NO843574L - Fremgangsmaate for paavisning, identifisering og kvantifisering av organismer og virus - Google Patents

Description

FREMGANGSMÅTE FOR PÅVISNING, IDENTIFISERING OG KVANTI-

FISERING AV ORGANISMER OG VIRUS

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og midler for påvisning, identifisering og kvantifisering av organismer i biologiske og andre prøver. Således ved-

rører den en fremgangsmåte for spesifikk og sensitiv på-. visning og kvantifisering av enhver organisme som inne-

holder ribosom RNA, (heretter R-RNA), transfer RNA (heretter t-RNA) eller annet RNA, alle medlemmer av store, mellomstore eller små kategorier eller taksonomiske grupper av slike organismer, og tidligere ukjente orga-

nismer inneholdende R-RNA eller t-RNA. Fremgangsmåten er i stand til å påvise nærvær av selv en organisme innehold-

ende R-RNA eller t-RNA.

Oppfinnelsen innebefatter også en fremgangsmåte for bruk

av spesifikt fremstilte nukleinsyrer som. er komplementære til. spesifikke sekvenser eller populasjoner av forskjellige sekvenser av RNA klassen mRNA eller hnRNA eller snRNA eller

klassen RNA sekvenser (heretter prekursor spesifikke. RNA sekvenser eller bsRNA) som foreligger i mRNA, R-RNA,

t-^-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler og ikke i fullstendige mRNA, R-RNA, t-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler å påvise, identifisere og kvantifisere spesifikke organismer, grupper av organismer, grupper.av eukaryotiske celler eller virus-

i celler.

Min oppfinnelse og nyheten, utnyttelsen og det overraskende derved er letter å forstå og oppfatte i lys av den representative bakgrunnsinformasjon som er angitt i det følgende omfattende dette felt. •

Bakgrunn

Hver av- cellene i alle livsformer bortsett fra virus inneholder

. ribosomer og derfor ribosom RNA. Et ribosom inneholder tre

adskilte, enkeltstrengede RNA molekyler, nemlig et stort molekyl, et middels stort molekyl og et lite molekyl. De to større R-RNA molekyler varierer i størrelse i forskjellige organismer.

Ribosom RNA er et direkte.geneprodukt og kodes for av R-RNA genet. Denne DNA sekvens brukes, som en mal for å syntetisere R-RNA molekyler. Et separat gen foreligger for hver av de ribosomale RNA underenheter. Multiple R-RNA gener eksisterer i de fleste organismer, mange høyere organismer inneholder både nukleær og mitokondriske R-RNA gener. Planter og visse, andre former inneholder nukleære, mitokondriske og kloroplast R-RNA gener. For enkelhet i den følgende omtale vil de tre adskilte R-RNA gener kalles R-RNA genet.

Tallrike ribosomer foreligger i alle celler i alle livsformer . Ca. 8 5 til 90 prosent av det totale RNA i en typisk celle er R-RNA. En slik bakterie som E. coli inneholder, ca.

10 4 ribosomer pr. celle, mens en vanlig pattedyrslevercélle inneholder ca. 5 x 10^ ribosomer. Da hvert ribosom inneholder en av hver R-RNA underenhet, inneholder bakteriecellen og

' 4 6

pattedyrcellen henholdsvis 10 og 5 x 10 av hver R-RNA underenhet.'

Nukleinsyrehybr.idiser ing, . en velkjent fremgangsmåte, er tidligere brukt for spesifikt å påvise ekstremt små eller store mengder av en spesiell nukleinsyresekvens, selv i nærvær av et meget stort overskudd av ikke beslektede sekvenser. Tidligere bruk av nukleinsyrehybridisering er f.eks. funnet i publikasjoner på området molekylærgenetikk av celler og virus, genetisk ekspresjon, av celler og virus; genetisk analyse av livsformer; evolusjon og taksonomi eller organismer og nukleinsyresekvenser; molekylær mekanismer for sykdoms-forløp; diagnostiske metoder for spesielle formål innebefattet påvisning av virus og bakterier i celler og organismer..

Sannsynlig er det bruktkarakterisertog mer studerte.gen- og geneprodukt R-RNA genet og R-RNA, og teknikkens, stand beskriver bruk av hybridisering av R-RNA og ribosomgener i gene-

tisk analyse.og evolusjon og taksonomisk klassifisering

av organismer og ribosomale genesekvenser. Genetisk analyse medfører f.eks. påvisning av antall ribosomalé RNA gener i forskjellige organismer, påvisning av likheten mellom de multiple ribosomale RNA gener som foreligger i celler;

påvisning av mengde og utstrekning av syntese av R-RNA i celler og de faktorer.som kontrollerer dem. Evolusjon og taksonomistudier innebefatter sammenligning av R-RNA gen basesekvensen fra beslektede og vidt forskjellige organismer.

Det er kjent at den ribosomale RNA genebasesek<y>ens i det minste delvis er lignende i meget forskjellige organismer, og at DNAet til E.' coli bakterielle ribosomale RNA gener hybridiserer godt. med R-RNA fra planter, pattedyr og en rekke andre bakteriearter. Fraksjonen av E. coli genet som hybridiserer med disse andre.arter varierer med graden av slektskap hos organismene. Nesten alle R-RNA genesekvenser hybridiserer til R-RNA fra nær beslektede bakteriearter, mens færre hybridiserer til R-RNA fra fjernere beslektede bakteriearter, og enda mindre med R-RNA fra pattedyr.

Som med R-RNA.er, er t-RNAer tilstede i alle levende celler som til. noen virus. t-RNA gener er tilstede i kromosom og plasmid DNAer fra prokaryoter og i DNAet til eukaryotiske celler, innebefattet DNA fra kjernen, mitokondria og kloroplaster. Forskjellige t-RNA gener fra en t-RNA type fore-, ligger ofte i en enkelt cel.le. t-RNA gener fra mitokondria, kjerner og kloroplaster er helt forskjellige. Mange virus-genomer inneholder gener for t-RNAér som er spesifikke for virusen.

t-RNA molekyler er direkte geneprodukter og syntetiseres i' cellen ved bruk av t-RNA genet som en mal. t-RNAet syntetiseres ofte som en del av et større RNA molekyl og t-RNA delen fjernes så fra dette forstadiemolekylet. Etter syntese modifiseres en fraksjon av basene til,t-RNA molekylet kjemisk av cellen.. Et typisk t-RNA molekyl inneholder fra 75-85. baser. . Tallrike ■ t-RNA molekyler foreligger i alle celler i alle.

livsformer, og normalt ca. 10% av en celles totale RNA består av t-RNA, en typisk bakteriecelle inneholder ca.

1,5 x 10 t-RNA molekyler av alle typer. Hvis vhve.r forskjellig' type t-RNA er likt representert i en bakteriecelle, er 2500 av hvert forskjellig t-RNA molekyl tilstede i hver celle. En typisk pattedyrlevercelle inneholder ca. 10 8 t-

RNA molekyler eller et gjennomsnitt på ca. 10^ kopier pr. celle av hver forskjellig t-RNA type.

Under proteinsyntese innrettes individuelle aminosyrer i riktig rekkefølge av forskjellige spesifikke t-RNAer, idet hver aminosyre bestemmes av en forskjellig t-RNA art. Noen aminosyrer bestemmes av mer enn en t-RNA type.

Det forekommer visse virus som inneholder t-RNA gener i

sine genomer, idet disse gener produserer virusspesifikk t-RNA når virusgenomet er aktivt i en celle. Disse t-RNAer kan også være tilstede i flere kopier i hver infisert celle.

Som med R-RNA gener og R-RNA er det tidligere beskrevet bruk av hybridisering av t-RNA og t-RNA gener i genetisk analyse og evolusjon og taksonomisk klassifisering av organismer,

og t-RNA genesekvenser. Genetisk analyse innebefatter f.eks. bestemmelsen av de antall t-RNA gener i forskjellige organismer; påvisning av likhetene mellom de multiple t^RNA

gener som er tilstede i celler; påvisning av hastighet og grad av syntese av t-RNA i celler og de faktorer som kontrollerer dem. Evolusjon og taksonomistudier innebefatter sammenligning av t-RNA genebasesekvensen fra beslektede og helt forskjellige organismer.

