KR100846511B1 - 9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 9종의 박테리아의 표적서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브세트를 이용하여 9종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법 - Google Patents
9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 9종의 박테리아의 표적서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브세트를 이용하여 9종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 9종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 9종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
프라이머, 프로브, 23S rRNA
Description
도 1은 23S rRNA 중의 표적 서열의 위치를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 4개의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 한 결과 얻어진 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트, 9종의 박테리아의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 9종의 박테리아의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
종래 호흡기 질환과 관련되는 박테리아를 검출하기 위한 프로브가 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제5,830,654호에는 약 14 내지 18 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)를 위한 혼성화 분석 프로브가 개시되어 있다. 미국특허 제5,525,718호에는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 특정한 유전자 (예, entE)에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제6,001,564호에는 각 에세리리키아 콜리 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데미스 (Staphylococcus epidermis), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 및 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)에 특이적 프라이머 또는 프로브가 개시되어 있다.
상기한 바와 같은 종래 기술에 의하더라도 호흡기 질환과 관련되는 것으로 알려진 9 종의 박테리아에 모두 공통적인 23S rRNA 유전자 중의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 개시된 바 없다. 또한, 이들 각 종의 표적 서열에 대하여 특이적인 프로브는 개시된 바 없다.
뉴클레오티드로 구성된 핵산의 2개의 단일가닥은 혼성화하여 이중나선 구조를 형성하는데, 반대 방향으로 달리는 상기 2개의 폴리뉴클레오티드는 매치되는 " 염기" 쌍 사이의 수소 결합에 의하여 결합되어 있다. 핵산의 제1 단일 가닥이 제2 단일가닥에 충분하게 상보적인 경우 상기 2개의 가닥은 혼성화를 촉진하는 조건하에서 결합하여, 이중 가닥 핵산이 얻어진다. 적절한 조건 하에서, DNA/DNA, RNA/DNA 또는 RNA/RNA 혼성체가 형성될 수 있다.
넓게는, 2개의 기본적 핵산 혼성화 과정이 있다. 하나는 "용액 중 (in solution)" 혼성화로 알려져 있으며, "프로브" 핵산 서열과 시험 시료로부터의 핵산 분자는 용액 중에 유리되어 있다. 다른 방법은, 상기 시료 핵산이 보통은 고체 기판에 고정화되어 있고, 프로브 서열은 용액 중에 유리되어 있다.
프로브는 검출될 핵산 서열 ("표적 서열")에 어떤 특정한 정도로 상보적인 단일가닥 핵산 서열일 수 있다. 프로브는 표지되어 있을 수 있다. 특정한 핵산 서열의 검출을 위한 과정으로서 핵산 혼성화를 사용하는 것에 대한 사항은 미국특허 제4,851,330호 및 제5,288,611호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.
본 발명의 목적은 9 종의 호흡기 질환 박테리아의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 표적 서열에 특이적인, 9 종의 호흡기 질환 박테리아 중 하나 이상을 검출하기 위한 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크 로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 9 종의 호흡기 질환 박테리아 중 하나 이상을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 7의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번 호 8의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 상기 표적 서열은 124번 내지 365번 뉴클레오티드 영역, 853번 내지 1353번 뉴클레오티드 영역, 2483번 내지 2932번 뉴클레오티드 영역 및 3041번 내지 3198번 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상인 것이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 124번 내지 365번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 3의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 5의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 7의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 8의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6 및 7의 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 9의 올리고뉴클레 오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 124번 내지 365번 뉴클레오티드 영역, 853번 내지 1353번 뉴클레오티드 영역, 2483번 내지 2932번 뉴클레오티드 영역 및 3041번 내지 3198번 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트는 9종의 호흡기질환을 야기시키는 박테리아에 공통적인 23S rRNA 유전자의 영역으로부터 제작되었다. 상기 9종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR하는 경우, 증폭할 수 있는 표적 서 열 영역은 S01 (23S rRNA 유전자의 124번 내지 365번 뉴클레오티드 영역), A02 (23S rRNA 유전자의 853번 내지 1353번 뉴클레오티드 영역), A07 (23S rRNA 유전자의 2483번 내지 2932번 뉴클레오티드 영역) 및 A17 (23S rRNA 유전자의 3041번 내지 3198번 뉴클레오티드 영역)로 구성된다. 도 1은 23S rRNA 유전자 중의 표적 서열의 위치를 도식적으로 나타낸 도면이다.
