JP4934679B2 - ９種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種を特異的に検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよびその方法 - Google Patents

９種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種を特異的に検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよびその方法 Download PDF

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Description

本出願は、２００５年１２月２７日に出願された韓国出願第１０−２００５−０１３０６１０号に対する優先権および３５ ＵＳＣ １１９条により得られるあらゆる利益を主張し、その開示内容は、全体として引用によって本出願に含まれる。
本発明は、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの標的配列を増幅させるプライマーセット、前記９種のバクテリアの標的配列に特異的にハイブリダイズするプローブセット、前記プローブセットが固定されてなるマイクロアレイおよび前記プローブセットを利用して前記９種のバクテリア種を検出する方法に関する。
一般的に、２個の十分に相補的な一本鎖核酸は、ハイブリダイズを促進する条件下で、ハイブリダイズして二重螺旋構造を形成するが、逆平行の２個の核酸鎖は、相補的な塩基間の水素結合によって結合されている。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションが形成されうる。
‘プローブ’は、検出される核酸配列（‘標的配列’）に、ある程度特定の相補的な一本鎖核酸配列である。必要な場合、プローブは、ラベリングされうる。特定の核酸配列の検出のための過程として、核酸ハイブリダイズを使用することについて、米国特許第４，８５１，３３０号明細書および米国特許第５，２８８，６１１号明細書に開示されており、その全体は引用として本明細書に含まれる。
広くは、２個の基本的な核酸ハイブリダイズ過程がある。その一つは、‘溶液中’ハイブリダイゼーションとして知られており、試験試料中の‘プローブ’核酸および‘標的’核酸の両方は、溶液中に遊離している。他の方法では、第１の核酸が、固体基板上または固体基板中に固定されてなり、第２の核酸は、溶液中に遊離している。例えば、電気泳動後にゲル内に存在する標的核酸の位置は、適切な条件下で、前記ゲル中の前記標的核酸とハイブリダイズできるラベリングされたプローブ核酸の溶液を使用することによって位置確認できる。
現在、２、３の呼吸器疾患と関連するバクテリアを検出するためのプローブが知られている。例えば、米国特許第５，８３０，６５４号明細書には、約１４〜１８のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、ヘモフィルス・インフルエンザのためのハイブリダイズ分析プローブが開示されている。米国特許第５，５２５，７１８号明細書には、スタフィロコッカス・アウレウスの特定の遺伝子（例、ｅｎｔＥ 遺伝子）に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが開示されている。また、米国特許第６，００１，５６４号明細書には、それぞれエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に特異的なプライマーまたはプローブが開示されている。
前記のような従来技術によっても呼吸器疾患と関連すると知られた、９種のバクテリア（クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエ）にいずれも共通した２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列を増幅できるプライマーセットは開示されていない。また、前記９種のバクテリア種の前記２３Ｓ ｒＲＮＡの標的配列に特異的なプローブは、開示されていない。前記プローブおよびプライマーは、呼吸器疾患に関連するバクテリア種の存否を検出するための特異的、かつ、選択的方法において使用されている。
本発明の目的は、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの標的配列を増幅するプライマーセットを提供することである。
前記オリゴヌクレオチドプライマーセットは、以下からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含む：配列番号１の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号３の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号６および７からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを有するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
本発明の他の目的は、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアのうち１つ以上を検出するためのプローブセットを提供することである。前記プローブセットは、前記プライマーセットによって増幅した標的配列に特異的である。
前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２７の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３０および３１からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３２〜３５からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを有する。
本発明のさらに他の目的は、前記プローブセットを含むマイクロアレイを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記プローブセットを含むマイクロアレイと、前記プローブセットを利用して９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアのうち一つ以上を検出する方法と、を提供することである。
本発明は、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち一つ以上の標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。前記オリゴヌクレオチドプライマーセットは、次からなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含む：配列番号１の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号３の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号６および７からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、を有するオリゴヌクレオチドセット。