Og som ved R-RNA genebasesekvenser er det kjent at en indi-viduell t-RNA genebasesekvens i det minste er delvis lik i forskjellige organismer. Totalt t-RNA viser denne samme type slektskap og totalt t-RNA fra en art vil hybridisere lignende med t-RNA gener fra en fjernere beslektet organisme. Rotte-mitokondrisk leucyl-t-RNA hybridiserte lignende med mito-. kondria DNA fra kylling og gjær. (Biochemistry (1975) IA, ^10, s. 2037) .. t-RNA gener har også vist å bevares sterkt blant medlemmene av bakteriefamilien Enterobacteriaceae. Totale t-RNA gener fra E. coli hybridiserer godt med"<v>t-RNA isolert fra arter som representerer forskjellige gener (J. Bacteriology (1977) 129, / 3, s. 1435-1439). Fraksjonen fra E. coli t-RNA/gen som hybridiserer til disse andre arter varierer med graden av slektskap hos organismene. En stor del av E. coli" t-RNA genesekvensen hybridiserer til t-RNA fra en nær beslektet art, men hybridiserte meget mindre til R-RNA fra fjernere beslektede arter.

Konserveringsgradén av t-RNA genesekvensene under evolusjonen er ikke så stor som den for R-RNA genesekvensene. Ikke desto mindre er t-RNA genesekvensene meget mer sterkt konservert enn den store mengde DNA sekvenser tilstede i celler.

■ Sensitivitet og letthet av påvisning av medlemmer fra forskjellige grupper av organismer ved anvendelse av sonder spesifikke for R-RNA eller t-RNA fra den gruppe av organismer økes sterkt ved det store antall både R-RNA og t-RNA molekyler som er tilstede i hver celle. I tillegg utføres hybridiserings-prøven betydelig lettere fordi RNA molekyler tilstede i celler er enkeltstrengede. Således er denatureringstrinn, slik som

må brukes for en hybridiséringsprøve som påviser enhver fraksjon av cellulært DNA, ikke nødvendig når målmolekylet er RNA. Sonder spesifikke for andre klasser av cellenukleinsyrer ved siden av R-RNA eller t-RNA kan brukes for spesifikt å påvise, identifisere og kvantifisere spesifikke grupper av organismer eller celler ved nukleinsyrehybridisering. Således innebefatter andre kliasser RNA i prokaryotiske celler bud-bringer RNA (heretter mRNÅ) og RNA sekvenser som er en del av.flere forstadiemolekyler. F.eks. syntetiseres R-RNA

i bakterien E. coli som et forstadiumsmolekyl ca. 6000 baser langt. Dette forstadiumsmolekyl behandles så'og gir R-RNA underenheter (totalt ca. 4500 baser) som innebygges i ribosomer og de ekstra RNA sekvenser (1500 baser totalt) som kastes. t-RNA molekyler og ribosom 5S RNA syntetiseres også og behandles på lignende måte.

I prokaryotiske celler infisert med virus er det også tilstede virusspesifikt mRNA. mRNAene fra bestemte prokaryotiske virus syntetiseres også som et.forstadiummolekyl som inneholder overskuddet RNA sekvenser som trimmes vekk og kastes.

Mange av de prokaryotiske mRNAer og virus mRNAer er tilstede opptil flere hundre tusen ganger pr. celle,, mens tusener av overskuddet RNA sekvenser tilstede i R-RNA eller t-RNA forstadiumsmolekyler kan være tilstede i hver celle..

Eukaryotiske celler inneholder også forstadium mRNA samt forstadium R-RNA og t-RNA, moelkyler som er større enn de endelige R-RNA eller t-RNA molekyler. I motsetning til prokaryoter er mange nylig syntetiserte eukaryotiske mRNA molekyler meget større enn de endelige mRNA molekyler og inneholder overskudd RNA sekvenser som trimmes vekk.og kastes. Andre klasser RNA tilstede i eukaryotiske celler er heterogen kjerne RNA (heretter kjent som hn-RNA), som er en forskjellig, klasse RNA som inneholder mRNA forstadiumsmolekyler (hvilke forlater kjernen for cytoplasma hvor proteinsyntesen foregår) og en stor mengde RNA som aldri forlater kjernen. Denne fraksjonen inneholder også en liten fraksjon dobbeltstrenget RNA. Eukaryotiske kjerner inneholder også små RNA molekyler kalt -småkjernet RNA (heretter snRNA), varierende i lengde fra 100-200 baser.

Graden eller antallet av kopier pr. celle av forskjellige mRNA molekyler varierer sterkt. Dette varierer fra en kompleks klasse av mRNA molekyler som er tilstede bare 1.-2 ganger pr. celle, til den moderat forekommende klasse av RNA molekyler som er tilstede flere hundre ganger pr. celle, til den meget sterkt representerte klasse RNA molekyler som kan være tilstede 10 4 eller flere ganger pr. celle. Mange av RNA sekvensene tilstede i hnRNA er også meget utbredt i hver celle. RNA sekvensene tilstede i forstadie RNA molekylene

for R-RNA, t-RNAer og mange mRNAer er også meget utbredt

i hver celle. Enkelte snRNA sekvenser er ekstremt utbredte og kan foreligge fra 10 4 til 10 6ganger pr. celle.

Eukaryotiske celler infiseres også av virus som produserer virusspesifikt mRNA og i. mange tilfeller virusspesifikke forstadie mRNA molekyler som inneholder RNA sekvenser ikke tilstede i det ferdige mRNA molekyl. Det individuelle virusspesifikke mRNA og forstadie RNA molekyler varierer

i utstrekning fra kompleks (1-2 kopier pr. celle) til vold-somt representert (ca.. 10 4 kopier pr. celle) .

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor en fremgangsmåte

for spesifikk og sensitiv påvisning, identifisering og kvantifisering av organismer,- samt virus tilstede i celler. Spesielt er fremgangsmåten anvendelig for sensitiv påvisning, identifisering og kvantifisering av alle medlemmer av forskjellige store kategorier av organismer, eukaryotiske celler, virus og i noen tilfeller tidligere ukjente organismer inneholdende mRNA, hnRNA, snRNA eller overskudd RNA molekyler

■ tilstede i' R-RNA, t-RNA, mRNA eller hnRNA molekyler.

Foreliggende oppfinnelse har derfor bred anvendelse på alle

■ områder hvor det er viktig å bestemme nærvær eller fravær

av levende organismer eller virus tilstede i celler; tilstand av genetisk ekspresjon av en organisme, celle, virus tilstede i en celle, eller grupper av celler av prokaryotiske eller eukaryotiske organismer. Slike områder er medisinsk, veterinær-medisinsk og agrikulturell diagnose og industriell og farma-søytisk kvalitetskontroll.

Oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for bruk av spesifikt fremstilte nukleinsyrer komlementære til ikke bare R-RNA og t-RNA, men også til spesifikke sekvenser eller populasjoner

av forskjellige sekvenser av RNA klassen mRNA eller hnRNA eller snRNA eller klassen av RNA sekvenser (heretter kalt forstadie spesifikke RNA sekvenser eller psRNA) som er tilstede bare ikke i forstadiene mRNA, t-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler og i ikke ferdige mRNA, R-RNA, t-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler for å påvise, identifisere og kvantifisere spesifikke organismer, grupper eller organismer, grupper av.eukaryotiske celler eller cirus i celler ved fremgangs-. måten for nukleinsyrehybridisering.

Foreliggende oppfinnelse og nyheten, anvendeligheten og det overraskende ved denne vil fremgå klarere i lys av den ytterligere representative bakgrunnsinformasjon som her gis, nemlig: .1. mRNAer og psRNAer foreligger i alle organismer og celler, hnRNAer og snRNAer er tilstede bare i eukary- " otiske celler. Celleorganeller som inneholder.DNA, innebefattet mitokondria og. kloroplaster inneholder også mRNA, psRNA, R-RNA og t-RNA.

