KR100923303B1 - 10 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 10 종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 10 종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법 - Google Patents
10 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 10 종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 10 종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 12 종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 12 종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
프라이머, 프로브, 독성인자
Description
도 1은 본 발명의 10개 종의 박테리아에 각각에 특이적으로 발현되는 독성인자 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 모두 포함하는 프라이머 세트를 프라이머로 사용하고, 상기 10개 박테리아 종의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭된 산물을, 표 1에 나타낸 12개 종 중 10개 종의 독성인자 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에 혼성화한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 내지 6은 본 발명의 12개의 프라이머 세트 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애에 특이적인 프라이머 세트를 제외한, 10개 프라이머 세트를 사용하여 단일 PCR 및 다중 PCR한 결과 얻어진 산물을 전기영동한 결과를 나 타내는 도면이다.
본 발명은 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 12 종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 12 종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
종래 호흡기 질환과 관련되는 박테리아를 검출하기 위한 프로브가 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,830,654호에는 약 14 내지 18 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)를 위한 혼성화 분석 프로브가 개시되어 있다. 미국특허 제5,525,718호에는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 특정한 유전자 (예, entE)에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제6,001,564호에는 각 에세리리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데미스 (Staphylococcus epidermis), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 및 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)에 특이적 프라이머 또는 프로브가 개시되어 있다.
상기한 바와 같은 종래 기술에 의하더라도 호흡기 질환과 관련되는 것으로 알려진 12 종의 박테리아에 각각 특이적인 독성 인자 유전자 중의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 개시된 바 없다. 또한, 이들 각 종의 표적 서열에 대하여 특이적인 프로브는 개시된 바 없다.
뉴클레오티드로 구성된 핵산의 2개의 단일가닥은 혼성화하여 이중나선 구조를 형성하는데, 반대 방향으로 달리는 상기 2개의 폴리뉴클레오티드는 매치되는 "염기" 쌍 사이의 수소 결합에 의하여 결합되어 있다. 핵산의 제1 단일 가닥이 제2 단일가닥에 충분하게 상보적인 경우 상기 2개의 가닥은 혼성화를 촉진하는 조건하에서 결합하여, 이중 가닥 핵산이 얻어진다. 적절한 조건 하에서, DNA/DNA, RNA/DNA 또는 RNA/RNA 혼성체가 형성될 수 있다.
넓게는, 2개의 기본적 핵산 혼성화 과정이 있다. 하나는 "용액 중 (in solution)" 혼성화로 알려져 있으며, "프로브" 핵산 서열과 시험 시료로부터의 핵산 분자는 용액 중에 유리되어 있다. 다른 방법은, 상기 시료 핵산이 보통은 고체 기판에 고정화되어 있고, 프로브 서열은 용액 중에 유리되어 있다.
프로브는 검출될 핵산 서열 ("표적 서열")에 어떤 특정한 정도로 상보적인 단일가닥 핵산 서열일 수 있다. 프로브는 표지되어 있을 수 있다. 특정한 핵산 서열의 검출을 위한 과정으로서 핵산 혼성화를 사용하는 것에 대한 사항은 미국특허 제4,851,330호 및 제5,288,611호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.
본 발명의 목적은 12 종의 호흡기 질환 박테리아의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 표적 서열에 특이적인, 12 종의 호흡기 질환 박테리아 중 하나 이상을 검출하기 위한 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 12 종의 호흡기 질환 박테리아 중 하나 이상을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴 클레오티드 세트; 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세 트; 서열번호 13의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 15의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 17의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 19의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 21의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 23의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 특이적으로 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 상기 표적 서열은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 것이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2 의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 13의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 15의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 17의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 18의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 19의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 21의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 23의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 24의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 것인, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리 고뉴클레오티드 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 표적 서열 중 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250 번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트는 12 종의 호흡기질환을 야기시키는 박테리아로부터 특이적으로 발현되는 독성인자를 코딩하는 독성인자 유전자의 영역으로부터 제작되었다. 상기 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아 및 각 박테리아에 특이적으로 발현되는 독성인자를 코딩하는 유전자는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자로 구성된다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR하는 경우, 증폭할 수 있는 표적 서열 영역은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레 오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 상기 12 종의 호흡기질환을 야기시키는 박테리아의 특이적으로 발현되는 독성인자를 코딩하는 유전자의 표적 서열 내의 서열로 구성된다. 바람직한 프라이머 세트의 일 예 및 그에 의하여 증폭되는 표적 서열 구간은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1. 본 발명의 프라이머 세트의 일 예 및 그에 의하여 증폭되는 표적 구간
| 박테리아종 및 독성인자 유전자 | 프라이머(서열번호) | 증폭구간 |
| 아시네토박터 바우마니 adeB 유전자 | 1 | 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역 |
| 2 | ||
| 보데텔라 퍼트시스 Tcf 유전자 | 3 | 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역 |
| 4 | ||
| 클라미도필라 뉴모니애 Omp 유전자 | 5 | 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역 |
| 6 | ||
| 엔테로박터 에어로젠스 tsx 유전자 | 7 | 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역 |
| 8 | ||
| 엔테로박터 클로아케 rpoS 유전자 | 9 | 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역 |
| 10 | ||
| 에세리키아 콜리 uspA 유전자 | 11 | 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역 |
| 12 | ||
| 클렙시엘라 뉴모니애 Wab 유전자 | 13 | 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역 |
| 14 | ||
| 레지오넬라 뉴모필라 Mip 유전자 | 15 | 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역 |
| 16 | ||
| 모락셀라 카타랄리스 cop 유전자 | 17 | 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역 |
| 18 | ||
| 미코플라즈마 뉴모니애 P1 유전자 | 19 | 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역 |
| 20 | ||
| 슈도모나스 애루지노사 ETA 유전자 | 21 | 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역 |
