JPH0771519B2 - 微生物の感受性測定法 - Google Patents

微生物の感受性測定法

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JPH0771519B2
JPH0771519B2 JP3315062A JP31506291A JPH0771519B2 JP H0771519 B2 JPH0771519 B2 JP H0771519B2 JP 3315062 A JP3315062 A JP 3315062A JP 31506291 A JP31506291 A JP 31506291A JP H0771519 B2 JPH0771519 B2 JP H0771519B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（技術的分野）本発明は、生物学的試料お
よびその他の試料中の生物を検出、同定、定量する方法
および手段に関するものである。すなわち本発明は、リ
ボソームＲＮＡ（以後ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（以後ｔ
ＲＮＡ）、或いはその他のＲＮＡを含むあらゆる生物、
そのような生物を含む大小さまざまなカテゴリー又は分
類学的群に属するあらゆる生物、そしてｒＲＮＡ又はｔ
ＲＮＡを含む未知の生物を特異的且つ鋭敏に検出し定量
する方法に関するものである。この方法によれば、ｒＲ
ＮＡ又はｔＲＮＡを含む１個の生物の存在ですら検出す
ることができる。
【０００２】本発明は又、ＲＮＡの１種、ｍＲＮＡ若し
くはｈｎＲＮＡ若しくはｓｎＲＮＡの特定の配列、又は
ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ若しくはｓ
ｎＲＮＡの前駆体分子にのみ存在し、成熟形態のｍＲＮ
Ａ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ若しくはｓｎＲＮ
Ａ分子には存在しないＲＮＡ配列（以後、前駆体特異的
ＲＮＡ配列又はｐｓＲＮＡと呼ぶ）に相補的になるよう
に作成した核酸を用いて、特定の生物、生物群、真核細
胞群又は細胞内ウィルスを検出し、同定し、定量する方
法を含む。
【０００３】本発明並びにその新規性、有用性および進
歩性は、当該分野の背景技術に関する以下の説明によ
り、明確に理解されよう。
【０００４】（背景技術）ウィルスを除くあらゆる細胞
はリボソームを含み、従って、リボソームＲＮＡを含
む。１個のリボソームは大、中、小３個の１本鎖ＲＮＡ
分子を含む。大きい方の２本のｒＲＮＡ分子は、生物の
種類によって大きさが異なる。
【０００５】ｒＲＮＡは、遺伝子から直接生産される分
子であり、ｒＲＮＡ遺伝子によってコードされる。この
ＤＮＡ配列は、ｒＲＮＡ分子を合成するための鋳型とし
て用いられる。ｒＲＮＡサブユニット１個ずつに、個別
の遺伝子が存在する。大部分の生物において多数のｒＲ
ＮＡ遺伝子が存在し、高等生物の多くは核とミトコンド
リアのｒＲＮＡ遺伝子を含有する。植物およびその他の
ある種の生物は、核、ミトコンドリアおよびクロロプラ
ストのｒＲＮＡ遺伝子をもっている。議論を簡単にする
ために、以後は、これら３種のｒＲＮＡ遺伝子をすべ
て、ｒＲＮＡ遺伝子ということにする。
【０００６】あらゆる細胞には多数のリボソームが存在
する。通常の細胞では全ＲＮＡの約８５〜９０パーセン
トがｒＲＮＡである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような
細菌は細胞１個当り約１０4 個のリボソームを含み、哺
乳類の肝細胞は約５×１０6個のリボソームを含む。各
リボソームは各々のｒＲＮＡサブユニット１個を含むか
ら、細菌細胞および哺乳類の細胞は、それぞれ１０4 お
よび５×１０6 個の各ｒＲＮＡサブユニットを含む。
【０００７】当業者には周知の方法である核酸ハイブリ
ダイゼーションが、従来から、関連のない配列が極度に
過剰に存在する場合においてさえ、極端に少量又は大量
の特定の核酸配列を特異的に検出するために用いられて
いる。従来の核酸ハイブリダイゼーションの利用例は、
例えば、細胞およびウィルスの分子遺伝学、細胞および
ウィルスの遺伝子発現、生命形態の遺伝子解析、生物お
よび核酸配列の進化および分類、疾病過程の分子メカニ
ズム、細胞および生物中におけるウィルスおよび細菌の
検出を始めとする特殊な目的のための診断法に関する文
献に認められる。
【０００８】最もよく特徴づけられ最も多く研究された
遺伝子および遺伝子産物はｒＲＮＡ遺伝子およびｒＲＮ
Ａであろう。そして従来、生物およびリボソーム遺伝子
配列の遺伝子解析、進化および分類に、ｒＲＮＡおよび
リボソーム遺伝子のハイブリダイゼーションが利用され
ている。遺伝子解析には、例えば、種々の生物における
ｒＲＮＡ遺伝子の数の決定、細胞内に存在する多数のｒ
ＲＮＡ遺伝子間の類似性の分析、細胞中におけるｒＲＮ
Ａ合成の速度および程度の決定並びにそれらをコントロ
ールする要素・因子の決定が含まれる。進化および分類
学的研究においては、近縁関係の生物および種々異なる
生物のｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を比較する。
【０００９】ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、種々様々の
生物において少くとも部分的には類似しており、大腸菌
ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡが植物、哺乳類、その他様々な
細菌等に由来するｒＲＮＡとよくハイブリダイズするこ
とは公知である。このように他の種にハイブリダイズす
る大腸菌遺伝子の割合は、その生物の近縁性の程度によ
って変わる。ほとんどすべてのｒＲＮＡ遺伝子配列は、
非常に近い関係の細菌に由来するｒＲＮＡとハイブリダ
イズするが、遠い関係の細菌種に由来するｒＲＮＡとは
それほどよくハイブリダイズせず、まして哺乳類ｒＲＮ
Ａとはあまりハイブリダイズしない。
【００１０】ｒＲＮＡと同様、ｔＲＮＡはすべての細
胞、並びにある種のウィルスに存在する。ｔＲＮＡ遺伝
子は、原核細胞の染色体およびプラスミドＤＮＡに、そ
して核、ミトコンドリア、葉緑体のＤＮＡを含む真核細
胞のＤＮＡに存在する。単一の細胞において、１種類の
ｔＲＮＡに対して異なるｔＲＮＡ遺伝子が複数種存在す
ることがよくある。ミトコンドリア、核および葉緑体の
ｔＲＮＡ遺伝子は全く異なる。多くのウィルスゲノム
は、そのウィルスに特異的なｔＲＮＡの遺伝子を含む。
【００１１】ｔＲＮＡ分子は、遺伝子から直接生産され
る分子であり、細胞中で鋳型としてｔＲＮＡ遺伝子を用
いて合成される。ｔＲＮＡは、しばしばより大きいＲＮ
Ａ分子の一部分として合成され、その後、そのｔＲＮＡ
部分はこの前駆体分子から切り出される。合成後、ｔＲ
ＮＡ分子の塩基の一部分は細胞によって化学的に修飾さ
れる。典型的ｔＲＮＡ分子は、７５〜８５個の塩基を含
む。
【００１２】生存しているすべての細胞には多数のｔＲ
ＮＡ分子が存在する。普通は、細胞の全ＲＮＡの約１０
％がｔＲＮＡ分子から成り、典型的な細菌細胞はあらゆ
るタイプのｔＲＮＡ分子を約 1.5×105 個含む。細菌細
胞中で各々異なる種類のｔＲＮＡが等しく発現されると
すると、各細胞にはそれぞれ異なるｔＲＮＡ分子が2500
個存在する。典型的な哺乳類肝細胞は約１０8 個のｔＲ
ＮＡ分子を含み、或いは、それぞれ異なる種類のｔＲＮ
Ａのコピーを細胞１個につき平均して約１０6個含む。
【００１３】蛋白合成中、個々のアミノ酸は種々の特異
的ｔＲＮＡによって正しい順序で一列に整列させられ
る。その時、各アミノ酸は異なるｔＲＮＡ種によって導
かれる。いくつかのアミノ酸は２種類以上のｔＲＮＡに
よって導かれる。
【００１４】ある種のウィルスはゲノム中にｔＲＮＡ遺
伝子を含む。これらの遺伝子は、ウィルスゲノムが細胞
中で活性である時、ウィルスに特異的なｔＲＮＡを生産
する。これらのｔＲＮＡは、各感染細胞中で多数コピー
されて存在することもある。
【００１５】ｒＲＮＡ遺伝子およびｒＲＮＡと同様に、
先行技術は、生物およびｔＲＮＡ遺伝子配列の遺伝子解
析、進化および分類学的研究におけるｔＲＮＡおよびｔ
ＲＮＡ遺伝子のハイブリダイゼーションの利用を開示し
ている。遺伝子解析としては例えば、種々の生物におけ
るｔＲＮＡ遺伝子数の決定、細胞中に存在する多数のｔ
ＲＮＡ遺伝子間の類似性の決定、細胞中におけるｔＲＮ
Ａの合成の速度および程度並びにそれらをコントロール
する要素・因子の決定がある。進化および分類学的研究
では、近縁関係の生物および非常に異なる生物に由来す
るｔＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較する。
【００１６】また、ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と同様
に、個々のｔＲＮＡ遺伝子の塩基配列は異なる生物にお
いても少くとも部分的に類似していることが知られてい
る。全ｔＲＮＡはこれと同じタイプの関係を示し、或る
種の生物に由来する全ｔＲＮＡは、遠い関係の生物のｔ
ＲＮＡ遺伝子とかなりの程度ハイブリダイズする。ラッ
トミトコンドリアのロイシル−ｔＲＮＡは、ニワトリお
よび酵母のミトコンドリアＤＮＡと有意にハイブリダイ
ズした（Biochemistry (1975) 14, ＃10, p. 2037)。ま
たｔＲＮＡ遺伝子は、Enterobacteriaceae科の生物間で
高度に保存されていることも示されている。大腸菌から
得た全ｔＲＮＡ遺伝子は、異なる遺伝子をもつ種から単
離したｔＲＮＡとよくハイブリダイズする（J. Bacteri
ology (1977) 129, ＃3, p.1435-1439）。このように
他の種にハイブリダイズする大腸菌ｔＲＮＡ／遺伝子の
割合は、生物の近縁性の程度によって変る。大腸菌ｔＲ
ＮＡ遺伝子配列が近い関係に由来するｔＲＮＡとハイブ
リダイズする割合は大きいが、遠い関係の種に由来する
ｔＲＮＡとはずっと少なくしかハイブリダイズしない。
【００１７】進化の過程におけるｔＲＮＡ遺伝子配列の
保存程度は、ｒＲＮＡ遺伝子配列の保存程度ほど大きく
はない。それにもかかわらず、ｔＲＮＡ遺伝子配列は細
胞中に存在する膨大な数のＤＮＡ配列よりずっと高度に
保存されている。
【００１８】特定の生物群のｒＲＮＡ又はｔＲＮＡに特
異的なプローブを用いてその生物群に属する生物を検出
する際の感度および容易さは、各細胞中に存在するｒＲ
ＮＡ分子およびｔＲＮＡ分子の数が多いことによって著
しく高まっている。その上、細胞中に存在するＲＮＡ分
子は１本鎖であるため、ハイブリダイゼーションテスト
は著しく容易に行われる。したがって、細胞ＤＮＡを検
出するハイブリダイゼーションテストでは使用しなけれ
ばならないような変性段階は、標的分子がＲＮＡである
場合には不必要になる。ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ以外に、
他の種類の細胞核酸に特異的なプローブを用いても、核
酸ハイブリダイゼーションによって特定の群の生物又は
細胞を特異的に検出、同定および定量することができ
る。例えば、原核細胞中の他のＲＮＡ種には、メッセン
ジャーＲＮＡ（以後ｍＲＮＡ）、および種々の前駆体分
子の一部であるＲＮＡ配列が含まれる。例えば、ｒＲＮ
Ａは、大腸菌中で塩基約6000個の長さの前駆体分子とし
て合成される。この前駆体分子はその後プロセッシング
を受けてｒＲＮＡサブユニット（塩基約4500個）とな
り、このサブユニットはリボソームに組み込まれ、余分
のＲＮＡ配列（総計1500塩基）は捨てられる。ｔＲＮＡ
分子および５Ｓ ｒＲＮＡも同様に合成され、プロセッ
シングを受ける。
【００１９】ウィルスに感染した原核細胞には、ウィル
ス特異的ｍＲＮＡも存在する。或る種の原核細胞ウィル
スのｍＲＮＡもまた、後に切り取られてすてられる余分
なＲＮＡ配列を含有する前駆体分子として合成される。
【００２０】原核細胞ｍＲＮＡおよびウィルスｍＲＮＡ
の多くは、１つの細胞につき数百倍まで存在する。一
方、ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ前駆体分子に存在する余分な
ＲＮＡ配列は、各細胞に数千個存在し得る。
【００２１】真核細胞も、前駆体ｍＲＮＡ分子、並びに
最終的なｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ分子よりも大きい前駆
体ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ分子を含有する。原核細胞と
は対照的に、多くの合成されたばかりの真核細胞ｍＲＮ
Ａ分子は最終的なｍＲＮＡ分子よりずっと大きく、切り
取られてすてられる余分なＲＮＡ配列を含んでいる。真
核細胞中に存在する他のＲＮＡ種はヘテロ核ＲＮＡ（以
後ｈｎＲＮＡ）であり、これは、ｍＲＮＡ前駆体分子
（これは核から出て、蛋白合成がおこる細胞質へ向か
う）と、核から出ることのない大量のＲＮＡとを含む様
々なＲＮＡの集団である。これには２本鎖ＲＮＡも小量
含まれる。さらに、真核細胞の核は、１００〜２００塩
基の長さの核内低分子ＲＮＡ（以後ｓｎＲＮＡ）と呼ば
れる小さいＲＮＡ分子も含んでいる。
【００２２】異なるｍＲＮＡ分子の量、又は細胞あたり
のコピー数は著しく変る。これは、細胞あたり１〜２倍
だけ存在する複雑なｍＲＮＡ分子種から、細胞毎に数百
倍存在する中位に豊富なＲＮＡ分子種、そして、細胞あ
たり１０4 倍又はそれ以上存在し得るきわめて豊富なＲ
ＮＡ分子種まで変化する。また、ｈｎＲＮＡ中に存在す
るＲＮＡ配列の多くも、各細胞に非常に豊富に存在す
る。ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび多くのｍＲＮＡの前駆体
ＲＮＡ分子中に存在するＲＮＡ配列も、各細胞中で非常
に豊富である。個々のｓｎＲＮＡ配列は極めて豊富で、
細胞あたり１０4から１０6 倍存在し得る。
【００２３】真核細胞もウィルスに感染し、ウィルス特
異的ｍＲＮＡ、および多くの場合成熟ｍＲＮＡ分子には
ないＲＮＡ配列を含むウィルス特異的前駆体ｍＲＮＡ分
子を産生する。個々のウィルス特異的ｍＲＮＡおよび前
駆体ＲＮＡ分子の存在量は、複雑なもの（１細胞につき
１〜２コピー）から、極めて豊富なもの（１細胞につき
約１０4 コピー）まで変化する。
【００２４】従って本発明はまた、細胞中に存在する生
物並びにウィルスを特異的かつ鋭敏に検出し、同定し、
定量する方法にも関係している。より詳細に述べると、
本発明の方法は、異なる大きさのカテゴリーの生物、真
核細胞、ウィルス、そして場合によっては、ｍＲＮＡ、
ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ若しくはｈｎＲＮＡ分子中に存在する余分なＲＮＡ
分子を含むこれまでに知られていない生物を感度良く検
出し、同定し、定量するのに有用である。
【００２５】そこで本発明は、生きている生物または細
胞内ウィルスの存否、生物、細胞、細胞内ウィルス又は
原核生物若しくは真核生物の細胞群の遺伝子発現状態を
決定することが重要な問題となるあらゆる分野に広く応
用しうる。その種の領域は、医学的、獣医学および農業
上の診断並びに工業的および製薬時の品質管理を含む。
【００２６】本発明は、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡに相補
的であるのみならず、ＲＮＡの一種であるｍＲＮＡ若し
くはｈｎＲＮＡ若しくはｓｎＲＮＡの特定の配列、また
は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はｓｎＲＮＡの
前駆体分子にのみ存在していて成熟形態のｍＲＮＡ、ｒ
ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ若しくはｓｎＲＮＡ分子
には存在しないＲＮＡ配列（以後、前駆体特異的ＲＮＡ
配列又はｐｓＲＮＡと記す）の特定の配列にも相補的で
ある特別に作製された核酸を用いて、核酸ハイブリダイ
ゼーション法によって、特定の生物、生物群、真核細胞
群又は細胞内ウィルスを検出し、同定し、定量する方法
に関するものである。
【００２７】本発明、およびその新規性、有用性および
非自明性は、以下に述べる当該分野に関する背景技術を
参照すれば明確に理解できるであろう。
【００２８】(1) ｍＲＮＡおよびｐｓＲＮＡはすべての
生物および細胞に存在し、ｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡ
は真核細胞にのみ存在する。ＤＮＡを含有する細胞小器
官（ミトコンドリア、葉緑体を含む）は、ｍＲＮＡ、ｐ
ｓＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡも含有している。
【００２９】(2) 典型的な細菌細胞は1000個以上の遺伝
子を含み、その大部分が特異的な蛋白質をコードしてい
る。哺乳類の細胞は10,000個以上の遺伝子を含み、その
各々がＲＮＡを生産する。どの遺伝子も細胞内で多数の
ＲＮＡコピーを生産する能力を有する。生産された各々
の特異的ＲＮＡ分子は、遺伝子の直接的な産物である。
【００３０】(3) 多数の異なるｍＲＮＡ配列が、各生物
又は細胞中に存在し得る。多細胞生物の個々の細胞は、
個々の細胞毎に又は異なる細胞群毎に異なるｍＲＮＡ配
列をもつかも知れない。
【００３１】真核生物の各細胞又は細胞群には、多くの
異なるｈｎＲＮＡ、ｐｓＲＮＡおよびｓｎＲＮＡ配列が
存在し得る。
【００３２】あるウィルスが感染した細胞の中には、種
々の異なるタイプのウィルス特異的ｍＲＮＡおよびｐｓ
ＲＮＡが存在することがある。
【００３３】(4) 原核細胞中におけるあるｍＲＮＡのコ
ピー数（以後は単に存在量と記す）はゼロから数百まで
変化する。原核生物又は原核細胞中のあるｐｓＲＮＡ配
列の存在量は、１０〜２０倍になり得る。
【００３４】真核細胞中のあるｍＲＮＡ分子の存在量
は、細胞あたり１〜２個から１０4 個以上までの範囲で
ある。
【００３５】真核細胞中のあるｈｎＲＮＡ配列の存在量
は、細胞あたり１〜２個から１０4個以上までの範囲で
ある。
【００３６】真核細胞中のあるｓｎＲＮＡ分子の存在量
は、細胞あたり１０4 から１０6 個まで変化する。
【００３７】真核細胞中のあるｐｓＲＮＡ配列の存在量
は、細胞あたり１〜２個から１０4個以上まで変化す
る。
【００３８】(5) 多くの真核細胞では、種々のタイプの
ＲＮＡがＤＮＡの反復配列部分からつくられる。この結
果、配列が互いに似てはいるが同一ではない多くのＲＮ
Ａ分子の集団が生ずる。しかし、これらＲＮＡ分子の一
つに相補的なプローブは、類似した他のＲＮＡ分子すべ
てとハイブリダイズすると思われる。
【００３９】(6) ウィルスおよび生物の種々のｍＲＮ
Ａ、ｐｓＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡをコード
する遺伝子配列は、進化の過程で種々の程度に保存され
てきた。これら配列の大部分は、ｔＲＮＡ配列に比べれ
ば保存度がずっと少ない。しかし、その配列の若干は高
度に保存されている。例えば、ヒストンｍＲＮＡをコー
ドする遺伝子は進化の間非常に高度に保存され、ヒスト
ン遺伝子配列は非常に異なる生物においても良く類似し
ている。
【００４０】これらのＲＮＡの多くのＤＮＡ配列におけ
る保存性の欠如は、非常に近い関係の生物又はウィルス
同士を容易に見分けることのできるプローブの作成を可
能にする。
【００４１】種々のｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ
およびｐｓＲＮＡについて、非常に多数の研究が行われ
ている（B. Lewin, Gene Expression １巻および２巻参
照）。これらの研究は、原核生物および真核生物並びに
ウィルスにおける遺伝子の解析、調節および進化に関す
るものであり、これらＲＮＡのハイブリダイゼーション
を行っている。
【００４２】先行技術におけるハイブリダイゼーション
法 従来、二つの基本的な核酸ハイブリダイゼーション法が
開示されている。その一つ、溶液内ハイブリダイゼーシ
ョン法では、プローブも試料の核酸分子も両方共溶液中
に遊離している。もう一つの方法では試料は固体支持体
に固定され、プローブは溶液中に遊離している。これら
の方法は、両方共広く用いられ、文献にも十分に記載さ
れている。溶液内ハイブリダイゼーション法の一例を、
後述の実施例に示す。Thomas等の論文（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA (1980), 77, p.520）には、固定法の一例
がある。
【００４３】核酸ハイブリダイゼーションテストの基本
成分は、次の如くである。
【００４４】（１）プローブ 検出するべき核酸配列（即ち標的配列）に相補的な標識
１本鎖核酸配列。ここで用いるように、標的配列はｒＲ
ＮＡ、ｔＲＮＡ又はその他のＲＮＡの全配列又は部分配
列である。
【００４５】プローブの長さは特定のテストに依り５個
〜数万塩基の間で変動し得る。プローブ分子の一部だけ
が、検出すべき核酸配列（以後は標的配列と記す）に相
補的であればよい。その上、プローブと標的配列との間
の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーシ
ョンは不完全な相補的分子間でもおこり、その場合、ハ
イブリダイズした領域内にある塩基の一部分は、正確に
相補的な塩基とは対にならない。プローブは、ＲＮＡか
又はＤＮＡから成ることができる。核酸プローブの形態
は、単一の極性をもつ標識１本鎖分子であっても、両方
の極性をもつ標識１本鎖分子であってもよい。プローブ
の形態は、その長さと同様、行うべきハイブリダイゼー
ションテストのタイプによって定まる。
【００４６】（２）試 料 試料は、標的分子（即ち、対象とする生物）を含むかも
知れないし、含まないかも知れない。試料の形態は種々