2. En typisk bakteriecelle inneholder mer enn et tusen

gener, hvorav den helt dominerende del koder for et spesifikt protein. En pattedyrcelle inneholder over 10000 gener hvorav hver kan produsere RNA. Ethvert gen har evne til å produsere flere kopier av RNA i encelle. Hvert spesifikt RNA molekyl.som fremstilles er et direkte geneprodukt.

3. Mange forskjellige mRNA sekvenser kan være tilstede

i hver organisme eller celle. De enkelte celler eller en flercellet organisme kan ha forskjellige mRNA

sekvenser .tilstede i hver celle eller i forskjellige

grupper 'av celler.

.Mange forskjellige hnRNA, psRNA og snRNA sekvenser kan være tilstede i hver celle eller gruppe av celler av en eukaryoti-sk organisme.

Celler infisert med en spesifikk virus kan inneholde en rekke forskjellige typer av virus spesifikke mRNA og psRNA.

4. Antall kopier (heretter utbredelsen) av et spesifikt

mRNA i en prokaryotisk celle varierer fra null til flere hundre. Utbredelsen av en spesifikk psRNA sekvens i en prokaryotisk organisme ■ eller celle kan være 10 til 20 ganger høyere..

Utbredelsen av et spesifikt mRNA molekyl i en eukary-otisk celle varierer fra .1 til 2 til større enn 10■ .4

Utbredelsen av en spesifikk hnRNA sekvens i en eukary-otisk celle varierer fra 1-2 til større enn 10 4 pr.

.celle.

Utbredelsen av et spesifikt snRNA molekyl i en eukary-otisk celle varierer fra 10 4 til 10 6pr., celle.

Utbredelsen av en spesifikk psRNA sekvens i en eukary-otisk celle varierer fra 1-2 til over 10 4pr. celle.

5. I mange eukaryoter produseres RNA av forskjellige

typer fra de gjentatte sekvensfraksjoner av DNAet.. Dette kan føre til en populasjon av utbredte RNA molekyler hvis sekvenser er lignende, men ikke identiske med hverandre. En sonde komplementær til en av disse RNA molekyler vil imidlertid hybridisere med alle

de andre lignende RNA molekyler.

6. Genesekvensene som koder for forskjellige individuelle mRNAer, psRNAer, hnRNAer og snRNAer i' virus

i levende organismer er blitt konservert i varierende grad under evolusjon. Den dominerende del av disse sekvenser er meget mindre konservert enn t-RNA sekvenser. Noen av sekvensene er imidlertid sterkt konservert. F.eks. det gen som koder for histon mRNA er meget konservert gjennom evolusjon og histongensekvensen er temmelig lik hos helt forskjellige organismer.

Mangelen på bevaring i DNA sekvensen av mange av disse RNAer tillater produksjonen av sonder som lett kan skille mellom nær beslektede organismer eller virus.

En. rekke studier er foretatt på forskjellige mRNAer, hnRNAer, snRNAer og psRNAer (se Gene Expression,

Vol. 1 og 2, av B. Lewin, i referanser). Disse omfatter hybridisering av disse RNAer under studier av genetisk analyse, regulering og evolusjon hos prokaryotiske og■eukaryotiske organismer og virus.

Tidligere kjente hybridiseringsfremgangsmåter

To grunnleggende nukleinsyrehybridiseringsf remcjangsmåter er tidligere beskrevet. I en, nemlig hybridisering i. løsning,

er både sonden og prøvenukleinsyremolekylene fri i løsning..

Med den andre metoden immobiliseres prøven på en fast bærer

sg sonden er fri i løsning. Begge disse metoder brukes meget og er godt beskrevet i litteraturen. Et eksempel på metodene i. løsning er gitt i det følgende i eksemplene. Også i artikkelen til Thomas et al. , Proe. Nati. Åcad. Sei. USA. (198-0), 77, s.

520 foreligger et eksempel på den immobiliserte metode.

De grunnleggende bestanddeler av en nukleinsyrehybridiserings-prøve er: 1. Sonde - En markert enkeltstrenget nukleinsyresekvens som er komplementær til nukleinsyresekvensen.som skal påvises (dvs. mål sekvensene)'-. Brukt her er målsekvensen den totale sekvens eller en undersekvens av R-RNA, t-RNA eller annet RNA.

Sondelengden kan variere fra 5 baser til titusener av baser og vil avhenge av den spesifikke prøve som skal utføres.

Bare en del av sondemolekylet behøver å være komplementært

med nukleinsyresekvensen som skal påvises (i det følgende mål-sekvensene). Dertil behøver komplementæriteten mellom sonde og målsekvensen.ikke å være perfekt. Hybridisering, opptrer mellom ikke perfekt komplementære molekyler med det resultat at en bestemt fraksjon av basen i det hybridiserte området ikke parres med den riktige komplementære base. En sonde kan., bestå av enten RNA eller DNA. Formen av nukleinsyresondeh kan være et markert enkeltstrenget molekyl med kun en polari-tet eller markert, enkeltstrenget molekyl med begge polari-teter tilstede. Formen av sonden i likhet med dens lengde vil bestemmes av typen hybridiseringsprøve. som skal utføres.

2. Prøve - Prøven kan men behøver ikke inneholde målmolekylet (dvs. organisme av interesse). Prøven kan ha en rekke former innebefattet væskeform såsom vann eller serum, eller fast såsom støv, jord. eller vevsprøver. Prøvenukleinsyren må være tilgjengelig for kontakt med sonden før noen hybridisering av sonden og målmolekylet kan finne sted. Således må organismens RNA være fri fra cellen og bringes under de riktige betingelser før hybridisering kan finne sted^. Tidligere kjente metoder for hybridisering"^ løsning krever rensing av RNAet for å kunne oppnå hybridisering av prøve RNAet med sonden. Dette har betydd at for å anvende metoden i løsning for påvisning av målsekvenser i en prøve, må nukleinsyrene i prøven først renses for å fjerne protein, lipider og andre cellebestanddeler, og deretter kontaktes med sonden under hybridiseringsbetingelser. Rensningene.av prøvenukleinsyren tar minst flere timer og kan ta opptil en dag, avhengig av prøvens natur og mengde.

3. Hybridiser-.ingsmetode

Sonde og prøve må blandes under betingelser som vil muliggjøre nukleinsyrehybridisering. Détte medfører kontakt av prøven -og sonden i nærvær et uorganisk eller organisk salt under riktige konsentrasjons- og temperaturbetingelser. Sonden og prøvenukleinsyrer må være i kontakt tilstrekkelig lang tid til å eventuell hybridisering mellom sonde og prøvenukleinsyre kan finne sted.

Sondens eller målets konsentrasjon i blandingen vil bestemme: den nødvendige tid for hybridisering. Jo høyere sonden eller målkonsentrasjonen er, jo kortere■hybridiseringsinkubasjons-tid kreves.

En nukleinsyrehybridiseringsinkubasjonsblanding bestående av sonde- og prøvenukleinsyrer må inkuberes ved en spesifikk temperatur i tilstrekkelig lang tid til at hybridisering kan finne sted. Lengden av den nødvendige tid for hybridisering - for å forløpe fullstendig avhenger av konsentrasjonen av sonde-nukleinsyren, konsentrasjonen av prøvenukleinsyren som er komplementær til sonden og"en grunnleggende hastighet for hybridisering som er karakteristisk for de anvendte hybridiseringsbetingelser. Den grunnleggende.hybridiseringshastighet bestemmes av typen salt tilstede i inkubasjonsblandingen,

dets konsentrasjon og inkubasjonstemperaturen. Natriumklorid, natriumfosfat og natriumsitrat er de hyppigst anvendte salter, for hybridisering, og saltkonsentrasjonen som brukes er sjelden oved 1 M og noen ganger opptil 1,5 - 2 M. De nevnte salter ovenfor, gir sammenlignbare hastigheter av nukleinsyre-hybr.idisering ved bruk i samme konsentrasjoner og temperaturer som de sammenlignbare kalium-, litium, rubidium- og cesium-

■salter. Britten et al. (1974) (Methods in Enzymology,

Volume XXIX, del E. , ed.. Grossraan. og Moldave; Academic Press, New York, side 364) og Wetmur og Davidsdn (1968)

(J. Molecular Biology, Vol. 31, side 349) beskriver data som illustrerer standard grunnhastigheten for hybridisering oppnådd ved vanlig brukte salter. Hybridiseringshastighetene for DNA med RNA varierer noe fra sådanne for DNA som hybridiserer med DNA. Variasjonsgraden er sjelden over ti ganger og varierer, avhengig f. eks. av om et overskudd DNA eller RNA brukes. Se Galau et ål. (1977) (Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, Vol 74, /'.6-, s. 2306).

