゥエルに塗抹し、風乾後、実施例 2に記載のカルノア固定の方法に従って固定した。このサンプルを用いて、実施例 3〜11に記載の方法に従って試験を行った。 1 11101/1〜 lmmol/1の PMSFの濃度で試験を実施した結果、 10 xmol/l以上の濃度で効果が認められ、 0. lmmo 1/1以上の PMSF 濃度では、白血球の形態の劣化が完全に抑制されていた。その結果を、第 5図の（a) プロテアーゼ 0.2単位/ mlのみ、（b) PMSF 1 mol/ml添加、（c) PMSF 10/zmol/ml添加、 (d) PMSF 0. Immol/ml添加、および（e) PMSF 1匪 ol/ m 1添加についてそれぞれ示した。

実施例 16：溶菌酵素ザィモラ一ゼの至適力価の検討

カンジダ 'アルビカンス（Candida albicans)を溶菌して D N Aを露出させるためのザィモラ一ゼの至適力価を検討した。カンジダ ·アルビカンスを YPD培地に植菌し、 30°Cで一昼夜培養した。その後、基質としてカンジダ •アルビカンスを PBSで懸濁した溶液（基質 1)、およびカルノア固定後、 70 %エタノールに浸し、風乾し、 PBSにて懸濁した溶液（基質 2) の 2種類を調製した。反応は、ザィモラーゼ /PBS： 0.5ml、基質： 1.5ml、 M/15リン酸緩衝液： 2.5ml、滅菌精製水： 0.5mlにて全量 5. Omlに調製したものを用いた。その後、 37°Cで、 2時間反応させ、その 0D₈。_Qを測定した。また、ザィモラ一ゼ（ザィモリエイス- 100T) 濃度は、 Omg/ml、 O.Olmg/mK 0.025rag/ ml、 0.05mg/mK 0. lmg/mK 0. 5mg/mK 0.5mg/mK 1 mg/mK 2.5mg/mK 5 mg/mlを用いた。その結果、基質 1を用いた場合のそれぞれの 0D₈。。値は、 0.533、 0.521、 0:553、 0.554、 0.548、 0.417、 0.394、 0.288、 0.163、 0.113 であり、また、基質 2を用いた場合のそれぞれの 0D₈。。値は、 0.445、 0.411、 0.359、 0.282、 0.232、 0.146、 0.115、 0.096、 0.08、 0.057であった。基質 1および基質 2がともに、 0.5mg/ml〜 5mg/ml、特に、 1 mg/ml〜 5 mg/ml の範囲で有効であることが判明した。すなわち、ザィモラ一ゼの使用量は、 50単位/ ml〜 500単位 /ml、特に 100単位 /ml〜500単位/ mlであることが好ましい。実施例 17：至適酵素処理条件（力価）の検討

(1) 貪食サンプルの作製

① U937細胞の調製

37°C, 5 %炭酸ガスインキュベーター内で、細胞培養フラスコ（175cm²) 中の RPMI1640培地 (25ml) で U937細胞 (ヒト単球株化細胞、 ATCC CRL-1593. 2) を培養した。次に、 U937細胞培養液を 50mlの遠沈管に入れ、 4°C、 220Xgで 10分間遠心分離し、 U937細胞を回収した。その後、回収した U937細胞を PBS200^1で懸濁し、血球計算盤で細胞数を計算し、細胞数を 1 ズ10⁴個/ 1〜2ズ10⁴個/^1に調製した。

②細菌貪食サンプルの調製

Staphylococcus aureus (ATCC 12600)、 Staphylococcus epideriidis (AT CC 14990)、 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)、 Enterococcus faecalis (ATCC 19433)および Escherichia coli (ATCC 11775) を、各々 5mlの BHI培養液に植菌し、 37°Cで 8時間以上培養した。培養した菌液を、 4t：、 2, OOOXgで 10分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレツトを PBS 5mlで懸濁し、再度、 4°C、 2， 000X gで 10分間遠心分離して集菌した。集菌した菌を PBS 5mlで懸濁した後、 PBSにて希釈して吸光度計により菌液の濁度 (O.D. =600nm) を、 Staphylococcus aureus (0.01〜0·03)、 Staphylococcus epidermidis (0.01〜0.03)、 Pseudomonas aeruginosa