본 발명의 프라이머 세트는 상기 9종의 호흡기질환을 야기시키는 박테리아의 23S rRNA 중에 공통적으로 존재하는 상기 4개의 표적 서열에 존재하는 서열로 구성된다. 바람직한 프라이머 세트의 일 예는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1. 본 발명의 프라이머 세트의 일 예
| 프라이머 명칭 | 서열번호 | 비고 |
| S01-F | 1 | S01 증폭용 포워드 프라이머 |
| S01-R | 2 | S01 증폭용 리버스 프라이머 |
| A02-F | 3 | A02 증폭용 포워드 프라이머 |
| A02-R | 4 | A02 증폭용 리버스프라이머 |
| A07-F | 5 | A07 증폭용 포워드 프라이머 |
| A07-R | 6 | A07 증폭용 리버스 프라이머 |
| A07-R2 | 7 | A07 증폭용 리버스 프라이머 |
| A17-F | 8 | A17 증폭용 포워드 프라이머 |
| A17-R | 9 | A17 증폭용 리버스 프라이머 |
본 발명은 또한,
서열번호 10의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 11 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존 재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 15의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 19의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 20의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 24 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 27의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클 레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 29의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 30 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 23S rRNA 유전자 중의 124번 내지 365번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 32 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존 재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 23S rRNA 유전자의 124-365 영역, 853-1353 영역, 2483-2932 영역 및 3041-3198 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 10의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미 도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 11 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 15의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자의 853-1353 영역 및 2483-2932 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열 번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 19의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 20의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자의 853-1353 영역 및 2483-2932 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성 화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 24 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자의 853-1353 영역 및 2483-2932 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열 번호 27의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 28의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 29의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자의 853-1353 영역 및 2483-2932 영역 으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 30 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 23S rRNA 유전자 중의 124번 내지 365번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 32 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열에 존재하는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편을 포함하는 길이가 10 내지 100bp인 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 11 내지 14의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루 엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 15의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 16 내지 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 21 내지 23의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 24 내지 26의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 27의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 3041번 내지 3198번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 853번 내지 1353번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 29의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 30 및 31의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 23S rRNA 유전자 중의 124번 내지 365번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 32 내지 35의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)의 23S rRNA 유전자 중의 2483번 내지 2932번 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코 커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 23S rRNA 유전자의 124-365 영역, 853-1353 영역, 2483-2932 영역 및 3041-3198 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 프로브 세트는 각각 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 증폭된 PCR 산물로서, 상기 9종의 박테리아에 공통적인 서열인 23S rRNA 유전자 중의 S01, A02, A07 및 A17 표적 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트는 상기 9종의 박테리아를 구별할 수 있다. 본 발명의 프로브 세트는 상기 9종의 23S rRNA 유전자 중의 S01, A02, A07 및 A17 표적 영역 중에 존재하는 서열을 상호 비교하여, 각 종에 특이적으로 존재하는 서열을 선발하여 제작되었다.
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 조합하여 이중가닥 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄 격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 또는 프로브 올리고뉴클레오티드 세트에 대하여는 상기한 바와 같다.
본 발명은 또한,
시료를 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레 지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 시료는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아로부터 유래된 핵산을 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것인 방법이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 핵산은 염색체 DNA, cDNA 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법이다. 본 구체예에 서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 및 방사성을 발하는 물질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 박테리아의 검출은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 PCR 산물을 표지하고, 이를 상기 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있 으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신(fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 또한, 상기 PCR 산물은 혼성화 전 또는 후에 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 PCR 산물과 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1 : 호흡기 질환을
야기시키는
9 종의 박테리아에 공통적인 표적 서열을 증폭하기 위한
프라이머의
선발
본 실시예에서는 9 종의 박테리아, 즉 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)의 23S rRNA 유전자에 공통적인 표적 서 열의 선발 및 그를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 설계하였다.
먼저, Genbank로부터 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아의 서열을 입수하고 DNASTAR 프로그램을 이용하여 이들로부터 23S rRNA의 각각 보존된 영역을 선발하였다. 분석에 사용된 박테리아 종, 종의 수 및 23S rRNA 서열의 예는 하기 표 2와 같다.