様々であり、水又は血清のような液体でもよいし、埃
塵、土壌又は組織試料のように固体でもよい。試料核酸
は、プローブと標的分子のハイブリダイゼーションがほ
んの少しでもおこる前に、プローブと接触できるように
しておかなければならない。従って、生物のＲＮＡはハ
イブリダイゼーションがおこる前に細胞から遊離され、
正しい条件下に置かなければならない。先行技術の溶液
内ハイブリダイゼーション法では、試料ｒＲＮＡとプロ
ーブとのハイブリダイゼーションが可能となるために
は、ＲＮＡの精製が必要である。この意味するところ
は、試料中の標的配列を検出するべく溶液内法を用いる
ためには、試料の核酸をまず精製して、蛋白質、脂質そ
の他の細胞成分を除去した後ハイブリダイゼーション条
件下でプローブと接触させなければならないということ
である。試料核酸の精製には最低数時間はかかり、試料
の種類および量によっては、１日かかることもある。
【００４７】（３）ハイブリダイゼーション法 プローブと試料とは、核酸ハイブリダイゼーションが可
能になる条件下で混合しなければならない。即ち、正し
い濃度および温度条件下で、無機又は有機の塩の存在下
プローブと試料とを接触させる。プローブおよび試料核
酸は、プローブと試料核酸間の可能なハイブリダイゼー
ションがおこるのに十分長い時間、接触させなければな
らない。
【００４８】混液中のプローブ又は標的の濃度はハイブ
リダイゼーショがおこるのに必要な時間を決定する。プ
ローブ又は標的濃度が高ければ高い程、ハイブリダイゼ
ーションに必要なインキュベーション時間はみじかくな
る。
【００４９】プローブおよび試料核酸から成る核酸ハイ
ブリダイゼーションインキュベーション混液は、特定の
温度でハイブリダイゼーションがおきるのに十分長い時
間インキュベートしなければならない。ハイブリダイゼ
ーションが完了するのに必要な時間の長さは、プローブ
核酸の濃度、プローブに相補的な試料核酸の濃度、そし
て用いたハイブリダイゼーション条件によって特徴づけ
られるハイブリダイゼーションの基本的速度によって決
まる。ハイブリダイゼーションの基本的速度は、インキ
ュベーション混液中の塩の種類、その濃度そしてインキ
ュベーション温度によって決まる。塩化ナトリウム、燐
酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムがハイブリダイゼー
ション用に最もよく使われる塩であり、用いる塩濃度は
１Ｍを越えることはほとんどないが、時には 1.5〜２Ｍ
にもなることがある。上記の塩類は、同じ濃度および温
度で用いた場合、同等の核酸ハイブリダイゼーション速
度を与える。カリウム、リチウム、ルビジウムおよびセ
シウム塩も同様である。Britten 等（1974）Methods in
Enzymology, XXIX 巻、part E., Grossman & Moldave
編、Academic Press，ニューヨーク， 364ページおよび
Wetmurおよび Davidson (1968)、 J. Molecular Biolog
y 31巻， 349ページには、一般に使用される塩で達せら
れるハイブリダイゼーション標準的速度のデータが示さ
れている。ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーション
速度はＤＮＡとＤＮＡとのハイブリダイゼーション速度
とは若干異なる。その変化の大きさは、１０倍以上にな
ることはほとんどないが、例えば過剰のＤＮＡ又はＲＮ
Ａが用いられるかどうか等によって変わる。Galau et a
l. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74巻、６号、
2306ページを参照されたい。
【００５０】或る条件は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイ
ゼーションの加速をおこす。フェノールと塩との乳濁液
は、その混合物を振盪した時、ＤＮＡハイブリダイゼー
ションを非常に速くする。その速度は、この系の標準Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーション速度の数千倍も速くなる。
Kohne 等、 Biochemistry (1977) 16 巻、532aページ参
照。中性および陰イオン性デキストランポリマーを、溶
液中で１本鎖ＤＮＡと混合した時にも、標準速度を50〜
100 倍上まわるＤＮＡハイブリダイゼーション速度促進
が認められた。Wetmer, Biopolymers(1975) 14巻、2517
ページ参照。これらのＤＮＡ加速条件のどれも、ＲＮ
Ａ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを加速するというこ
とは報告されなかった。本発明者は、ＲＮＡ：ＤＮＡハ
イブリダイゼーションの加速条件を記した公知文献を知
らない。
【００５１】（４）ハイブリダイゼーションアッセイ 標的分子とハイブリダイズしたプローブ分子の存在を検
出する方法が必要である。そのような方法は、標的分子
とハイブリダイズしたプローブが標的分子とハイブリダ
イズしなかったプローブから分離することができるとい
う事実に基づいている。溶液内ハイブリダイゼーション
混合物をアッセイする従来の方法は、まず精製して、次
にハイブリダイゼーションインキュベーション混合液中
でプローブと接触させた試料核酸に対して行われてい
る。
【００５２】溶液内ハイブリダイゼーション混合液中の
ハイブリダイズしたプローブの存在をアッセイする標準
法としてヒドロキシアパタイト（ＨＡ）が使用されてい
る。適当な条件下でＨＡは、ハイブリダイズしたＤＮＡ
プローブと選択的に結合するが、ハイブリダイズしてい
ないプローブとは結合しない。ハイブリダイズしたプロ
ーブをアッセイするには他の方法も利用できる。その中
には、Ｓ1 ヌクレアーゼ法がある。これは、ある種の特
異的酵素がもっているハイブリダイズしていないプロー
ブを分解して小さいサブユニットにしてしまう能力に依
存しており、その際、ハイブリダイズしているプローブ
はその酵素によって分解されず、大きいままである。分
解したプローブは、その後サイズ−分離法により、ハイ
ブリダイズしているプローブから分離することができ
る。溶液内でハイブリダイズした核酸をアッセイする種
々の方法が、Britten 等(1974)（上掲）によって記され
ている。
【００５３】固定した試料核酸のハイブリダイゼーショ
ン法では、ハイブリダイゼーションアッセイが、ハイブ
リダイゼーション法に組み込まれている。これらの方法
は、試料核酸を不活性支持体上に固定し、それからこの
固定された核酸を溶液中に遊離している標識プローブ
と、ハイブリダイズさせるというものである。プローブ
と固定化試料核酸をハイブリダイゼーションさせると、
プローブが試料核酸に結合し、従って、プローブが不活
性支持体に結合する。ハイブリダイズしないプローブは
溶液中に遊離して残り、不活性支持体並びにハイブリダ
イズしたプローブから洗浄によって除去することができ
る。このような方法では、核酸ハイブリダイゼーション
用の試料調製のために最低数時間、そして洗浄に１〜２
時間かかり、大量のプローブを必要とする。この方法の
利点は、複数の試料を同じ不活性支持体に固定し、すべ
ての試料を一度にハイブリダイズさせて処理することが
できることである。このような固定化試料法の例は、An
alytical Biochemistry （1983） 128巻、 415ページ、
およびJ.of Infectious Disease (1982) 145巻， 6号，
863 ページに出ている。
【００５４】ハイブリダイゼーションに利用できる核酸
の調製 溶液内核酸ハイブリダイゼーション法には、常に他の細
胞成分を除去して精製した核酸を用いる。細胞およびウ
ィルス中の核酸は、他の細胞成分、一般には蛋白質とし
っかり結合しているのが普通であり、この形ではハイブ
リダイゼーションにつかえない。細胞又はウィルスを単
純に破壊して成分を放出しても、ハイブリダイゼーショ
ンに使える核酸は得られない。核酸は細胞から放出され
た後でも他の細胞又はウィルス成分と複合したままにな
っており、実際には、同じく放出され得るヌクレアーゼ
によって分解されることもある。その上、そのような混
合物に添加された標識プローブは、「粘着性」の細胞又
はウィルス成分と結合し、ハイブリダイゼーションには
役に立たなくなるかも知れないし、プローブもヌクレア
ーゼの作用によって分解するかも知れない。
【００５５】核酸精製のためには従来種々の方法があ
り、その中のいくつかはManiatis等（上掲）によって記
述されている。これらの方法はすべて時間がかかり（１
時間かかるものは、非常に速いと見なされる）、しか
も、いろいろな操作を必要とする。
【００５６】本発明者の知る限り、従来、核酸をハイブ
リダイゼーションに使えるようにするための何らかの予
備的精製段階を必要としないで溶液内核酸ハイブリダイ
ゼーションを実施する方法はない。
【００５７】固定化核酸ハイブリダイゼーション法は試
料核酸を不活性支持体に固定する段階と、この固定され
た核酸を溶液中に遊離している標識プローブとハイブリ
ダイズさせる段階とを含む。
【００５８】核酸を不活性支持体上に固定するプロセス
は、固定された核酸をハイブリダイゼーションに使える
ようにするのに十分効果的な精製段階となる。核酸以外
の細胞又はウィルス成分の大部分は不活性支持体とは結
合しない。また、結合したとしても、核酸が結合した場
所とは異なる場所に結合する。このような方法は、ハイ
ブリダイゼーション用の試料核酸をつくるのに最低数時
間を必要とする。この方法の利点は、複数の試料を不活
性支持体上に固定化し、ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションアッセイ段階を通じてこれらを
全部一緒に処理できることである。ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイでは、ハイブリダイゼーション混合物から
不活性支持体を取り出す。固定試料とハイブリダイズし
たプローブは不活性支持体と共に残り、ハイブリダイズ
していないプローブは溶液中に遊離したまま残る。
【００５９】このように、生物の存在は非常に多くの先
行技術の方法のいずれかによって検出し得るが、これら
の方法には何らかの理由で完全に満足の行くものは一つ
もない。そのような方法には、以下に示すように、例え
ば、増殖法、光学的検出法、血清学的および免疫化学的
方法が含まれる。
【００６０】増殖テスト 多数の異なる増殖テストが存在し、それぞれ特定の生物
又は生物群の増殖に有用である。増殖テストは、１個の
生物を検出する潜在的感度を有する。しかし実際には、
多くの生物は増殖させるのが困難であるかまたは不可能
である。これらのテストは時間がかかるのが普通であ
り、完了するまでに１日から数ヶ月もかかる。その上、
大きな生物群（例えば細菌全体）に属するいずれかの生
物の存在を検出するには、その群のすべての生物の増殖
条件がわかっていると仮定して、膨大な数のテストが必
要である。
【００６１】光学的検出法 検鏡法と鑑分染色法とを組み合わせると、非常に強力
な、多くの場合非常に迅速な検出法となる。この方法の
主要な問題は、大量の他生物の存在下における特定生物
の検出である。例えば、多くの種々のグラム陰性桿菌の
存在下で特定のグラム陰性桿菌を同定する場合である。
その上、大きな生物群（細菌全体の群のような）に属す
るすべての生物の存在を検出するためには、多数のテス
トを行わなければならない。
【００６２】血清学的および免疫化学的方法並びに生化
学的テスト これらのテストには、多数の異なる種類がある。これら
のテストは通常定性的であり、感度が非常に良いわけで
はなく、しばしば増殖段階を必要とする。大きな生物群
に属するすべての生物を検出するには、これらテストを
多数行う必要がある。
【００６３】Falkow等による米国特許第4,358,535 号明
細書は、遺伝物質即ち遺伝子又はゲノムの検出法を開示
している。この米国特許の発明では、病原体を含んでい
るのではないかと疑いをもたれる臨床試料又は単離物を
不活性の多孔性支持体（例えばニトロセルロースフィル
ター）上に移し、細胞が局在化されるように処理する。
その後、細胞ＤＮＡが放出されて支持体に結合するよう
に細胞を処理する。その後の処理で、ゲノムの個々のＤ
ＮＡ鎖の分離がおきる。それから、そのＤＮＡ鎖をハイ
ブリダイゼーション条件下で特徴的ポリヌクレオチド配
列に特異的な標識プローブと接触させる。病原体由来の
１本鎖ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼ
ーションは、標識によって検出される。
【００６４】この米国特許発明の遺伝子又はゲノムを検
出する方法は、前述の他の方法と同様、本発明による方
法のような特異性、感度、迅速性又は簡便性をもたな
い。米国特許に開示された Falkow 等の方法と、以下に
開示する本発明の方法との比較をまとめて次に示す。
【００６５】(1) ハイブリダイゼーションを行う方法Falkow等の方法 固定法のみ本発明の方法 溶液内法、更に固定法も使用可能 (2) 検出すべき核酸の種類Falkow等の方法 遺伝物質（即ち遺伝子はゲノム）。細胞性生物では、遺
伝物質は常にＤＮＡである。
【００６６】本発明の方法 遺伝子の１次産物（ＲＮＡ）のみを検出。ＲＮＡは、細
胞性生物中には遺伝物質として存在しない。
【００６７】(3) 検出すべき核酸配列の数（１細胞あ
たりのコピー数）Falkow等の方法 ほとんど全ての微生物の染色体遺伝子は細胞あたり１個
のみ存在する。染色体外遺伝子は、普通細胞あたり１〜
３個存在する。ｒＲＮＡ遺伝子は細胞あたり３〜６個存
在する。
【００６８】本発明の方法 １細菌細胞あたり、ｒＲＮＡコピー104 個が存在する。
各細菌細胞あたり、各ｔＲＮＡのコピー約２×103 個が
存在する。細菌細胞あたり、各々の特異的ｍＲＮＡ分子
10〜200 個が存在する。その数は、一般に真核細胞の方
が多い。
【００６９】(4) ハイブリダイゼーション法の核酸定
量能Falkow等の方法 何も開示されていない。
【００７０】本発明の方法 核酸（ＤＮＡもＲＮＡも）を定量できるすぐれた能力。
【００７１】(5) 細胞の遺伝子発現の状態を決定およ
び定量する能力Falkow等の方法 遺伝子発現は遺伝物質の検出によっては決定することが
できない。
【００７２】本発明の方法 遺伝子の１次産物物即ちＲＮＡを検出するプローブの使
用により、遺伝子発現が決定および定量できる。
【００７３】(6) 診断で偽陽性と検出される相対確率Falkow等の方法 高い（特定の遺伝子のみ検出）。
【００７４】本発明の方法 低い（ＲＮＡの検出に重点がおかれる時）。
【００７５】(7) 核酸検出の相対感度Falkow等の方法 良い。核酸ハイブリダイゼーションテストは、一般に非
常に鋭敏である。
【００７６】本発明の方法 高感度。Falkowが示した方法による感度の20〜104 倍鋭
敏。ＲＮＡは、それをつくる遺伝子より豊富にあるのが
ほとんど常である。又溶液内法は、固定法より感度が良
い。
【００７７】(8) ハイブリダイゼーションテストのた
めの試料調製Falkow等の方法 試料核酸を固定し、ハイブリダイゼーションに使えるよ
うにするために２〜１０時間かかる。ＤＮＡを１本鎖の
形に変える段階を含む。すべての試料核酸がハイブリダ
イズするわけではない。
【００７８】本発明の方法 試料をハイブリダイゼーション可能にするために１〜５
分間かかる。細胞中のＲＮＡはすでに１本鎖である。試
料核酸のすべてがハイブリダイゼーション可能である。
【００７９】(9) 必要なプローブの量Falkow等の方法 ハイブリダイゼーション混合物中に、通常0.01〜１マイ
クログラムのプローブを必要とする。
【００８０】本発明の方法 １試料につき、10-5〜10-6マイクログラムのプローブが
必要である。
【００８１】(10) ハイブリダイゼーションがおこるの
に必要な時間Falkow等の方法 2〜20時間。
【００８２】本発明の方法 0.2〜0.6 時間。
【００８３】特定起源に由来するｒＲＮＡ配列に相補的
な選択された標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼ
ーションを利用して、特定の生物群に特徴的なｒＲＮＡ
又はｔＲＮＡの存否を検出する本発明の方法を教示して
いる先行技術を本発明者は知らない。又、特定の起源に
由来するｒＲＮＡ又はｔＲＮＡサブ配列のすべてに相補
的な標識核酸分子を用いる核酸ハイブリダイゼーション
によって、特定起源に由来する一般にはｒＲＮＡ又はｔ
ＲＮＡの存否を検出する本発明の方法を開示する先行技
術も本発明者は知らない。
【００８４】又、特定起源に由来するｍＲＮＡ、ｈｎＲ
ＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡのサブ配列（１ヶ又は
複数）、配列（１ヶ又は複数）又は配列若しくはサブ配
列の集団に相補的な選択された標識核酸分子を用いる核
酸ハイブリダイゼーションを利用して、ｍＲＮＡ、ｐｓ
ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はｓｎＲＮＡの特定の配列又は種
々の特定配列の集団の存否を検出して特定の生物、生物
群、真核細胞群又は特定の細胞内ウィルス又は特定の細
胞内ウィルス群を検出、同定および定量するという本発
明の方法を教示する先行技術も本発明者は知らない。
【００８５】更に又、特定の生物群又はウィルス群に特
徴的な核酸の存否を検出する本発明の検出法、何らかの
目的で或る特定の生物群又はウィルス群の核酸を標識特
異的プローブとの溶液内核酸ハイブリダイゼーションに
使用できるように迅速に処理する本発明の方法、特定の
生物群の核酸を特異的相補的プローブとのハイブリダイ
ゼーションに使用可能にするための迅速な方法と、或る
生物又はウィルスの核酸とその生物又はウィルスの核酸
に相補的な標識プローブとの溶液内ハイブリダイゼーシ
ョンの速度を著しく加速することによってその生物の核
酸を検出する方法とを組み合わせた溶液内核酸ハイブリ
ダイゼーション法を利用する本発明の方法、特定の生物
群又はウィルス群の抗菌剤に対する感受性又は抗ウィル
ス剤に対する感受性を測定する本発明の方法、血液、尿
その他の体液若しくは組織若しくはその他の試料中にお
ける抗菌性或いは抗ウィルス性物質の存在を検定する本
発明の方法、細胞の増殖状態を調べる方法、微生物又は
ウィルス感染を検知する方法、又はハイブリダイゼーシ
ョン混合物中に、所定の条件下で前記混合物とヒドロキ
シアパタイトとを接触させて生成した溶液を特殊な方法
で処理することにより、ハイブリダイズしたプローブが
存在するかどうかを迅速に検定する本発明の方法を教示
する先行技術を本発明者は知らない。
【００８６】発明の開示 本発明は、生物学的試料、およびその他の試料中の生物
を検出し、同定し、定量する方法および手段を提供す
る。より詳細に言えば、リボソームＲＮＡ（以後ｒＲＮ
Ａ）、トランスファーＲＮＡ（以後ｔＲＮＡ）又はその
他のＲＮＡを含むあらゆる生物、そのような生物の大、
小さまざまなカテゴリー又は分類学的群に属するあらゆ
る生物、そして、ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡを含むこれまで
未知の生物を特異的かつ鋭敏に検出し、定量する方法に
関するものである。この方法は、ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ
を含む１個の生物でも、その存在を検出することができ
る。
【００８７】本発明は、ＲＮＡの一種であるｍＲＮＡ、
ｈｎＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡの特異的配列、又はｍ
ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ若しくはｓｎ
ＲＮＡの前駆体分子にのみ存在していて成熟したｍＲＮ
Ａ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ若しくはｓｎＲＮＡの分子に
は存在しないＲＮＡ配列（以後は前駆体特異的ＲＮＡ配
列又はｐｓＲＮＡと呼ぶ）に相補的である特別に作製さ
れた核酸を用いて、特定の生物、生物群、真核細胞群又
は細胞内ウィルスを検出、同定そして定量する方法をも
提供する。
【００８８】また本発明は、(a) 或る特定の生物の遺伝
子発現のパターンに関係なく働く１回のアッセイ操作で
多数の異なる生物のいずれか一つの存在を特異的に検出
でき、(b) 対象とする群に属しない生物が存在していて
も特定種類の生物のみを検出できるように試験法を修正
することができ、(c) 極めて高い検出感度を有していて
一個体の生物又は一個の細胞の存在を検出でき、(d) 存
在する生物又は細胞の数を定量することができ、かつ、
(e) 増殖段階を必要としない方法および手段をも提供す
る。
【００８９】本発明は、特定の生物群又はウィルス群の
抗菌剤又は抗ウィルス剤に対する感受性を検知するため
の手段、血液、尿、その他の体液、又は組織若しくはそ
の他の試料中の抗菌物質又は抗ウィルス性物質の存在を
アッセイするための手段、細胞の増殖状態を調べるため
の手段、微生物またはウィルス感染を検出するための手
段、ハイブリダイゼーション混合物中におけるハイブリ
ダイズしたプローブの存在を迅速にアッセイするための
手段を提供する。
【００９０】既に述べたように、ｒＲＮＡ塩基配列は非
常に広範囲の生物において部分的に類似している。二種
の生物の関係が近ければ近い程、全ｒＲＮＡにおいて二
つの種で類似する部分（割合）は大きくなる。いかなる
生物種のｒＲＮＡ配列も、短いｒＲＮＡサブ配列のひと
つながりと見なされ、その中の一つのサブ配列はほとん
どすべての生体で類似している。従って、ほとんどすべ
ての生体のｒＲＮＡはこのサブ配列を含むに違いない。
別のサブ配列は、その生物が属する種のメンバーのｒＲ