本発明のプライマーセットにおいて、前記標的配列は、バクテリア２３Ｓ ｒＲＮＡの１２４番〜３６５番位置に該当するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ａ）、８５３番〜１３５３番位置に該当するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｂ）、２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｃ）および３０４１番〜３１９８番位置に該当するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｄ）からなる群から選択される一つ以上の配列でありうる。
本発明のプライマーセットは、配列番号１の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の１２４番〜３６５番位置に該当するヌクレオチド領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットでありうる。
本発明のプライマーセットは、配列番号３の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の８５３番〜１３５３番位置に該当するヌクレオチド領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットでありうる。
本発明のプライマーセットは、配列番号５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号６および７の配列からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエからなる９種のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットでありうる。
本発明のプライマーセットは、配列番号８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の３０４１番〜３１９８番位置に該当するヌクレオチド領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットでありうる。
本発明のプライマーセットは、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の１２４番〜３６５番、８５３番〜１３５３番、２４８３番〜２９３２番および３０４１番〜３１９８番位置に該当するヌクレオチド領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットでありうる。一実施形態で、前記プライマーセットは、配列番号１の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号３の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号６および配列番号７からなる群から選択された配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、を有する。さらに他の実施形態で、前記プライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号３のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号５のオリゴヌクレオチドおよび配列番号６または配列番号７のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、配列番号８のオリゴヌクレオチドおよび配列番号９のオリゴヌクレオチドと、を含むオリゴヌクレオチドセットを有する。
本発明のプライマーセットは、前記９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子で共通する標的領域から設計された。前記９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアは、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエである。
本発明のプライマーセットを使用してＰＣＲする場合、増幅できる標的配列領域は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１２４番〜３６５番位置に該当するヌクレオチド領域（Ｓ０１で表す：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ａ）、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の８５３番〜１３５３番位置に該当するヌクレオチド領域（Ａ０２で表す：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｂ）、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域（Ａ０７で表す：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｃ）、および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３０４１番〜３１９８番位置に該当するヌクレオチド領域（Ａ１７で表す：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｄ）から選択される。図１は、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列の位置を示す図面である。
本発明のプライマーセットは、前記９種の呼吸器疾患に関連するバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する前記４個の標的配列から設計された。本発明によるプライマーセットの例示的な例を、下記の表１に表した。
本発明はまた、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１２４〜３６５、８５３〜１３５３、２４８３〜２９３２および３０４１〜３１９８番に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される一つ以上の標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する。一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２７の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３０および３１からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３２〜３５からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを有する。
本発明のプローブセットは、配列番号１０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含む、クラミドフィラ・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の３０４１番〜３１９８番位置に該当するヌクレオチド領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。