(0.02〜0.03)、 Enterococcus faecalis (0·01〜0·03)、 Escherichia coli (0.02〜0.03) にそれぞれ調製したものを 15ml作製した。作製した菌液は、個別の 175cm²の培養用フラスコに移し、 30分間室温で静置した。へパリン加健常ヒト血液 50mlを採取し、血球分離試薬を 4 ： 1の割合で加え、 37°Cで 30分間静置し、白血球画分を分取した。分取した白血球画分を PBSで 50ml にした。培養用フラスコ（前出）の上清を静かに捨て、 PBSで希釈した白血球画分を 10mlずつフラスコに加え、室温で 10分間静置した。培養用フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を 0.02%EDTA含有 PBS 10mlで 15mlの遠沈管に回収し、 4°C、 140X g〜180X gで 10分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められたので、滅菌精製水 lmlにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、 PBSを 14ml加えて等張ィ匕を行い、再度 4°C、 140X g〜180Xgで 10分間遠心分離を行い、白血球を収集した。収集した白血球を PBSで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、 1 X10⁴個 / 1〜5 X10⁴個/ lに調製した。この貪食サンプルを、それぞれ SA貪食サンプル、 SE貪食サンプル、 PA貪食サンプル、 EF貪食サンプル、 EK貪食サンプルとした。

③塗抹固定

実施例 17(1)①で調製した U937細胞と、実施例 17(1)②で作製した各細菌貪食サンプルとを APSコートスライドグラスの各ゥエルに 5 lずつ塗抹し、風乾させた。次に、実施例 2に記載のカルノア固定液に 20分間浸した後、 75%エタノールに 5分間浸し、カルノア固定液を洗浄して風乾させた後、試験に使用するまで 4°Cで保存した（実施例 2参照）。次いで、固定サンプルの前処理を、実施例 3に従って行った。

(2) 貪食サンプルの規格及び試験方法

①細胞数

各細菌貪食サンプルのスライドグラスに塗抹固定する細胞の数を、 5.0X 10⁴〜2.5X10⁵個/ゥエルとし、また、 U937細胞の細胞の数を 5.0X10⁴〜1.0 X10⁵個/ゥエルとした。

②貪食率

スライドグラスに塗抹固定した細菌貪食サンプルを、ァクリジンオレンジ染色液で染色し、蛍光顕微鏡（X1，000) で無作為に約 200個の細胞を計測した。計測した細胞の中で、細胞内に細菌を貪食している細胞（第 6図で矢印にて示す、貪食に特徴的な形態変化が認められた細胞）を陽性細胞とし、以下の数式に従ってその貪食率（％) を算出した。貪食率（％) = [(陽性細胞数 Z計測細胞数） X 100] この時に算出した各細菌貪食サンプルの貪食率（％)は、 10%以上であった。 ③試験方法

実施例 17 (2)①および②で作成した貪食サンプルを検体とした。使用した SA貪食サンプルの貪食率は 23%であり、 1.98X 10⁵個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 27%であり、 1.74X 10⁵個/ゥエルであった。また、 EF貪食サンプルの貪食率は 34%であり、 6.40X 10⁴個/ゥエルであった。各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例 3に記載の方法に従って、酵素前処理を行った。次に、酵素前処理済みのスライドダラスを湿潤箱に置き、各種力価に調製した各酵素溶液 1 mlを検体塗抹部位に滴下して反応させた。その後、 0.2mol/l塩酸含有 PBS、 70%エタノールにそれぞれ 10分間浸し、風乾させた。このスライドグラスを、 70匪 ol/l水酸化ナトリゥム含有 PBSに 3分間、 70%エタノールに 10分間浸した後に風乾し、 1%ァクリジンオレンジ染色液で染色した。その後、蛍光顕微鏡（XI, 00 0) により評価した。 Staphylococcus aureusおよび Staphylococcus epide rmidisは、リゾス夕フィンで至適力価の検討を行った。 Enterococcus faecal isは、 N -ァセチルムラミダーゼとリゾチームの併用で至適力価を検討するため、 N -ァセチルムラミダーゼを 100単位/ m 1に固定した場合のリゾチ一ム至適力価の検討と、リゾチ一ムを 10, 000単位/ mlに固定した場合の N-ァセチルムラミダーゼ至適力価の検討を行った。判定は、酵素処理により菌体が白血球中に確認されなくなるとき「適」とした。