ＮＡにおいてのみ類似している。その他のサブ配列は、
その種が属する目（もく）の生物に存在する。
【００９１】非常に異なる生物のｒＲＮＡ配列は少くと
も一部が類似しているから、非常に異なる生物で類似し
ているｒＲＮＡ配列を検出するプローブを用いる本発明
の方法は、試料中のこれら生物の１つ又はそれ以上の存
否を検知することができる。遠い関係の生物において類
似するｒＲＮＡ配列に相補的な標識核酸配列（１つ又は
複数）を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおい
てそのようなプローブとして用いることができる。
【００９２】近い関係の生物のｒＲＮＡ配列は、遠い関
係の生物のそれよりもよく似ているから、特定の狭い生
物群において類似するｒＲＮＡ配列のみを検出するプロ
ーブを用いる本発明の方法は、試料中のこれら特定の生
物の１つ又はそれ以上の存否を多くの（近縁関係のな
い）生物の存在下においてさえ検知することができる。
【００９３】これらの群特異的プローブは、種々の異な
る大きさのカテゴリーに対して特異的なものとすること
ができる。或るプローブは分類学上の特定の属に特異的
であり得、又別の或るプローブは特定の科又は他の属に
特異的である。
【００９４】群特異的プローブは或る生物群のｒＲＮＡ
とハイブリダイズする能力をもつが、他のいかなる生物
群のｒＲＮＡともハイブリダイズしない。そのような群
特異的相補配列は、その特定の群に属さない多くの生物
に由来する大量のｒＲＮＡが存在していても、その特定
の群のいずれかの生物に由来するｒＲＮＡの存在を検出
する。
【００９５】試料中のｒＲＮＡ分子の総数は、ｒＲＮＡ
に相補的な標識配列（１つ又は複数）と、過剰プローブ
又は過剰試料ＲＮＡを利用する標準的な核酸ハイブリダ
イゼーション法とを用いて測定される。
【００９６】種々様々な生物の細胞のｒＲＮＡ含有量は
当業者には公知である。類似生物の非常に大きい群、例
えば細菌群では、細胞あたりのｒＲＮＡ量はざっと２〜
５倍に変化する。従って、もし試料中のｒＲＮＡ分子の
数がわかり、そのｒＲＮＡの起源となった生物が属する
広い意味での群が特定されれば、試料中に存在する細胞
数の正しい推定値が計算できる。もし、その群が特定さ
れていないならば、その試料を、各々が特定の広い生物
カテゴリーに特異的であるように選択した一連のｒＲＮ
Ａに相補的なプローブにハイブリダイズすることによっ
てその群（クラス）を決定することができる。
【００９７】現在、１回のアッセイ操作による検出およ
び定量範囲は、１０4 個のｒＲＮＡ分子（１個の細菌又
は１０-2個の哺乳類細胞）から約１０12個のｒＲＮＡ分
子（１０8 個の細菌又は１０6 個の哺乳類細胞）までで
あり、細胞数では約１０8 個に及ぶ。一回のテストを、
１０3 個から１０10個の細菌までを定量するような方法
で行うこともできる。このテストは、このように極めて
フレキシブルである。
【００９８】ｒＲＮＡに対するこのテストは特異的であ
り、非常に少い生物の存在を検出することができるか
ら、増殖段階によって生物数を増幅する必要はない。
【００９９】ｒＲＮＡを含む生物がそのような生物を含
むかも知れない試料中に存在するかどうかを決める本発
明は、基本的に、次のように実施する。
【０１００】（ａ）試料又はその試料から単離した核酸
を、すべての生物のｒＲＮＡに相補的な標識核酸分子か
ら成るプローブと一緒にする。
【０１０１】（ｂ）生成した混合物を、所定のハイブリ
ダイゼーション条件下で所定時間インキュベートする。
【０１０２】（ｃ）その後、生成した混合物について、
プローブのハイブリダイゼーションをアッセイする。
【０１０３】本発明により、ｒＲＮＡを含む特定のカテ
ゴリーに属する生物がそのような生物を含むかも知れな
い試料中に存在するかどうかを決定する場合には、次の
ように実施する。
【０１０４】（ａ）試料又はその中の核酸を、特定のカ
テゴリーの生物のｒＲＮＡにのみ相補的であって関連の
ない生物由来のｒＲＮＡには相補的でない標識核酸分子
からなるプローブと接触させる。
【０１０５】（ｂ）そのプローブと試料又はその単離核
酸とをインキュベートする。
【０１０６】（ｃ）インキュベートした混合物につい
て、上記プローブのハイブリダイゼーションをアッセイ
する。
【０１０７】本発明は又、被検試料中の生物の数を決定
するためにも用いられる。そのためには、上記２番目の
方法において、プローブハイブリダイゼーションがおこ
った場合、試料中のｒＲＮＡ量を特定の群に属する個々
の生物に通常存在するｒＲＮＡ分子の数とを比較する。
【０１０８】勿論、使用し得る本発明の範囲内の変更と
して、上述の２番目の方法における段階（ａ）の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを１組含む方
法も含まれる。そのような場合には、各別個のプローブ
は特定の生物群のｒＲＮＡのみに相補的な標識核酸分子
から成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的で
ある。段階（ａ）の後、各プローブ試料混合物を所定の
ハイブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベ
ートし、その後、各混合物についてプローブのハイブリ
ダイゼーションのアッセイを行う。
【０１０９】既述のように、ｔＲＮＡ塩基配列は、非常
に異なる生物において部分的に類似している。２種の生
物がより近い関係にあるならばある程、ｔＲＮＡ配列に
おける関連づけられる割合はより大きくなる。各々のｔ
ＲＮＡ遺伝子配列は、一連の短いｔＲＮＡサブ配列がつ
ながったものと考えられる。或るサブ配列は関連のある
生物を含む大きい群において類似している。又別のサブ
配列は、関連のある生物が属する中位の大きさの群にお
いて類似しており、第三のサブ配列は、関連のある生物
の小さい群において類似している。
【０１１０】非常に異なる生物のｔＲＮＡ配列も少なく
とも一部は類似しているから、非常に異なる生物におい
て類似するｔＲＮＡ配列を検出するプローブを用いる場
合の本発明の方法は、試料中にこれら生物が１種類か又
はそれ以上存在するかどうかを検出することができる。
したがって、遠く離れた生物において類似のｔＲＮＡ配
列に相補的な標識核酸配列（１個又は複数）を、核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイにおいてそのようなプロ
ーブとして用いることができる。
【０１１１】そして、関係の近い生物のｔＲＮＡ配列
は、関係の遠い生物のそれよりもよく似ているから、特
定の狭い生物群において類似するｔＲＮＡ配列のみを検
出するプローブを使用する場合の本発明の方法では、試
料中のこれら特定生物の１つ又はそれ以上の存否を、関
連性のない多くの生物の存在下においてさえ検出するこ
とができる。そのような群特異的プローブは、種々の大
きさのカテゴリーに特異的である。例えば、あるプロー
ブは分類学上の特定の属に対して特異的であるかもしれ
ないが、別の或るものは特定の科又は別の属に対して特
異的である。
【０１１２】群特異的プローブは、或る生物群のｔＲＮ
Ａとはハイブリダイズできるが別の生物群のｔＲＮＡと
はハイブリダイズできないという性質を有する。そのよ
うな群特異的相補配列は、その特異的生物群のいずれか
のメンバーのｔＲＮＡの存在を（その特異的群に属さな
い多くの生物に由来するｔＲＮＡが大量存在する場合で
さえ）検出する。
【０１１３】ｔＲＮＡを含む特定のカテゴリーの生物が
そのような生物を含むかも知れない試料中に存在するか
どうかを決定することを目的とする本発明を実施するに
は、（ａ）試料又はその中の核酸を、特定のカテゴリー
の生物のｔＲＮＡにのみ相補的であって関連のない生物
に由来するｔＲＮＡには相補的でない標識核酸分子から
成るプローブと接触させる、（ｂ）プローブと試料又は
その単離された核酸とをインキュベートし、（ｃ）イン
キュベートした混合物について、上記プローブのハイブ
リダイゼーションのアッセイを行う。
【０１１４】本発明は又、被検試料中に存在する生物の
数を調べるために用いることもできる。それには、上記
の２番目の方法において、プローブハイブリダイゼーシ
ョンがおこった場合、アッセイの後、試料中のｔＲＮＡ
の量を、上記特定の群に属する個々の生物に通常存在す
るｔＲＮＡ分子の数と比較する。
【０１１５】勿論、本発明の範囲内で使用し得る変更と
して、上記の２番目の方法における段階（ａ）の単一プ
ローブの代わりに、複数の異なるプローブを１組用いて
もよい。そのような場合、各別個のプローブは、特定の
生物群のｔＲＮＡのみに相補的である標識核酸分子から
成り、各プローブは異なる生物群に対して特異的であ
る。段階（ａ）の後、各プローブ試料混合物を所定のハ
イブリダイゼーション条件下で所定の時間インキュベー
トし、その後各混合物についてプローブのハイブリダイ
ゼーションアッセイを行う。
【０１１６】本発明の方法および手段は、本発明に従う
テスト方法を特徴づける次の記述によってより明確に理
解しうる。
【０１１７】ＲＮＡの検出および定量のための核酸ハイ
ブリダイゼーションテスト手順 好ましい検出法は、（ａ）迅速で、（ｂ）容易に使用で
き、（ｃ）高度に鋭敏で、（ｄ）１回の実験室アッセイ
で検出および定量できるものでなければならない。
【０１１８】Legionella属のメンバー由来のｒＲＮＡに
はハイブリダイズするが他の生物に由来するｒＲＮＡに
はハイブリダイズしない核酸プローブがあれば、核酸を
試料から精製する必要なく、例えばLegionella菌をたっ
た１回の実験室アッセイで検出並びに定量する迅速で使
用し易く鋭敏な溶液内検出テストが可能になる。
【０１１９】この溶液内ハイブリダイゼーションテスト
法の基礎的な面を、次に記述する。ここに記述する方法
はLegionella属のメンバーを検出するようになっている
が、その他の多くの生物群又はウィルスを検出する適当
なプローブを用いてこの同じテスト方法を使用できるこ
とは当然である。
【０１２０】段階１ 試料の調製 試料を、界面活性剤（洗浄剤）と蛋白分解酵素を含む溶
液と混ぜる。界面活性剤は細菌を溶解して細胞成分を可
溶化するのに役立ち、酵素は（その中には、ＲＮＡ及び
ＤＮＡを分解する酵素も含まれる）細胞蛋白質を破壊す
る。界面活性剤−酵素混合物の組成は、使用する界面活
性剤および蛋白分解酵素の種類並びに検査する試料の量
および種類によって定まる。使用される界面活性剤とし
ては、ラウリル硫酸ナトリウム、サルコシル、ツヴィッ
タージェント（Zwittergent ）があり、使用される酵素
としてはプロティナーゼＫおよびプロナーゼがある。非
常に種々様々の酵素、カオトロピック・エージェント
（chaotropic agents ）のような溶解補助剤を用いるこ
とができる。プローブは、試料に加える界面活性剤−酵
素混合物中に入っていてもよい。
【０１２１】酵素−界面活性剤は、試料中のLegionella
菌に非常に速かに作用する。大抵の場合は、ｒＲＮＡを
プローブとの溶液内ハイブリダイゼーションが可能にな
るようにするために混合物をインキュベートする必要は
ない。特定の場合には、短時間のインキュベーションが
必要である。
【０１２２】場合によっては、蛋白分解酵素を含ませる
必要がなく、界面活性剤のみでもｒＲＮＡとプローブと
の溶液内ハイブリダイゼーションが可能になる。
【０１２３】このアプローチにより、試料ｒＲＮＡを、
溶液内アッセイにおいてプローブとハイブリダイズし得
る状態にするための非常に迅速かつ容易な方法が得られ
る。その上、このアプローチによれば、試料ｒＲＮＡを
精製せずに溶液中でハイブリダイゼーションをおこすこ
とができる。この方法の鍵は、プローブがLegionellaｒ
ＲＮＡを検出するということである。ｒＲＮＡは細胞中
で１本鎖であり、リボソーム蛋白質がｒＲＮＡから除去
されればすぐにプローブとハイブリダイズする。これに
対して、ｒＲＮＡ ＤＮＡ（即ちｒＲＮＡの遺伝子）又
はその他のＤＮＡ配列を直接検出するためには、プロー
ブがＤＮＡとハイブリダイズする前に、２本鎖のｒＲＮ
Ａ遺伝子を分離させて２本の１本鎖にする操作を行わな
ければならない。
【０１２４】本発明者の知る限りでは、一般の生物又は
特定の群の生物の存否を検出して定量する目的でｒＲＮ
Ａ、ｔＲＮＡ、一般のＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとの
溶液内ハイブリダイゼーションが可能になるようにする
ために上記のような酵素−界面活性剤−試料法を用いた
先行技術はない。
【０１２５】段階２ ハイブリダイゼーションインキュ
ベーション混合物の調製 試料−酵素−界面活性剤混合物に、プローブとハイブリ
ダイゼーションをおこすのに十分な塩とを加え、生成し
た混合物を適当な温度でインキュベートする。塩濃度と
ハイブリダイゼーションインキュベーション温度の組合
せによって規準（criterion ）が決定される。インキュ
ベーション条件の規準は、プローブの選択の際に用いた
規準と等しくなければならない。さもないとプローブの
特異性が変化し得る。
【０１２６】インキュベーション混合物は、ハイブリダ
イゼーションがおこるのに十分な時間インキュベートし
なければならない。塩の種類および濃度により、達し得
るハイブリダイゼーション速度が決まる。例えば、或る
種の塩は適切な濃度で使用すると、非常に速いハイブリ
ダイゼーションをおこす。そのような塩の一例は燐酸ナ
トリウムである。Legionella特異的プローブを 3.0Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液（pH＝6.8 ）（以後ＰＢと記す）中
で精製Legionella rRNAと混ぜ７６℃でインキュベート
すると、0.72M NaCl、76℃という標準条件（これら二つ
の条件は規準としては等しい）下でインキュベートした
同量のLegionellaプローブおよびｒＲＮＡの場合より１
００倍以上速くハイブリダイズする。このハイブリダイ
ゼーション速度を上昇させるためにその他の塩を用いる
こともできる。この中には、大部分のナトリウム塩、ア
ンモニウム塩、ルビジウム塩、カリウム塩、セシウム
塩、リチウム塩が含まれる。
【０１２７】３ＭのＰＢ中７６℃で、Legionella特異的
プローブと、ＰＢ−酵素−界面活性剤−試料−プローブ
混合物中に存在するLegionella ｒＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーション速度も、標準インキュベーション条件で
見られるハイブリダイゼーション速度を１００倍以上上
まわる。標準塩濃度条件下でも、プローブと酵素−界面
活性剤−試料混合物中のｒＲＮＡとの間でハイブリダイ
ゼーションがおこる。
【０１２８】本発明の特徴の一つは、前にも指摘したよ
うに、生物のｒＲＮＡを検出することにより、非常に少
数の生物を検出することができるということである。こ
れは、各細胞中に多数のｒＲＮＡ分子が存在するために
可能なのである。Legionella様生物では、個々の細菌細
胞中に 5,000〜10,000個のｒＲＮＡ分子がある。核酸ハ
イブリダイゼーションで到達し得る検出感度を決定する
主な要因の一つは、達成することができるハイブリダイ
ゼーション速度である。ｒＲＮＡの検出と前述の加速イ
ンキュベーション条件の使用とを組み合わせると、非常
に少量の試料およびプローブの使用で非常に短い時間内
に細菌およびその他の生物を検出する極端に高い感度を
得ることができる。この実例を後に記す。
【０１２９】本発明者の知る限りでは、或る生物又は生
物群が存在するかどうかを、その生物のｒＲＮＡ、ｔＲ
ＮＡ、その他のＲＮＡ又はＤＮＡを検出することによっ
て決定するための溶液内ハイブリダイゼーションテスト
において上記のような加速系を使用した先行技術はな
い。又本発明者の知る限り、特定の生物又はウィルス又
は生物群又はウィルス群が存在するかどうかを、その特
定の生物又は生物群のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はその他の
ＲＮＡ又はＤＮＡを検出することによって決定するため
に、上記のような加速系と酵素−界面活性剤−試料−プ
ローブ混合物とを組み合わせて使用した先行技術もな
い。
【０１３０】段階３ インキュベーション混合物におけ
るプローブと標的ｒＲＮＡとのハイブリダイゼーション
のアッセイ 試料が標的ｒＲＮＡ分子（従って標的生物）を含んでい
るというシグナルは、インキュベーション混合物中にハ
イブリダイズしたプローブが存在することである。そこ
で、インキュベーションの終了後に、インキュベーショ
ン混合物中に、ハイブリダイズしたプローブがあるかど
うかアッセイしなければならない。そのようなアッセイ
は、簡単に行えて迅速であるのが好ましい。このアッセ
イのために、インキュベーション混合物をヒドロキシア
パタイト（ＨＡ）を用いて処理する。適切な条件下で、
ＨＡはｒＲＮＡと速かにかつ完全に結合するが、ハイブ
リダイズしてないプローブ分子とは結合しない。プロー
ブ分子が標的ｒＲＮＡ分子とハイブリダイズしているな
らば、プローブはｒＲＮＡに物理的に結合しているので
あるから、プローブもＨＡと結合する。
【０１３１】当該生物のｒＲＮＡの検出によって、生物
を検出することが本発明の特徴である。ＨＡが数秒でｒ
ＲＮＡ又は一般のＲＮＡに結合でき、プローブとは全然
結合しないという性質を利用することによって、フレキ
シビリティーが大きく、数分間しかかからず、しかも多
数の試料をうまく処理できるハイブリダイゼーションア
ッセイ法が開発できる。その上、試料−界面活性剤−酵
素−プローブインキュベーション混合物は、適当な緩衝
液で希釈し、直接処理してハイブリダイズしたプローブ
の存在をアッセイすることができる。
【０１３２】ＨＡは、プローブのハイブリダイゼーショ
ンをアッセイするために用いる物質として当業者に知ら
れている。ここに記載したアッセイ法は、先行技術によ
るＨＡの使用（Brenner et al., Analytical Biochem
(1969) 28、 477）に比べて遥かに有利であり、室温で
行うことができ、約１５℃から約９０℃までの温度範囲
で有効に機能する。必要な段階数は少なく、各遠沈段階
で加熱する必要がない。また、 Zwittergent（Calbioch
em，サンディエゴ、カリフォルニア）およびラウリル硫
酸ナトリウムのような界面活性剤の存在下でも不存在下
でも行うことができる。さらに、先行技術の方法より３
〜５倍も速く、１回のアッセイが３〜５分で行える。必
要なＨＡは約５分の１ですむ。アッセイの種類によっ
て、界面活性剤の濃度は０〜１０％の範囲で、燐酸塩濃
度は 0.1Ｍ〜 0.2Ｍの範囲で変え得る。またこの方法
は、多数の試料の処理にも容易に適用できる。
【０１３３】ＨＡ以外の方法も、プローブのハイブリダ
イゼーションアッセイに使用できる。これらには、Ｓ1
酵素法のような酵素アッセイ、サイズ分離法、そして種
々の試料固定化法が含まれる。ここに言うプローブは、
ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
アッセイを行うこれらの方法およびその他の方法と共に
効果的に用いることができる。
【０１３４】群特異的ｒＲＮＡプローブの調製方法 群特異的プローブをつくるには、種々のアプローチをと
ることができる。これらのアプローチは、１つを除いて
すべて、群特異的プローブ配列を同定して精製するため
に種々の核酸ハイブリダイゼーション法を使用する。
【０１３５】方法 Ａ 群特異的ｒＲＮＡプローブをつくる最も有用な方法は、
組換えＤＮＡ技術を用いることである。この方法に含ま
れる段階は次の通りである。（標準ＤＮＡ組換え技術の
詳細は、Molecular Cloning ，A Laboratory Manual ，
T. Maniatis 等、Cold Spring Harbor Publication（19
82）に記されている。） （１）対象とする特定の生物から核酸を単離する。標準
的単離法を用いる。
【０１３６】（２）この単離したＤＮＡを用いて、この
生物のｒＲＮＡ遺伝子をクローン化し、Maniatis等（上
掲）が示した標準的ＤＮＡ組換え技術を用いてリボソー
ム遺伝子ＤＮＡを大量につくる。
【０１３７】（３）制限酵素を用いてｒＲＮＡ遺伝子Ｄ
ＮＡを短い断片にし、ついで、Maniatis等（上掲）が示
した標準的ＤＮＡ組換え法を用いてこれら短いＤＮＡ断
片のライブラリーをつくる。
【０１３８】（４）ライブラリーをスクリーニングし
て、対象とする生物の分類学上の種に属する他の生物の
ｒＲＮＡにのみハイブリダイズする短いｒＲＮＡ遺伝子
配列を含むクローンを同定する。このクローンを単離す
る。このクローンは、対象とする生物が属する特定の種
のｒＲＮＡにのみ相補的な種特異的ＤＮＡ配列を含む。
【０１３９】ライブラリーを更にスクリーンし、次のク
ローンを同定し、単離する。
【０１４０】(a) 対象とする生物が属する分類学上の
属の生物に由来するｒＲＮＡにのみハイブリダイズする
ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含むクローン。
【０１４１】(b) 対象とする生物が属する分類学上の
目の生物に由来するｒＲＮＡにのみハイブリダイズする
ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含むクローン。
【０１４２】(c) 対象とする生物が属する分類学上の
科の生物に由来するｒＲＮＡにのみハイブリダイズする
ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含むクローン。
【０１４３】(d) 対象とする生物が属する分類学上の
綱の生物に由来するｒＲＮＡにのみハイブリダイズする
ｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列を含むクローン。
【０１４４】(e) できるだけ多くの異なる生体に由来
するｒＲＮＡにハイブリダイズするｒＲＮＡに相補的な
