JP4235645B2 - 呼吸器疾患と関連した10種のバクテリアに特異的なプライマーセット及びプローブオリゴヌクレオチド - Google Patents

呼吸器疾患と関連した10種のバクテリアに特異的なプライマーセット及びプローブオリゴヌクレオチド Download PDF

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Description

本発明は、呼吸器疾患と関連した10種のバクテリア種の標的配列を共通に増幅できるプライマーセット及び該10種のバクテリアのうち各バクテリアの標的配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたオリゴヌクレオチドプローブに関する。
従来、呼吸器疾患と関連するウイルスを検出するためのプローブが知られている。例えば、特許文献1には、約14〜18bpのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドから構成されるインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に対するハイブリダイゼーション分析プローブが開示されている。特許文献2には、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の特定の遺伝子(例、entE)と選択的にハイブリダイゼーションができるオリゴヌクレオチドが開示されている。また、特許文献3には、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス菌(Proteus mirabilis)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)またはモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)のそれぞれに特異的なプライマーまたはプローブが開示されている。
米国特許第5,830,654号明細書 米国特許第5,525,718号明細書 米国特許第6,001,564号明細書
しかしながら、前記従来技術によっても、呼吸器疾患に関連するとされる百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌という10種のバクテリアに共通な標的配列を増幅できるプライマー、または前記バクテリア種の各標的配列に対する特異的なプローブは、開示されていない。
従って、本発明の第一の目的は、前記10種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの標的配列を増幅できるプライマーセットを提供することである。
また、本発明の第二の目的は、前記10種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの各標的配列に対して特異的で、かつ他種の核酸と交差反応を起こさないプローブオリゴヌクレオチドを提供することである。
さらに、第三の目的は、前記10種の呼吸器疾患と関連するバクテリアの存在を検出する方法を提供することである。
前記課題を解決するために、本発明は、配列番号1中の10個以上の連続塩基の断片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、配列番号2中の10個以上の連続塩基の断片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌(Bordetella pertussis)、肺炎クラミドフィラ菌(Chlamydophila pneumoniae)、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌(Mycoplasma pneumoniae)、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌(Legionella pneumoniae)、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用プライマーセットを提供する。
前記他の課題を解決するために、本発明は、配列番号3及び4中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の百日咳菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号5及び6中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号7及び8中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号9及び10中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号11及び12中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号13及び14中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号15及び16中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号17及び18中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の緑膿菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号19及び20中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド、及び配列番号21及び22中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpの一つ以上の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプライマーオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌からなる群から選択された一つ以上のバクテリアの標的核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、前記記載のプライマーセットをプライマーとしてPCRを行うステップを含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、前記記載のプライマーセットをプライマーとしてPCRを行うステップと、前記記載のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、得られたPCR産物を検出するステップとを含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法を提供する。
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブが、マイクロアレイの基板に固定化されている前記バクテリアの存在を検出する方法を提供するものである。
さらに、前記他の課題を解決するために、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブが固定化された基板を使用することを特徴とするマイクロアレイを提供するものである。
本発明のプライマーセットによれば、1つのプライマーセットを利用して百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌の10種の呼吸器疾患関連バクテリア種の標的配列を増幅できる。
また、本発明のプローブによれば、前記10種の呼吸器疾患関連バクテリア種の核酸配列と交差反応性がなく、かつ特異的に特定種を検出できる。
また、本発明の方法によれば、前記10種の呼吸器疾患関連バクテリアからなる群から一つ以上のバクテリアを効率的に検出できる。さらに、本発明のマイクロアレイは、前記10種の呼吸器疾患関連バクテリアのいずれか一つ以上のバクテリアの検出に有用である。
本発明は、配列番号1中の10個以上の連続塩基の断片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、配列番号2中の10個以上の連続塩基の切片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に特異的な標的配列増幅用のプライマーセットを提供する。
本発明のプライマーセットは、前記10種のバクテリアから由来する16S rRNA遺伝子内の標的配列、すなわち327〜529番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを増幅するのに使われうる。前記プライマーセットは、前記10種のバクテリア由来の標的配列を共通して増幅できるために、各バクテリア種に対して別々のプライマーセットを使用せずに標的配列を増幅できる。
プライマーセットを作製するために用いられた各種の菌株数は、下記表1の通りである。
前記バクテリア種の119菌株から16S rRNA遺伝子の配列を比較し、その結果から4個のプライマー候補を選別した(表2参照)。
前記表2に表した候補プライマーセットのうち、配列番号1及び2を含むプライマーセットが10種のバクテリア由来の16S rRNA遺伝子を最も効率的に増幅できると判別された。
また、本発明は、配列番号3及び4中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の百日咳菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号5及び6中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号7及び8中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号9及び10中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号11及び12中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号13及び14中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号15及び16中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号17及び18中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の緑膿菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号19及び20中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、及び配列番号21及び22中の10個以上の連続塩基の断片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌からなる群から選択された一つ以上のバクテリアの標的核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、前記10種のバクテリアのうち、特定の種を特異的に検出するためのプローブとして使われうる。