④結果

Staphylococcus aureusの溶菌においては、表 4に記載のように、リゾス夕フィンの力価は 1単位/ mlで十分効果を示すが、 Staphylococcus epidermi disの溶菌においては、 10単位/ ml以上のリゾスタフィンカ価が必要であった。ゆえに、リゾス夕フィンの至適力価を、 10単位/ ml〜100単位/ mlに設定した。また、 Enterococcus faecal isの溶菌においては、リゾチームの力価を

10, 000単位/ mlで固定したとき、 N-ァセチルムラミダーゼカ価が 10単位/] nl以下では溶菌されなかった。リゾチームについては、表 5に記載の通り、 N - ァセチルムラミダーゼカ価を 100単位/ mlに固定したとき、リゾチーム力価が 1,000単位/ ml以下では溶菌されなかった。ゆえに、 N-ァセチルムラミダーゼの至適力価は、 100単位/ ml〜l,000単位/ ml、また、リゾチームの至適力価は、 10，000単位/1111〜100，000単位/1111に設定した。その結果を、第 7図に示すが、図中、（a)は酵素処理前の Staphylococcus aureusの貪食サンプル、 (b)は処理前の Enterococcus faecal isの貪食サンプル、 (c)はサンプル（a)を酵素処理した後、および (d)はサンプル (b)を酵素処理した後の様子を示している。表 4 ： S. aureus、 S. epidermidisに対する

リゾスタフィンの至適酵素処理力価

表 5 ： E. faecalisに対する N-ァセチルムラミダーゼおよび

リゾチームの至適酵素処理力価

貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における上記各酵素の至適力価も同一とした。

実施例 18：至適酵素処理条件（温度）の検討

各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例 17 (2)③に記載の方法に準じて検討した。ただし、本試験の酵素処理時間は 30分、検討温度は 4 ° (：、 25°C, 37°C、 42°C、 60°Cとし、また、各酵素力価は、 N-ァセチルムラミダ一ゼ（100単位 /ml、生化学工業社製）、リゾチーム（10, 000単位/ ml、生化学工業社製）、リゾス夕フィン（10単位 Ail、 S IGMA社製）とした。判定は、実施例 17 (2)③に記載の方法に準じて行った。その結果、

St aphyl ococcus aureusは、 4 °C〜60°Cの温度範囲で白血球の菌体は確認されなかった。 Staphylococcus epi dermi di sは、処理温度 4 °Cおよび 25°Cでは白血球中の菌体が残存していたが、 37°C以上では菌体が確認されなかった。また、 Ent erococcus f aecal i sでは、処理温度 4 ° (：、 25°Cおよび 60°Cで菌体が残存していたが、 37°Cおよび 42°Cでは確認されなかった。ゆえに、至適酵素処理温度を 37 ：〜 42 に設定した。その結果を、表 6に示した。表 6 ：.酵素試薬の至適処理温度処理温度 (。C)