Bestemte betingelser fører til akselerasjon av DNA; DNA hybridisering. En emulsjon av-fehol og salt påskynder den meget raske hybridisering av DNA når blandingen røres. Hastigheten øker flere tusen ganger raskere enn standard hybridiser ihgsha stigheter oppnådd med dette systemet (Kohne et al.,. Biochemis.try (1977) Vol. 16, s. 532a). DNA hybridiseringshastighetsakseleréring fra 50 til 100 ganger sammenlignet med standardhastigheter er også observert når nøytrale og anioniske dekstranpolymerer blandes med enkeltstrenget DNA i løsning (Wetmur, Biopolymers (1975) Vol 14. s. 2517). Ingen av disse DNA - akselererende hastighetsbetingelser ble rapportert og akselerere hybridiseringshastigheten for DNA:RNA hybridisering. Søkeren har ikke kjennskap til tidligere litteratur som dokumenterer en tilstand for akselerering av hastigheten

til RNA:DNA hybridisering.

4. Hybridiserings-

måling - En fremgangsmåte er nødvendig for å

påvise nærværet av sondemolekyler hybridisert til målmolekylene. En slik metode avhenger av evnen til å adskille sonden som hybridiseres til målmolekyler fra sonden som ikke er hybridisert til målmolekyler. Tidligere kjente metoder for å måle hybridiserings-blandinger i løsning har blitt utført på prøvenukleinsyrer som først er renset og deretter kontaktet med sonden i hybridiser ing s inkubas jons bland ing en .

Hydroksyapatitt (HA) er blitt brukt som en standardmetode

for å måle hybridiseringsblanderetninger i^ løsning med hensyn til nærvær av hybridisert sonde. Under de viktige betingelser binder HA selektivt hybridisert DNA sonde, men binder ikke sonde som ikke er hybridisert. Andre metoder foreligger for å måle hybridisert sonde. Disse innebefatter. S-^ nukleasemåling som avhenger av et spesifikt enzyms evne til å nedbryte ikke hybridisert sonde til små underenheter, mens den hybridise.rte sonde ikke nedbrytes av enzymet og forblir stor. Den ned-brutte sonde kan deretter adskilles fra den hybridiserte sonde ved størrelsesseparasjonsteknikk. Forskjellige metoder for å måle hybridiserte nukleinsyrer i løsning er beskrevet i Britten et al. (1974) ovenfor.

Metodene for immobilisert prøvenukleinsyrehybridisering har hybridiseringsmålinger innebygget i hybridiseringsmetoden. Disse metoder innebefatter fiksering av prøvenukleinsyren

på en inert bærer og deretter hybridisering av denne immobiliserte nukleinsyre med en markert sonde som er fri i løsning.Hybridisering av enhver prøve med den immobiliserte prøve-nukleinsyr.e fører til bindingen av sonden til prøvenuklein-syren og derfor knytting av sonden til den inerte bærer. Ikke hybridisert sonde forblir fri i løsning og kan.vaskes vekk fra den inerte bærer og den hybridiserte sonde. En slik. metode krever minst flere timer for å forberede prøven for nukleinsyrehybridisering, i en til to timer for vask og krever.store, mengder sonde. En fordel ved denne metoden er dens evne til å plassere flere prøver på samme inerte bærer og å hybridisere og behandle alle prøvene samtidig. Eksempler på en slik immobilisert prøvemetode er beskrevet

. i- AnalyticalBiochemistry (1983) Vol.. 128, s. 415, og J.

ofInfectious Disease (1982) Vol. 145, V 6, s. 863.

Tilgjengeliggjørelse av nukleinsyrer for hybridisering

Nukleinsyrehybridiseringsmetoder i løsning har alltid anvendt nukleinsyrer som er blitt renset vekk fra andre

cellebestanddeler. Nukleinsyrer i celler og virus er normalt tett kompleksert til andre cellebestanddeler, normalt protein,

og er i denne form ikke tilgjengelig for hybridisering.

Enkel oppbrytning av cellen eller virusen for å frigjøre innholdene gjør ikke nukleinsyrene tilgjengelig for hybridisering. Nukleinsyrene forblir kompleksert med andre celle-eller virusbestahddeler selv når de er frigjort fra cellen,

og kan faktisk bli sterkt nedbrutt av nukleaser som også

kan frigjøres. I tillegg .kan en markert sonde sammensatt til en slik blanding bli kompleksert til."klebrig" celle eller virus bestanddeler og gjøres utilgjengelige for hybridisering, eller sonden kan nedbrytes ved nukleasevirkhing.

En rekke tidligere kjente metoder foreligger for. rensing av nukleinsyrer, og flere av disse er beskrevet i Maniatis et al., ovenfor. Disse metoder er alle tidkrevende -- en som tar opptil en .time anser som meget rask og krever flere manipulasjoner.

Såvidt kjent foreligger ingen tidligere metode for å. utføre nukleinsyrehybridisering i løsning, som ikke krever bruk av noe forrensningstrinn for å gjøre nukleinsyrene tilgjengelige for hybridisering.

De immobiliserte nukieinsyrehybridiseringsmetoder.innebefatter fiksering av prøvenukleinsyren på en inert bærer og deretter hybridisering av denne immobiliserte nukleinsyre med markert sonde som er fri i. løsning.

Fremgangsmåten for fik-sering av nukleinsyrer på den inerte bærer gir ét tilstrekkelig effektivt rensetrinn til å gjøre de bundede nukleinsyrer tilgjengelige for hybridisering.

De fleste ikke nukleinsyrecéller eller viruskomponenter bindes ikke til den inerte bærer, og de som binder, bindes på forskjellige steder fra nukleinsyrene. En slik metode krever flere timer minst for å forberede prøvenukleinsyrer for hybridisering. En fordel ved denne metoden er muligheten å plassere flere prøver på den inerte bærer og behandle dem alle.sammen gjennom hybridiserings- og hybridiserings-målingstrinnene. Hybridiseringsmålingen'består i fjerne den inerte bærer fra hybridiseringsblandingen. Sonde som er hybridisert til den fikserte prøve, forblir på' den inerte bærer

mens ikke hybridisert sonde forblir fri i løsning.

A S M. A/S. 15.000. 6.84

Vekstprøver:

Et stort antall forskjellige vekstprøver foreligger, hver anvendelig for veksten av en spesifikk organisme eller en gruppe organismer. Vekstprøver.har den potensielle sensitivitet til å påvise en .organisme. I praksis er imidlertid mange organismer vanskelige eller umulige å dyrke. Disse prøver er normalt langvarige idet de tar fra en dag til måneder å avslutte. Dertil ville et stort antall prøver kreves for

å påvise nærvær av et.hvilket som helst medlem av en stor gruppe organismer (f.eks. alle bakterier) forutsatt at vekst-'betingelsene for alle medlemmer av gruppen er kjente.

Optiske påvisningsmetoder:

Mikroskopisk analyse i forbindelse med differensielle farge-metoder er meget effektivt, og i mange tilfeller en meget rask påvisningsmetode. Et hovedproblem med dette er påvisningen av spesifikke organismer i nærvær av store mengder av andre organismer, f.eks. identifikasjon av en spesifikk type av gramnegative stavformede bakterier i nærvær av mange forskjellige typer av gramnegative stavformede bakterier.