| 22 | ||
| 스트렙토코커스 뉴모니애 lytA 유전자 | 23 | 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역 |
| 24 |
본 발명은 또한,
서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 32 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 34 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 36 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 40 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 45 내지 46로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 47 내지 48로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 49의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 50 내지 51로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 52 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 56 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이사의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 32 내지 33로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 34 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 36 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 40 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티 드를 포함하는, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 45 내지 46으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 47 내지 48로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 49의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 50 내지 51로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 52 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 56 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 25 내지 27의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28 내지 31의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 32 내지 33의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 34 내지 35의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 36 내지 39의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클 레오티드를 포함하는, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 40 내지 44의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 45 내지 46의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 47 내지 48의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 49의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 50 내지 51의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 52 내지 55의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 56 내지 58의 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자의 126번 내지 250번 뉴클레오티드 영역, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자의 64번 내지 449번 뉴클레오티드 영역, 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae) Omp 유전자의 413번 내지 684번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자의 1267번 내지 1710번 뉴클레오티드 영역, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자의 797번 내지 934번 뉴클레오티드 영역, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자의 855번 내지 999번 뉴클레오티드 영역, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자의 89번 내지 442번 뉴클레오티드 영역, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자의 105번 내지 490번 뉴클레오티드 영역, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자의 77번 내지 308번 뉴클레오티드 영역, 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae) P1 유전자의 4207번 내지 4618번 뉴클레오티드 영역, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자의 252번 내지 802번 뉴클레오티드 영역, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자의 137번 내지 363번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 프로브 세트는 각각 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 증폭된 PCR 산물로서, 상기 12 종의 박테리아의 각각에 특이적으로 발현되는 독성인자 유전자에 표적 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트는 상기 12 종의 박테리아를 구별할 수 있다. 본 발명의 프로브 세트는 상기 12 박테리아 종에 특이적인 독성인자 유전자를 탐색하고, 탐색된 상기 독성인자 유전자 중의 각 표적 영역 중에 존재하는 서열로부터 각 종에 특이적으로 존재하는 서열을 선발하여 제작되었다.
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 조합하여 이중가닥 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄 격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기한 바와 같다.
본 발명은 또한,
시료를 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 12종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 시료는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 12종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아로부터 유래된 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것인 방법이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 핵산은 염색체 DNA, cDNA 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법이다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 및 방사성을 발하는 물질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법이다.
본 발명의 방법의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된 다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 박테리아의 검출은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 PCR 산물을 표지하고, 이를 상기 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 또한, 상기 PCR 산물은 혼성화 전 또는 후에 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 PCR 산물과 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 사용 설명서를 포함하는, 시료 중 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커 스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 12종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 사용 설명서는 상기 프라이머 세트를 상기 12종 각각에 특이적인 독성인자 유전자를 증폭하기 위한 증폭용 프라이머로서 사용할 수 있도록 지시하는 내용을 포함한다. 상기 키트는 상기 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 증폭반응 예를 들면, PCR에 의하여 생성된 특정한 종에 특이적인 산물이 존재하는 경우, 상기 박테리아 종이 존재하는 것으로 판단하도록 한다. 상기 키트에는 증폭용 시약, 및 검출을 위한 표지를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트의 일 예는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 추가로 포함하는, 시료 중 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 클라미도필라 뉴모니애 (Chlamydophila pneumoniae), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 12종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선 택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하기 위한 키트이다. 상기 프로느는 상기 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 증폭반응에서 얻어진 산물을 검출할 수 있도록 한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1 : 호흡기 질환을
야기시키는
12 종의 박테리아에 공통적인 표적 서열을 증폭하기 위한
프라이머의
선발
본 실시예에서는 12 종의 박테리아 각각에 특이적으로 발현되는 독성인자를 코딩하는 유전자를 선발 및 그를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브를 설계하였다.