표 2.
| 종 | 스트레인 수 | 23S rRNA 서열의 예 (서열번호) |
| Chlamydophila pneumoniae | 1 | 36, 37 |
| Haemophilus influenzae | 50 | 38 내지 45 |
| Mycoplasma pneumoniae | 1 | 46 |
| Klebsiella pneumoniae | 61 | 47 내지 61 |
| Legionella pneumophila | 22 | 62 내지 64 |
| Moraxella catarrhalis | 10 | 65 내지 67 |
| Pseudomonas aeruginosa | 72 | 68 내지 76 |
| Staphylococcus aureus | 79 | 77 내지 83 |
| Streptococcus pneumoniae | 105 | 84 내지 94 |
| 합계 | 401 | - |
그 결과, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6 및 서열번호 8 및 9의 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 설계하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 상기 9개 종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중 하나 이상을 증폭할 수 있다.
실시예
2: 본 발명의
프라이머
세트를 이용한 9 종의 호흡기 질환과 관련된 박테리아의 23S
rRNA
유전자의 증폭
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 9종의 호흡기 질환을 유발하는 박테리아의 23S rRNA를 증폭하였다.
먼저, 하기 표 4에 나타낸 47종의 대조군 박테리아 및 9종의 표적 박테리아의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 실시예 1에서 제작된 4개의 프라이머 세트 중 각 세트를 프라이머로 하여 단일 PCR (single PCR)을 수행하여 각 표적 서열을 특이적으로 증폭하는지를 확인하였다.
단일 PCR (single PCR) 조건은 다음과 같다. MgCl2 1.5mM, dNTP 250 mM, 트리스-HCl (pH 9.0) 10 mM 및 Taq 폴리머라제 1 유니트, 프라이머 약 2 pmol을 포함하는 혼합액 중에 G-스핀 게놈 DNA 추출 키트 (iNtRON 사)로부터 추출된 게놈 DNA 2㎕를 포함하는 20㎕의 반응액을 95℃에서의 변성 10초, 60℃에서의 어닐링 10초 및 60℃에서의 연장 13초를 25회 반복하였으며, 작동시간은 29분 5초이었다.
얻어진 PCR 산물은 전기영동에 의하여 확인하였는 바, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
다음으로, 본 실시예에서는 9 종의 호흡기 질환과 관련된 박테리아로부터 DNA를 분리한 다음, 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 8 및 9의 각 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR을 수행하고, 그 산물을 아가로즈 겔 상에 확인하였다.
(1) 박테리아 배양물의 준비
9종 박테리아의 배양 분리체 (cultural isolate)는 아태감염연구재단 (Asian-Pacific Research Foundation for Infectious Diseases, ARFID)에서 제공받을 것을 사용하였다. 상기 9종 박테리아의 아태감염연구재단의 수탁번호는 다음 표 2-1과 같다. 당업자라면 누구가 상기 아태감염연구재단으로부터 상기 균주들을 분양받을 수 있다.
표 2-1.
| 종 | 아태감염연구재단 수탁번호 | 기원 |
| Chlamydophila pneumoniae | K01 - Cpn -05-1 | 한국 |
| Haemophilus influenzae | P01 - HIN -N-45 | 필리핀(열대성) |
| Klebsiella pneumoniae | P01 - KPN -N-51 | 한국 |
| Legionella pneumophila | K01 - Lpn -05-1 | 한국 |
| Moraxella catarrhalis | K01 - MCA -04-13 | 한국 |
| Mycoplasma pneumoniae | K01 - Mpn -05-1 | 클로닝(A,B 2부분) |
| Pseudomonas aeruginosa | P01 - PAE -N-49 | 필리핀 |
| Staphylococcus aureus | Si01 - SAU -N-140 | 싱가포르 (일반성) |
| Streptococcus pneumoniae | P01 - SPN -N-118 | 필리핀 (열대성) |
(2) 다중 PCR
다중 PCR에 사용된 PCR 믹스 조성은 다음과 같았다. 증류수 10.5㎕, 10x버퍼 7.5㎕, dNTP 200 μM (각각) 1㎕, 말단 표지된 프라이머 400nM (각각) (Bioneer, 한국) 20㎕, 추출된 게놈 DNA 5㎕, Taq 폴리머라제 5 유니트 1㎕를 포함하는 총 50㎕ 반응액을 사용하였다. 양성 대조군으로 사용되는 인간 MODY e9 DNA를 사용하였다.