本発明のプローブセットは、ヘモフィルス・インフルエンザの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の８５３番〜１３５３番および２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される一つ以上の標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを有する。他の実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドと、配列番号１５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドと、を含むオリゴヌクレオチドプローブを有する。
本発明の前記プローブセットは、配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含む、クレブシエラ・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。
本発明の前記プローブセットは、レジオネラ・ニューモフィラの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の８５３番〜１３５３番および２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される一つ以上の標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを有する。
他の実施形態で、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドと、を含むオリゴヌクレオチドプローブを有する。
本発明の前記プローブセットは、モラクセラ・カタラーリスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の８５３〜１３５３番および２４８３〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される一つ以上の標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを有する。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、を有する。
本発明の前記プローブセットは、配列番号２７の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含む、マイコプラズマ・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の３０４１番〜３１９８番位置に該当する領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブでありうる。
本発明の前記プローブセットは、シュードモナス・アエルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の８５３−１３５３および２４８３−２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される一つ以上の標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号２８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを有する。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号２８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、を含む。
本発明の前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号３０および３１からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含む、スタフィロコッカス・アウレウスの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の１２４番〜３６５番位置に該当するヌクレオチド領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。
本発明の前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号３２〜３５からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の２４８３番〜２９３２番位置に該当するヌクレオチド領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。
本発明の前記プローブセットは、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択されるバクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１２４−３６５、８５３−１３５３、２４８３−２９３２および３０４１−３１９８番位置に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される標的配列にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドプローブセットでありうる。一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２７からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２８からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３０および３１からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３２〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、からなる群から選択される一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを有する。他の実施形態で、本発明の前記オリゴヌクレオチドプローブセットは、配列番号１０からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１５からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２０からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２７からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２８からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２９からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３０および３１からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３２〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、を含む。
本発明のプローブセットは、本発明のプライマーセットを使用したＰＣＲにより得られる、前記９種のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的領域であるＳ０１、Ａ０２、Ａ０７およびＡ１７を通じて増幅したＰＣＲ産物に特異的に結合する。したがって、本発明のプローブセットは前記９種のバクテリアを区別するために使われうる。本発明のプローブセットは、前記９種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的領域であるＳ０１、Ａ０２、Ａ０７およびＡ１７を比較し、各バクテリア種に特異的に存在する配列を選択することにより設計される。