(1) 프라이머의 설계
먼저, 호흡기 질환 관련된 데이터베이스 (예, http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/virufact.html) 및 관련 문헌조사를 통하여 박테리아 종 및 그에 특이적인 독성인자 유전자를 선발하였다. 서열 정렬 (sequence alignment) 등의 방법을 사용하여, 1차적으로 14종의 26개 독성인자 유전자를 탐색하였고, 이를 다시 blastn 프로그램을 이용하여 공지된 데이터베이스 (예, NCBI GENBANK)에 저장되어 있는 서열과 서열 유사성을 조사하여, 최종적 으로 12개 종의 12개 독성인자 유전자를 선발하였다.
상기 선발된 12개 종의 12개 독성인자 유전자로부터 상기 각 독성인자 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하였다. 프라이머 설계에는, Santalucia 98 파라미터 (Santalucia J, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1460-1465 (1998))를 활용하여 열역학적 계수를 결정하였다. 프라이머 및 프로브 설계의 변수는 다음과 같다. ambiquity_code 개수: 0, GC 함량: 30-70%, 비특이적 결합 매치 : 4bp 이상은 제외, 타종과 10bp 이상 연속되는 서열이 없는 경우, 프라이머 길이: 19-23bp, 반복서열 제외, △G =137078-162324, △TM =10℃, 대조종과의 매치 수: 8, 9, 암플리콘 길이: 60-400bp.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같은 12개의 종 중에서 각 종에 특이적으로 존재하는 독성인자 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트를 설계하였다.
(2) 프로브의 설계
DNAstar 프로그램을 이용하여 각 유전자의 증폭된 영역으로부터 프로브를 선발하였다. 그 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2.
실시예
2: 본 발명의
프라이머
세트를 이용한 10 종의 호흡기 질환과 관련된 박테리아 각각에 특이적인 독성인자 유전자의 증폭
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 표 1에 나타낸 12종 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애를 제외한 10 종의 호흡기 질환을 유발하는 박테리아의 각 종에 특이적인 독성인자 유전자를 단일 PCR 및 다중 PCR에 의하여 증폭하였다. 모든 전위 프라이머 및 역위 프라이머에는 5' 말단이 Cy-3로 표지된 프라이머를 사용하였다. 프라이머로는 서열번호 1 내지 4, 서열번호 7 내지 18 및 서열번호 21 내지 24의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
(1) 박테리아 배양물의 준비
10종 박테리아의 배양 분리체 (cultural isolate)는 아태감염연구재단 (Asian-Pacific Research Foundation for Infectious Diseases, ARFID)에서 제공받을 것을 사용하였다.
(2) 단일 PCR
먼저, 대조군 박테리아 및 상기 중 10 종의 표적 박테리아의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 실시예 1에서 제작된 12개의 프라이머 세트 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애에 특이적인 프라이머 세트를 제외한, 각 세트를 프라이머로 하여 단일 PCR (single PCR)을 수행하여 각 표적 서열을 특이적으로 증폭하는지를 확인하였다. 대조군 박테리아는 복수 종의 박테리아를 포함하는 6개 군으로 나누었으며, 그룹 1은 Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Bacillus subtilis, Bordetella avium, Bordetella bronchiseptica 및 Citrobacter freundii로 구성되고, 그룹 2는 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Gemella melitensis, Haemophilus aphrophilus, Klebsiella oxytoca, Moraxella nonliquefaciens, Morganella morganii 및 Proteus mirabilis로 구성되고, 그룹 3은 Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Shigella flexneri, Shigella sonnei, 및 Staphylococcus cohnii로 구성되고, 그룹 4는 Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus gallinarium, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus xylosus, CNS, 및 Streptococcus agalactiae (group B)로 구성되고, 그룹 5는 Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius/milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus pyogens, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Streptococcus sanguinis 및 Streptococcus suis로 구성되고, 그룹 6은 Acinetobacter haemolyticus, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, Salmonella bongori, Shigella boydii, Salmonella choleraesuis, Shigella flexneri, Shigella sonnei, 및 Salmonella typhimurium으로 구성된다.