4 25 37 42 60 貪食サンプル、\

1回適適適適

S A貪食サンプル 2回適適適適

3回適適適適適

1回不適不適適適適

S E貪食サンプル 2回不適適適適

3回不適不適適適適

1回不適適適不適

E F貪食サンプル 2回不適不適適適不適

3回不; I& 不適適適不適貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適温度も同一とした。

実施例 19：至適酵素処理条件（時間）の検討

実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。検討した時間は、 0分、 10分、 20分、 30分、 60分、 120分とした。使用した SA貪食サンプルの貪食率は 18 %であり、 7. 80 X 10⁴個/ゥエルであつた。 SE貪食サンプルの貪食率は 34%であり、 1. 10 X 10⁵個/ゥエルであった。また、 EF貪食サンプルの貪食率は 28%であり、 1. 30 X 10⁵個/ゥエルであった。各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例 17 (2)③に記載の方法に準じて検討した。但し、本試験の酵素処理温度は 37° (：、各酵素力価は N-ァセチルムラミダーゼ（100単位 /ml)、リゾチーム（10, 000単位/ ml)、リゾス夕フィン（10単位/ ml) とした。判定は、実施例 17 (2)③に記載の方法に準じて行った。その結果、 Staphyl ococcus aureus、 S taphylococcus epidermidi s, Enterococcus faecal i s貪食サンプルともに酵素処理時間 20分以上（0分および 10分においては不適であった）で、白血球中に菌体は確認されなかったことから、少なくとも 15分以上、好ましくは 20分以上、さらに至適酵素処理時間を 30分〜 60分とするのが好ましい。その結果を、表 7に示した。

表 7 ：酵素試薬の至適処理時間

貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定における酵素処理の至適時間も同一とした。

実施例 20：プローブ濃度の検討

本発明の in situハイブリダィゼ一シヨン反応において、プローブ濃度はハイプリッド形成速度に影響を与える主要な因子である。プローブ濃度が低すぎると反応速度の低下を招き、シグナルが明確でなくなる可能性がある。また、過剰量のプローブの使用は、非特異的反応の原因に繋がる。

ゆえに、各種プローブ液について、至適濃度を検討した。まず、実施例 17(1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。使用した SA貪食サンプルの貪食率は 24%であり、 1.48X 10⁵個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 28%であり、 2.07 X 10⁵個/ゥエルであった。？ A 貪食サンプルの貪食率は 11%であり、 1.59 X 10⁵個/ゥエルであった。また、 EF貪食サンプルの貪食率は 24%であり、 1.72X10⁵個/ゥエルであった。 EK 貪食サンプルの貪食率は 12%であり、 1.63X 10⁵個/ゥエルであった。各貪食サンプルを塗抹したスライドグラスを用いて、実施例 17(2)③に記載の方法に準じて検討した。プローブは、ジゴキシゲニン標識したものを使用し、 Staphylococcus aureus、 Staphylococcus epidermidis、 Enterococcus f aec alis、 Pseudomonas aeruginosa, Escherichia col iに対する各プローブ濃度を、それぞれ、 0.06ng//iK 0.6ng/i K 1.2ng/ K 1.8ng/^l、 2.4ng/^K 3ng/ xlに調製した。貪食サンプルを塗抹したスライドグラス（第 8図参照）に、上記各種濃度に調製したプローブ液を使用し、実施例 3〜11に記載の方法に従い検討した。

その結果、低濃度（0.06ng/ l)ではシグナルが明確でなくなり、一方で、高濃度（2.4ng/ Hおよび 3ng / 1) ではバックグラウンドの増大が認められた。ゆえに、 SA、 SE、 PA、 EF、 8 のプロ一ブ濃度を0.6〜1.8½/ 1、好ましくは 0.6〜1.2ng/ lとした。また、 0.06ng/z 1においては不適であり、 0.6ng/ 1においては適であったことから、少なくとも 0. lng/ l以上とするのが好ましい。

さらに、 2.4ng/ lにおいては不適であり、 1.8ng/ xlにおいては適であつたことから、 2.2ng/ il以下とするのが好ましい。その結果を、以下の表 8〜表 12に示した。表 8 ： S Aプローブ貪食サンプルプローブ濃度（ngZ zL)

0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3

S A貪食サンプル + + + + +

SE貪食サンプル + +

P A貪食サンプル + +

EF貪食サンプル + +

EK貪食サンプル + + 表 9 ： S Eプローブ

表 10 ： P Aプローブ

表 11 ： EFプロ一ブ貪食サンプルプローブ濃度 (n g L)

0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3

S A貪食サンプル +

SE貪食サンプル + +

P A貪食サンプル + +

EF貪食サンプル + + + + +

EK貪食サンプル表 12 ： EKプローブ貪食サンプルプローブ濃度（ngZ zL)