本明細書において、‘プローブ’とは、相補的な一本鎖標的配列と塩基対をなすことができて、二重鎖分子（ハイブリッド）を形成する一本鎖核酸配列をいう。
本明細書において、‘ハイブリダイゼーション’とは、二重鎖分子（ハイブリッド）を形成するための、２個の相補的な核酸間鎖の水素結合をいう。
また、本明細書において、‘ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）’とは、ハイブリダイゼーション中およびその後の処理工程における温度および溶媒組成物を記載するために使用される用語である。高いストリンジェンシー条件下では、相補性が高い核酸ハイブリッドのみ形成される。したがって、ハイブリダイゼーション分析条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するためには、２つの核酸鎖（プローブおよび標的）間に存在する相補性の量を決定する。高いストリンジェンシー条件の具体例として、６５℃で、等モルのＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１２Ｍリン酸バッファが挙げられる。ストリンジェンシーは、プローブ−標的ハイブリッドと、プローブ−非標的ハイブリッドと、の安定性の差を最大化するように選択される。本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブセットが固定されてなる基板を備えるマイクロアレイを提供する。
本明細書において、‘マイクロアレイ’とは、基板上に固定されてなる２以上のポリヌクレオチドの群の高密度のアレイである。ここで、前記２以上のポリヌクレオチドの群は、基板において、予め決定された異なる領域に固定されてなる。このようなマイクロアレイは、当業界で周知のものである。このようなマイクロアレイとしては、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号明細書および米国特許第５，７４４，３０５号明細書に開示されており、これら特許の内容は、引用によって本明細書に含まれる。
本発明はまた、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される呼吸器疾患と関連するバクテリア種を検出する方法を提供する。前記方法は、試料を本発明によるオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させて、前記試料中の標的配列とプローブとをハイブリダイズさせる工程と、前記オリゴヌクレオチドプローブと試料中の標的配列間のハイブリダイゼーションの程度を検出する工程と、を有する。
前記方法の一実施形態において、前記試料は、ＰＣＲ産物を含む。前記ＰＣＲ産物は、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択されるバクテリア種から得られるテンプレート核酸と、本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーセットと、を使用するＰＣＲによって得ることができる。前記テンプレート核酸は、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびこれらの断片からなる群から選択されうる。
前記方法において、前記標的配列は、検出可能なラベル物質でラベリングされうる。例えば、前記ラベル物質は、蛍光性物質、燐光性物質または放射性物質でありうる。望ましくは、前記ラベル物質は、蛍光物質であるＣｙ−５またはＣｙ−３である。
前記方法において、前記プローブセットは、マイクロアレイの基板上に固定されてなる。
前記方法において、標的配列と前記オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件下で行われうる。例えば、前記高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件は、６５℃で、等モルのＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１２Ｍリン酸バッファでありうる。
前記方法において、‘ＰＣＲ’とは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味するものであり、標的核酸に特異的に結合するプライマー対およびＤＮＡポリメラーゼを利用して標的核酸を増幅する方法である。このようなＰＣＲ法は、当業界で周知のものである。ＰＣＲは、商業的に利用可能なキットを利用してもよい。ＰＣＲ法は、１回のＰＣＲ反応で、単一の標的配列のみを増幅する１回のＰＣＲと、１回のＰＣＲ反応で複数の他の標的配列を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ（多重ＰＣＲ）とが含まれる。マルチプレックスＰＣＲは、それぞれ特定の標的配列に特異的な、複数のプライマー対を利用して行われる。
前記方法において、前記オリゴヌクレオチドプローブ配列と、標的配列と、のハイブリダイゼーションの程度の検出は、検出可能な信号を発生させる物質で前記ＰＣＲ産物（標的配列）をラベリングし、前記ラベリングされたＰＣＲ産物と、前記オリゴヌクレオチドプローブセットと、をハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイズされた産物から発生する信号を検出して行われうる。当業界で周知の任意の検出可能な信号を放出するラベル物質が使われうる。例えば、前記検出可能な信号を発生させる物質は、光学的に検出可能な物質または電気的信号を発生させる物質でありうるが、これらの例に限定されるものではない。前記光学的に検出可能な物質は、蛍光物質または燐光物質でありうる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ−５またはＣｙ−３でありうる。また、前記ＰＣＲ産物は、ハイブリダイズ前または後に検出可能な信号を発生させる物質とラベリングされうる。
ハイブリッドの検出は、ＰＣＲ産物がラベリングされることを要しない。例えば、ＰＣＲ産物がラベリングされない場合、ＰＣＲ産物とオリゴヌクレオチドプローブセットとのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション前後の電気的信号の差によって検出することができる。適した電気的信号の例として、電気容量が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の核酸プライマーセットは、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアから標的配列を増幅できる。
本発明のプローブセットは、本発明のプライマーセットを利用して増幅したＰＣＲ産物の標的配列に特異的であるので、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアのうち一つ以上を検出するところに使われうる。
本発明のマイクロアレイは、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアのうち一つ以上を検出するところに使われうる。