ＤＮＡ配列を含むクローン。
【０１４５】上述のクローン選択の図式は、多数の可能
な図式の一つに過ぎない。
【０１４６】Maniatis等（前出）が論じた標準的クロー
ニングおよびスクリーニング法が用いられる。
【０１４７】（５）(a) 各クローンのＤＮＡを大量に生
産する。各クローンのＤＮＡから、ｒＲＮＡに相補的な
ＤＮＡ配列だけを単離して精製する。このためには、例
えばManiatis等の方法のような多くの既存法の中から一
方法を選んで行う。
【０１４８】(b) 場合によっては、クローン中に存在
する全ＤＮＡがプローブとして有用である。このような
場合には、クローニングベクターから単離した全ＤＮＡ
を用いる。
【０１４９】(c) 別のある場合には、ｒＲＮＡに相補
的なＤＮＡ配列を含むクローニングベクターの１本鎖Ｄ
ＮＡが、プローブとして用いられる。そのような場合に
は、Maniatis等が記載したような多くの方法の中の一つ
を用いて、この鎖を単離して精製しなければならない。
【０１５０】（６）(5a)(5b)(5c)で得られたプローブＤ
ＮＡには、アッセイ混合物中で同定できるように、何ら
かの方法で標識をつけなければならない。多くの種類の
マーカーを用いることができるが、最もよく使われるマ
ーカーは放射能である。その他のものとして、螢光、酵
素、ビオチンがある。ＤＮＡにマーカーをつけるために
は、Maniatis等（前出）が示したような標準法が用いら
れる。
【０１５１】（７）クローニングベクターにある群特異
的ｒＲＮＡ遺伝子配列は、２本鎖の状態で存在する。こ
れらの鎖の１本はｒＲＮＡに相補的であってそれとハイ
ブリダイズする。もう１本の鎖は、ｒＲＮＡにはハイブ
リダイズしないが、ｒＲＮＡに相補的な標識群特異的配
列を作成するのに用いることができる。このためには、
ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼおよび標識された核酸前
駆体分子を利用する。この酵素はその標識前駆体を利用
し、鋳型としてそのＤＮＡ鎖を用いてＤＮＡ又はＲＮＡ
を合成する。新たに合成された標識分子はｒＲＮＡに相
補的であり、群特異的プローブとして用いることができ
る。鋳型ＤＮＡは種々の確立された手段によって除去す
ることができ、１本鎖の標識核酸のみが残る。これは、
Maniatiset al.（前出）および Taylor 等の論文Bioch
emica & Biophys. Acta (1976) 442 , 324 に記載され
ている。
【０１５２】方法 Ｂ いくつかの酵素は、全ｒＲＮＡ配列に相補的な標識ＤＮ
Ａを合成するための鋳型として任意の起源のｒＲＮＡを
利用することができる。特定種類の生物のｒＲＮＡのみ
に相補的な群特異的配列は、ハイブリダイゼーション選
択プロセスによって単離することができる。合成した標
識ＤＮＡのうち、特定の種類の生物のメンバー由来のｒ
ＲＮＡのみにハイブリダイズするものは、標準的ハイブ
リダイゼーション法によって単離できる。このプロセス
の一例を後に記す。このようなプローブは、方法Ａに記
述したようにクローン化するのに十分な量で作成するこ
とができる。このクローンの塩基配列は標準法によって
決定でき、その配列は、標準法を使用する化学的合成に
よってプローブを調製するために用いることができる。
【０１５３】方法 Ｃ 種々異なる生物から得たｒＲＮＡのヌクレオチド配列が
すでに決定されている。特定の生物群に類似している群
特異的配列は、これら既知の配列を比較することによっ
て同定できる。その後、この群特異的ｒＲＮＡ配列に相
補的な配列を、標準法によって化学合成して標識するこ
とができる。
【０１５４】ｔＲＮＡに相補的な特異的プローブの調製 特異的ｔＲＮＡプローブを作るためにはいろいろなアプ
ローチをとることができ、ｒＲＮＡプローブ作成のため
の上記基本的アプローチを、ｔＲＮＡプローブ調製のた
めに用いることができる。個々のｔＲＮＡ種および遺伝
子を単離するためには標準法が利用でき、これは当業者
には公知である。プローブの形態はＤＮＡでもＲＮＡで
もよく、プローブの長さは１２〜数千塩基にできる。プ
ローブは、それが特異的である核酸（即ち標的核酸）に
完全に相補的である必要はない。また、プローブの全長
が標的分子に相補的である必要はない。
【０１５５】ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｐ
ｓＲＮＡに相補的な特異的プローブの調製 ｒＲＮＡに相補的な特異的プローブを作成するのに用い
た同じ基本的アプローチを用いて特定種類のｍＲＮＡ、
ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡに対して特異的
なプローブを調製することができる。それぞれの種類の
ＲＮＡを単離し、それを更に分画する方法は当業者には
公知である。ここでも、プローブの形態はＤＮＡでもＲ
ＮＡでもよく、プローブの長さは、約１２〜数千塩基の
範囲で変えられる。また、プローブの相補的領域は標的
核酸に完全に相補的である必要はなく、プローブの全長
が標的分子に相補的である必要はない。
【０１５６】試料核酸の単離 先行技術の標準法を用いて、アッセイすべき試料から核
酸を単離することができる。核酸の単離および精製の標
準法の一つを後述の実施例で示す。これは、 Maniatis
et al.（前出）も論じられている。
【０１５７】精製段階を行うことなく核酸を溶液内ハイ
ブリダイゼーションに使用可能にする新しい技法を次に
述べる。
【０１５８】核酸ハイブリダイゼーションの実施 標識プローブの適当量を試料核酸と混ぜる。この混合物
を特定の塩濃度に調節する（普通はNaClが使われる）。
混合物全体を一定温度で一定時間インキュベートする。
この時間の終りに、混合物をハイブリダイゼーションア
ッセイにより分析する。核酸ハイブリダイゼーションを
おこす塩、溶媒、核酸濃度、容量、温度の多数の異なる
組み合わせが存在する。好ましい組み合わせは、そのア
ッセイの実施状況による。しかし重要なことは、ハイブ
リダイゼーション段階の基準（「定義」参照）が群プロ
ーブを同定し選択する時に用いた基準と一致することで
ある。もし、ハイブリダイゼーション段階の基準が異な
るならば、プローブの特異性は変るかも知れない。Brit
ten とKohne 「Repeated Sequences in DNA 」Science
(1968) 161，p.529 、WetmurとDavidson「Kinetics of
Renaturation of DNA 」J. Mol. Biol. (1968) 31，p.
349 、Kohne とBritten 「Hydroxyapatite Techniques
for Nucleic Acid Reassociation」、HarperとRow 、
「核酸研究法」（1971）Cantoni & Davies編、２巻， 5
00ページ参照。
【０１５９】ハイブリダイゼーション混合物中のプロー
ブおよび試料核酸の量に関して、２つの異なるアプロー
チが用いられる。その一つ、過剰プローブ法では、試料
核酸（この場合ＲＮＡ）より多量のプローブが存在す
る。もう一つの方法、過剰ＲＮＡ法では、プローブより
多量のｒＲＮＡが存在する。過剰プローブ法は、未知の
試料中のＲＮＡの存在を検出するすぐれた方法であり、
以下に述べるようないくつかの利点を有する。この二つ
のアプローチの詳細については後記表１および２を参照
されたい。過剰プローブ法を用いると、もし適切なＲＮ
Ａプローブが使えるならば、検出および定量は一回の実
験室アッセイで行なうことができる。ハイブリダイゼー
ションが完了したなら、ハイブリダイズしたプローブの
量が試料中に存在するＲＮＡ量の直接の尺度となる。
【０１６０】プローブが少しでもハイブリダイズすると
いう事実はＲＮＡが存在することを示しており、ハイブ
リダイズしたプローブの量は試料中にあるＲＮＡの量を
示す。
【０１６１】ハイブリダイゼーションが或る既知の時間
内に完了したことを確めることは、ＲＮＡの定量のため
に重要である。これは、ハイブリダイゼーションが所定
の時間内に確実に完了するように十分な量のプローブを
加えることによって、容易に達成される。プローブを多
く加えれば加える程、ハイブリダイゼーションが速く完
了する。このように、過剰プローブ法は、ハイブリダイ
ゼーションを確実に完了させ、これがいつおこったかを
知る手段を提供する。
【０１６２】これに対して、過剰ｒＲＮＡ法を用いる
と、一回の実験室アッセイではＲＮＡの検出および定量
が行えない。過剰ＲＮＡ法では、いつテストポイントを
とるべきかを予想することができない。少量のＲＮＡを
含む未知の試料は、多量のＲＮＡを含む試料よりずっと
ゆっくりハイブリダイズする。
【０１６３】ハイブリダイゼーションアッセイ 特定の群のＲＮＡが試料中に存在するというシグナル
は、２本鎖標識プローブの存在である。文献中でよく論
じられている多くの種々の方法が、ハイブリダイゼーシ
ョン混合物中の２本鎖型の標識プローブの存在をアッセ
イするのに用いられる。方法の選択は、ハイブリダイゼ
ーション段階のために選ばれた方法、ハイブリダイゼー
ション混合物の組成、プローブ上のマーカーの種類およ
びその他の要因に依存する。一般に用いられる方法の一
つを後述する。ここでも又、WetmurとDavidson、Kohne
とBritten 、およびThomas等の文献（前出）も参照され
たい。又、Flavell 等の論文「Eur.J.Biochem.」(1974)
47，p.535 ）、Maxwell 等の論文「Nucleic Acids Re
search」(1978), 5,2033ページも参照されたい。
【０１６４】しかし、すべての場合に重要なことは、ハ
イブリダイゼーション反応のために用いたと同じ基準
か、ハイブリダイゼーションがおこり得ない基準のどち
らかでアッセイを行うことである。
【０１６５】核酸ハイブリダイゼーションによる核酸配
列の定量 試料中にある核酸の量は、当業者によく知られている方
法を用いて核酸ハイブリダイゼーションによるいくつか
の方法で測定することができる。２つの方法を、ｒＲＮ
Ａの定量例により後に開示する。
【０１６６】本発明の方法は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む
生物の存否を決定することが必要な場合に広く一般に用
いられ、喀痰、血清、その他の動物体液および組織のよ
うな生物学的試料や、工業的または製剤的試料および水
にも適用できるものと理解されたい。このアプローチの
詳細はＲＮＡを定量するのかＤＮＡを定量するのかによ
って変るが、一般的アプローチはＤＮＡ、ＲＮＡ両方共
同じである。
【０１６７】表 １ 過剰プローブ法 プローブ：プローブは、Ｂ群細菌の生物に由来する特異
的な選択された標識配列である。これはｒＲＮＡの塩基
配列の１０％に相当し、Ｂ群細菌由来のｒＲＮＡと完全
にハイブリダイズするが、その他の生物由来のｒＲＮＡ
とはハイブリダイズしない。プローブは、それ自身とは
ハイブリダイズしない。
【０１６８】Ａ．陽性同種対照 (1) プローブ 0.1μｇ＋試料Ｂ群 rRNA 10-3μｇ (2) 完結するまでハイブリダイズさせ、２本鎖プローブ
をアッセイする。
【０１６９】(3) (a) プローブの１％が２本鎖分子を形
成する。
【０１７０】(b) これはｒＲＮＡ試料の直接の尺度であ
る。ハイブリダイズしたプローブ分子の数は存在するｒ
ＲＮＡ分子の数と等しい。
【０１７１】Ｂ．異種対照 (1) プローブ 0.1μｇ＋試料ヒト rRNA 10-3μｇ (2) 完結するまでハイブリダイズさせ、２本鎖プローブ
をアッセイする。
【０１７２】(3) プローブは、Ｂ群細菌に由来するｒＲ
ＮＡ以外のいかなるｒＲＮＡともハイブリダイズしな
い。
【０１７３】Ｃ．未知の試料 (1) プローブ 0.1μｇ＋未知の試料 (2) 完結するまでハイブリダイズさせ、２本鎖プローブ
をアッセイする。
【０１７４】(3) (a) Ｂ群のｒＲＮＡがなければ、プロ
ーブはハイブリダイズしない。
【０１７５】(b) Ｂ群のｒＲＮＡがあるとプローブはハ
イイブリダイズして２本鎖分子を形成する。
【０１７６】(c) ハイブリダイズしたプローブ分子の数
は、試料中にあるＢ群ｒＲＮＡ分子の数と等しい。
【０１７７】(d) プローブの１％がハイブリダイズした
ら、Ｂ群ｒＲＮＡが存在することになる。なぜならば、
プローブはＢ群細菌に由来するｒＲＮＡのみとハイブリ
ダイズするように選択されているからである。プローブ
はＢ群ｒＲＮＡのみとハイブリダイズするから、他のｒ
ＲＮＡが存在していても、存在する細菌ｒＲＮＡの検出
又は定量を妨害しない。
【０１７８】(e) 選択されたプローブを使用すると、ハ
イブリダイゼーションの完了が容易に確保される。ｒＲ
ＮＡ配列の10％に当たる選択されたプローブは、全ｒＲ
ＮＡ配列に相当するプローブより１０倍速くハイブリダ
イズする。
【０１７９】(f) 一般のｒＲＮＡの検出は不可能であ
る。なぜならば、プローブはＢ群ｒＲＮＡとのみハイブ
リダイズするからである。Ｂ群ｒＲＮＡの検出感度は極
めて高い。
【０１８０】Ｄ．要 約 過剰プローブ法は、Ｂ群生物を検出し、定量するのに一
回のアッセイだけで良い。
【０１８１】表 ２ 過剰ｒＲＮＡ法：選択されたプローブの使用 プローブ：プローブは、Ｂ群細菌に由来する特異的な選
択された標識配列であってＢ群生物のｒＲＮＡ塩基配列
の１０分の１に相当する。このプローブはＢ群由来のｒ
ＲＮＡとは完全にハイブリダイズするが、他の生物由来
のｒＲＮＡにはハイブリダイズしない。プローブは、そ
れ自身とはハイブリダイズしない。
【０１８２】Ａ．陽性同種対照 (1) 試料Ｂ群rRNA 0.1μｇ＋プローブ10-3μｇ (2) ハイブリダイゼーションを完結させ、２本鎖プロー
ブをアッセイする。
【０１８３】(3) (a) ハイブリダイズするプローブの割
合は、ｒＲＮＡとプローブとの間の類似性の直接の尺度
である。この場合、プローブの 100％がハイブリダイズ
し得る。
【０１８４】(b) このパーセントは、存在するｒＲＮＡ
の量の尺度ではない。これを測定するためには、反応の
動態を調べなければならない。
【０１８５】Ｂ．異種対照 (1) 試料ヒトrRNA 0.1μｇ＋プローブ10-3μｇ (2) ハイブリダイゼーションを完結させ、２本鎖プロー
ブをアッセイする。
【０１８６】(3) プローブは、非細菌性ｒＲＮＡとはハ
イブリダイズしない。
【０１８７】Ｃ．未知の試料 (1) 試料＋プローブ１０-3μｇ (2) ハイブリダイゼーションを完結させ、２本鎖プロー
ブをアッセイする。
【０１８８】(3) (a) 試料中にＢ群ｒＲＮＡが存在しな
ければ、プローブはハイブリダイズしないこととなる。
【０１８９】(b) Ｂ群ｒＲＮＡが存在するならば、プロ
ーブはハイブリダイズする。
【０１９０】(c) 反応が完了した時のハイブリダイゼー
ション率（％）からはｒＲＮＡ量を決めることができな
い。これを決めるためには、ハイブリダイゼーションの
動態を測定しなければならない。プローブは唯一種類の
ｒＲＮＡとハイブリダイズするから、動態測定は簡単で
ある。
【０１９１】(d) プローブの 100％が試料とハイブリダ
イズするならば、これはＢ群ｒＲＮＡが試料中にあるこ
とを意味する。このことは、Ｂ群ｒＲＮＡのみが存在す
ることを意味するものではない。プローブとハイブリダ
イズしない他のｒＲＮＡも試料中に存在するかもしれな
い。
【０１９２】(e) プローブの 100％が試料とハイブリダ
イズしたら、試料ｒＲＮＡとプローブのハイブリダイゼ
ーションの動態を測定することにより、ヒトｒＲＮＡの
存在下のＢ群ｒＲＮＡを特異的に定量することが可能で
ある。プローブはＢ群ｒＲＮＡのみとハイブリダイズす
るので動態反応の要素はＢ群ｒＲＮＡとの反応に由来す
る１つのみである。
【０１９３】(f) ハイブリダイゼーションが完了しない
状況もある。この方法においては、プローブが非常に少
量しか存在しないから、試料中のｒＲＮＡがハイブリダ
イゼーションを完了させなければならない。試料中に十
分量のｒＲＮＡが存在しなければ、ハイブリダイゼーシ
ョンは完了しない。そのような状況の解釈を次に述べ
る。
【０１９４】通常のアッセイ時間で未知試料とプローブ
が20％ハイブリダイズするとしたら、一回のみで反応が
完了したとは言えない。ハイブリダイゼーション値が高
まるかどうか測定するために、最初の時間の２倍の時間
をかける必要がある。ハイブリダイゼーション値が増加
しなければ、ハイブリダイゼーションは完了である。こ
の場合、試料中のｒＲＮＡ濃度はプローブが過剰になっ
てしまうくらいに低く、試料中に存在するｒＲＮＡ分子
数はハイブリダイズしたプローブ分子数と等しい。
【０１９５】ハイブリダイゼーション値が高まれば、ハ
イブリダイゼーションは最初の時点では完了していなか
ったのである。この時点で反応が終了したのかどうか決
定するには第３回目を実施しなければならない。
【０１９６】Ｄ．要 約 過剰試料ｒＲＮＡ法は、検出し、定量するために多数回
の測定を必要とし、過剰プローブ法よりも時間がかか
る。
【０１９７】特定の起源から得たｒＲＮＡ配列の特定の
部分のみに相補的な選定プローブを使用してｒＲＮＡを
検出することと、特定の起源から得たｒＲＮＡ配列の全
体に相補的な非選定プローブを使用してｒＲＮＡを検出
することとの対比 ｒＲＮＡを検出し、定量し、同定するためにｒＲＮＡ配
列の特定の部分のみに相補的な特別に選択したプローブ
を使用する場合の本発明は、ｒＲＮＡを検出するために
全ｒＲＮＡ配列に相補的な（特別には）選択されていな
いプローブ又は配列を使用する場合の本発明と比べて、
重要な能力と利点を有する。過剰ｒＲＮＡ及び過剰プロ
ーブを用いるハイブリダイゼーション法で、選択された
プローブを使用することの利点を下記に示す。配列全体
を利用するプローブを使用することの問題も示した。
【０１９８】過剰プローブハイブリダイゼーション及び
過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーションに関して、配列全
体に対応するプローブを用いる場合と比較して、選択し
たプローブを用いることの利点を下記に示す。
【０１９９】Ａ．過剰プローブハイブリダイゼーション
法 １．全配列に対応するｒＲＮＡプローブについての問題
点 1) 過剰プローブ法によって試料中のｒＲＮＡを検出す
ることはできる。しかし、存在するｒＲＮＡの型を決定
する手段はない。従って、このプローブは、過剰プロー
ブハイブリダイゼーション法によって未知試料中の特定
ｒＲＮＡの存在を特異的に検出し、定量するためには使
えない。
【０２００】2) 上述のように、このプローブで試料中
の特定のｒＲＮＡの存在を検出し定量するためには、過
剰プローブ法は使えない。この目的のためには、このプ
ローブは過剰ｒＲＮＡ法で使用しなければならない。
【０２０１】過剰ｒＲＮＡ法は過剰プローブ法よりずっ
と多くの時間と作業を必要とし、複雑である。
【０２０２】２．選択されたプローブを使用することの
利点 1) 選択されたプローブ過剰ハイブリダイゼーション法
によって未知試料中の特定ｒＲＮＡの存在を敏感かつ特
異的に検出し、定量するために使用することができる。
これは他の生物のｒＲＮＡが存在していても一回の実験
室アッセイで行いうる。
【０２０３】2) 選択されたプローブを使用すると、未
知試料中の特定のｒＲＮＡの存在を検出して定量するた
めに、過剰プローブ法を使用することができる。このこ
とは仕事を非常に単純化する。
【０２０４】Ｂ．過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーション
法 １．全配列に対応するプローブについての問題点 1) このプローブを用いて未知試料中のｒＲＮＡを検出
することはできる。しかし、多くの場合、存在するｒＲ
ＮＡの型又は量を決定するための手段はない。従って、
このプローブは、未知試料中の特定のｒＲＮＡの存在を
特異的に検出し、定量するためには使えない場合が多
い。
【０２０５】2) 特定のｒＲＮＡを検出する感度は他の
生物のｒＲＮＡが存在することにより限定される場合が
多い。
【０２０６】3) 特定のｒＲＮＡの存在を検出し、定量
することが可能な多くの場合、この方法では多くの作業
が必要となる。
【０２０７】２．選択されたプローブを使用することの
利点 1) 選択されたプローブは、全ての状況で未知試料中の
特定ｒＲＮＡの存在を特異的に検出し、定量するために
用いることができる。これは他の生物のｒＲＮＡが多量
に存在していても実施できる。
【０２０８】2) 選択されたプローブを用いると、他の
生物のｒＲＮＡが存在していても、特定のｒＲＮＡの検
出感度は下がらない。
【０２０９】3) 選択されたプローブを用いると特定ｒ
ＲＮＡの検出と定量がずっと容易になる。
【０２１０】実施例による具体的説明 試料が特定の群のメンバーの菌を含むかどうかを決定す
るために、本発明は使用できる。下記に具体的に示す本
発明方法は、特定の群のメンバーでない多数の生物が存
在しても試料中の特定の群の細菌の存在を検出し、定量
化し得る方法である。
【０２１１】実施例に記載されているように、本発明の
方法は、先ず特定の基準においては、関心のある特定群
のどのメンバーからのｒＲＮＡともハイブリダイズ化す
るが他の生物から得られたｒＲＮＡとはハイブリダイズ
化しない一群の特異的ｒＲＮＡプローブを調製すること
である。核酸ハイブリダイゼーション試験にそのような
プローブを使用すると、他の生物が多量に存在しても特
定群のメンバーを検出できる。
【０２１２】下記に本発明の実施例を示す。各々の例
は、特定群の生物のＲＮＡとのみハイブリダイズする標
識核酸プローブを調製することを含む。
【０２１３】各々のプローブを調製する方法の基礎的な
概略は次の通りである。
【０２１４】1) 関心のある群のｒＲＮＡに相補的な標
識核酸を調製する。
【０２１５】2) このＤＮＡをプローブが特異的な生物
群に進化的に非常に近接した生物群から得たｒＲＮＡと
ハイブリダイズ化し、特異的な基準下では最も近接した
関連群の生物から得たｒＲＮＡとはハイブリダイズ化し
ない標識核酸フラクションを選択する。このフラクショ