다중 PCR 조건은 95℃에서 1분 동안 초기 변성, 95℃에서 5초 동안 변성 및 62℃에서 13초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 연장 반응을 25회 반복하고, 72℃에서 1분 동안 연장반응을 수행하였다.
이상과 같은 단일 PCR 및 다중 PCR 결과는 다음 3과 같다.
표 3.
표 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR 결과 4 개의 표적 서열을 확인할 수 있었으며, 이는 다중 PCR 중에 서열번호 1 내지 6, 8 및 9의 프라이머 세트는 상호 표적 서열 특이성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 표 3에서 균주에 대한 약자는 표 4에 나타낸 바와 같다. 표 3에서 다중 PCR 결과 중 클라미도필라 뉴모니아 종에 대한 A02 및 A07 프라이머 세트, 스타필로코커스 아우레우스 종에 대한 A17 프라이머 세트 및 스트렙토코커스 뉴모니아 종에 대한 A02 프라이머 세트에 대한 결과는 단일 PCR 결과에서는 희미하게 보였으나, 다중 PCR에서는 보이지 않았다. 표 3에서 PTC는 양성 대조군이고, 16S-F 및 16S-R는 16S rRNA를 표적으로 하는 프라이머 세트를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 4개의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 한 결과 얻어진 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에서 네모로 표시한 부분은 단일 PCR과 다중 PCR에서 차이는 보이는 영역이며, 이 산물에 대하여는 프로브를 설계하지 않았다.
실시예
3 : 9 종의 호흡기 질환과 관련된 박테리아의
마이크로어레이
상에서의 검출
본 실시예에서는 실시예 2에서 증폭된 증폭 산물을 마이크로어레상에 고정화되어 있는 프로브와 혼성화시키고, 그 혼성화 정도를 검출함으로써 특정한 박테리아 종으로부터 증폭된 증폭 산물이 존재하는지를 확인하였다.
모든 전위 프라이머 및 역위 프라이머에는 5' 말단이 Cy-3로 표지된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2의 시료 준비 및 PCR과 동일하게 수행하였다. 증폭 산물을 하기와 같이 마이크로어레이 상에서 검출하였다.
실험에 사용된 9개 종의 총 스트레인 수는 401개 스트레인이었으며, 대조군으로 10 속의 47개 종 226개 스트레인을 사용하였다.
실험군과 대조군에 사용된 박테리아 스트레인 수는 다음 표 4와 같다.
표 4.
상기 사용된 대조군 박테리아 47종과 이들을 입수할 수 있는 아태감염연구재단, ATCC 및 KCCM 등의 수탁번호 및 시료 채쥐 번호는 하기 표 4-1과 같다.
표 4-1
| 종 | 수탁번호 | 기원 |
| Acinetobacter baumanii | ATCC 19606 (KCTC 2508) | |
| Acinetobacter calcoaceticus | ATCC 14987 | |
| Acinetobacter Iwoffii | 01-ACI-111 | 말단 혈액 |
| Bacillus subtilis | ATCC 6633 | |
| Bordetella ansorpii | SMC 8986 | |
| Bordetella avium | ATCC 41061 | |
| Borditella bronchiseptica | ATCC 21998 | |
| Borditella pertussis | ATCC BAA-589 | |
| Citrobacter freundii | KCTC 2006 | |
| Enterobacter aerogenes | KCCM 12177 | |
| Enterobacter cloacae | KCCM 12177 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC 29212 | |
| Enterococcus faecium | ATCC 19434 (KCCM 12118) | |
| Escherichia coli | ATCC 25922 | |
| Gemella melitensis | 강태남(14225676) | 혈액(환자( |
| Haemophilus aphrophilus | ATCC 13252 (KCCM 41597) | |
| Klebsiella oxytoca | ATCC 8742 (KCTC 1686) | |
| Moraxella nonliquefaciens | 1 | |
| Morganella morganii | 01-MMO-140 | 침 |
| Proteus mirabilis | ATCC 25933 (KCTC 2510) | |
| Proteus vulgaris | ATCC 6059 (KCTC2511) | |
| Pseudomonas fluorescens | ATCC 25141 (KCTC 2344) | |
| Pseudomomas putida | 22-1 | 08-701 |
| Pseudomomas stutzeri | 21-1 | 01-478 |
| Salmonella typhi | 2 | |
| Salmonella typhimurium | KCCM 11862 | |
| Shigella boydii | ATCC 8700 (KCCM 41649) | |
| Shigella flexneri | ATCC 11836 (KCCM 11937) | |
| Shigella sonnei | ATCC 29930 (KCCM 40949) | |
| Staphylococcus cohnii | 1 | |
| Staphylococcus epidermidis | ATCC 35984 | |
| Staphylococcus gallinarium | ATCC35539 (KCTC3585) | |