本発明の検出方法によれば、９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアを高い効率および高い特異性で検出できる。
以下、本発明を、実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：呼吸器疾患と関連する９種のバクテリアに共通した標的配列を増幅するためのプライマーの選択
実施例１では、９種のバクテリア種、すなわち、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、およびストレプトコッカス・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通した標的配列の選択および該標的配列を増幅できるプライマーセットを設計した。
まず、臨床分離株から得られた２３Ｓ ｒＲＮＡを配列分析することによって、呼吸器疾患と関連するバクテリアの配列を入手した。前記バクテリア種、前記各バクテリア種のストレイン数および各配列についての配列番号は下記表２の通りである。
前記バクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の保存された領域は、ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを使用して選択された。
オリゴヌクレオチドプライマーセットは、ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを使用して前記４個の標的配列のそれぞれに対して設計された：配列番号１および２からなるオリゴヌクレオチドプライマーセット、配列番号３および４からなるオリゴヌクレオチドプライマーセット、配列番号５および６からなるオリゴヌクレオチドプライマーセット、および配列番号８および９からなるオリゴヌクレオチドプライマーセット。これらオリゴヌクレオチドプライマーセットそれぞれは、前記９個種のバクテリアのうち一つ以上の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の標的領域を増幅できる。
実施例２：本発明のプライマーセットを利用した９種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
実施例１で設計された前記４個のプライマーセットを利用して、前記９種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。
まず、各標的配列が特異的に増幅するかどうかを決定するために、実施例１で設計されたプライマーの単一セット（‘１回のＰＣＲ’）のみを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（‘ＰＣＲ’）を使用した増幅を行った。多様な１回のＰＣＲにおいて、４７種の対照群バクテリア種および９種の試験バクテリア種から得たゲノムＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして使用した。使用された前記対照群および試験バクテリア種は、下記の表４に記載した。
各１回のＰＣＲは、下記のようにして、２μｌのゲノムＤＮＡ（Ｇ−ＳＰＩＮゲノムＤＮＡ抽出キット；ｉＮｔＲＯＮ社製を用いて抽出された）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ 各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および約２ｐｍｏｌの各プライマーを含む２０μｌのＰＣＲ溶液を用いて２９分間および５秒間行った：９５℃、１０秒間の変性、６０℃、１０秒間のアニーリング、および６０℃、１３秒間の伸長を、２５サイクル。
前記ＰＣＲ産物を、電気泳動によって同定した。９個の試験種に対する結果は下記の表３の通りである。予想されるＰＣＲ産物は４７個の対照群種の一つから得たｇＤＮＡを使用した対照群ＰＣＲで増幅した（データは表示しない）。
次いで、マルチプレックスＰＣＲを、９個の呼吸器疾患と関連するバクテリア種の一つから得られたゲノムＤＮＡを同時に増幅するために実施例１で設計された前記４個のプライマーセットを使用して行った。マルチプレックスＰＣＲから得られた産物は、アガロースゲル上での電気泳動によって同定した。
（１）バクテリア培養物の準備
９種の呼吸器疾患関連バクテリア種の培養分離株は、アジア太平洋感染症研究財団（Ａｓｉａｎ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＡＲＦＩＤ）により提供されたものを使用した。
（２）マルチプレックスＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲのためのＰＣＲミックスは、最終的５０μｌに調製し、それは、蒸留水１０．５μｌ、１０ｘバッファ（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１５０ｍＭ 硫酸アンモニウム、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）７．５μｌ、ｄＮＴＰ ２００μＭ（それぞれ）１μｌ、末端ラベリングされたプライマー４００ｎＭ（それぞれ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）２０μｌ、抽出されたゲノムＤＮＡ ５μｌおよびＴａｑポリメラーゼ５ユニット １μｌを含む。Ｈｕｍａｎ ＭＯＤＹ ｅｘｏｎ９（‘９ｅ’）ＤＮＡを、陽性対照群として使用した。
マルチプレックスＰＣＲ条件は以下の通りである：９５℃で１分間初期変性；９５℃で５秒間変性、６２℃で１３秒間アニーリングおよび７２℃で１５秒間伸長反応を２５サイクルし；ならびに、７２℃で１分間伸長反応。
９個の試験バクテリア種に対する１回のＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲは、下記の表３に示した通りである。表３の９個のバクテリア種に対して使われた略字は、下記の表４に定義された通りである。表３で、‘ＰＴＣ’は陽性対照群、１６ＳｒＲＮＡを標的とするプライマーセット（１６Ｓ−Ｆおよび１６Ｓ−Ｒ）も対照群として含まれた。
表３において、１回のＰＣＲ結果は、前記試験バクテリア種のそれぞれにはあらゆる４個の標的配列が存在するものではないということを表す。さらに、表３において、マルチプレックスＰＣＲ結果は、前記試験バクテリア種のそれぞれにはあらゆる４個の標的配列が存在するものではないとしても、前記４個のプライマーセットのそれぞれの標的配列が、４個のプライマーセットを利用したマルチプレックスＰＣＲによって確認されうるということを表す。これは、一般的に、前記４個のプライマーセットのうち任意の一つの標的配列特異性は、マルチプレックスＰＣＲ中に他のプライマーの存在によって影響されていないということを表す。しかし、Ａ０２−ＦおよびＲ、Ａ０７−ＦおよびＲプライマーセットを使用したクラミドフィラ・ニューモニエ種の増幅、Ａ１７−ＦおよびＲプライマーセットを使用したスタフィロコッカス・アウレウス種の増幅およびＡ０２−ＦおよびＲプライマーセットを使用したストレプトコッカス・ニューモニエ種の増幅は、１回のＰＣＲで弱いバンドを示したが、マルチプレックスＰＣＲでは示していない。
図２は、本発明の４個のプライマーセットを使用して前記９個試験バクテリア種のそれぞれに対して、同時にマルチプレックスＰＣＲした結果得られたＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図面である。
実施例３：マイクロアレイを利用した９種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの検出