I tillegg ville et stort antall prøver kreves for å påvise nærvær av. alle medlemmer av en stor gruppe organismer (såsom gruppen av alle. bakterier).

Serologiske og immu. nokjemiske metoder og biokjemiske prøver: Et stort antall forskjellige typer av disse prøver foreligger. De er normalt kvalitative, ikke meget sensitive og krever ofte et veksttrinn. Mange av disse prøvene ville kreves for å påvise alle medlemmer av en stor gruppe organismer..

5^ ife /fe. ^fe.

US patent A.358.535 beskriver en fremgangsmåte for påvisning av.genetisk materiale, dvs. gener eller genomer. I dette patent overføres en klinisk prøve eller isolat mistenkt for

■ å inneholde et patogen på en inert porøs bærer såsom et

nitrocellulosefilter, og behandlet på en slik måte at cellene lokaliseres. Cellene behandles så på en slik måte at deres DNA frigjøres og dette kobles på bæreren. Ettérfølgende behandling gir en.separasjon av de individuelle DNA strenger i genomet. Strengene bringes så i kontakt med markerte sonder spesifikke for den karakteristiske polynukleotidsekvens under hybridiseringsbetingelser. Hybridisering av prøven til de enkeltstrengede polynukleotider fra patogenet påvises ved hjelp av markøren.

Fremgangsmåten ifølge dette patentet for påvisning av gener eller genomer. i likhet med andre forut nevnte metoder har ikke den spesifisitet, sensitivitet, hurtighet eller er så lett å utføre som min oppfinnelse. En sammenfatning av sammen-ligninger av denne metode som er beskrevet i dette patent og. Søkerens metode, som her er beskrevet er gitt nedenunder:

1. Fremgangsmåte for utførelse av hybridisering

FALKOW ET AL. METODE

Immobilisert metode bare

SØKERENS METODE

I løsning metode foretrukket.

Immobilisert metode kan brukes.

2. Klasse av nukleinsyre som skal påvises

FALKOW ET- AL. METODE

Genetisk materiale (dvs. gener eller genomer).

I cellulære organismer er det genetiske materialet

alltid DNA..

SØKERENS METODE

Påvisning av et primært genprodukt (RNA)

bare. RNA er ikke tilstede som genetisk materiale i cellulære organismer.

3 . ■ Utbredelse (kopier pr. celle),

av nukleinsyresekvenser s.om skal påvises

4. Hybridiseringsmetodens evne til å kvantifisere nukleinsyrer

5. Evne til å bestemme og kvantifi-

sere tilstanden av genetisk eks-

presjon i en celle

6. Relativ sannsynlighet for påvisning av falsk positiv under diag-

nose

7. Relativ sensitivitet for påvisning av nukleinsyrer 8.Fremstilling av prøve for hybridiseringsforsøk 9. Mengde av nødvendig sonde 10. Nødvendig tid for hybridisering .

Søkeren har ikke kjennskap til noen teknikkens stand som angir hans metode for påvisning av nærvær eller fravær av

■R-RNA, eller av t-^RNA karakteristika for en spesiell gruppe

av organismer som anvender nukleinsyrehybridisering hvor det brukes et utvalgt markert nukleinsyremoleky1 komplementært til en rekke av R-RNA fra en spesiell kilde. Heller ikke har han kjennskap til noen teknikkens stand som beskriver hans'metode for påvisning av nærvær eller fravær av R-RNA generelt, eller av t-RNA fra en spesiell kilde ved nukleinsyrehybridisering som anvender et markert- nukleinsyremoleky1 komplementært til alt R-RNA eller t-RNA fra en spesifikk.kilde.

Heller ikke har han kjennskap til noen teknikkens stand som angir hans metode for påvisning av nærvær eller fravær av spesifikke sekvenser eller populasjoner av forskjellige spesifikke sekvenser av mRNA, psRNA, hnRNA eller snRNA for å påvise, identifisere og kvantifisere spesifikke organismer, grupper

av organismer, grupper av eukaryotiske celler eller spesifikk virus i celler eller en gruppe spesifikk virus i celler ved nukleinsyrehybridisering hvor det brukes utvalgte markerte nukleinsyremolekyler komplementære til en rekke eller rekker, en sekvens eller sekvenser eller en populasjon av sekvenser. eller rekker av mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA fra en spesiell kilde.

Heller ikke har■han kjennskap til noen teknikkens stand som beskriver hans metode for påvisning av nærvær eller fravær av en nukleinsyre karakteristisk for en spesiell gruppe av organismer eller virus; eller for raskt å muliggjøre nukleinsyrehybridisering i løsning med en spesifikk markert sonde, nukleinsyrene av en spesiell gruppe av organismer eller virus for ethvert formål, eller for anvendelse av en i. løsning nukleinsyrehybridiseringsmetode som kombinerer en rask metode for å gjøre nukleinsyrene fra spesifikke grupper av organismer tilgjengelige for hybridisering med en spesifikk komplementær sonde, med en metode for påvisning av en organismes nukleinsyre ved sterkt å aksellerere hastigheten av hybridisering

i_ løsning av nukleinsyrene fra en organisme eller virus og den markerte sonde komplementær til organismens eller virusens nukleinsyre; eller av å bestemme det antimikrobielle reagenssensitivitet eller antivirusreagens sensitivitet for en spesiell .gruppe av organismer eller virus; eller av å bestemme nærvær. .av antimikrobielle eller antivirussubstanser i blod, urin, andre kroppsvæsker eller vev eller andre prøver; eller for å påvise cellers veksttilstand.; eller for å påvise mikroorganismer eller virusinfeksjoner; eller for raskt å bestemme nærvær i en hybridiseringsblanding av sonde som har hybridisert ved å kontakte blandingen med hydroksyapatitt under forutbestemte betingelser og deretter behandle den resulterende . løsning på en spesifikk måte.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte

og midler for påvisning, identifisering og kvantifisering av organismer i biologiske og andre prøver, og nærmere bestemt en metode for spesifikk og sensitiv påvise og. kvantifisere enhver organisme som inneholder ribosom RNA, (heretter-R-RNA) , overførings RNA (heretter t-RNA) eller annet RNA, alle medlemmer av store, mellomliggende eller små kategorier eller taksonomiske grupper av slike organismer; og tidligere ukjente organismer inneholdende R-RNA eller t-RNA. .Metoden kan påvise nærvær av selv en organisme inneholdende R-RNA eller t-RNA.

Oppfinnelsen tilveiebringer også eri metode for å anvende spesielt fremstilte nukleinsyrer komplementære til spesifikke sekvenser eller populasjoner av forskjellige sekvenser av RNA klassen mRNA eller hnRNA, eller snRNA eller klassen

av RNA sekvenser (i det følgende forstadiespesifikke RNA sekvenser eller psRNA) som er,tilstede bare i forstadiene, av mRNA, R-RNA, t-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler, og ikke i ferdige mRNA,. t-RNA, hnRNA eller snRNA molekyler for å påviser, identifisere og kvantifisere spesifikke organismer, grupper.av organismer, grupper eller eukaryotiske celler eller viruser i celler.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en metode og anordninger

med følgende karakteristika: (a) evne til spesifikt å påvise nærvær av et hvilket som helst av et stort antall forskjellige

.organismer med en enkel målemetode som også virker uavhengig

av mønsteret for genetisk ekspresjon hos enhver spesiell organisme; (b) evne til å modifisere prøven,for å påvise bare spesifikke kategorier av organismer, selv i nærvær'

av organismer utenfor den interessante gruppe; (c) ekstremt høy påvisningssensitivitet, og evne til å påvise nærvær av en organisme i cellen; (d) evne til å kvantifisere antallet av organismer eller celler tilstede; og (e) krever ikke et veksttrinn.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer midler for påvisning av den antimikrobielle reagenssensitivitet eller antivirus-reagenssensitivitet for en spesiell gruppe organismer eller virus; for å bestemme nærvær av antimikrobielle eller antivirussubstanser i blod., urin, andre kroppsvæsker eller vev eller andre prøver, for å påvise cellers veksttilstand;

for å påvise mikroorganismer eller virusinfeksjoner; og for raskt å.bestemme nærvær i en' hybridiseririgsblanding av sonde som har hybridisert.