| Staphylococcus haemolyticus | ATCC 29970 (KCTC 3341) | |
| Staphylococcus hominis | 3 | |
| Staphylococcus intermedius | ATCC 29633 (KCTC 3344) | |
| Staphylococcus lentus | ATCC 29070 (KCTC 3577) | |
| Staphylococcus lugdunensis | 2 | |
| Staphylococcus xylosus | ATCC 29971 (KCTC 3342) | |
| CNS | 7 | 복막액 |
| Streptococcus agalactiae -( Group B) | Sag 101-SGA-183 | 위 흡입액 |
| Streptococcus dysgalactiae | 김창회 (중외) | |
| Streptococcus gordonii | ATCC 10558 (KCTC 3286) | |
| Streptococcus intermedius / milleri | 01-SMI-158 | 고름 |
| Streptococcus mitis | 3 | CSF |
| Streptococcus oralis | ATCC 9811 (KCCM41567) | |
| Streptococcus pyogenes | 05-251 | 침 |
| Streptococcus salivarius subsp. thermophilus | Ssa 1NBIMCC 1374 (KCTC 5091) | |
| Streptococcus sanguinis | NRRL 804 (KCTC 3731) | |
| Streptococcus suis | ATCC 43765 (KCTC 3557) |
(1) 프로브의 설계
DNAstar 프로그램을 이용하여 각 바이러스 게놈의 증폭된 영역으로부터 프로브를 선발하였다
표 5.
| 프로브 명칭 | 표적 박테리아 | 서열번호 | 23S rRNA 중의 표적 영역 |
| A17-Chl.pneumo-re | 클라미도필라 뉴모니아 | 10 | 3041-3198 (A017) |
| A02-Hae.influe | 헤모필러스 인플루엔자 | 11 | 853-1353 (A02) |
| A02-Hae.influe1-re | 헤모필러스 인플루엔자 | 12 | 853-1353 (A02) |
| A02-H.inf2-I | 헤모필러스 인플루엔자 | 13 | 853-1353 (A02) |
| A02-H.inf2-A | 헤모필러스 인플루엔자 | 14 | 853-1353 (A02) |
| A07-Hae.influe | 헤모필러스 인플루엔자 | 15 | 2483-2932 (A07) |
| A07-Kle.pneumo1-re | 클렙시엘라 뉴모니아 | 16 | 2483-2932 (A07) |
| A07-Kle.pneumo3-re | 클렙시엘라 뉴모니아 | 17 | 2483-2932 (A07) |
| A07-Kle.pneumo-re | 클렙시엘라 뉴모니아 | 18 | 2483-2932 (A07) |
| A02-Leg.pneumo | 레지오넬라 뉴모필라 | 19 | 853-1353 (A02) |
| A07-Leg.pneumo2 | 레지오넬라 뉴모필라 | 20 | 2483-2932 (A07) |
| A02-Mor.catarr1-re | 모락셀라 카타랄리스 | 21 | 853-1353 (A02) |
| A02-Mor.cat2-C | 모락셀라 카타랄리스 | 22 | 853-1353 (A02) |
| A02-Mor.cat2-N | 모락셀라 카타랄리스 | 23 | 853-1353 (A02) |
| A07-Mor.catarr-re | 모락셀라 카타랄리스 | 24 | 2483-2932 (A07) |
| A07-Mor.cat2-C | 모락셀라 카타랄리스 | 25 | 2483-2932 (A07) |
| A07-Mor.cat2-N | 모락셀라 카타랄리스 | 26 | 2483-2932 (A07) |
| A17-Myc.pneumo | 미코플라즈마 뉴모니아 | 27 | 3041-3198 (A17) |
| A02-Pse.aerugi | 수도모나스 애루지노사 | 28 | 853-1353 (A02) |
| A07-Pse.aerugi-re | 수도모나스 애루지노사 | 29 | 2483-2932 (A07) |
| S01_Sta.aureu1 | 스타필로코커스 아우레우스 | 30 | 124-365 (S01) |
| S01_Sta.aureu2 | 스타필로코커스 아우레우스 | 31 | 124-365 (S01) |
| A07-Str.pneumo2-re | 스트렙토코커스 뉴모니아 | 32 | 2483-2932(A07) |
| A07-Str.pneumo3 | 스트렙토코커스 뉴모니아 | 33 | 2483-2932(A07) |
| A07-Str.pneumo3-O-re | 스트렙토코커스 뉴모니아 | 34 | 2483-2932(A07) |
| A07-Str.pneumo3-P-re | 스트렙토코커스 뉴모니아 | 35 | 2483-2932(A07) |
(2) 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이의 제조
에탄올 중의 GAPTES (감마-아미노프로필트리에톡시 실란)(γ-aminopropyltriethoxy silane) 용액 (농도 20%(v/v)) 또는 GAPDES (감마-아미노프로필디에톡시 실란) 용액 (농도 20%(v/v))을 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 CEE 사의 스핀 코터 모델 CEE 70을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120 ℃에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
위와 같이 제조된 아미노 기로 활성화된 기판 상에 서열번호 10 내지 35의 프로브 세트를 기판 상에 스폿팅하여 고정화하여, 마이크로어레이를 제작하였다.