実施例３において、実施例２で得られたマルチプレックスＰＣＲ産物を、マイクロアレイ上に固定されてなるプローブとハイブリダイズさせ、プローブ−標的ハイブリダイゼーションの程度を決定して特定のバクテリア種から増幅したＰＣＲ産物が存在するかどうかを検出した。
あらゆるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’末端がＣｙ−３でラベリングされたプライマーを使用したことを除いては、実施例２と同様に試料準備およびマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を下記のようにマイクロアレイを利用して検出した。
試験群として前記９個のバクテリア種の４０１個ストレインが使われ、対照群として１０個の他のバクテリア属の４７種の２２６ストレインが使われた。
実験群と対照群とに使われたバクテリアストレインは、次の表４の通りである。
（１）プローブの設計
プローブは、ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを利用して、各バクテリアゲノムのＰＣＲで増幅した領域から選択した。プローブ情報は表５に整理した。
（２）プローブが固定されてなるマイクロアレイの製造
エタノール中のＧＡＰＴＥＳ（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）溶液（濃度２０％（ｖ／ｖ））またはＧＡＰＤＥＳ（γ−アミノプロピルジエトキシシラン）溶液（濃度２０％（ｖ／ｖ））をウェーハにスピンコーティングした。スピンコーティングは、下記：初期コーティング５００ｒｐｍ／１０秒、メインコーティング２０００ｒｐｍ／１０秒、でスピンコーター（ＣＥＥ社製 モデルＣＥＥ ７０）を使用した。スピンコーティングが完了した後、基板をテフロン（登録商標）ウェーハキャリアに固定して１２０℃で４０分間硬化した。硬化された基板は、水に１０分間浸漬させた後、１５分間超音波洗浄し、再び水に１０分間浸漬した後乾燥させた。乾燥は、スピンドラヤーを利用して行った。あらゆる実験は、大部分のホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルーム・クラス１０００で行った。
アミノ基で活性化された基板上に、配列番号１０〜３５からなるプローブを含むプローブセットを基板上にスポッティングして固定化して、マイクロアレイを製作した。
（３）検出
前記ＰＣＲ産物を直接マイクロアレイに添加した。前記マイクロアレイを４２℃で１時間培養してプローブ・標的ハイブリダイゼーションを起こした。次いで、前記マイクロアレイを洗浄バッファで洗浄した。ハイブリダイズされたＰＣＲ産物から出る蛍光強度は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製、米国）を利用して測定した。前記マイクロアレイ上で特定のプローブと形成してハイブリッドされたものから出る蛍光強度の測定値を、表６に整理した。
表６に示すように、本発明によって設計されたプローブを使用して前記９種のバクテリアを高い敏感性で検出できた。表６において、番号１〜９、および２４に該当するプローブは、各種対照群プローブを表す。番号１に該当するプローブは、ＰＣＲが成功的に行われたということを表す陽性ＰＣＲプローブである。番号２に該当するプローブは、ハイブリダイズが成功的に行われたということを表す陽性プローブである。番号４−１０および３１に該当するプローブは、各領域に該当する各標的領域が成功的に増幅したということを表す陽性プローブである。
表６の結果はまた、本発明によって設計されたプローブは、表７〜１６に表すように、５６個バクテリア種の６４０ストレインのうち、前記９個の標的バクテリア種に対して９９．８％以上の特異性および１００％の敏感性を持つということを表す。マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行うことによって得られた実験結果は、培養実験によって確認された。
本明細書に使われた用語は、特定の実施形態を単に記述しようとする目的であり、本発明を限定しようとする意図ではない。用語‘ａ’および“ａｎ”は量を限定することを表すものではなく、参照されたアイテムが一つ以上存在するということを表す。用語“または”とは“および／または”を表す。用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”、“ｈａｖｉｎｇ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”、および“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”は、開放された末端用語として解釈されねばならない（すなわち、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”を意味するが、これに限定されない）。
値の範囲の言及は、別途に言及がなければ、前記範囲内に該当する各別個の値を個別的に参照する略字法としての役割を行おうとする意図でなされ、各別個の値は、明細書に個別的に言及されたように明細書に挿入される。あらゆる範囲の末端点は、前記範囲内に含まれて独立的に組み合わせることができる。
本明細書に言及されたあらゆる方法は、他に言及がないか、文脈によって明確に反駁されなければ、適切な順序で行われうる。任意のおよびあらゆる例、または例示的言語（例えば、“ｓｕｃｈ ａｓ”）の使用は、単に本発明をさらによく表そうとしようとする意図であり、別途に請求されなければ、本発明の範囲を限定するものではない。明細書のいかなる用語も、本明細書に使われたような本発明の実施に必須の請求されていない要素を表すと解釈されてはならない。別途に定義されていなければ、本明細書に使われた技術的および科学的用語は当業者によって通例的に理解される。
本発明を実施するために発明者らに知られた最良の形態を含む、本発明の望ましい実施形態が本明細書に記述されている。これら望ましい実施形態の変形は、前記の明細書を読み取れば明確になる。本発明者らはその変形を適切に採用することを予想し、本明細書に具体的に記述されたものとは異なって本発明が実施されることも予想できる。したがって、本発明は適用可能な法によって許容されるかぎり、特許請求の範囲に言及された主題のあらゆる変形および等価物を含む。さらに、前記記述された要素のそのあらゆる可能な変形や任意の組み合わせは、別途の言及がなければ、本発明に含まれうる。本発明はその実施形態を参照して具体的に図示または記述されているが、当業者ならば、特許請求の範囲に定義されたような本発明の精神および範囲を逸脱しないかぎり、形態および詳細内容の多様な変化は行われうるということを理解できるであろう。
本発明の前記のようなおよび異なる特徴および利点は、添付された図面を参照して例示的な実施形態をさらに詳細に説明することによってさらに明確になる。
２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の標的配列の位置を図式的に示す図面である。 本発明の４個のプライマーセットを使用してＰＣＲした結果、得られた産物を電気泳動した結果を示す図面である。

Claims (8)