ンは関心ある生物群のｒＲＮＡに特異的であり、多くの
近接した群又は他の生物から得たｒＲＮＡとはハイブリ
ダイズしない。
【０２１６】
【実施例】実施例１ いかなる細菌のｒＲＮＡともハイブリダイズするプロー
ブの調製 代表的な状況では、組織培養用プレート上１回に１０6
〜１０7 個の哺乳動物の細胞が成育する。細菌、特に M
ollicutes 網のメンバーは組織培養細胞を汚染する。他
の多くの細菌と異なり、Mollicutes網の細菌は抗生物質
によっては容易に除去されず、組織培養上の困難な汚染
菌である。組織培養細胞中に多くの Mollicutes 種も検
出されてきた。組織培養用プレートにこれらの生物が１
個でも存在すれば、抗生物質が存在しても、増殖し、細
胞あたり数百個の生物が作られる可能性がある。そのよ
うな生物は細胞の活性を変化させる能力があり、その
際、多くの試験結果と組織培養の市場性に影響する。
【０２１７】これらの生物を検出するための先行技術
は、増殖試験、鑑別染色試験及び免疫学的アッセイのよ
うな基本的に定性的な試験を含んでいる。
【０２１８】増殖試験の感受性はきわめて高いが、３〜
６週間かかる。増殖試験は、多くの生物は増殖が困難で
あるか又は不可能であるという別の不便さもある。
【０２１９】染色法の実際の検出上の感度は知られてい
ないが、細胞あたり数個以上の生物が存在しているはず
であることが知られている。
【０２２０】免疫学的試験は定性的であり、特定の種に
対する抗体を用いる。免疫学的試験は迅速に行なうこと
ができるが感度は高くない。さらに、全てのタイプの M
ollicutes を検出するためには、多くの異なる抗体が必
要である。
【０２２１】下記に示される本発明方法の実施はMollic
utesを含む全ての細菌群の菌の存在を検出し、定量し、
組織培養中Mollicutesの存在を検出し、通常は細菌を含
まない組織中の細菌の存在を検出し、多数の哺乳動物の
細胞が存在しても細菌を検出するために用いる試験であ
る。
【０２２２】実施例に示すように、本発明方法は先ず第
１に何らかの細胞由来のｒＲＮＡに相補的であるが、哺
乳類細胞のｒＲＮＡには相補的でない特異的ｒＲＮＡプ
ローブを作ることを含む。核酸ハイブリダイゼーション
テストにおけるそのようなプローブの使用は、多量の哺
乳類細胞の存在下でもあらゆるタイプの細菌の検出を可
能にする。
【０２２３】次に、本発明のこの実施例の詳細をあげ
る。
【０２２４】哺乳類細胞および細菌細胞からのｒＲＮＡ
の分離 哺乳類細胞を、 0.3M NaCl、0.02M トリスpH＝7.4 に再
懸濁する。サルコシルを最終濃度１％になるように加え
て、細胞を溶解する。
【０２２５】溶解後直ちに、フェノール／クロロホルム
１／１混液を同量加え、生成した混液を２分間烈しく振
盪する。その後、混液を遠沈し（8000×ｇ、10分間）水
相と有機相とを分離する。水相を回収し、これに又別の
フェノール／クロロホルムの同量を加える。
【０２２６】上のように振盪、遠沈した後、水相を再び
回収する。これに２倍量の９５％エタノールを加え、こ
の混合物を−２０℃で２時間放置して、核酸の沈澱を容
易ならしめる。
【０２２７】それから、混合物で遠沈し（8000×ｇ、１
０分間）、沈降物をチューブの底に沈澱させる。液は除
去する。ペレットとなった核酸を水に再溶解する。この
溶液に、その後、 0.2M NaCl、 5×10-3M MgCl2 、 5×
10-3M CaCl2 、0.02M トリス（pH＝7.4 ）５０マイクロ
グラム／mlのデオキシリボヌクレアーゼＩを加え、３７
℃で１時間インキュベートする。
【０２２８】それから、上のように、等量のフェノール
／クロロホルムを加えて振盪する。上記のように遠沈し
水相を回収する。エタノールは、上記のようにＲＮＡを
沈澱させる。上記のように沈降物を遠沈し、ペレットＲ
ＮＡを水に再溶解する。
【０２２９】この溶液を 2M LiClにする。そして４℃で
１０〜２０時間放置し、高分子量ＲＮＡの沈澱を容易に
する。それからこの溶液を遠沈し、沈殿物を収集し、水
に再溶解する。
【０２３０】このＲＮＡ標本は、９５％以上のｒＲＮＡ
を含む。
【０２３１】細菌のｒＲＮＡは、下記の事項を除けば、
同様にして分離される。界面活性剤のみでは細菌が溶解
されない場合、その他の手段を用いる。これには一般的
には、細菌がサルコシルによる溶解を受けやすくするた
めに細菌を酵素（リゾチーム）で前処理すること等であ
る。細菌溶解後は、分離操作は前述の通りである。
【０２３２】精製ｒＲＮＡを、−７０℃で貯える。
【０２３３】モレキュート綱生物のｒＲＮＡに相補的な
放射性ＤＮＡ（ 3 Ｈ−ｃＤＮＡ）の調製 Mycoplasma hominis（M. hominis種）（分類学的には、
モレキュート綱のメンバーである）に由来するｒＲＮＡ
を鋳型として用いて、マイコプラズマ・ホミニスｒＲＮ
Ａに相補的な放射性ｃＤＮＡを合成する。
【０２３４】このｃＤＮＡは、鋳型としてｒＲＮＡを利
用し、ｒＲＮＡに相補的な（ｃＤＮＡ）、 3Ｈ−ｃＤＮ
Ａをつくることができる逆転写酵素の性質を利用するこ
とによって生産される。
【０２３５】逆転写酵素反応混合物は、次のものを含
む。
【０２３６】５０mMトリス・HCl(pH＝8.3)，8mM MgC
l2 , 0.4mM ジチオトレイトール、50mMKCl, 0.1mM 3H-
デオキシチミジン三燐酸 (50 curies/mmole) 0.2 mM デ
オキシアデノシン三燐酸、0.2mM デオキシシチジン三燐
酸、0.2mM デオキシグアノシン三燐酸、Ｅ．coliＤＮＡ
からつくられたオリゴデオキシリボヌクレオタイドプラ
イマ２００ミリグラム／ml、５０マイクログラム／mlの
マイコプラズマ・ホミニスｒＲＮＡ、５０単位／mlＡＭ
Ｖの逆転写酵素。
【０２３７】この混合物を、４０℃で３０分間インキュ
ベーする。それからに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）（pH＝7.3 ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、ＮａＣｌおよびグリコーゲンを最終濃度がそれぞ
れ10-2M, 1%, 0.3M, 100μｇ／mlになるように加える。
【０２３８】その溶液を、フェノール／クロロホルム
（１：１）の１容量と混合し、２分間烈しく振盪し、そ
れから遠沈して（8000×ｇ，１０分間）、水相を回収す
る。
【０２３９】2.5 容量の９５％エタノールを加えて、核
酸を沈澱させる。遠沈により沈澱物を回収し、Ｈ2 Ｏに
再溶解する。この溶液は、鋳型ｒＲＮＡと新たに合成さ
れた3Ｈ−ｃＤＮＡとを含む。
【０２４０】この溶液をそれから 0.3M NaOHにして、５
０℃で４５分間インキュベートする。水冷し、 0.3M HC
l で中和する。それに2.5 容量の９５％エタノールを加
えて、残る核酸を沈澱させ、生成した沈澱を水に再溶解
する。
【０２４１】この溶液を、0.3M NaCl, 0.1% サルコシル
で平衡状態にしたSephadex G-100カラムを通過させ、出
てきた液を回収した。この液をエタノールで沈澱させ、
生成した沈澱物を少量の水に溶解する。
【０２４２】ここで述べたプロセスは、鋳型ｒＲＮＡと
3Ｈ−ｃＤＮＡ製造に由来するその他の前駆物質を除去
するためのものである。
【０２４３】それから 3Ｈ−ｃＤＮＡをマイコプラズマ
・ホミニスｒＲＮＡにハイブリダイズする。これは、そ
れが本当にこのｒＲＮＡに相補的であることを確認する
ためである。
【０２４４】このハイブリダイゼーション混合物は、１
mlにつき0.05マイクログラム１本鎖3Ｈ−ｃＤＮＡ、２
０マイクログラムのマイコプラズマ・ホミニスｒＲＮＡ
そして、0.48M ＰＢ（燐酸緩衝液）から成る。この混合
物を６５℃で0.2 時間インキュベートし、それから0.14
M ＰＢに希釈して0.14M ＰＢで平衡状態にしたヒドロキ
シアパタイト（ＨＡ）カラムに６５℃で通過させる。
【０２４５】ｒＲＮＡにハイブリダイズした 3Ｈ−ｃＤ
ＮＡはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに吸着し、
非ハイブリダイズ 3Ｈ−ｃＤＮＡはカラムを通過する。
その後ＨＡカラムを 0.3M ＰＢで溶出して、ハイブリダ
イズ 3Ｈ−ｃＤＮＡを回収する。
【０２４６】このフラクションをその後透析してＰＢを
除去し、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、遠沈
し、核酸を水に再溶解する。この溶液を上記のようにＮ
ａＯＨで処理し、ｒＲＮＡを取り除く。
【０２４７】中和し、グリコーゲン担体を添加し、エタ
ノール沈澱による濃縮後、 3Ｈ−ｃＤＮＡを少量の水に
再溶解する。この溶液は、マイコプラズマ・ホミニスｒ
ＲＮＡに相補的な 3Ｈ−ｃＤＮＡのみを含む。
【０２４８】マイコプラズマ・ホミニスには相補的で、
ヒトｒＲＮＡには相補的でない 3 Ｈ−ｃＲＮＡの選択 精製 3Ｈ−ｃＤＮＡを、これを大過剰のヒトｒＲＮＡ
と、ハイブリダイズすることにより更に分画化する。こ
のハイブリダイゼーション混合物は、0.48M ＰＢ１mlあ
たり、0.05マイクログラム 3Ｈ−ｃＤＮＡと４０マイク
ログラムヒトｒＲＮＡとから成る。
【０２４９】これを、６８℃で１時間インキュベート
し、0.14M ＰＢに希釈し５５℃、0.14M ＰＢで、平衡状
態にしたＨＡを通す。ＨＡに吸着しないフラクション
（全体の約５０％）（即ちヒトｒＲＮＡにハイブリダイ
ズしない 3Ｈ−ｃＤＮＡ）を収集する。
【０２５０】このフラクションを同じ条件で新しいＨＡ
カラムを再び通過させる。ここでも、吸着しないフラク
ションを集める。このフラクションを透析してＰＢを除
き、エタノールで沈澱させて核酸を濃縮し、水に再溶解
する。この溶液を既述のようにＮａＯＨで処理し、ヒト
ｒＲＮＡを除去する。
【０２５１】中和し、グリコーゲン担体を添加し、エタ
ノール沈澱による濃縮後、 3Ｈ−ｃＤＮＡを少量の水に
再溶解する。この 3Ｈ−ｃＤＮＡ標本は、マイコプラズ
マ・ホミニスｒＲＮＡには相補的であるが、ヒトｒＲＮ
Ａには相補的でない。
【０２５２】選択 3 Ｈ−ｃＤＮＡと、異なる期限からの
ｒＲＮＡとのハイブリダイゼーション 選択 3Ｈ−ｃＤＮＡプローブの調製は、核酸ハイブリダ
イゼーションにより細菌ｒＲＮＡの存在を検出すること
によって哺乳類組織培養細胞および哺乳類組織にあるモ
リキュート綱のメンバーを含む細菌を検出することを可
能にする。
【０２５３】そのようなテストに必要な要件は、選択プ
ローブが細菌を含まない哺乳類細胞からのｒＲＮＡにハ
イブリダイズしてはいけないということである。この要
求が合うことは表３Ｖに示されている。
【０２５４】表３のIIおよびIII は、プローブがモリキ
ュート綱のすべてのメンバーを検出し、あらゆるタイプ
の細菌を検出する筈であることを示している。
【０２５５】例えば、LegionellaおよびＥ．coliおよび
Bacillus subtilis は非常に異なる細菌のタイプの代表
である。そしてプローブは、これらタイプの各々からの
ｒＲＮＡとハイブリダイズする。
【０２５６】進化論的考案は、このプローブがほとんど
全ての既知又は未知の細菌に由来するｒＲＮＡにハイブ
リダイズすることを示す。これは、進化を通じてｒＲＮ
Ａヌクレオチド配列が非常によく保存されているためで
ある。
【０２５７】この選択プローブは、組織培養細胞中に細
菌の特異的な綱、モリキュートの存在を検出するために
役に立つ。大部分の組織培養細胞では増殖培地に抗生物
質が存在し、これがモリキュート綱のメンバー以外のほ
とんどすべての細菌の増殖を阻止する。
【０２５８】従って、組織培養標本の汚染はモリキュー
ト綱のメンバーによることはほとんど確実である。
【０２５９】重要な点は、存在する生物の数を測定する
ことができることである。
【０２６０】先行技術の方法では、大抵の場合、細胞が
汚染されていることがわかると、細胞系およびその産物
は捨てられる。これら微生物を定量できれば、その汚染
による影響のひどさについて、判断を下すことができ
る。
【０２６１】汚染は、非常に軽度で、1000個につきたっ
た１個の微生物であるかも知れない。この汚染レベルな
らば細胞にほとんど影響を与えないであろうし、多くの
場合細胞産物を捨てる必要はない。それらをもっとひど
く汚染されるまでは、貴重な細胞ラインをとっておくよ
うな決定を下しうるかも知れない。何らかの種類の細胞
汚染の重大性を判断するためには、定量的考察が重要で
ある。
【０２６２】 表 ３ 選択したモリキュート 3 Ｈ−ｃＤＮＡの、広く異なる起源に由来するｒＲＮＡと のハイブリダイゼーション （Ｉ）対照実験 rRNA の起源 3 H-cDNAと rRNA とのハイブリダイゼーション率 (A) rRNAは加えず、 3H-cDNA ＜１％ の自己反応。
【０２６３】 (B) 偽 rRNA 分離。 ＜１％ (C) マイコプラズマ・ホミニス ９７％ rRNAで汚染されていることが わかっているヒト細胞ＲＮＡ。
【０２６４】 （II） 3Ｈ−ｃＤＮＡと分類学的モリキュート綱の種々の種とのハイブリダイゼ ーション ｒＲＮＡの起源 3 H-cDNAと rRNA とのハイブリダイゼーション率 (A) Mycoplasmatales 目のメンバー (1) Mycoplasma hominis ９７％ （ヒトに感染） (2) Mycoplasma salivarius ９３％ （ヒトに感染） (3) Mycoplasma hyorhinis ８４％ （豚に感染） (4) Mycoplasma pulmonis ８２％ （マウスに感染） (B) Acholeplasma taceae 目のメンバー (1) Acholeplasma laidlawii #1 ５２％ の分離（牛、鳥、犬、家猫、 マウス、羊、ブタ、霊長類に感染する） (2) Acholeplasma laidlawii（#2を分離） (C) Spiroplasmataceae 目のメンバー (1) ＳＭＣＡ（昆虫とマウスに感染） ６９％ (2) みつばち（みつばちから分離） ６８％ (3) サボテン（サボテンから分離） ７１％ (4) Corn stunt（コーンから分離） ６９％ (5) Corn stunt（昆虫から分離） ６５％ (III) 3Ｈ−ｃＤＮＡと他のタイプの細菌（分類学的 Schizomytes鋼）のｒＲＮ Ａとのハイブリダイゼーション rRNA の起源 3 H-cDNAと rRNA とのハイブリダイゼーション率 (A) Enterobateraceae科のメンバー (1) Escherichia coli（哺乳類に感染） ５２％ (B) Legionella pneumophilaのメンバー (1) Legionella pneumophila（ヒトに感染） ＞２８％ (C) Micrococcaceae科のメンバー (1) Micrococcus luteus ５０〜６０％ (2) Staphylococcus aureus ５０％ (D) Lactobacillaceae科のメンバー (1) Streptococcus faecalis ５０％ (E) Bacillaceae 科のメンバー (1) Bacillus subtilis ４０％ （IV） 3H-cDNAと酵母 rRNA との ２％ ハイブリダイゼーション （Ｖ） 3H-cDNAと哺乳類、および鳥からの rRNA とのハイブリダイゼーション rRNA の起源 3 H-cDNAと rRNA とのハイブリダイゼーション率 ヒト（霊長類） １％ 牛（ウシ科） １％ マウス（げっ歯類） １％ ラット（〃） １％ ハムスター（〃） １％ 家兎（兎類） １％ にわとり（トリ） １％ 過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーションは、６８℃、0.48
M ＰＢで行なわれる。
【０２６５】ハイブリダイゼーションアッセイは、６７
℃で、0.14M ＰＢ、 0.005％ドデシル硫酸ナトリウム中
で行われる。ハイブリダイズさせることは、該ｒＲＮＡ
又はミトコンドリアｒＲＮＡと 3Ｈ−ｃＤＮＡの反応を
完了させるだけで十分である。哺乳類および鳥の場合に
は、非細菌性ｒＲＮＡの Cot値は最低 2×103 に達す
る。１〜２％の非特異的シグナルは、上記のハイブリダ
イゼーション値からさし引いた。
【０２６６】核酸ハイブリダイゼーションによるｒＲＮ
Ａの定量 選択 3Ｈ−ｃＤＮＡプローブと、組織から分離したＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーションの動態を既知の標準混合
物のそれと比較することにより、試料中にある細菌ｒＲ
ＮＡの量を測定できる。
【０２６７】これは、哺乳類細胞の大過剰が存在してい
ても可能である。なぜならば、プローブはこのｒＲＮＡ
とはハイブリダイズしないからである（表３Ｖ参照）。
【０２６８】動態を測定するために、ハイブリダイゼー
ション混合物は、１０-5〜１０-4マイクログラムの 3Ｈ
−ｃＤＮＡと１〜１０3 マイクログラムの精製ＲＮＡ試
料とを、0.01〜0.1ml の0.48M ＰＢ中に含む。
【０２６９】この混合物を６８℃でインキュベートし、
一部をとり、0.14M ＰＢに希釈して反応開始後の種々の
時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。ハイブ
リダイゼーションアッセイは、既述のようにヒドロキシ
アパタイトを用いて行う。
【０２７０】得られた結果を既知量の細菌ｒＲＮＡを含
む標準ＲＮＡと反応したプローブのハイブリダイゼーシ
ョンと比較する。
【０２７１】これらの標準は、哺乳類細胞ＲＮＡと既知
量の特異的細菌ｒＲＮＡとの混合物である。
【０２７２】組織培養細胞中のMollicutes綱のメンバー
の検出および定量 表４は、選択プローブと３種類の組織培養細胞試料から
分離した（既述のようにして）ＲＮＡとをハイブリダイ
ズすることによって得られたデータである。
【０２７３】細胞系ナンバー３のみが検出可能程度に汚
染され、反応の動態は約５×１０7個の細菌細胞が組織
培養細胞に存在することを示している。
【０２７４】 表 ４ 組織培養細胞中のMollicutesの検出および定量 ハイブリダイゼー 3H-cDNAとRNA とのハイブ 検出された 細胞系 ション時間（時間） リダイゼーション率（％） 細菌数 1.44-2C 17 1 検出されず (ラット) 40 1 検出されず 2.P388D1M 1.1 1 検出されず (マウス) 22.5 1 検出されず 3.P388D1C 0.025 20 5×107 個 (マウス) 16.2 78 （哺乳類細胞につき 約１モリキュート） 過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーションを、68℃で0.48M
ＰＢ、0.01〜0.04ml容量で行なう。各混合物は、 2×10
5 マイクログラムの 3H-cDNAプローブと５０〜２００マ
イクログラムの試料ＲＮＡとを含む。
【０２７５】次の実施例は、多数の血球の存在下で非常
に少数のたった１個のトリパノソーマの検出に用いられ
る、本発明の方法のもう一つの実施例である。
【０２７６】原虫類Trypanosoma の或るメンバーは、人
に対して病原性を有し、東アフリカ睡眠症、西アフリカ
睡眠症、南アメリカトリパノソーマ症を含む病気を発生
させるから、トリパノソーマの検出は重要である。
【０２７７】これらの生物は大きく、生活環の段階によ
って変る特徴的な形を示す。先行技術の方法は、これら
生物をヒトに検出する場合、主として血清学的方法、鑑
別染色法を検鏡検査、動物接種法と組み合わせて利用し
ている。
【０２７８】血清診断法は感度および特異性が変化し、
解釈がむづかしいかも知れない。検鏡法が最も多く用い
られるが、大量の血球の存在下で少数のトリパノソーマ
を見出すのは、しばしば困難である。動物接種は時間と
費用のかかる方法である。
【０２７９】次の例で示す発明の実施例は、多量の血球
と共存する場合でも１個のトリパノソーマを比較的容易
に検出できる方法である。
【０２８０】実施例２ トリパノソーマｒＲＮＡに相補的な放射性ＤＮＡの調製 Trypanosoma brucei ｒＲＮＡに相補的な放射性ＤＮＡ
（ 3Ｈ−ｃＤＮＡ）を前に詳述した M. hominis 3H-cD
NAと同じ方法で調製する。但し、Trypanosomab. rRNA
を鋳型として用いる。
【０２８１】トリパノソーマｒＲＮＡに相補的である
が、ヒトｒＲＮＡには相補的でないトリパノソーマ 3 Ｈ
−ｃＤＮＡの選択 これはTrypanosoma b. 3H-cDNAをヒトｒＲＮＡにハイブ
リダイズさせることを除けば、M. hominisについて既述
したものと同じ方法で行われる。
【０２８２】ヒト組織、又は体液中のトリパノソーマの
検出および定量に、選択トリパノソーマ 3 Ｈ−ｃＤＮＡ
の使用 選択 3Ｈ−ｃＤＮＡプローブの調製により、トリパノソ
ーマｒＲＮＡの存在の検出によるヒト試料中のトリパノ
ソーマの検出および定量が可能になる。
【０２８３】そのようなテストに必要な要件は選択プロ
ーブは、トリパノソーマを含まないヒト細胞に由来する
ｒＲＮＡにはハイブリダイズしてはいけないということ
である。表５はこの要求が満されることを示す。
【０２８４】 表 ５ 選択されたTrypanosoma brucei 3 Ｈ−ｃＤＮＡと異なる起源からのｒＲＮＡとの ハイブリダイゼーション ｒＲＮＡの起源 3 H-cDNAと rRNA のハイブリダイゼーション率 ＲＮＡを加えず 1 ％ Trypanosoma brucei rRNA 98 ％ Mycoplasma hominis rRNA 1 ％ ヒトｒＲＮＡ 1 ％ Trypanosoma bruceiに汚染されている 98 ％ ことがわかっているヒトrRNA 過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーションを６５℃で0.48M
ＰＢ中で行なう。反応は２４時間続き、そのハイブリダ
イゼーション時間はヒトｒＲＮＡ又はミトコンドリアｒ
ＲＮＡと細菌ｒＲＮＡとの反応が確実に完了するために