0.06 0.6 1.2 1.8 2.4 3

S A貪食サンプル + +

SE貪食サンプル + +

P A貪食サンプル + +

EF貪食サンプル + +

EK貪食サンプル + + + + + 貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におる上記各プローブの至適濃度も同一とした。

実施例 21：ハイブリダィゼ一ション温度の検討

ハイブリダィゼーシヨン反応における反応温度は、ハイブリッド形成速度とハイプリッドの安定性に影響を与えるパラメータ一である。ハイブリダィゼ一シヨン反応を高温にすると細胞の形態が劣化することが知られていることから、至適温度の検討（4 °C、 25°C、 37°C、 42°C、 50°C、 60°C) を行つた。

まず、実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。使用した SA貪食サンプルの貪食率は 31 %であり、 1. 38 X 10⁵個/ ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 42 %であり、 1. 95 X 10⁵個/ゥエルであった。 PA貪食サンプルの貪食率は 14%である、 1 . 27 X 10⁵個/ゥェルであった。また、 EF貪食サンプルの貪食率は 48 %であり、 1. 05 X 10⁵個/ ゥエルであった。 EK貪食サンプルの貪食率は 17 %であり、 1. 85 X 10⁵個/ゥエルであった。

貪食サンプルおよび U937細胞を塗抹固定したスライドグラス（第 9図参照）を使用して、実施例 3〜1 1に記載の方法に従い検討した。その結果、ハイプリダイゼ一シヨン温度が 4 °C以下ではハイプリッド形成速度が低下し、各種プローブで安定なシグナルが観察されなかった。また、 60°Cにおいては細胞形態の変化が認められ、安定なシグナルが観察されなかった。また、 25°Cおよび 50°Cでは 37°Cおよび 42°Cに比べ、シグナルが明確でなかつたが検出することは可能であった。ゆえに、至適ハイプリダイゼーションの温度は、 25°C〜50° (：、より好ましくは 37〜42°Cに設定すると良い。それら結果を、以下の表 13〜表 17に示した。表 13 : S Aプローブ

表 14 ： S Eプローブ

表 1 5 ： P Aプロ一ブ

表 16 ： EFプローブ貪食サンプルハイブリダィゼーシヨン温度（°C)

4 25 37 42 50 60

S A貪食サンプル

SE貪食サンプル

P A貪食サンプル

EF貪食サンプル + + + + +

EK貪食サンプル表 1 7 : EKプロ一ブ

貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼーションの至適温度も同一とした。

実施例 22：ハイブリダィゼーション時間の検討

実施例 17 ( 1 )①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とし、 10分、 60分、 90分、 120分、 180分、 900分間のハイブリダィゼーシヨン時間について検討した。使用した SA貪食サンプルの貪食率は 47%であり、 1.45 X10⁵個/ゥエルであった。 SE貪食サンプルの貪食率は 47%であり、 1.33X 10⁵個/ゥエルであった。 PA貪食サンプルの貪食率は 15%である、 1.91X 10⁵個/ゥヱルであった。また、 EF貪食サンプルの貪食率は 41%であり、 1.45X 10⁵個/ゥエルであった。 EK貪食サンプルの貪食率は 20%であり、 1.23 X 10⁵個/ゥエルであった。

貪食サンプルおよび U937細胞を塗抹固定したスライドグラス（第 9図に示すものに同じ）を使用して、実施例 3〜11に記載の方法に従い検討した。その結果、ハイブリダィゼ一ション時間が 10分ではシグナルが観察されなかったが、 60分以上でシグナルが観察され、 90分以上で安定したシグナルが観察された。また、ハイブリダィゼーシヨン時間が 900分においてもシグナルの検出には変化は認められなかった。ゆえに、少なくとも 30分以上、好ましくは 60分以上、より好ましくは 90分以上とするのが好ましい。さらに好ましい至適ハイブリダィゼーシヨン時間は、 120分〜 900分に設定すると良い。それら結果を、以下の表 18〜表 22に示した。表 1 8 : S Aプローブ