  1. 配列番号１の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号３の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドならびに配列番号６および７からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    を有する、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、マイコプラズマ・ニューモニエ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される一つ以上のバクテリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち一つ以上の標的配列を増幅するための、オリゴヌクレオチドプライマーセット。
  2. 配列番号１からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号３からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号５からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６または配列番号７からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号８からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
  3. 試料をオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させて、前記試料中の標的配列と、オリゴヌクレオチドプローブと、をハイブリダイズさせる工程と、
    前記オリゴヌクレオチドプローブと試料中の標的配列との間のハイブリダイズの程度を検出する工程と、
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、
    配列番号１０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１５の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２０の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２７の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２８の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２９の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号３０および３１からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号３２〜３５からなる群から選択される配列の１０個以上の連続ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    からなる群から選択され、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択される少なくとも１種のバクテリア種の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１２４〜３６５、８５３〜１３５３、２４８３〜２９３２および３０４１〜３１９８番に該当するヌクレオチド領域からなる群から選択される少なくとも一つの標的配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを有し、並びに
    前記試料が、クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択されるバクテリア種から得られる鋳型ＤＮＡと、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、を使用したＰＣＲによって得られてなるＰＣＲ産物を含む、
    クラミドフィラ・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ニューモニエからなる群から選択されるバクテリア種を検出する方法。
  4. 前記標的配列が、検出可能なラベル物質でラベリングされている、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ラベル物質が、蛍光性、燐光性または放射性物質である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、マイクロアレイ基板上に固定されてなる、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
    配列番号１からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号３からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号５からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６または配列番号７からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    配列番号８からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドセットと、
    を有する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドプローブセットが、
    配列番号１０からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１１〜１４からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１５からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１６〜１８からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号１９からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２０からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２１〜２３からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２４〜２６からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２７からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２８からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号２９からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号３０および３１からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    配列番号３２〜３５からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと、
    からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブを有する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
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