.Som forut beskrevet er R-RNA basesekvenser spesielt like

.hos helt forskjellige organismer. Jo nærmere beslektet to organismer er, jo større er fraksjonen av det totale R-RNA som ligner i. de to arter. R-RNA sekvensen for enhver spesiell art eller organisme kan ansees som en rekke korte R-RNA undersekvenser, hvorav en undersekvens er" lik i praktisk talt allle livsformer. Derfor må R-RNA for nesten alt liv inneholde denne undersekvense. En forskjellig undersekvens er lignende bare i R-RNA fra medlemmer av de arter som organismen tilhører. Alle undersekvenser er tilstede i ordenen av organismer som artene tilhører osv.

Fordi R-RNA sekvenser fra helt forskjellige organismer i

det minste delvis ligner hverandre, kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som anvender en sonde som påviser R-RNA sekvenser som er like hos helt forskjellige organismer påvise nærvær eller fravær av enhver eller flere av disse organismer i en prøve. En markert nukleinsyresekvens, eller sekvenser komplementære.til R-RNA sekvensene som er lignende hos sterkt divergerende organismer,, kan brukes som en slik sonde i nukleinsyrehybridiseringsbestemmelse.

Fordi R-RNA sekvensene fra nær beslektede organismer er

mer like enn sådanne fra fjernere beslektede organismer,

kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som innebefatter bruk av en prøve som påviser bare R-RNA sekvensene som er lignende i en spesielt snever gruppe av organismer påvise nærvær eller fravær av en hvilken som helst eller flere av slike spesielle organismer i en prøve, selv i nærvær av mange ikke-beslektede organismer. Disse gruppespesifikke sonder kan være spesifikke for en rekke kategorier med forskjellig.størrelse. En sonde kan være spesifikk for en spesiell taksonomisk slekt, mens andre er spesifikke for. en spesiell familie eller annen slekt.

Gruppespesifikke. sonder har evne til å hybridisere til

R-RNA fra en gruppe eller organismer, men ikke hybridisere til R-RNA fra.noen annen gruppe organismer. En slik gruppe spesifikk komplementær sekvens vil påvise nærvær av R-RNA

fra ethvert medlem av den spesifikke gruppe av organismer selv i nærvær av en stor mengde av R-RNA fra mange organismer som.ikke tilhører den spesifikke gruppen.

Det totale antall R-RNA molekyler i en prøve måles ved å■ bruke en markert sekvens eller sekvenser komplementære til R-RNA og standard overskudd som deler overskudd prøve RNA nukleinsyrehybridiseringsmetodologi.

R-RNA innhold.et i celler fra et stort utvalg organismer er tidligere kjent. I en bred gruppe av lignende organismer, f.eks. bakterier, varierer'mengden av R-RNA pr. celle omtrent 2 til 5 ganger. Hvis antallet av R-RNA molekyler i en prøve Og den prøve klasses identitet av kilden til R-RNA er kjent, kan en god bestemmelse av antall nærværende celler i prøven beregnes. Hvis den brede klasse identitet ikke er kjent, kan den påvises ved å hybridisere prøven til en rekke utvalgte sonder komplementære til R-RNA,som hver er spesifikke for en spesiell bred kategori av organismer.

På det nåværende tidspunkt er det utførlige påvisnings-■og. kvantifiseringsområdet for en enkel prøveprosedyre fra 4

10 R-RNA molekyler (1 bakterie eller 10 pattedyrceller)

til ca. IO<12>R-RNA molekyler (IO<8>.bakterier eller IO<6>pattedyrceller), en spennvidde på ca. 10 8 i celletrall.

En enkelt prøve kunne altså utføres på en slik måte at

den effektivt kvantifiserer fra 10^ bakterier til 10"^ bakterier. Prøven er ganske fleksibel på denne måten.

Fordi prøven for R-RNA er spesifikk og kan påvise nærvær

av meget få organismer er det ikke noe behov for å øke antallet organismer med et veksttrinn.

Utførelsen av den form av foreliggende oppfinnelse som er rettet på å påvise■nærværet av en organisme som inneholder R-RNA i en prøve som inneholder en slik organisme omfatter prinsipielt: . (a) bringe sammen prøven, eller isolerte nukleinsyrer i denne prøven, med en sonde som omfatter markerte nukleinsyremolekyler som er komplementære til R-RNA fra alle organismer; ■ (b) inkubere den resulterende blanding under forutbestemte hybridiseringsbetingelser i en forut bestemt tid, og deretter ; (c) bestemme den resulterende, hybridisering av sonden i blandingen.

Nar foreliggende oppfinnelse er rettet på å bestemme nærvær av alle medlemmer av en spesifikk kategori av organismer som inneholder R-RNA i en prøve som kan inneholde slike organismer består metoden i:.

a) kontakte prøven, eller.nukleinsyren deri med en sonde omfattende markerte nukleinsyremolekyler som er bare komplementære overfor R-RNA fra medlemmer av den spesifikke kategori eller organismer, men ikke komplementære til R-RNA

fra ikke-beslektede organismer;

b) inkubere sonden og prøven, eller de isolerte nukleinsyrer

deri; og

c.) måle hybridiseringen av sonden i den inkuberte blanding.

Foreliggende oppfinnelse kan også brukes for å påvise antallet:av organismer tilstede i prøven som undersøkes ved å tilsette målingen i den andre ovenfor beskrevne metode i det tilfellet sondehybridisering har forekommet, trinnet for sammenligning av mengden av R-RNA tilstede i prøven med antallet av R-RNA molekyler normalt tilstede i individuelle organismer til-hørende den spesifikke gruppen.

Og selvfølgelig innebefattet i variasjonene innenfor omfanget' av foreliggende oppfinnelse som kan brukes er den .'som omfatter in lieu av den enkelte sonde i trinn (a) i den andre av de ovennevnte metoder, flere eller, et batteri av'forskjellige sonder. I et slikt tilfelle omfatter hver separat sonde markerte nukleinsyremolekyler som er komplementære bare til R-RNAet for en spesifikk gruppe av organismer og hver sonde-er spesifikk for en forskjellig gruppe av organismer; trinn (a) etterfølges av inkubering av hver sonde-prøveblanding under forutbestemte hybridiseringsbetingelser i en forut bestemt tid, og deretter måling av .hver prøve med' hensyn til hybridisering av sonden.

Som tidligere beskrevet -er t-RNA basesekvsner delvis like hos helt forsjellige organismer. Jo nærmere beslektet to-.. organismer er, jo større er den fraksjon av t-RNA sekvenser som er beslektet. Hver t-RNA genesekvens kan ansees som

en rekke av korte t-RNA undersekvenser. En undersekvens er lignende hos en stor beslektet gruppe av organismer. En annen undersekvens er lignende hos en beslektet gruppe av organismer med mellomliggende størrelse mens en tredje undersekvens er lignende i en liten beslektet, gruppe av organismer.osv...

Da altså t-RNA sekvensene hos helt forskjellige organismer

er i det. minst delvis lignende, kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som anvender en sonde som påviser

t-RNA sekvenser som er like hos helt forskjellige organismer, påvise nærvær eller fravær av en hvilken som helst eller flere av slike organismer i en prøve. Således "kan en markert nukleinsyresekvens, eller sekvenser komplementære til t-RNA sekvensene som er lignende hos helt forskjellige organismer, brukes som en slik sonde.i en nukleinsyrehybridiseringsmåling.

Og fordi t-RNA sekvensene hos nær beslektede organismer er mer like enn sådanne hos fjernere beslektede organismer,

kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, som innebefatter bruk av en sonde som påviser.bare de t-RNA sekvenser som er lignende hos. en spesiell snever gruppe av organismer, påvise nærvær eller fravær av enhver eller flere av slike spesielle organismer i en prøve, selv i nærvær av mange ikke-.beslektede organismer. Slike grupper spesifikke . sonder kan være spesifikke for en rekke kategorier med forskjellig størrelse. F.eks. kan en sonde være spesifikk for en spesiell taksonomisk slekt, mens en annen er spesifikk for en spesiell familie eller annen slekt.