表 1 9 ： S Eプローブ

表 2 0 ： S Eプローブ

表 2 1 ： E Fプローブ

貪食サンプル八イブリダィゼーシヨン時間（分）

10 60 90 120 180 900

S A貪食サンプル

S E貪食サンプル

P A貪食サンプル

E F貪食サンプル + + + + + +

E K貪食サンプル表 22 : EKプローブ

貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明の臨床検体の感染症原因微生物同定におけるハイブリダイゼ一ションの至適時間も同一とした。

実施例 23：ハイブリダィゼーション溶液に添加する界面活性剤の影響実施例 17(1)①および②に記載の方法で作成した貪食サンプルを検体とした。プローブ希釈液に各種界面活性剤（SDS、ラウリスサルコシン、サボニン、 BRIJ35、 Tween 20、 Triton X-100) を添加し、実施例 7に従ってハイブリダィゼ一ションを行ったところ、 0.25%の SDSを添加することにより検出感度が飛躍的に増強された。また、ラウリルサルコシン、 BRI〗 35、ッィ一ン 20 (Tween 20) によって検出感度を高めることができた。その結果を、以下の表 23に示した。表 23 界面活性剤シグナル検出無添加 +

SDS

ラウリルサル: 1シン + +

サポニン

BRIJ 35 + +

Tween 20 + +

Triton X-100 + さらに、 SDSを種々の濃度で用いた結果、好ましい濃度は、 1 %以下、より好ましくは0.1%〜0.5%、さらに好ましくは 0.25%であることが明らかになった。

貪食サンプルを用いて得られたこれら結果を本発明に応用したところ、同一の結果を得ることができた。ゆえに、本発明においても in situハイブリダィゼーシヨンの工程に界面活性剤、特に、 SDSを添加するのが好ましい。

実施例 24：ハイブリダィゼ一ションの際に使用するプローブ鎖長の検討 Staphylococcus aureusプローブ (SA-24 (配列番号： 1 ))および Pseudomo nas aeruginosaプロ一ブ (P 2-2 (配列番号： 7))を、ジゴキシゲニンでラベル化した。

まず、精製した各種 DNAプロ一ブ 1 を、 10XL.B. (0.5mol/l トリス塩酸（pH 7.5) 5 50歷 οί/l 塩化マグネシウム、 0.5mgゥシ血清アルブミン） lOOmmol/1 ジチオスレィ 1 ル 5 1、 dNTPs (A、 G、 C) 各 InmoK ジゴキシゲニン -dUTP (Dig-dUTP) 0.5nmoK dTTP各 0.5nmol、 DNase 3 l (25mU、 75mUおよび 200mU相当量）、 10U/ 1 DNAポリメラ一ゼ 1 lおよび滅菌精製水適量にて全量 50 1となるように調製した。 15°C、 2 時間でジゴキシゲニンラベル化を行った。ラベル化後、 5分間煮沸し反応を停止させた。反応停止液をスピンカラム（CENTRI- SEP C0LUMUNS CS90K PRINCETON SEPARATIONS, INC.) に注入し、 25°Cで 2分間遠心分離 (3,000X g) を行い、遊離のヌクレオチドを除去した。その後、溶出液の濃度を吸光度計により測定し、 3 %ァガロースゲルにて電気泳動しサイズを確認した。次に、サザンブロッティング法によりァガ口一スゲル内の DNAをニトロセルロース膜に転写させた。その後、 2%ブロッキング試薬（ロシュ社製）に 30分間浸した後、 1 /5, 000量のアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加え、 30分間浸した。次に、 lOOmmol/1のトリス塩酸 (pH 7.5)、 150匪 ol/l 塩ィ匕ナトリウムにて 10分間振とうし、 2回洗浄した。その後、 100匪 ol/lのトリス塩酸（pH9.5)、 150mmol/l 塩化ナトリウムにて 10 分間振とうして洗浄した。その後、 NBT/BCIP溶液に浸して発色させた。最後に、精製水に浸し発色を止めて乾燥させた。その結果、第 10図の ω