단일 PCR (single PCR) 조건은 다음과 같다. MgCl2 1.5mM, dNTP 250 mM, 트리스-HCl (pH 9.0) 10 mM 및 Taq 폴리머라제 1 유니트, 프라이머 약 2 pmol을 포함하는 혼합액 중에 G-스핀 게놈 DNA 추출 키트 (iNtRON 사)로부터 추출된 게놈 DNA 2㎕를 포함하는 20㎕의 반응액을 95℃에서의 변성 10초, 60℃에서의 어닐링 10초 및 60℃에서의 연장 13초를 25회 반복하였으며, 작동시간은 29분 5초이었다.
그 결과, 각 단일 PCR에 의하여 상기 호흡기 질환과 관련되는 10개의 종의 독성인자 유전자의 표적서열이 특이적으로 증폭되었다 (도 2 참조). 도 2에서 S는 단일 PCR을 나타내고, M은 다중 PCR을 나타내며, 숫자는 다른 시료를 나타낸다. 대조군의 경우, 호흡기 질환을 유발하지 않은 Shigella 종을 제외하고는 표적 유전자를 증폭하지 못하였다 (데이터는 나타내지 않음).
(3) 다중 PCR
다음으로, 본 실시예에서는 상기 10 종의 호흡기 질환과 관련된 박테리아로부터 DNA를 분리한 다음, 표 1에 나타낸 12개의 프라이머 세트 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애에 특이적인 프라이머 세트를 제외한, 10개 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR을 수행하고, 그 산물을 본 발명의 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 사용한 혼성화 반응 및 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 확인하였다. 대조군 박테리아는 상기 단일 PCR에서 사용된 박테리아 군을 사용하였다.
다중 PCR에 사용된 PCR 믹스 조성은 다음과 같았다. 증류수 10.5㎕, 10x버퍼 7.5㎕, dNTP 200 μM (각각) 1㎕, 말단 표지된 프라이머 400nM (각각) (Bioneer, 한국) 20㎕, 추출된 게놈 DNA 5㎕, Taq 폴리머라제 5 유니트 1㎕를 포함하는 총 50㎕ 반응액을 사용하였다. 양성 대조군으로 사용되는 인간 MODY e9 DNA를 사용하였다. 다중 PCR 반응액은 상기 표 1에 나타낸 12개의 프라이머 세트 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애에 특이적인 프라이머 세트를 제외한, 10개의 프라이머 세트에 더하여, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 3,300 bp 23S rRNA 유전자의 A02 및 A07 영역에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 사용하였다. 즉, A02 및 A07 영역에 대한 프라이머를 유니버설 프라이머로 사용하였다. 상기 A02에 특이적인 프라이머는 포워드 프라이머로서 서열번호 59의 올리고뉴클레오티드 및 리버스 프라이머로서 서열번호 60의 올리고뉴클레오티드이고, 상기 A07에 특이적인 프라이머는 포워드 프라이머로서 서열번호 61의 올리고뉴클레오티드 및 리버스 프라이머로서 서열번호 62의 올리고뉴클레오티드이다. 상기 A02 및 A07 영역은 23S rRNA 유전자의 853번 내지 1353번 뉴클레오티드 영역 및 23S rRNA 유전자의 2483번 내지 2932번 뉴클레오티드 영역을 나타낸다.
다중 PCR 조건은 95℃에서 1분 동안 초기 변성, 95℃에서 5초 동안 변성 및 62℃에서 13초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 연장 반응을 25회 반복하고, 72℃에서 1분 동안 연장반응을 수행하였다.
얻어진 다중 PCR 산물은 상기 표 1에 나타낸 12개 종 중 10개 종의 독성인자 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에서 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 형광을 측정하였다 (고정화된 프로브에 대하여는 표 3 참조).
상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이는 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 에탄올 중의 GAPTES (감마-아미노프로필트리에톡시 실란) (γ-aminopropyltriethoxysilane) 용액 (농도 20% (v/v)) 또는 GAPDES (감마-아미노프로필디에톡시실란) 용액 (농도 20% (v/v))을 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 CEE 사의 스핀 코터 모델 CEE 70을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120 ℃에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
위와 같이 제조된 아미노 기로 활성화된 기판상에 상기 표 1에 나타낸 12개 종 중 10개 종의 독성인자 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 기판상에 스폿팅하여 고정화하여, 마이크로어레이를 제작하였다.
얻어진 마이크로어레이에 상기 증폭 산물을 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 세척 버퍼로 세척한 다음, GenePix Scanner (Molecular Device 사, 미국)를 이용하여 형광을 측정하였다.