Gruppe spesifikke sonder har evne til å hybridisere til t-RNA fra en gruppe organismer, men ikke hybridiserer til t-RNA fra noen annen gruppe organismer. En slik gruppe spesifikk komplementær sekvens vil påvise nærvær av t-RNA fra ethvert medlem av den ' spesifikke gruppe organimser selv i nærvær av en stor mengde av t-RNA fra mange organismer som ikke til-hører den spesifikke gruppen.

Under utførelse av den form av oppfinnelsen som er rettet på å bestemme nærværet av ethvert medlem av en spesifikk kategori organismer som inneholder t-RNA i en prøve som kan inneholde slike organismer, består fremgangsmåten i å: •a), kontakte prøven, eller nukleinsyrene deri, med en prøve omfattende markerte nukleinsyremolekyler som er komplementære bare til det t-RNA fra medlemmer fra den spesifikke kategori av organismer, men ikke komplementære til t-RNA fra ikke beslektede-organismer. b) inkubere sonden og prøven, eller de. isolerte nukleinsyrer deri; og c) måle hybridiseringen av prøven i den inkubefte' blanding.

Foreliggende oppfinnelse kan også brukes for å bestemme antall organismer tilstede i prøven som undersøkes ved å til-føre målingen i den andre ovenfor beskrevne metode i tilfelle sondehybridisering har opptrådt, trinnet for sammenligning av mengde av t-RNA tilstede i prøven med antallet t-RNA molekyler normalt tilstede i individuelle organismer tilhørende den spesifikke gruppe.

Og selvfølgelig innebefattet i variasjonene innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse som kan brukes er den som omfatter, in lieu av den enkle sonde i trinn (a) i den andre av de ovenfor nevnte metoder, flere eller et batteri av forskjellige sonder. I et slikt tilfelle omfatter hver separat sonde markerte nukleinsyremolekyier som er komplementære bare til t-RNA fra en spesifikk gruppe av organismer og hver prøve er spesifikk for en forskjellig gruppe av organismer; trinn (a) etterfølges av inkubering av hver sonde-prøve-blanding under forutbestemte hybridiseringsbetingelser for en forutbestemt tid, og deretter måling av hver blanding med hensyn til. hybr idisering av. sonden.

Fremgangsmåten og midlene ifølge foreliggende oppfinnelse er mer fullstendig illustrert i den følgende beskrivelse av karakteriserende trekk ved prøvemetoden ifølge oppfinnelsen.

Nukleinsyrehybridiseringsprøvemetoder for påvisning og kvantifisering av RNA . En ønskelig påvisningsprøve bør: a) ' være rask; b) være lett å bruke; c) være meget følsom; d) være i stand til å påvise og kvantifisere i kun en laboratoriemåling.

Den foreliggende nukleinsyresonde som yll .hybridisere til R-RNA fra ethvert medlem av slekten Legionella, .men ikke hybridiserer til R-RNA. fra hoen annen kilde, muliggjør en rask, lett i bruk, sensitiv,.i løsning påvisningsprøve som både kan påvise og kvantifisere, f.eks. Legionella bakterier ved utførelse av bare en laboratoriemåling og ikke krever rensing av nukleinsyrer fra prøven.

En beskrivelse av de grunnleggende.aspekter for denne hybri- . seringsprøven i løsning følger. Skjønt den beskrevne fremgangsmåte er ment for å påvise medlemmer av slekten Legionella er det åpenbart at denne samme prøvemetode kan brukes med den riktige sonde for å påvise mange andre grupper eller organismer eller virus.

Trinn 1. Fremstilling av prøven

Bland prøven med en løsning inneholdende en detergent og et proteolytisk enzym. Detergenten lyser bakteriene og hjelper til å solubilisere cellulære bestanddeler, mens enzymet øde-legger de cellulære proteiner innebefattet.slike enzymer som nedbryter RNA og DNA. Sammensetningen av detergent-enzymblandingen avhenger av typen detergent og proteolytisk enzym som skal. brukes og mengden og typen av prøven som skal under-, søkes. Detergenter som brukes innebefatter natriumlaurylsulfat, sarkosyl og. zwittergent-, mens enzymene som brukes innebefatter proteinase K og pronase. En rekke enzymer, solubiliserings-midler såsom kaotropiske reagenser kan brukes. Sonden kan også foreligge i detergent-enzymblandingen som tilsettes , prøven.

Enzymdeter.genten virker meget raskt på alle Legionella bakterier i prøven. I de fleste tilfeller er det ikke nødvendig,

å inkubere blandingen for å gjøre R-RNA tilgjengelig for hybridisering med sonden i løsning. I visse tilfeller kreves en kort' inkuberingsperiode.

Under andre forhold er det ikke nødvendig å ta med det proteolytiske enzym, og detergent alene vil gjøre R-RNA tilgjengelig for hybridisering med sonden ^ løsning.

'Dette gir "en meget rask og lett metode for å få prøve R-RNA i

en tilstand hvor det kan hybridisere med sonden i en måling

i løsning. I tillegg muliggjør det hybridisering i løsning uten rensing av prøve R-RNAet. En nøkkel til denne metoden

er at prøven påviser Legionella R-RNA. R-RNA er enkeltstrenget i cellen og lett å hybridisere med prøven så snart de ribosomale proteiner er fjernet fra R-RNAet. I motsetning til direkte å påvise ribosomalt R-RNA DNA (dvs. genet for R-RNA) eller noen annen DNA sekvens, vil det være nødvendig å tilføye en frem-, gangsmåte som fikk dobbeltstrenget R-RNA gen til å skille seg i to enkelte strenger før sonden kunne hybridisere til den.

Såvidt kjent for Søkeren er det ikke tidligere beskrevet bruk av en enzym-detergent-prøvemetode for å gjøre R-RNA, over-førings R-RNA, RNA i allminnelighet eller DNA tilgjengelig for hybridisering med en sonde i. løsning for å påvise og kvantifisere nærvær eller fravær av organismer generelt eller av

.en spesifikk gruppe av organismer.

Trinn. 2. Fremstilling a v hybridiseringsinkuberingsblanding.

Tilsett prøve-enzym-detergentblandingen sonden og tilstrekkelig salt til å muliggjøre hybridisering og.inkuber den resulterende blanding ved riktig temperatur. Saltkonsentrasjonen og tempe-raturen for hybridiseringsinkubasjon bestemmer tilsammen kriteriene. Kriteriene for inkuberingsbetingelser må være lik de. som brukes for å utvelge sonden, ellers kan sondens spesifisitet forandres.

Inkuberingsblandingen må inkuberes i tilstrekkelig lang tid for hybridisering. Salttypen og konsentrasjonen bestemmes av hybridiseringshastighet som kan oppnås. Således vil spesielle salter fremskynde meget rask hybridisering ved bruk i riktig konsentrasjon. Et eksempel på et slikt salt er natrlumfosfat. Legionella spesifikk sonde blandet med renset Legionella R-RNA i 3,0 M na.triumf osf atpuf f er (pli - 6,8) (i det følgende kalt PB) og inkubert ved 76°C hybridiserer over 100 ganger raskere enn de samme mengder Legionella sonde og R-RNA inkubert under standard betingelser med 0,72 M NaCl, 76°C (disse to betingelser er like i kriteriet). Andre salter kan også brukes for å bevirke den hybridiseringshastighetsakseleréring. Disse, innebefatter spesielt natrium, ammonium, rubidium., kalium, cesium og litiumsalter.

I .3 M PB ved 7.6°C blir hybridiseringshastigheten til den Legionella spesifikke sonde med Legionella R-RNA tilstede

i PB-enzym-deterg.ent-prøve sonde blanding også akselerert over 100 ganger mer enn hybridiseringshastighetene for standard inkuberingsbetingelser .■ Hybridiseringsbetingelser . Hybridisering opptrer, også mellom sonden og R-RNA i en enzym-detergentprøveblanding under standard saltkonsentrasjons-betingelser.