S Αプロ一ブ使用時および (b) PAプロ一ブ使用時についてそれぞれ示すように、 25mUの DNase (図中、レーン 1 ) を用いて、その鎖長が、主として約 350〜約 600塩基長に分布するように切断した場合に、ラベル効率が高いことが示された。こうして得られた検出用プローブを、貪食サンプルや感染症患者からの臨床検体を用いた本発明の感染症原因微生物の検出方法において使用し、ハイプリダイゼーシヨンを行ったところ、優れた感度でシグナルが検出された。従って、ハイブリダィゼーシヨンに使用するプローブの鎖長は、約 350〜約 600の塩基長、好ましくは、約 350〜約 550の塩基長とすることが良いものと判明した。

実施例 25：ハイブリダィゼーシヨンの際に使用するプローブの検討

実施例 17 (1)①および②に記載の方法で作成した、 Escher i ch i a co l iの貪食サンプルを検体として、検出用プローブについての検討を行った。

検出用プローブは、 EC-24 (配列番号： 1 1)、 EC- 34 (配列番号： 12) および EC- 39 (配列番号： 13) から、実施例 24に記載したようにジゴキシゲニンラベル化し、約 350〜約 600塩基長を有するように調製したものを、それぞれ単独または 3種を組み合わせて使用した。得られた結果から、第 1 1図に示すとおり、（a) EC- 24、（b) EC- 34または（c) EC- 39のそれぞれを単独で検出用プローブとして用いるよりも、（d)これらを混合してなる混合プローブ「MIX」の方がシグナルが明瞭に検出され、感度が高められることが明らかであった。

産業上の利用可能性

本発明の方法における in s i tuハイプリダイゼーシヨンは、 2時間以下でも安定なシグナルを観察することができるので、評価判定を非常に迅速に得ることができる。このような時間短縮は、敗血症の迅速な診断に適用する価値を実証するものに他ならない。

Claims

請求の範囲

1. 生体由来の食細胞を含む臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物の DN Aを露出させる処理を施し、該露出 DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ一シヨンできる検出用 DNAプローブを用いて in situハイブリダィゼ一シヨンを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するための方法であって、以下の特徴（1)〜（8)、すなわち；

(1) 固定化する食細胞の密度（X個/ ml) が、 5 10⁶個/1111< 個/]111く 1 X10⁸個/ mlであること、

(2) 前記 DNAを露出させる工程においてリゾスタフィンが使用され、その力価が、 1単位/ ml〜l， 000単位/ mlであること、

(3) 前記 DNAを露出させる工程においてリゾチームが使用され、その力価が、 1,000単位/ ml〜l, 000, 000単位/ mlであること、

(4) 前記 D N Aを露出させる工程において N-ァセチルムラミダ一ゼが使用され、その力価が、 10単位/ ml〜10，000単位/ mlであること、

(5) 前記 DNAを露出させる工程においてザィモラ一ゼが使用され、その力価が、 50単位 Ai 1〜 500単位/ mlであること、

(6) 前記 in situハイブリダィゼーシヨンの工程において界面活性剤を使用すること、

(7) 前記検出用 DNAプローブが、 350〜600塩基長の鎖長を有する 1種以上の DNAプローブであること、および

(8) 前記検出用 DNAプローブの濃度が、 0.11½/ 1〜2.21¾/ 1でぁることの少なくとも 1つ以上の特徴を有する、

ことを特徴とする、感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するための方法。

2 . 前記 D NAを露出させる工程において、リゾスタフイン、リゾチ一ム、 N-ァセチルムラミダーゼおよびザィモラ一ゼより選択される 1以上の酵素が使用され、そして、リゾスタフインの力価が 10単位 /ml〜100単位/ ml、リゾチームの力価が 10, 000単位/1111〜100，000単位/1111、 N-ァセチルムラミダ —ゼの力価が 100単位/ ml〜l，000単位 /ml、ザィモラ一ゼのカ価が 100単位/ ml 〜500単位/ mlである請求の範囲第 1項に記載の方法。