すなわち、配列番号3及び4;配列番号5及び6;配列番号7及び8;配列番号9及び10;配列番号11及び12;配列番号13及び14;配列番号15及び16;配列番号17及び18;配列番号19及び20;配列番号21及び22はそれぞれ、百日咳菌;肺炎クラミドフィラ菌;インフルエンザ菌;クレブシエラ肺炎菌;レジオネラ肺炎菌;モラクセラ・カタラーリス;マイコプラズマ肺炎菌;緑膿菌;黄色ブドウ球菌;肺炎レンサ球菌から由来した核酸に特異的なオリゴヌクレオチドである。本発明では、このオリゴヌクレオチドを、前記10種のバクテリアのうち、特定の種を特異的に検出するためのプローブとして(例えば、配列番号3及び4に基づくオリゴヌクレオチドを百日咳菌を検出するためのプローブとして)使用することができる。
本発明において、「プローブ」とは、ハイブリダイゼーションプローブを意味し、核酸の相補性鎖に配列特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを意味する。本発明において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸(PNA)、DNA及びRNAを含むものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記10種のバクテリアから特定の種を特異的に検出するために使われるいかなる方法でも使われうる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが固定化されている固体基板を利用して特定の種を検出する方法に使うことができる。
本発明の前記プローブオリゴヌクレオチドは、10種の呼吸器疾患関連バクテリアのゲノムをテンプレートとし、配列番号1中の10個以上の連続塩基の切片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、配列番号2中の10個以上の連続塩基の切片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドとを含むプライマーセットをプライマーとしたPCRで増幅された核酸を特異的に検出することもできる。プローブオリゴヌクレオチドが結合する位置を表3に示す。
本発明のプライマーセット及びオリゴヌクレオチドプローブは、特定バクテリアの存在を検出する方法に使用することができる。この方法は、前記プライマーセットをプライマーとして、前記10種のバクテリアのうち一つ以上を含む試料から分離された核酸をテンプレートとしてPCRを行うことにより、また、前記各バクテリア種に特異的に結合できる前記プローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することにより、特定バクテリアの存在を検出するのに使われうる。さらに前記プライマーセットをプライマーとして、前記10種のバクテリアのうち一つ以上を含む試料から分離された核酸をテンプレートとしてPCRを行い、それから得られるPCR産物を前記各バクテリア種に特異的に結合できる前記プローブオリゴヌクレオチドを反応させることによって、前記PCR産物検出することによっても、特定バクテリアの存在を検出することができる。
従って、本発明は、具体的にはバクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、本発明の配列番号1中の10個以上の連続塩基の切片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドと、配列番号2中の10個以上の連続塩基の切片を有し、長さが10bp〜100bpであるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットとをプライマーとして使用してPCRを行うステップと、得られたPCR産物を本発明の配列番号3〜22の配列中のいずれかに存在する10個以上の連続塩基の切片を含むオリゴヌクレオチド及びそれに相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択される長さが10bp〜100bpである一つ以上のプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して検出するステップとを含む、百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌または肺炎レンサ球菌のいずれか一つ以上のバクテリアの存在を検出する方法をも提供する。
前記プローブオリゴヌクレオチドは、適切な検出可能なシグナルを発生させる標識物質で標識されていてもよい。
本発明の方法において、「PCR」とは、重合酵素連鎖反応を意味し、重合酵素を利用して標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法である。かかるPCR法は、当業界で公知であり、商業的に利用可能なキットを利用することもできる。かかるPCR法には、一回に一つの標的だけを増幅する単一PCRと、一回に複数の標的を増幅する多重PCRとが含まれる。多重PCRでは、複数のプライマー対が利用される。
本発明の方法において、前記一つ以上のバクテリアの検出は、検出可能なシグナルを発生させる物質で前記PCR産物を標識し、それを前記プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それから発生するシグナルを検出して行うことができる。前記検出可能なシグナルは、例えば、光学的シグナルまたは電気的シグナルであるが、これらの例に限定されるものではない。前記光学的シグナルとして、具体的には蛍光または燐光を発生させる物質が挙げられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、Cy−5及びCy−3などが挙げられる。また、前記PCR産物は、ハイブリダイゼーション前またはその後に検出可能なシグナルを発生させる物質で標識されてもよいし、標識されなくてもよい。標識されていない場合の前記PCR産物とプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果は、例えば、電気的シグナルを介して検出できるが、それらの例に限定されるものではない。
本発明はまた、本発明のプローブオリゴヌクレオチドまたはプローブオリゴヌクレオチドセットが固定化されている基板を用いたマイクロアレイを提供する。
本発明のマイクロアレイにおいて、「マイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度に固定化されているものであり、本発明においては、前記ポリヌクレオチドグループを、それぞれ一定の領域に固定化する。かかるマイクロアレイは、当業界で公知である。マイクロアレイについては、例えば、米国特許第5,445,934号明細書及び同第5,744,305号明細書に開示されている。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。
(実施例1:9種の呼吸器疾患関連バクテリアに特異的なプローブが固定化されているマイクロアレイを利用した標的バクテリアの検出)
本実施例では、百日咳菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なそれぞれ2個のオリゴヌクレオチド(それぞれ、配列番号3及び4、7及び8、9及び10、11及び12、13及び14、15及び16、17及び18、19及び20、21及び22)がそれぞれ4個のスポット領域に固定化されているマイクロアレイを製造し、これを利用して試料中に標的バクテリア種が存在しているか否かを確認した。
本実施例で用いられるマイクロアレイは、アミン化合物で活性化された基板上に、前記種の特異的オリゴヌクレオチドを添加し、50℃で30分間反応させることによって固定化した。得られたマイクロアレイに、前記のような9種各バクテリア由来した核酸が含まれている試料を、前記バクテリアに特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているスポットに添加し、16℃で12時間ハイブリダイゼーション反応を行った。図1は、マイクロアレイから測定された540nmでの蛍光強度によるハイブリダイゼーションの結果を表す写真である。図1に示すように、本発明の各オリゴヌクレオチドが各種に対する特異的なプローブとして使用することができるということが分かる。図1で、A、B、C、D、E、F、G、H及びIは、それぞれ百日咳菌、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に対して特異的なオリゴヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイからのハイブリダイゼーション結果を表す写真である(四角形内を参照)。
従来公知のプライマーの場合、1個のプライマーセットで10種の呼吸器バクテリアを1回で検出できるということは確認されていないが、本発明のプライマーセットは、本発明の実施例で確認されたように、百日咳菌11株数、肺炎クラミドフィラ菌15株数、インフルエンザ菌20株数、マイコプラズマ肺炎菌10株数、クレブシエラ肺炎菌19株数、レジオネラ肺炎菌9株数、モラクセラ・カタラーリス6株数、緑膿菌7株数、黄色ブトウ球菌17株数及び肺炎レンサ球菌5株数、すなわち10種のバクテリアの119株数で発見された標的配列を共通に増幅するのに使われうるという長所がある。
本発明の10種のバクテリアの標的配列を特異的に増幅できるプライマーセット及び該10種のバクテリアのうち各種の標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、例えば呼吸器疾患と関連した10種のバクテリア種関連の技術分野に効果的に適用可能である。
マイクロアレイから測定された540nmでの蛍光強度によるハイブリダイゼーション結果を表す写真である。