十分である。
【０２８５】ハイブリダイゼーションアッセイは、ヒド
ロキシアパタイトで７２℃、0.14MＰＢ、 0.005％ドデ
シル硫酸ナトリウム中で行われる。
【０２８６】本発明者がつくったある例証的プローブ
は、Legionella属のメンバーに対してのみ特異的であ
る。そのプローブは、Legionella属の種々のメンバーか
らの核酸と５０％以上ハイブリダイズし、哺乳類、酵母
および種々の広く異なる細菌株からの核酸とは明白には
ハイブリダイズしない（表８）。
【０２８７】プローブはLegionella pnuemophilaおよび
Legionella micdadei のようなほとんど又は全然集団Ｄ
ＮＡ近縁度を示さないLegionella種ともよくハイブリダ
イズする。
【０２８８】その他の既知のLegionella種は表６で用い
られており、表７に列挙したこのプローブで検出するこ
とができる。
【０２８９】既知のLegionella種（２３種類もの種）の
すべてを調べた。すべては、表６で用いられたプローブ
によって特異的に検出することができた。
【０２９０】このプローブの特異性は、関連性のない細
菌又は哺乳類細胞の多量の存在下でさえもLegionella種
の検出および定量を可能にする。例えば、Legionella p
neumophilaに感染したハムスターの肝細胞について、特
異的プローブと十分に確立された核酸ハイブリダイゼー
ション操作法を用いて、Legionella菌の存在並びに数を
検出した。
【０２９１】その肝は、微生物学的増殖試験により、あ
らかじめ検査した。それは、感染した肝臓１ｇあたり約
１０7 個のLegionellaがあることを示した。
【０２９２】核酸ハイブリダイゼーションアッセイで
は、肝１ｇにつき約１〜２×１０8 個のLegionella菌が
示された。この結果は、増殖試験におけるプレーティン
グ効率は約５〜１０％であることを示唆する。
【０２９３】特異的プローブは、多量の哺乳類細胞の存
在下においてさえLegionella菌の高度に鋭敏かつ迅速な
検出を可能にする。
【０２９４】１日もかからないアッセイで、そのプロー
ブは0.4mg 肝（約２×１０5 個の細胞）と混ぜ合わせた
約 400個のLegionella菌の存在を容易に検出した。
【０２９５】 表 ６ レジオネラ特異的プローブと、広く異なる起源からの核酸とのハイブリダイゼー ション （Ｉ）対 照核酸の起源 ハイブリダイズしたプローブの標準パーセント (1) 核酸なし 1 (2) 偽核酸分離 1 (3) Legionellacae pneumopila 100（実際の％＝81） 感染−ハムスター組織 （II）Legionellacae (1) Legionella bozemanii(WIGA) > 50 (2) Legionella dumoffi(TEX-KL) > 50 (3) Legionella garmanii(LS-13) > 50 (4) Legionella jordanis(BL540) > 50 (5) Legionella longbeachae > 50 (6) Legionella micdadai(HEBA) > 50 (7) L. MSH9 > 50 (8) Legionella oakridgenis > 50 (オ-クリッシ゛ 10 ） (9) Legionella pneumophila(PHA 1) 100 (10) Legionella lansing 2 > 50 (11) L. SC-32C-C8 > 50 (III) その他の細菌種 (1) Aeromonas hydrophila 1 (2) B.subtilis 1 (3) Campylobacter jejuni 1 (4) Cytophaga johnsonae 1 (5) E.coli 1 (6) Flavobacterium breve 1 (7) Flavobacterium gleum 1 (8) Flavobacterium meningoseptium 1 (9) Flavobacterium multivarum 1 (10) Flavobacterium spiritvarum 1 (11) Flavobacterium thalophohilum 1 (12) Flexibacter canadensis 1 (13) Proteus mirabilis 1 (14) Proteus rettgeri 1 (15) Proteus vulgalis 1 (16) Providencia alicalifaciens 1 (17) Providencia stuaritii 1 (18) Pseudomonas alcaligenes 1 (19) Vibrio E 1 Tor 1 (20) Mycoplasma hominis 1 (21) Mycoplasma hyorohinis 1 (22) Mycoplasma salivarium 1 (23) Acholeplasma Laidlawii 1 (24) Spiroplasma SMCA 1 (25) Spiroplasma corn stunt 1 (26) Spiroplasma honey bee 1 (27) Spiroplasma cactus 1 （IV）酵 母 S. cerv 1 （Ｖ）哺乳類 ヒ ト 1 ハムスター 1 マウス 1 過剰ｒＲＮＡハイブリダイゼーションを７６℃、0.47M
ＰＢで行なう。ハイブリダイゼーションアッセイは、７
２℃で0.14M ＰＢ、 0.005％ドデシル硫酸ナトリウム中
で行なう。
【０２９６】ハイブリダイゼーション時間は 3Ｈ−ｃＤ
ＮＡと核ｒＲＮＡ又はミトコンドリアｒＲＮＡとの反応
を確実に完了させるに十分である。哺乳類および鳥の場
合には、非細菌性ｒＲＮＡのCot 値は最低２×１０3 に
達する。
【０２９７】表 ７ 表６の特異的核酸プローブによって検出されるその他の
Legionellaの種種 L. WA-316 L. WO-44-3C （L. feeleii） L. phoenix 1 L. WA-270A L. PF-209C-C2 L. SC 65C3（ORW ） L. jamestown 26G1-E2 L. MSH-4 L. lansing 3 L. SC18-C9 L. SC63-C7 L-81-716（L. wadsworthii）実施例３ Legionella属のメンバーのｒＲＮＡにのみ、ハイブリダ
イズするプローブの調製Legionella rRNA に相補的な放
射性ＤＮＡの調製 Legionella pneumophila種に由来するｒＲＮＡを鋳型と
して用いて、 Legionella pneumophila ｒＲＮＡに相補
的な標識（放射性）ｃＤＮＡを合成する。
【０２９８】このｃＤＮＡの調製は逆転写酵素がｒＲＮ
Ａを鋳型として利用でき、ｒＲＮＡに相補的な 3Ｈ−ｃ
ＤＮＡを調製できる能力を利用したものである。
【０２９９】これは、Legionella pneumophila由来のｒ
ＲＮＡを鋳型として用いるということを除けば、Mycopl
asma hominis 3H-cDNAの生産に関して記載したと同じ方
法で行われる。
【０３００】Legionella属のメンバーからのｒＲＮＡに
のみ、ハイブリダイズする放射性プローブの選択 精製 3Ｈ−ｃＤＮＡをE.coli、 Acholeplasma laidlawa
iiおよびProvidentiastuartiiに由来する大過剰のｒＲ
ＮＡとハイブリダイズさせることにより、分画化する。
【０３０１】ハイブリダイゼーション混合物は、0.48M
ＰＢ１ml中に0.05〜１マイクログラム 3Ｈ−ｃＤＮＡと
２０マイクログラムずつの細菌ｒＲＮＡを含んで成る。
この混合物を、７６℃で１時間インキュベートし、その
混合物を0.14M ＰＢに希釈して72℃、0.14M ＰＢで平衡
状態にしたＨＡカラムを通す。
【０３０２】ＨＡに吸着しない 3Ｈ−ｃＤＮＡ（即ち、
そのｒＲＮＡにハイブリダイズしない 3Ｈ−ｃＤＮＡ）
のフラクションを集める。このフラクションを上記と同
じ条件でＨＡを通し、再び吸着されなかったフラクショ
ンを集める。
【０３０３】この 3Ｈ−ｃＤＮＡを濃縮し、再び上述の
ように細菌ｒＲＮＡとハイブリダイズさせる。吸着しな
いフラクションを集めて濃縮し、さらに上記のように、
３回目として細菌ｒＲＮＡとハイブリダイズさせ、上の
ようにＨＡで分画化する。
【０３０４】吸着しないフラクションを集める。塩基で
処理して、存在するｒＲＮＡを取り出し水中に濃縮す
る。この 3Ｈ−ｃＤＮＡ標本は、Legionella属のいかな
るメンバーにもハイブリダイズするが、他の起源のｒＲ
ＮＡにはハイブリダイズしない。
【０３０５】Legionella特異的 3 Ｈ−ｃＤＮＡプローブ
と、異なる起源のｒＲＮＡ、およびｒＲＮＡ遺伝子との
ハイブリダイゼーション 選択プローブを用いれば、核酸ハイブリダイゼーション
によってLegionellarRNAの存在を検出することにより、
試料中のLegionella属のメンバーを検出することができ
る。
【０３０６】そのようなテストに必要な要件は、Legion
ella特異的プローブが他の起源に由来するｒＲＮＡにハ
イブリダイズしてはいけないということである。
【０３０７】核酸のハイブリダイゼーション過剰ｒＲＮ
Ａ法によるLegionella rRNAの定量 試料中にある細菌ｒＲＮＡの量は、選択 3Ｈ−ｃＤＮＡ
プローブと組織試料から分離したＲＮＡとのハイブリダ
イゼーションの動態を測定し、これらの動態を既知の標
準混合物のそれと比較することによって決定することが
できる。
【０３０８】これは、哺乳類細胞のｒＲＮＡの大過剰が
存在していても可能である。なぜならば、そのプローブ
はこのｒＲＮＡとはハイブリダイズしないからである。
【０３０９】動態を測定するためには、ハイブリダイゼ
ーション混合物は0.01〜0.1 mlの0.48M ＰＢ中に例え
ば、１０-5〜１０-4マイクログラム 3Ｈ−ｃＤＮＡと0.
01〜103 マイクログラム精製試料ＲＮＡを含む。
【０３１０】この混合物を７６℃でインキュベートし、
一部をとり、0.14M ＰＢに希釈し、反応開始後の種々の
時間にハイブリダイゼーションアッセイを行う。ハイブ
リダイゼーションアッセイは、既述のように、ヒドロキ
シアパタイトを用いて行なう。
【０３１１】得られた結果を、既知量の細菌ｒＲＮＡを
含む標準ＲＮＡと反応させたプローブはハイブリダイゼ
ーション動態と比較する。これらの標準は、哺乳類細胞
ＲＮＡと既知量の特異的細菌ｒＲＮＡとの混合物であ
る。
【０３１２】表８は、水試料中および感染ハムスター肝
試料中にあるLegionella pneumophilaの定量に関するデ
ータを示す。
【０３１３】水試料および肝試料について、ジョージア
州アトランタ市の疾病コントロールセンターで、標準定
量的増殖試験により、Legionella pneumophilaの存在を
調べた。
【０３１４】 表 ８ 増殖試験により 過剰rRNA核酸ハイブリダイゼー 測定した値 ション法により測定 感染ハムス ター肝 1g あたりの 107 細菌/g肝 1-2×108 細菌/g肝 L.pneum.細胞 水試料１mlあたりの 1.5×108 細胞/ml 2.1×108 細胞/ml 同細菌過剰プローブ法 試料中にある細菌ｒＲＮＡの量は、存在するLegionella
rRNA の量に比較して、Legionella特異的 3Ｈ−ｃＤＮ
Ａプローブが過剰にあるという条件下で、ハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、測定することができる。
【０３１５】この混合物を、最後までハイブリダイズさ
せる。この時点で、試料中にある各Legionella rRNA は
プローブ分子で飽和させられる。ｒＲＮＡとハイブリダ
イズしたプローブの量を、正確に作成された標準検量曲
線と比較することによって試料中のｒＲＮＡ量を測定す
ることができる。
【０３１６】それからLegionella pneumophila細菌１個
あたりのｒＲＮＡ分子の平均数を知ることによって、試
料中にある該細菌の総数を計算できる。
【０３１７】表９は、後章に詳述する過剰プローブハイ
ブリダイゼーション加速−酵素−界面活性剤試料法によ
り測定した水試料中のLegionella pneumophilaの定量に
関するデータを示す。
【０３１８】水試料について、標準定量増殖法により、
Legionella pneumophilaの存在を調べた。これらの試験
法は完了するまでに数日かかるが、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは約１時間ですむ。
【０３１９】 表 ９ 増殖法で測定 過剰プローブ法で測定 水試料１mlあたりの 1.5×108 細胞/ml 2.2×108 細胞/ml Legionella pneumophilaLegionella属のメンバー由来のｒＲＮＡのみに特異的な
プローブ Ａ．水試料中の分析：加速ハイブリダイゼーション法 (1) 試料およびハイブリダイゼーションインキュベーシ
ョン混合物の調製。
【０３２０】次の順序で、できるだけ早く混合する。
【０３２１】(a) 試料９μｌ (b) 次のものを含む酵素−界面活性剤−溶液２μl 5mg
/mlの Proteinase K ，0.5M Tris（pH＝8.1 ）、８％ d
odecyl硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４％サルコシン酸ナ
トリウム、0.25MNaCl 、0.016M EDTA 、0.016M EGTA 。
【０３２２】(c) プローブ水溶液１μｌ (d) 4.8M PB 20μl (2) 混合物を、７６℃でハイブリダイゼーション反応が
完了するまでの時間インキュベートする。
【０３２３】(3) ハイブリダイゼーションアッセイを次
のようにして行う。
【０３２４】(a) インキュベーション混合物を次のも
のを含む室温溶液１mlに加える。
【０３２５】0.05ｇヒドロキシアパタイト(HA)、0.054M
PB 、0.02％ツヴィッタージェント14(CalBiochem)（以
後はZ-14と記す） (b) 混合物を室温で30秒間振盪し、0.14M PB 5ml、0.0
2% Z-14を加え、混合物を７２℃で２分間インキュベー
トする。
【０３２６】(c) その溶液を遠沈してＨＡにペレット
にする。すべての遠沈は室温で行われる。傾瀉し、液体
部分をとる。これが洗浄＃１である。
【０３２７】(d) ペレットに0.14M PB 6mlと0.02% Z-1
4溶液を加える。それを渦巻き状に振って、ＨＡペレッ
トを再懸濁する。遠沈してＨＡをペレットにする。傾瀉
し液体部分をとる。これが洗浄＃２である。
【０３２８】(e) 段階(d) を繰返す。この結果、洗浄
＃３が得られる。
【０３２９】(f) 0.03M を６ml加えて、渦巻き振盪に
より、ＨＡペレットを再懸濁する。懸濁液を遠沈して、
ＨＡをペレットとする。液を傾瀉し、その中のプローブ
の存在をアッセイする。このフラクションは、ハイブリ
ダイズしたプローブを（もしあれば）含む。特定条件
下、ＨＡからハイブリダイズしたプローブを溶出する必
要はない。
【０３３０】ハイブリダイズしたプローブを、例えば、
もしプローブに、ＨＡの存在下でも検出できるようなマ
ーカーで標識をつけると、段階(c) からのペレットで直
接プローブのアッセイを行うことができる。
【０３３１】ヨウ素 125のようなマーカーの場合には、
ＨＡペレットを含むチューブを直接ガンマ検出器に入れ
ることができる。
【０３３２】より迅速にかつ容易に試験するために、そ
の他の変更も加えてよい。例えば、事情によっては、使
用するＨＡの容量および量を減らしたり、洗浄回数を減
らすことができる。
【０３３３】又別の場合には、ＨＡの容量および洗浄数
をふやすのが望ましい。燐酸ナトリウム以外の種々の塩
および他の界面活性剤もアッセイに使用することができ
る。
【０３３４】Ｂ．液体試料の分析：標準速度ハイブリダ
イゼーション初速度法 (1) 試料およびハイブリダイゼーションインキュベーシ
ョン混合物の調製 次の順序で、できるだけ早く混合する。
【０３３５】(a) 試料１４μl (b) Ａで記した酵素−界面活性剤溶液２μl (c) プローブ１μl (d) 3.2M PB 、0.03M EDTA、0.03M EGTAを含む溶液３
μl (2) この混合物を、７６℃で、ハイブリダイゼーション
が完了するまでの時間インキュベートする。
【０３３６】(3) ハイブリダイゼーションアッセイは次
のように行う。
【０３３７】(a) インキュベーション混合物を 0.14M
PB 、0.02% Z-14、0.05g-HAを含む溶液１mlに加える。
(b) 実験手順上のこの点からは、Ａに記載のものと一
致する。
【０３３８】Ｃ．組織試料の分析：加速ハイブリダイゼ
ーション法 水性10％肝ホモジネートを組織試料として用いた。
【０３３９】(1) 試料およびインキュベーション混合物
の調製 次の順序で、できるだけ早く混合する。
【０３４０】(a) 試料８μl （10％肝ホモジネート） (b) ８％ ＳＤＳ ４％サルコシネートＮａ 0.25M ＮａＣｌ 0.016M ＥＤＴＡ 0.016M ＥＧＴＡ 0.38M Tris（pH＝8.2 ） 195 mg／ml Pronase を含有する酵素−界面活性剤−混合液３ml (c) Legionella rRNA のみに特異的なプローブ１μｌ (d) 4.8M PB 20μl (2) 混合物を７６°でハイブリダイゼーション反応が確
実に完了する時間、インキュベートする。(3) ハイブリ
ダイゼーションアッセイを水試料の分析の章、加速法に
記したように行なう。
【０３４１】Ｄ．組織試料の分析：標準速度ハイブリダ
イゼーション法 試料として、水性１０％肝ホモジネートを用いる。
【０３４２】(1) 試料およびインキュベーション混合物
の調製。できるだけ早く次の順序で混合する。
【０３４３】(a) 試料１２μｌ (b) Ｂに記載した酵素−界面活性剤４μｌ (c) Legionella rRNA にのみ特異的なプローブ１μｌ (d) 3.2M PB 、0.03M EDTA、0.03M EGTAを含む溶液３
μl (2) 混合物を７６℃で一定の時間インキュベートする。
【０３４４】(3) ハイブリダイゼーションアッセイは、
次のように行う。
【０３４５】(a) インキュベーション混合物を、0.14M
PB、0.02% Z-14、0.05g-HAを含む溶液１ml。
【０３４６】(b) この点からは、Ａに記載の通りにす
る。
【０３４７】水および肝試料中のLegionella pneumophi
laを検出する核酸ハイブリダイゼーション試験の詳細を
以下に示す。
【０３４８】実施例４ 水性試料中のLegionella菌の迅速、鋭敏な検出法（加速
法） (1) 次の諸成分をできるだけ速く次の順序で混合する。
【０３４９】(a) １mlに対して約１０5 個のレジオネ
ラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）菌を含
む水性試料 4.5μｌ。水中の細菌数は米国アトランタの
疾病コントロールセンターで増殖試験により測定した。
【０３５０】(b) Ａに記載の酵素−界面活性剤溶液１
μｌ (c) Legionella特異的プローブ 0.5μｌ 7.5×10-6μｇ相当量のプローブ (d) 4.8M PB 10μｌ ハイブリダイゼーション混合物を約２分間アセンブリン
グ。
【０３５１】(2) ハイブリダイゼーション混合物を３６
分間、７６℃で、インキュベートする。
【０３５２】(3) Ａに記載のようにハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを行う。これには約５分かかる。
【０３５３】(4) フラクションについて、プローブの存
在をアッセイする。これには、約１０分間かかる。
【０３５４】ハイブリダイゼーション混合物中にあるLe
gionella菌の数は、約 500個であった。この微生物数を
検出し定量するのに、始めから終りまで約１時間かか
り、１０-5マイクログラム以下のプローブを使用した。
【０３５５】過剰プローブハイブリダイゼーションテス
トとして計画されたこの試験では、プローブの２３％が
Legionella rRNA とハイブリダイズした。
【０３５６】同条件で、細菌を加えない一つの試料、ハ
イブリダイゼーション混合物に１０5 個の大腸菌（E.co
li）を存在させた他試料をそれぞれ用いて対照試験を行
った。
【０３５７】どちらの場合も、ハイブリダイズしたよう
に振舞ったプローブは１〜２％に過ぎなかった。
【０３５８】上記試験を変形して、より大きな容量中の
Legionella菌の存在をアッセイすることができる。
【０３５９】例えば、１ml中に、１０4 個のLegionella
菌を含む水試料１mlを３０分間遠沈して、細菌をペレッ
トにする。少量の酵素−界面活性剤をペレットに加え、
この混合物について加速法を用いてハイブリダイゼーシ
ョンテストを行ったら、Legionella菌が容易に検出され
た。
【０３６０】更に多量の試料を遠沈することもできる
し、細菌を濃縮するその他の方法（膜濾過を含む）を使
うこともできる。これらの変形は、大量の試料中の少量
の細菌の検出を可能にする。
【０３６１】大気試料も膜濾過法を含む種々の方法によ
って濃縮することができ、大量の大気試料中の少数の細
菌を検出することができる。
【０３６２】実施例５ ハムスター肝試料中の Legionella 菌の迅速、鋭敏な検
出 (1) 次の諸成分をできるだけ早くつぎの順序で混合す
る。
【０３６３】(a) Legionella pneumophilaに感染した
ハムスター肝の１０％肝ホモジネート４μｌ。これは、
肝臓 400マイクログラム、又は約６×１０4 個肝細胞に
相当する。この試料には約 750個のLegionella pneumop
hilla が存在した。
【０３６４】(b) 次のものから成る酵素−界面活性剤
溶液４μｌ。４５μｇ／mlプロティナーゼＫ、８％ＳＤ
Ｓ、４％サルコシン酸ナトリウム、 0.5M トリス(pH=8.