(3) 검출
얻어진 마이크로어레이에 상기 증폭 산물을 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 세척 버퍼로 세척한 다음, GenePix Scanner (Molecular Device 사, 미국)를 이용하여 형광을 측정하였다.
표 6
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 설계된 프로브를 사용하여 9종의 박테리아를 높은 민간도로 검출할 수 있었다. 표 6에서, 번호 1-9 및 24번에 대응되는 프로브는 다양한 대조군 프로브를 나타낸다. 1번에 대응되는 프로브는 PCR이 성공적으로 수행되었는지를 나타내는 양성 PCR 프로브이다. 2번에 대응되는 프로브는 혼성화 반응이 제대로 일어났는지를 나타내는 양성 마이크로어레이 프로브이다. 3번에 대응되는 프로브는 음성 프로브이다. 4-9 및 24에 대응되는 프로브들은 각 영역에 대응되는 각 표적 영역이 성공적으로 증폭되었는지를 나타내는 양성 프로브이다.
하기 표 7 내지 16에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 설계된 프로브를 사용하여 56종의 박테리아 종, 640 스트레인으로부터 9개 종의 박테리아를 99.8%이상의 특이도 및 100%의 민감도로 검출할 수 있었다. 표 7 내지 16은, 마이크로어레이 상에서의 혼성화를 수행함으로써 얻어진 실험 데이터를 배양 실험을 통하여 확인한 결과이다.
표 7.
| S.pneumoniae | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 104 | 0 |
| - | 0 | 518 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 8.
| H.influenzae | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 48 | 0 |
| - | 0 | 574 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 9.
| S.aureus | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 78 | 0 |
| - | 0 | 544 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 10.
| P.aeruginosa | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 72 | 0 |
| - | 0 | 550 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 11.
| K. pneumoniae | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 61 | 1 |
| - | 0 | 561 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 99.8% |
표 12.
| M.catarrhalis | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 10 | 1 |
| - | 0 | 612 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 99.8% |
표 13.
| C.pneumoniae | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 1 | 0 |
| - | 0 | 621 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 14.
| L.pneumophila | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 23 | 0 |
| - | 0 | 599 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
표 15.
| 9종 박테리아 전체 | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 402 | 2 |
| - | 0 | 218 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 99.1% |
표 16.
| M. pneumoniae | 배양결과 | ||
| + | - | ||
| 마이크로어레이 결과 | + | 5 | 0 |
| - | 0 | 617 | |
| 민감도 | 특이도 | 100% | 100% |
본 발명의 핵산 프라이머 세트에 의하면, 9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아로부터 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 하여, 9종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 의하면, 9종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 9 종의 호흡기 질환을 야기시키는 박테리아를 높은 특이성을 가지고 효율적으로 검출할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (24)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 8 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 세트;를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성된 9종의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
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- 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 11 내지 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 21 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 24 내지 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 28의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 30 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및서열번호 32 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)의 23S rRNA 유전자에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 23S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
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- 제8항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이.
- 시료를 제8항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 존재를 검출하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 시료는 제1항에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 수도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로 구성되는 9종의 호흡기질환을 유발하는 박테리아의 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아로부터 유래된 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 및 방사성으로 이루어진 군으로부터 선택된 광을 발하는 물질인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법.
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