Claims (4)

  1. バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、配列番号1オリゴヌクレオチドと、配列番号2オリゴヌクレオチドとを含む百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、マイコプラズマ肺炎菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に存在する標的配列を特異的な増幅する、プライマーセットと、
    前記プライマーセットを用いたPCRにより得られた産物について、配列番号3及び4の百日咳菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号5及び6の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号7及び8のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号9及び10のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号11及び12のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号13及び14のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号15及び16のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号17及び18の緑膿菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号19及び20の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、並びに配列番号21及び22の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドからなる、百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌に存在する標的核酸を特異的に検出する、プローブとからなる、セット
  2. バクテリアを含む試料から分離された核酸をテンプレートとし、請求項1に記載のプライマーセットをプライマーとしてPCRを行うステップと、
    請求項に記載の配列番号3及び4の百日咳菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号5及び6の肺炎クラミドフィラ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号7及び8のインフルエンザ菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号9及び10のクレブシエラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号11及び12のレジオネラ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号13及び14のモラクセラ・カタラーリス由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号15及び16のマイコプラズマ肺炎菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号17及び18の緑膿菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、配列番号19及び20の黄色ブドウ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチド、並びに配列番号21及び22の肺炎レンサ球菌由来の核酸に特異的なプローブオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、得られたPCR産物を検出するステップと、
    を含むことを特徴とする百日咳菌、肺炎クラミドフィラ菌、インフルエンザ菌、クレブシエラ肺炎菌、レジオネラ肺炎菌、モラクセラ・カタラーリス、マイコプラズマ肺炎菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌及び肺炎レンサ球菌の存在を検出する方法。
  3. 前記プローブオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイの基板に固定化されていることを特徴とする請求項に記載の方法。
  4. 請求項1に記載のPCR用プライマーセットと、
    請求項に記載のプローブオリゴヌクレオチドが固定化された基板を使用することを特徴とするマイクロアレイとを含む、キット
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