2)、0.008M EDTA 、0.008M EGTA 、0.25M NaCl。
【０３６５】(c) Legionella特異的プローブ４μｌ。
プローブ量は、約１０-5マイクログラムである。
【０３６６】(2) ハイブリダイゼーション混合物を７６
℃で３時間インキュベートする。
【０３６７】(3) Ａに記載の通り、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを行う。
【０３６８】(4) 生じたフラクションについて、Legion
ella rRNA にハイブリダイズしたプローブの存在をアッ
セーする。
【０３６９】ハイブリダイゼーション混合物中にあるLe
gionella菌の数は約 750個である。この数のLegionella
細胞中にあるｒＲＮＡ量は約 1.1×１０-5マイクログラ
ムである。存在する肝細胞の数は約６×１０4 個で、存
在する肝ｒＲＮＡ量は約１マイクログラムである。 Leg
ionella 特異的プローブの１０％が、ハイブリダイズし
た。
【０３７０】対照試験は感染しない肝臓で同様にして行
われ、プローブの１％以下がハイブリダイズしているよ
うに振舞った。実施例４および５はそのような試験の多
くのあり得る形態の中の２つだけを示しているに過ぎな
い。
【０３７１】種々の容量、塩、界面活性剤、プローブ、
試料の型、蛋白分解酵素、ＨＡ量、インキュベーション
時間、生物の種類、プローブ量、インキュベーション温
度、ハイブリダイゼーション速度加速系を用いる試験
が、ここに記した試験の一般的状況において、成功裡に
利用される。
【０３７２】ｒＲＮＡプローブのどれでも、上述のシス
テムに匹敵するシステムでは用いることができる。ｒＲ
ＮＡでないプローブも、若干の明白な変形を施したこれ
らのシステムで、有効に用いることができる。
【０３７３】例えば、特定の生物又は生物群の特定のＤ
ＮＡ配列に特異的な試験を、もし２本鎖ＤＮＡを１本鎖
型に変える段階を入れるならば、正に上述のように行な
うことができる。その他の場合には、又異なる変形を施
した方法を用いなければならない。
【０３７４】MycobacteriaおよびBacilli のような細菌
は破壊されにくい。上記の方法に関連して、これら細菌
を破壊する段階を用いなければならない。例えば、界面
活性剤なしで酵素リゾチームを用いて１回インキュベー
ションすると、大部分のBacillus菌は、界面活性剤によ
り溶解し易くなる。
【０３７５】他方、マイコバクテリアは非常に溶解しに
くく、それらは試験する前に物理的に破壊する必要があ
るかも知れない。
【０３７６】上記方法の変形をｔＲＮＡプローブ又は生
物中に存在する他のＲＮＡに特異的なプローブに関連し
ても用いることができる。
【０３７７】大きな容量の試料、例えば大気又は液体か
ら、少数の細菌又はその他の細胞を濃縮するための段階
をその他の細菌生物又はその他の種類の生物の大部分を
見出すハイブリダイゼーションテストに関連して用いる
ことができる。
【０３７８】以上、Legionella属のメンバーに由来する
核酸にのみハイブリダイズする核酸プローブの生産およ
び使用について詳しく述べてきたが、この実施例および
他の実施例から、上に例証せる操作法を基にして、その
他のプローブも生産できるということは当業者には容易
に理解できる。
【０３７９】そのような他のプローブを生産するために
用いる方法は、次のようである。
【０３８０】(1) 関心のある群のメンバーのｒＲＮＡに
相補的な標識核酸をつくる。
【０３８１】(2) このＤＮＡを、プローブが特異的であ
る生物群に進化論的に最も近い生物群のメンバーからの
ｒＲＮＡにハイブリダイズさせる。
【０３８２】特異的なクリテリオンにおいて、この一番
近い生物群のメンバーからのｒＲＮＡにハイブリダイズ
しない標識核酸の１部分を選択する。この部分が関心の
ある生物群に特異的である。
【０３８３】これらの例を、次にあげる。
【０３８４】（ａ）Leptospira科の菌のメンバーに由来
するｒＲＮＡとのみハイブリダイズし、他の起源のｒＲ
ＮＡとはハイブリダイズしない標識プローブの生産。
【０３８５】（ｂ）Mycoplasma科の菌のメンバーに由来
するｒＲＮＡとのみハイブリダイズし、その他の起源に
由来するｒＲＮＡとは、ハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
【０３８６】（ｃ）Enterobacteriaceae科のメンバーに
由来するｒＲＮＡとのみのハイブリダイズし、その他の
起源のｒＲＮＡとはハイブリダイズしない標識プローブ
の生産。
【０３８７】（ｄ）嫌気的細菌群のメンバーとのみハイ
ブリダイズし、その他の起源由来のｒＲＮＡとはハイブ
リダイズしない、標識プローブの生産。
【０３８８】（ｅ）菌類（Fungi ）のメンバーに由来す
るｒＲＮＡとのみハイブリダイズし、その他の起源に由
来するｒＲＮＡとはハイブリダイズしない標識プローブ
の生産。
【０３８９】（ｆ）Chlamydia 群のメンバーに由来する
ｒＲＮＡとのみハイブリダイズし、その他の起源に由来
するｒＮＲＡとはハイブリダイズしない標識プローブの
生産。
【０３９０】（ｇ）Mycobacteriaceae科のメンバーに由
来するｒＲＮＡとのみハイブリダイズし、その他の起源
に由来するｒＲＮＡとはハイブリダイズしない標識プロ
ーブの生産。
【０３９１】（ｈ）生きている生物に由来するｒＲＮＡ
にハイブリダイズする標識プローブの生産。
【０３９２】（ｉ）哺乳類に由来するｒＲＮＡとのみハ
イブリダイズし、その他の起源のｒＲＮＡとはハイブリ
ダイズしない標識プローブの生産。
【０３９３】生物を検出、定量、同定するために、ｔＲ
ＮＡプローブを使用する例証的実施例 ｔＲＮＡプローブをｒＲＮＡプローブの場合と同様に用
いて、生物、そして或る場合には、ウィルスを検出、同
定、定量することができる。
【０３９４】例えば、Legionellaに特異的なｔＲＮＡプ
ローブをLegionellaにのみ特異的なｒＲＮＡプローブに
関して記載した方法と同じやり方で生産し、用いること
ができる。
【０３９５】こうして、Legionella特異的ｒＲＮＡのた
めに記述した例証的実施例は、Legionella特異的ｔＲＮ
Ａプローブの例証としても役立つ。
【０３９６】多くのＤＮＡおよびＲＮＡウィルスに存在
する遺伝子は、そのウィルスに特異的であるｔＲＮＡ遺
伝子を含む。
【０３９７】ｍＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又はｐ
ｓＲＮＡに特異的なプローブを使用して、生物および細
胞中ウィルスを検出、定量、同定する例証的実施例 ｍＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡに特
異的なプローブ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡの場合と同様
なやり方で用いて特異性の大きい又は小さい生物群、細
胞又は細胞中のウィルスを検出、同定、定量することが
できる。
【０３９８】これらの種々のＲＮＡｓを生産する個々の
遺伝子の進化的保存は非常に変化するから、非常に大き
い生物クラスのメンバーを検出するプローブと、比較的
小さい生物クラスのメンバー、細胞又は細胞中のウィル
スを検出するプローブを生産することは可能である。
【０３９９】高度に保存されている遺伝子配列の一例
は、ヒストン遺伝子、真核細胞に存在する一族の遺伝子
である。ヒストンは、すべての真核細胞にある核−構造
蛋白質である。ヒストンＤＮＡ配列は、広く異なった生
物においてさえ非常に似ている。
【０４００】例えば、ウニと人とのヒストン遺伝子はよ
く似ていて、ハイブリダイズし合う。特定のヒストンｍ
ＲＮＡ又はヒストンｍＲＮＡ集団に特異的なプローブ
は、広く異なる生物から成る大きな群のメンバーの存在
又は不存在を検出し、定量することができる。
【０４０１】細胞又は生物の検出感度は、ヒストンｍＲ
ＮＡ量が多いと高まる。増殖するためには、細胞又は生
物はヒストンｍＲＮＡを大量に合成しなければならな
い。
【０４０２】別の実施例はｐｓＲＮＡを規定し、進化の
過程で保存されない或る遺伝子配列を含む。
【０４０３】或るタイプの生物に由来するそのような遺
伝子配列は、遠い関係の種に由来するＤＮＡにはハイブ
リダイズしない。
【０４０４】或る一つの特定のｐｓＲＮＡ配列又は、１
生物タイプ又はウィルスタイプに由来する種々のｐｓＲ
ＮＡ配列の集団に特異的なプローブを用いて近い関係の
生物から成る小さい群又は、細胞中の近い関係のウィル
スの小群のメンバーを検出、定量、同定することができ
る。
【０４０５】別の実施例は、特定の細胞損傷および破壊
を検討するために体液の検査に用い得るｍＲＮＡ，ｈｎ
ＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡの配列（１ヶ又は複
数）に特異的なプローブの開発である。
【０４０６】或る種の病気では細胞が破壊され、細胞核
酸を含むその内容物が循環血液中にもれる。肝炎による
肝損傷はそのような状態の一つであり、肝細胞からのＤ
ＮＡもＲＮＡも両方共、細胞損傷の結果として循環血液
中へ入ることが知られている。
【０４０７】肝細胞にのみ特徴的であり、他の正常細胞
タイプには存在しないＲＮＡ配列（１又は複数）に特異
的なプローブを生産することができる。そのようなＲＮ
Ａの存在はよく知られている。
【０４０８】それから、このプローブを用いて本文中に
記載の核酸ハイブリダイゼーション法によって血液試料
中の肝−特異的−ｍＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又
はｐｓＲＮＡ配列を検出し、同定し、定量することかで
きる。
【０４０９】血液中にあるＲＮＡの量は細胞損傷の程度
を反映するから、肝損傷の存在およびその大きさの程度
範囲を決めることができる。
【０４１０】特殊なタイプの肝細胞にのみ存在する特定
のｍＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡ配
列（１又は複数）に特異的なプローブも生産することが
できる。それを使って特殊な肝細胞タイプの損傷の結
果、血液中に存在するＲＮＡ配列を検出、定量すること
ができる。明らかに、肝細胞中の特異的ＲＮＡ配列が豊
富であればある程ＲＮＡ検出感度は高くなる。
【０４１１】体組織又は器官（心、腎、脳、筋肉、膵、
脾等々を含む）の損傷も、この方法で検出、定量でき
る。脊髄液および尿を含むその他の体液も、これらの特
異的ＲＮＡの存在をアッセイすることができる。
【０４１２】ｒＲＮＡに特異的なプローブを利用し、血
液又はその他の体液について、ｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ配
列の存在を試験することによって、いかなる起源の組織
損傷があるかについて有用な初期スクリーニングをする
ことができる。
【０４１３】存在するｒＲＮＡ又はｔＲＮＡの定量は、
起源を確認することなく組織損傷の程度の大きさを示
す。
【０４１４】核酸ハイブリダイゼーションテストおよび
ここに記載されたアプローチを使用する又別の例は大腸
菌（E.coli）腸毒素蛋白質を規定するプラスミド遺伝子
を含む大腸菌細胞の検出および定量である。
【０４１５】そのようなテストは、腸毒素蛋白質ｍＲＮ
Ａを含む大腸菌の存在を検出および定量するために腸毒
素蛋白質ｍＲＮＡに相補的な標識核酸プローブを使用す
ることを含む。
【０４１６】これは、この明細書中に記載の溶液内ハイ
ブリダイゼーション法を利用することによって達せられ
る。
【０４１７】既述したように、核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いることにより大腸菌（E.coli）腸毒素を生
産し、従って腸毒素ｍＲＮＡを含む大腸菌の存在を検
出、定量するための手段として、大腸菌腸毒素ｍＲＮＡ
に相補的なプローブを使用することは前に論じたファル
コウ等の米国特許に記載されているような方法に比べて
著しくすぐれている。
【０４１８】前述のものと同じアプローチを用いて、特
定の抗生物質又はその他の抗菌剤に対する耐性を与え
る、特定の微生物の特異的遺伝産物を検出することがで
きる。
【０４１９】大部分の抗生物質に対する耐性を与える遺
伝子は、ほとんど常に細胞中のプラスミドに存在する。
生物が耐性を伝える因子に生産するためには、その因子
のための遺伝子およびその因子のためのｍＲＮＡが細胞
中に存在しなければならない。
【０４２０】そこで、核酸ハイブリダイゼーション法に
よって、その因子のｍＲＮＡに特異的なプローブはその
因子を生産する生物を検出、同定、定量することができ
る。
【０４２１】核酸ハイブリダイゼーション法によって、
例えば、ｍＲＮＡ，ｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲ
ＮＡ配列を含む生物、細胞又は細胞中のウィルスの特定
群を検出、同定、定量する目的でｍＲＮＡ，ｈｎＲＮ
Ａ，ｓｎＲＮＡ又はｐｓＲＮＡの特定配列又は配列集団
に特異的な核酸プローブを使用する上記の例は例証的で
あるに過ぎず、限定するものではない。
【０４２２】抗菌剤に対する微生物の感受性の測定 多数の異なる臨床的情況は、種々の細菌の抗菌剤および
抗生物質に対する感受性の測定を必要とするV. Lorian
著「Antibiotics in Laboratory Medicine」、Williams
& Wilkens社 米国バルチモア．1980参照）。
【０４２３】これらの情況は、すべての特異的微生物ク
ラスを検出、定量する方法を利用する。これらの情況の
多くにおいては、既述の核酸ハイブリダイゼーションテ
ストの使用が抗菌剤感受性の測定を著しくスピードアッ
プする。
【０４２４】試料中の生物が成長し、分割するにつれて
培地中のＲＮＡ量は増加する。生物が２倍になると培地
中にある異なるタイプのＲＮＡの量も２倍になる。
【０４２５】こうして、生物の増殖は増殖培養開始後種
々の時間に、培地中のＲＮＡ量を測定することによっ
て、モニターできる。
【０４２６】ＲＮＡ量が時間と共に増加すれば、それは
生物の増殖を示す。その増加の大きさは増殖の程度を示
す。増殖速度は時間あたりの増殖程度である。ｒＲＮ
Ａ，ｔＲＮＡ，ｐｓＲＮＡ，ｐｓｔＲＮＡ、或る種のｍ
ＲＮＡｓ、又はｐｓｍＲＮＡｓ、ある種のｓｎＲＮＡ又
はｐｓｓｎＲＮＡｓ又はｈｎＲＮＡ又はｐｓｈｎＲＮＡ
に対して特異的なプローブを、個々に、又は組み合せて
用いて生物の増殖を測定することができる。なぜならば
微生物が増殖するにつれて、培地中のこれらＲＮＡの各
々の量が増加するからである。
【０４２７】ある特定の生物を、その成育を完全に阻止
するような薬剤の存在下で培養しても、ＲＮＡは時間と
共に増加することはない。一方、このような薬剤で部分
的に増殖が阻止されるような生物の場合は、ゆっくりと
したＲＮＡの増加を示す。
【０４２８】阻害されない培養菌は、その薬剤を含まな
い対照培養菌と同じ速度のＲＮＡ増加を示す。
【０４２９】この一例が、臨床的喀痰試料中のヒト型結
核菌Mycobacterium tuberculosisの感受性の測定であ
る。
【０４３０】そのような試料を診断する第１段階は、抗
酸菌を検出するための染色用にその喀痰の直接塗沫標本
をつくることである。陽性の直接塗沫標本を得るには、
喀痰１mlにつき、最低104 〜105 個のヒト型結核菌が必
要であると推定される。しかし、増殖培養法ではたった
10〜100 個のこれら微生物が回収される。
【０４３１】もし、その喀痰標本が塗沫陽性を示すなら
ばその標本を処理して、マイコバクテリア以外のすべて
の細菌を殺し、処理標本の希釈物を抗菌剤を含む寒天培
地と薬剤を含まない対照寒天上で平板培養する。
【０４３２】生活力のある個々の細菌は、対照寒天上で
はコロニーを形成するが、特定の抗菌剤を含む寒天上で
は増殖が阻止される。対照寒天上の数と薬剤処理寒天上
の数に対する比が、その抗菌剤の有効性の尺度である。
【０４３３】小コロニーは最低１０6 個の細菌を含む。
これは、１ヶの細菌からコロニーを形成するには最低２
０回の分割が必要であることを意味し、そして、各分割
には最低１２時間かかるから、全部で240 時間又は１０
日間が最低必要である。大抵の場合にはコロニー出現ま
でにこの長さの２〜４倍（３〜６週間）かかる。
【０４３４】Legionellaについて前に記述した方法は、
抗菌剤−感受性の測定のために必要な時間を著しく短縮
する。
【０４３５】Mycobacterium 属のメンバーに由来するｒ
ＲＮＡにのみ特異的なプローブをそのようなテストに用
いることができる。そのようなプローブを用いれば、Le
gionellaについて前述したものと等しい定量並びに検出
感度を得ることができる。
【０４３６】加速ハイブリダイゼーション条件と過剰プ
ローブ法を用いる核酸ハイブリダイゼーションテスト
は、約200 個のMycobacteria細胞の容易な検出を可能に
する。
【０４３７】ｒＲＮＡが遊離してハイブリダイズするよ
うにMycobacteria細胞の崩壊を確実にするための段階を
加える。Mycobacteriaは、酵素−界面活性剤溶液の存在
下で容易には崩壊しない。
【０４３８】上述のように、最小の陽性喀痰標本（酸性
染色で測定）は、１mlにつき約１０4 〜１０5 個のMyco
bacteria細胞を含みそしてこれらの１０〜１０2 個の細
胞は、コロニー形成単位として検出される。
【０４３９】寒天上の薬剤感受性試験では、抗菌剤が存
在しない対照寒天上に、４０〜５０個のコロニーが出現
するのを確実にするために十分量のMycobacteriaを対照
および実験寒天表面に加える。
【０４４０】もし、核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イを用いてこれを実施すると、これは培養が約５０個の
Mycobacteriaで出発し、検出可能レベルの細胞を得るた
めには約３〜４個の細胞分割又は約２〜３日かかること
を意味する。
【０４４１】もしも、薬剤による顕著な増殖阻害がおき
たならば、対照は陽性で、薬剤を含む培地は陰性にな
る。高感度核酸ハイブリダイゼーション法の使用は、感
受性測定のために要する時間を５〜１０倍短縮すること
ができる。
【０４４２】上記のものは、Legionellaについて記した
ような核酸ハイブリダイゼーションテストを抗菌剤感受
性の測定のために使用する一例である。
【０４４３】どんな微生物の感受性も、標準増殖法と核
酸ハイブリダイゼーションに基づく微生物アッセイとの
組み合わせを用いて測定することができる。
【０４４４】その上、多くの場合では、微生物に対する
核酸ハイブリダイゼーションテストの特異性および感受
性のために、他の微生物および真核細胞が大過剰に存在
している場合でも、特定生物の抗生物質感受性の測定が
可能である。
【０４４５】同じアプローチを用いて、血液、尿その他
の体液および組織およびその他の試料中の抗微生物活性