도 1은 본 발명의 10개 종의 박테리아에 각각에 특이적으로 발현되는 독성인자 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 모두 포함하는 프라이머 세트를 프라이머로 사용하고, 상기 10개 박테리아 종의 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 증폭된 산물을, 표 1에 나타낸 12개 종 중 10개 종의 독성인자 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에 혼성화한 결과를 나타내는 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 10개의 종 중에서 각 종에 특이적으로 존재하는 독성인자 유전자가 다중 PCR에 의하여 특이적으로 증폭됨을 알 수 있다. 도 1에서 균주에 대한 약자는, Aba: 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), Bpe: 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), Eae: 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), Ecl: 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), Eco: 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), Kpn: 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), Lpn: 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), Mca: 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), Pae: 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), Spn: 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 설계된 프로브를 사용하여 10 종의 박테리아를 높은 민감도로 검출할 수 있었다.
도 1에서, 프로브가 고정화되어 있는 위치는 다음 표 3과 같다.
표 3.
| 행1 | 행2 | 행3 | 행4 | 행5 | 행6 | 행7 | 행8 | 행9 | 행10 | 행11 | 행12 | |
| 열1 | - | 32 | 33 | - | ||||||||
| 열2 | 46 | 45 | - | 56 | 58 | 57 | - | |||||
| 열3 | 49 | 29 | 30 | 28 | 31 | |||||||
| 열4 | 48 | 47 | - | - | 40 | 41 | 42 | 25 | 26 | 27 | ||
| 열5 | 52 | 53 | 54 | 55 | 34 | 35 | 39 | |||||
| 열6 | 50 | 51 | - | - | - |
표 3에서, 각 행과 열은 각각 2개의 스팟을 나타낸다. 표 3에서, 각 번호는 고정화되어 있는 프로브를 나타내는 서열번호를 나타내고, - 표시는 음성 대조군 프로브를 나타낸다 (서열번호로 표시된 프로브에 대하여는 표 2 참조). 표 3에서, 서열번호로 표시되지 않은 프로브는 본 발명에 청구된 바와는 관계 없는 프로브로서, 상기 표적 서열에 특이적 (예를 들면, 23S rRNA 유전자에 특이적인 프로브) 또는 비특이적인 프로브이나, 본 발명과는 구체적인 관련성이 없으므로 상세한 설명은 생략한다.
도 2 내지 6은 본 발명의 12개의 프라이머 세트 중 클라미도필라 뉴모니애 및 미코플라즈마 뉴모니애에 특이적인 프라이머 세트를 제외한, 10개 프라이머 세트를 사용하여 단일 PCR 및 다중 PCR한 결과 얻어진 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2 내지 6에 나타낸 바와 같이, 10개의 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR 결과 10 개의 표적 서열을 확인할 수 있었으며, 이는 다중 PCR 중에 서열번호 1 내지 4, 서열번호 7 내지 18 및 서열번호 21 내지 24의 프라이머 세트는 상호 표적 서열 특이성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 도 2에서, 화살표는 다중 PCR 결과에서 유니버설 프라이머에 의하여 증폭된 23S rRNA 유전자의 A02 및 A07 표적 영역을 나타낸다. 도 2 내지 6에서, 균주의 약자는 도 1에 대하여 설명한 바와 같다.
본 발명의 핵산 프라이머 세트에 의하면, 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아로부터 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 하여, 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 의하면, 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 12 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아를 높은 특이성을 가지고 효율적으로 검출할 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd.
<120> A primer set for amplifying target sequences of 12 bacterial
species causing respiratory diseases, probe set specifically
hybridizable with the target sequences of the 12 bacterial
species, a microarray having immobilized the probe set and a
method for detecting the presence of one or more of the 12
bacterial species
<130> PN069347
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Claims (38)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드세트 세트;서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 및서열번호 23 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트;를 포함하는 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자 서열을 특이적으로 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
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- 시료를 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하는 방법으로서,상기 프로브는 서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 34 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 36 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 40 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 45 내지 46로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 47 내지 48로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 49의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 52 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및서열번호 56 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 것이고,상기 시료는 제1항에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 1차 시료로부터 유래된 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것인 방법.
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- 제32항에 있어서, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 및 방사성을 발하는 물질인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하기 위한 키트.
- 제37항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하는, 시료 중 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis), 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하기 위한 키트로서,상기 프로브는 서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) adeB 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 28 내지 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 보데텔라 퍼트시스 (Bordetella pertussis) Tcf 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 34 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 에어로젠스 (Enterobacter aerogenes) tsx 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 36 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) rpoS 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 40 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) uspA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 45 내지 46로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) Wab 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 47 내지 48로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) Mip 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 49의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis) cop 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 52 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) ETA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및서열번호 56 내지 58로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) lytA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 것인 키트.
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