3 . 前記 D NAを露出させる工程において、酵素が使用され、そして、該酵素を反応させる温度が 26 〜 59°Cであり、該酵素を反応させる時間が 15 分〜 120分である請求の範囲第 1項または第 2項に記載の方法。

4. 前記 D NAを露出させる工程において、さらに食細胞の形態を保持させる物質を使用する請求の範囲第 1項乃至第 3項のいずれかに記載の方法。

5 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、フエ二ルメチルスルフォ二ルフルオラィドである請求の範囲第 4項に記載の方法。

6 . 前記フエ二ルメチルスルフォニルフルオライドが、 10 mo l/l〜10 讓 ol/lの濃度で使用される請求の範囲第 5項に記載の方法。

7 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質である請求の範囲第 4項乃至第 6項のいずれかに記載の方法。

8 . 前記食細胞の形態を保持させる物質が、ジメチルスルフォキシドにて溶解された物質であり、また、当該ジメチルスルフォキシドが、前記 D N Aを露出させる工程で用いられる溶液において 5 %未満の濃度に調製される請求の範囲第 7項に記載の方法。

9 . 前記 in s i tuハイブリダィゼ一シヨンの工程において、 D NAと D N Aプローブとが、界面活性剤の存在下で八イブリダィズされる請求の範囲第 1項乃至第 8項のいずれかに記載の方法。

10. 前記界面活性剤が、ァニオン界面活性剤である請求の範囲第 9項に記載の方法。

11. 前記ァニオン界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである請求の範囲第 10項に記載の方法。

12. 前記 in s i tuハイブリダィゼーシヨン工程において、ハイブリダィズ反応させる温度が 25°C〜50°Cであり、反応させる時間が 30分〜 900分である請求の範囲第 1項乃至第 11項のいずれかに記載の方法。

13. 前記固定工程の前に、得られた食細胞を支持担体上に支持させるェ程を含み、当該支持担体が、 3—ァミノプロピル卜リエトキシシランをコ一卜したスライドグラスである請求の範囲第 1項乃至第 12項のいずれかに記載の方法。

14. 前記シグナルの検出の際に、シグナルと細胞のコントラストを明確にさせるための色素が使用される請求の範囲第 1項乃至第 13項のいずれかに記載の方法。

15. 前記臨床検体が、血液である請求の範囲第 1項乃至第 14項のいずれかに記載の方法。

16. 食細胞を含む生体由来の臨床検体より食細胞を得、得られた食細胞を固定し、該食細胞膜の透過性を亢進させる処理を施し、該食細胞中に存在すると予想される感染症原因微生物の D NAを露出させる処理を施し、該 D N Aにストリンジエンドな条件下ハイブリダイゼ一ションすることのできる検出用 D NAプロ一ブを用レて界面活性剤の存在下に i n s i t uハイブリダィゼ一シヨンを行い、得られたシグナルにより感染症原因微生物を検出および/または同定するためのキットであって、

(1) 前記 D NAを露出させる工程において使用される酵素が、少なくとも、リゾスタフィン、リゾチ一ム、 N-ァセチルムラミダーゼ、ザィモラーゼからなる群より選択される 1種以上の酵素を含み、および

(2) 少なくとも 1種以上の検出用 D NAプロ一ブを含む、

ことを特徴とする、感染症原因微生物を検出および Zまたは同定するためのキッ卜。

17. 生体由来の食細胞を含む臨床検体中に含まれる、食細胞によって貪食された外来微生物の遺伝子をモニタ一する方法であって、請求の範囲第 1 項乃至第 15項のいずれかに記載の方法における in s i tuハイブリダィゼ一ション法を用いて該遺伝子を検出する工程を含み、該臨床検体中の外来微生物の遺伝子がモニターされることを特徴とする方法。

18. 敗血症または菌血症の診断方法であって、請求の範囲第 1項乃至第 15項のいずれかに記載の方法における in s i tuハイブリダィゼ一シヨン法を用いて原因微生物の候補となる微生物の遺伝子を同定する工程を含み、同定された結果に基づいて敗血症原因微生物または菌血症原因菌が特定されることを特徴とする方法。