の存在を測定できることは明らかである。
【０４４６】この場合、本発明核酸ハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、もし抗菌活性がなければ増殖がおこる
という条件下で、血液、尿又はその他の試料と接触して
置かれている特定の微生物群の増殖に、その血液、尿又
はその他の試料が与える影響をモニターし定量すること
ができる。
【０４４７】細胞の増殖状態を測定する方法 細胞内における蛋白合成の全体的速度を細胞あたりのリ
ボソームの数によって測定する。ｔＲＮＡ合成速度もま
た細胞あたりのリボソーム数に関連する。細胞内の蛋白
合成の阻害は、細胞によるｒＲＮＡ合成を停止させる結
果になる。実際に、何らかの手段により細胞増殖が止ま
るとｒＲＮＡ合成の停止がおこり、細胞増殖をスローダ
ウンすると、ｒＲＮＡ合成はスローダウンするという結
果になる。
【０４４８】合成されたばかりのｒＲＮＡ分子は、リボ
ソームにある成熟ｒＲＮＡ分子サブユニットの集合より
も大きい。
【０４４９】例えば大腸菌(E.coli)のｒＲＮＡの長さが
6000塩基対という前駆体分子として合成される。前駆体
は、それから処理を受けてｒＲＮＡサブユニット（合計
約4500塩基）を生じる。それはその後、リボソームおよ
び「エキストラ (extra)」又は前駆体特異的ｒＲＮＡ
（ｐｓｒＲＮＡ）配列に組み込まれる。これらは、結局
は細胞によって分解される。
【０４５０】ｒＲＮＡは、増殖していない細胞中では合
成されない。従って、前駆体特異的ｒＲＮＡ配列もこれ
ら細胞には存在しない。この場合、多数のｒＲＮＡ分子
は細胞中に存在するが、ｐｓｒＲＮＡ配列は存在しな
い。
【０４５１】ゆっくり増殖する細胞では少量のｒＲＮＡ
前駆体が合成され、少量のｐｓｒＲＮＡが存在する。
【０４５２】速く増殖する細胞では大量のｒＲＮＡ前駆
体が合成され、数千のｐｓｒＲＮＡ配列が存在する。
【０４５３】細胞中にｐｓｒＲＮＡがないのは、細胞が
増殖していないという信号である。細胞内のｐｓｒＲＮ
Ａに対するｒＲＮＡの比は、細胞の増殖速度の指標であ
る。
【０４５４】抗菌剤は細胞増殖を阻害する。その薬剤に
よって増殖を阻害されない細胞は、大量のｐｓｒＲＮＡ
を含む。部分的に増殖を阻害される細胞では、ｐｓｒＲ
ＮＡはより少量存在する。ｒＲＮＡ：ｐｓｒＲＮＡの比
は阻害程度の尺度である。
【０４５５】特定の微生物群のｐｓｒＲＮＡ配列に特異
的な核酸プローブを核酸ハイブリダイゼーションテスト
に用いて、特定の抗微生物剤又はそのような薬剤群の存
在および不存在下で生物が成長する場合のこれら微生物
中のｐｓｒＲＮＡの存在又は不在を決定し定量すること
ができる。
【０４５６】これは、関心のある微生物群に関係のない
大量の生物が存在する場合でも可能である。
【０４５７】又、この核酸ハイブリダイゼーション法を
用いて血液、尿その他の体液および組織およびその他の
試料中に、抗微生物活性をもった物質が存在するかどう
かを決定することも当然である。
【０４５８】この細胞増殖測定方法を用いてｒＲＮＡを
合成するあらゆる細胞の増殖状態を決定することができ
る。上記の例はそのような方法に用いられる多くの例の
１つに過ぎない。
【０４５９】特定の生物群又は細胞群のｐｓｔＲＮＡ配
列に特異的なプローブを用いる方法を利用して、これら
生物又は細胞の増殖状態を決定することもできる。
【０４６０】又、速く増殖する生物には豊富にあり、増
殖しないかゆっくり増殖する細胞には存在しないか少量
しかない或る種のｍＲＮＡ，ｐｓｍＲＮＡ，ｈｎＲＮ
Ａ，ｐｓｈｎＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ，又はｐｓｓｎＲＮＡ
に特異的なプローブの利用に基づく方法を用いてこれら
生物又は細胞の増殖状態を測定することもできる。
【０４６１】例えば、速やかに増殖する細胞には、ＲＮ
Ａポリメラーゼという蛋白質に対するｍＲＮＡが豊富
に、即ち１細胞あたり数百コピー存在する。増殖してい
ない細胞ではほんの少しのＲＮＡが合成され、ｍＲＮＡ
はほとんど存在しない。
【０４６２】上記ウイルスが細胞中で速やかに増殖して
いる時には豊富にあり、ウィルスが細胞にはあるが増殖
していない時にはない或る種のウィルスｍＲＮＡ又はｐ
ｓｍＲＮＡに特異的なプローブの利用に基づく方法を用
いて細胞内のウィルスの増殖状態を測定することもでき
る。
【０４６３】こうして或る特定カテゴリーに属する生物
のメンバーが試料中にあることがわかっている状態で
は、単一のプローブを用いて上記生物の増殖状態を測定
することができる。
【０４６４】例えば、その生物にｐｓｒＲＮＡが検出で
きなければ、それは増殖していない状態にある。もしｐ
ｓｒＲＮＡがその生物に検出されはしたが、そこにある
生物の数に比べて相対的に少量である場合には、その生
物はゆっくり増殖している。もしそこのある生物の数に
比して多量のｐｓＲＮＡが検出されるならば、その生物
は速やかに増殖している。
【０４６５】特定の生物又は生物クラスの増殖状態を測
定する又は別のアプローチは２つのプローブの利用に基
づく。その各々は、特定カテゴリーの生物に由来するＲ
ＮＡにのみハイブリダイズし、１つのプローブは、増殖
しない生物又は細胞でも、速やかに増殖する生物又は細
胞でも大体同量前記生物中に存在する安定ＲＮＡ（ｒＲ
ＮＡ又はｔＲＮＡ）に特異的である。他のプローブは速
やかに増殖する細胞には豊富にあり、増殖しない生物又
は細胞には存在しないかもしくは少量存在する特定のｍ
ＲＮＡ，ｐｓｍＲＮＡ，ｐｓｔＲＮＡ，ｐｓｓｎＲＮ
Ａ，ｈｎＲＮＡ，ｐｓｈｎＲＮＡ又はｐｓｒＲＮＡ又は
ｐｓｒＲＮＡ配列（１又は複数）に特異的である。これ
らのプローブは、それぞれに特異的で試料中に存在する
ＲＮＡ量を検出、同定及び定量するために用いられる。
これらのＲＮＡの量比は、その生物又は細胞の増殖状態
の指標を示す。
【０４６６】本発明の特定の実施例として、試料中に存
在するｒＲＮＡおよびｐｓｒＲＮＡを検出、同定、定量
するために２種のプローブを使用する。一方のプローブ
は特定のカテゴリーの生物又は細胞のｒＲＮＡに特異的
であり、他方のプローブは同一カテゴリーの生物又は細
胞のｐｓｒＲＮＡに特異的である。
【０４６７】試料中にあるｐｓＲＮＡ：ｒＲＮＡの量の
比は、その生物又は細胞の増殖状態の指標である。速や
かに増殖する細胞ではｐｓｒＲＮＡの数千のコピーがあ
りｐｓｒＲＮＡ／ｒＲＮＡの比は最大である。ゆっくり
増殖する細胞では比較的少量のｐｓｒＲＮＡがあり、ｐ
ｓｒＲＮＡ／ｒＲＮＡの比はずっと小さくなる。
【０４６８】増殖していない細胞ではｐｓｒＲＮＡはな
い筈であり、ｐｓｒＲＮＡ／ｒＲＮＡの比は最小であ
る。
【０４６９】この同じ２プローブ法は、上記のプローブ
の異なる種々の組合わせで用いられる。プローブで検出
される前記の特殊のカテゴリーのメンバーではない生物
又は細胞の存在下で行われ得る。
【０４７０】ここに述べた特殊カテゴリーの生物の増殖
状態を測定するための方法の明白な応用は、血液，尿そ
の他の体液又は組織又はその他の試料中の抗菌剤の存在
を決定するために、又、特定の抗菌剤又はそのような薬
剤群に対する、特定カテゴリーの生物の感受性を決定す
るためにこれらの方法を使用することである。
【０４７１】例えば、特定の薬剤によって増殖を完全に
阻害される細菌は最小のｐｓｒＲＮＡ／ｒＲＮＡ比をも
つ。
【０４７２】ウィルスの検出、同定および定量 特定のウィルス又はウィルス群が試料中にあるかどうか
を速やかに決定できることは、しばしば重要である。こ
れは、ここに記載の核酸ハイブリダイゼーションテスト
により達せられる。
【０４７３】（ａ）溶液内ハイブリダイズに使える核酸
を速くつくる方法、（ｂ）核酸ハイブリダイズの速度を
著しく促進する方法、（ｃ）ハイブリダイズしたプロー
ブの存在をアッセイする迅速な方法を組み合わせた迅速
な核酸ハイブリダイゼーションテストが、関心のウィル
ス群に相補的な核酸プローブの使用によって試料中にあ
るＤＮＡ又はＲＮＡウィルス群の検出、同定および定量
に直接応用できる。
【０４７４】その上、そのようなウィルスアッセイ法を
用いて特定の抗ウィルス剤の効力を測定したり、血液、
尿およびその他の試料中の抗ウィルス活性の存在を測定
することができる。
【０４７５】生物の食細胞の検査によって微生物感染を
検出する方法 上述のｒＲＮＡに特異的な核酸ハイブリダイゼーション
テストの特徴である検出の極端に高い感受性および特異
性は、微生物診断用の適切な臨床標本を得ることに関し
ておこる問題に簡単な解決を与える。
【０４７６】多くの場合、白血球（以後ＷＢＣと記す）
フラクションを含む簡単な血液テスト試料で十分であ
る。
【０４７７】このＷＢＣアプローチを用いる一つのやり
方は、まず、ＷＢＣ試料をすべての細菌群のメンバーか
ら分離したｒＲＮＡにハイブリダイズし、その他の起原
に由来するｒＲＮＡには、ハイブリダイズしない標識プ
ローブとハイブリダイズさせることである。そのような
プローブは、どんな細菌にとっても一般的スクリーニン
グ手段として役立つ。
【０４７８】細菌ｒＲＮＡにポジティブである試料は、
それから更にその存在する細菌を同定するために、その
他のプローブで段階的にアッセイを受ける。
【０４７９】例えば、エンテロバクター（Enterobacte
r）科のメンバー由来のｒＲＮＡにはハイブリダイズす
るが、その他のあらゆる起源に由来するｒＲＮＡにはハ
イブリダイズしないプローブを用いてエンテロバクター
（Enterobacter）菌を検出又は除外することができる。
一方、嫌気菌のｒＲＮＡにのみ特異的なプローブは、嫌
気菌を見出すために用いられる。
【０４８０】上記の例証は、核酸ハイブリダイゼーショ
ンによって微生物感染を速やかに診断するための最初の
臨床試料としてＷＢＣを用いる多くの可能な方法の中の
一つに過ぎない。例えば、診断のためには、患者の臨床
症状によってプローブの異なる組み合わせが用いられ
る。
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【０５１７】明細書および請求の範囲中に用いられてい
る用語の定義を、次に記す。
【０５１８】用語の定義 塩基：下記ヌクレオチドの項参照。
【０５１９】不適性塩基対：下記不完全相補的な塩基配
列の項参照。
【０５２０】塩基配列（ヌクレオチド配列又は遺伝子配
列又はポリヌクレオチド配列又は１本鎖核酸配列）：複
数の塩基から成るＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【０５２１】相補的塩基対：或る塩基は、互いに化学的
親和性を有し、対を形成する。この場合、塩基は互いに
相補的であるという。相補的塩基対は、ＤＮＡではＡ：
ＴとＧ：Ｃ、ＲＮＡではＡ：Ｕである。
【０５２２】相補的鎖又は相補的塩基配列：完全に相補
的な核酸分子とは、１分子中の各塩基が他の鎖中の相補
的な塩基と対になって、安定な２重らせん分子を形成す
る核酸分子をいう。その個々の鎖を相補的鎖という。
【０５２３】クリテリオン：最も正確には、２本鎖核酸
の融解温度と、ハイブリダイゼーションが行われる温度
との差と定義される。２本鎖核酸の融解温度は、主とし
て、溶液の塩濃度によって定まる。クリテリオンは、２
本の１本鎖が安定な２本鎖分子を形成するために必要な
相補性の程度を定める。クリテリオンは、ストリンジェ
ントであるとか、ストリンジェントではない、と記載さ
れる。高度にストリンジェントなクリテリオンでは、２
本の相互作用する相補的配列が高度に相補的であって、
安定な２本鎖分子が形成されることが要求される。スト
リンジェントでないクリテリオンとは、比較的似ていな
い相補的鎖が相互に作用して２本鎖分子を形成すること
を可能とするクリテリオンである。高度なストリンジェ
ントでは、２本鎖分子中に少量の不適性塩基対の存在し
か許されない。あまりストリンジェントでないクリテリ
オンでは、ハイブリダイゼーション産物中に多量の不適
性塩基対が許される。
【０５２４】核酸の変性又は解離：２本鎖核酸分子中の
塩基対間の結合が切れ、２本の１本鎖分子を生成し、こ
れらがその後拡散して互いに離れる。
【０５２５】２本鎖核酸：細胞中でみられるように、大
部分のＤＮＡは２本鎖の状態にある。ＤＮＡは、らせん
状に互いに巻きついた２本のＤＮＡ分子又は鎖から成
る。塩基は内側に向き合って、互いに、別の鎖の相補的
塩基に特異的に結合する。例えば、１本の鎖のＡは常に
他の鎖のＴと対になり、１本の鎖のＧは他の鎖のＣと対
になる。細菌細胞では、２本鎖分子は約５×１０6 塩基
対の長さである。この分子の１本の鎖の塩基の各々は、
他の鎖のそれに相補的な塩基と対になる。個々の２本鎖
分子の塩基配列は相補的鎖と称される。
【０５２６】ハイブリダイゼーション：下記核酸ハイブ
リダイゼーションの項参照。
【０５２７】不完全相補的な塩基配列（不適性塩基
対）：２本の鎖の間で安定な２本鎖分子が形成される
が、一方の鎖のある塩基部分が、他の鎖の非相補的塩基
と対になっている場合をいう。
【０５２８】標識プローブ又は標識配列：核酸ハイブリ
ダイゼーションによって他の核酸を検出するのに用いる
１本鎖核酸分子。プローブ分子は、特異的に検出され得
るように標識されている。これは、特定の標識分子を核
酸に取り込ませるとか、特定の標識を核酸に結合させる
ことによって達せられる。
【０５２９】最も有効なプローブは、それ自身はハイブ
リダイズしないが、検出すべき核酸が存在する場合のみ
ハイブリダイズすることのできる、標識した１本鎖核酸
配列である。非常に多種類の異なる標識が使える。これ
らの中には、放射性物質，蛍光物質，および化学発光物
質などが含まれる。
【０５３０】核酸ハイブリダイゼーション又はハイブリ
ダイゼーション（再対合又は復元）：２本鎖分子の２本
の鎖間の結合が切れて、２本の１本鎖が互いに完全に分
離することがある。適当な条件下では、これらの相補的
な１本鎖は衝突し、互いを認識し、２重らせん分子を再
形成し得る。このような相補的１本鎖分子から２本鎖分
子が形成されるプロセスを核酸ハイブリダイゼーション
という。核酸ハイブリダイゼーションは、部分的に相補
的なＲＮＡおよびＤＮＡの１本鎖間でもおこり得る。
【０５３１】ヌクレオチド、ヌクレオチド塩基又は塩
基：大部分のＤＮＡは、たった４種類の窒素含有塩基の
配列から成る。即ちアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グ
アニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）である。これらの塩基が
組み合わさって遺伝アルファベットを形成し、それらの
長い規則正しい配列は、遺伝暗号の形で遺伝子情報を数
多く含む。大部分のＲＮＡもまた４種類だけの塩基の配
列から成る。しかし、ＲＮＡではチミンの変わりにウリ
ジン（Ｕ）が入る。
【０５３２】再対合：上記核酸ハイブリダイゼーション
の項参照。
【０５３３】復 元：上記核酸ハイブリダイゼーション
の項参照。
【０５３４】リボソームＲＮＡすなわちｒＲＮＡ：リボ
ソーム中にあるＲＮＡ。ほとんどすべてのリボソーム
は、３種類の１本鎖ＲＮＡサブユニットを含む。その１
つは大きく、１つは中位で、１つは小さい。
【０５３５】リボソーム：蛋白合成に必要な細胞内粒子
（ＲＮＡと蛋白質とを含む）。ウィルス以外のすべての
生命体はリボソームを含む。
【０５３６】ｒＲＮＡ ＤＮＡ又はｒＲＮＡ遺伝子：リ
ボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ中の塩基配列。各ｒ
ＲＮＡサブユニットは別個の遺伝子によってコードされ
る。
【０５３７】ｒＲＮＡプローブ：ｒＲＮＡに相補的で、
ｒＲＮＡにハイブリダイズして安定な２本鎖分子を形成
する標識核酸配列。ｍＲＮＡ：ｍＲＮＡは、特定の蛋白
質を規定するのに必要な情報を含む直接の遺伝産物であ
る。細胞の機序によって、ｍＲＮＡの配列が特定の蛋白
質に変換される。各細胞には多くの異なるｍＲＮＡが存
在する。
【０５３８】ｈｎＲＮＡ：真核細胞の核中に存在するＲ
ＮＡ配列の複雑な一群であって、前駆体ｍＲＮＡ分子を
含む。殆どのｈｎＲＮＡ配列は核からでることはない。
これらの分子の大部分は機能がわかっていない。
【０５３９】ｓｎＲＮＡ：主として真核細胞の核中にて
大量に存在する比較的安定な小さい核ＲＮＡの一群。
【０５４０】前駆体ＲＮＡ：原核生物及び真核生物にお
ける多くのＲＮＡ分子は大きいＲＮＡ分子の一部として
合成され、それから種々のタイプの成熟ＲＮＡ分子とそ
の他のより小さい配列（これは明らかにすてられる）が
形成される。
【０５４１】前駆体特異的ＲＮＡ（ｐｓＲＮＡ）：前駆
体ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ，ｈｎＲ
ＮＡに存在し、成熟ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｓ
ｎＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡ分子には存在しないＲＮＡ
配列。
【０５４２】２本鎖核酸分子の熱安定性：熱安定性、す
なわち２本鎖分子集団の半分が１本鎖形に変化する融解
温度。
【０５４３】制限酵素：異種核酸に対する制限−修飾細
胞防御システムの成分。これらの酵素は、非修飾（例え
ばメチル化）２本鎖ＤＮＡをある一点で、二重対称を示
す特定配列のところで切断する。
【０５４４】トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）：蛋白
合成が行われている間、個々のアミノ酸は種々の特異的
アダプター分子すなわちｔＲＮＡ分子によって正しい順
序に並ばされる。各アミノ酸は、異なるｔＲＮＡ種によ
って配列させられる。
【０５４５】以上本発明を詳細に例を挙げて説明した
が、この発明の精神に反することなく、種々の変更、同
等物および別法の使用が可能であり、そのような変更、
同等物および別法のすべては、添附の請求の範囲内に含
まれることは明らかである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特定の微生物、細胞又は細胞内ウィルス
    の抗菌剤又は抗ウィルス剤に対する感受性を調べ、前記
    抗菌剤又は抗ウィルス剤の存在下における前期微生物、
    細胞又は細胞内ウィルスの増殖状態を知るための方法で
    あって、 イ）微生物、細胞又は細胞内ウィルスを増殖条件下で１
    種類又はそれ以上の抗菌剤又は抗ウィルス剤と接触させ
    る段階と、 ロ）生成した混合物をインキュベートする段階と、 ハ）上記微生物、細胞又は細胞内ウィルスの増殖状態を
    遺伝プローブ・ハイブリッド化技術により特定の増殖状
    態に対応する上記微生物、細胞又は細胞内ウィルス中の
    ＲＮＡの存在を測定する段階、から成ることを特徴とす
    る方法。
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