Et av trekkene ved oppfinnelsen, som tidligere påpekt, er

dens evne til å påvise meget små antall organismer ved å påvise deres R-RNA. Dette er mulig p.g.a. det store antall R-RNA molekyler i hver celle. I Legionella lignende organismer er 5000 til 10000 R-RNA molekyler tilstede i hver enkelt bakteriecelle. En av de viktige faktorer for sensitivitet og påvisning som kan oppnås med nukleinsyrehybridisering, er hybridiseringshastigheten som kan oppnås. Kombinasjonen av påvisning av R-RNA og bruk av de hastighetsakselererende inkubasjonsbetingelser beskrevet ovenfor gjør det mulig å oppnå ekstremt høy sensitivitet for påvisning av bakterier og andre organismer i løpet av et meget kort tidsrom ved bruk av meget små mengder prøve.og sonde. Et illustrerende eksempel

på dette, er beskrevet senere.

Såvidt S.økeren kjent foreligger tidligere ingen bruk av hastighetsakselererende systemer med i. løsning hybridiseringsforsøk for bestemmelse av nærvær eller fravær av en organisme eller gruppe av organismer ved påvisning av R-RNA, overførings. RNA, annet RNA eller DNA av organismene av interesse. Det foreligger heller ingen tidligere bruk av hastighetsakselererende systemer og enzym-detergent-prøve-sonde-blandingene for å bestemme nærvær eller fravær av en spesifkk organisme eller virus eller gruppe av organismer eller virus for å påvise R-RNAet, overførings RNA eller annet RNA eller DNA i den spesifikke organisme eller gruppe av organismer av interesse.

Trinn 3. Måling av inkubasjonsblandingen for hybridisering.

av . sonden med mål R- RNA

Signalet på at prøven inneholder mål R-RNA molekyler (og derfor målorganismen) er nærværet av hybridisert sonde i inkubasjonsblandingen. Således må inkubasjonsblandingen måles med hensyn på nærvær av hybridisert sonde ved slutten av inkubasjonsperioden. Det er ønskelig at en slik måling er lett og rask og utføre. For denne måling behandles inkubasjonsblandingen ved bruk av hydroksyapatitt (HA). Under de riktige betingelser binder HA R-RNA raskt og fullstendig, men binder' ikke de ikke hybridiserte sondemolekyler. Hvis et sondemolekyl. hybridiseres til et mål R-RNA molekyl,, bindes sonden også til HA fordi den er fysikalsk knyttet til R-RNAet.

Påvisning av organismer ved å påvise deres R-RNA er et trekk ved oppfinnelsen. HAets evne til. å binde R-RNA eller RNA

generelt i sekunder, mens sonden overhodet ikke bindes, har muliggjort utvikling av en hybridiseringsmålemetode som tar minutter å utføre, er meget fleksibel og som egner seg godt for håndtering av flere prøver. I tillegg kan prøve-detergent-enzym-sondeinkuberingsblandingen fortynnes i den riktige puffer og direkte behandles for å måle nærvær av hybridisert sonde.

HA er tidligere kjent som en substans brukt for å måle hybridisering av sonder. Målemetoden, som er beskrevet her har den fordel fremfor den tidligere kjente bruk av HA (Brenner et al., Analytical Biochm, (196 9 ( 28 s. 477), kan utføres ved romtemperatur og vil virke over et temperaturområdet fra ca. 15°C til 90°C. Den har færre' trinn og krever, ikke.opp-varming ved hvert sentrifugeringstrinn; den kan utføres i nærvær eller fravær av detergenter såsom zwittergent (Calbiochem, San Diego, Calif.) og natriumlaurylsulfat.

Den er 3 - 5 ganger raskere, og en enkelt måling kan utføres på 3 - 5 minutter. Den krever ca. 5 ganger mindre HA. Deter-gentkonsentrasjonen kan variere fra 0 til 10%, mens fosfat-konsentrasjonene kan variere fra 0,1 M til 0,2 M avhengig

av typen- måling. Metoden kan også lett tilpasses behandling

av flere prøver.

Forskjellige metoder fra HA foreligger for å rrtåie hybridisering av sonden. Disse innebefatter enzymmålinger såsom S-^enzymmetoden, størrelsesseparasjonsmetoder, og en rekke pr.øveimmobiliseringsmetoder. Sondene som her omtales kan brukes-virkningsfullt med disse og enhver annen metode for å utføre hybridisering og hybridiseringsmålinger.

Fremgangsmåter for fremstilling

av gruppespesifikke R- RNA sonder

Forskjellige muligheter kan brukes for å fremstille gruppe-spesif ikke sonder. Alle disse muligheter bortsett fra en baserer' seg på differensielle nukleinsyrehybridiserings-muligheter for å identifisere og rense gruppespesifikke sondesekvenser.

Fremgangsmåte A: Den mest anvendelige fremgangsmåte f or fremstilling av. gruppe spesifikke R-RNA sonder brukes rekombinant DNA metodologi. Trinnene som inngår i denne fremgangsmåte (De spesifikke detaljer for standard DNA rekombinante tek-nikker er beskrevet i boken, Molecular - doning, A Laboratory Manual, T.'Maniatis et al. , Cold Spring Harbor Publication

(1982)) 1. Isolatnukleinsyre fra en spesifikk organisme av interesse. Standard isoleringsmetoder anvendes. 2. Ved bruk av dette isolerte DNA, klon R-RNA gener fra denne organisme og fremstille så store mengder av ribosom gen DNA ved bruk av standard DNA rekombinant teknologi som vist i Maniatis et al., supra. 3. Reduser R-RNA gen DNA til korte stykker med restrik-sjonsenzymer og lage en samling av disse korte DNA stykker ved bruk av standard DNA rekombinant metoder, som vist i Maniatis et al., ovenfor.

.'4. Undersøk samlingen og identifiser en klon som inneholder en kort R-RNA genesekvens som hybridiserer bare til R-RNA fra andre medlemmer av den taksonomiske art av den interessante organisme. Isoler denne klon. Den

inneholder en art spesifikk DNA sekvens som er komplementær bare til R-RNA fra den spesifikke art som den.interessante organisme tilhører.

v

Undersøk samlingen videre og identifiser og isoler

.de følgende kloner: a) et klon som inneholder en DNA sekvens komplementær til R-RNA som bare vil hybridisere til. R-RNA fra medlemmer av den taksonomiske slekt som organismen av interesse tilhører; b) et klon som inneholder en DNA sekvens komplementær til R-RNA som bare vil hybridisere til R-RNA fra medlemmer åv den taksonomiske orden som organismen av interesse tilhører; c) en klon som inneholder en DNA sekvens komplementær til R-RNA som vil hybridisere bare til R-RNA fra medlemmer av den taksonomiske familie'som organismen av interesse tilhører; d) en klon som inneholder en DNA sekvens komplementær til R-RNA som vil hybridisere bare til R-RNA fra medlemmer av den taksonomiske klasse som organismen av interesse til-hører; og e) en klon som inneholder en DNA sekvens

komplementær til R-RNA som vil hybridisere til R-RNA'

fra så mange forskjellige livsformer som mulig.

Den foregående klone utvalgsskjema er bare et av mange mulige.

Standardmetoder for kloning' og undersøkelser skal brukes som omtalt i Maniatis et al., ovenfor. 5. a) Fremstill store mengder av hvert klons DNA. Fra DNAet av hvert enkelt klon isoler og rens bare den DNA sekvens.som er komplementær til R-RNA ved bruk av en av de mange metoder som foreligger for å utføre dette, f.eks. som i Maniatis et al., ovenfor. b) I visse tilfeller er det totale DNA tilstede i et klon anvendelig som en sonde, i hvilket tilfelle det

totale DNA isolert fra kloningsvektoren brukes.

c) I visse andre tilfeller brukes DNA enkeltstrengen . fra kloningsvektoren som inneholder DNA sekvensen

komplementær til R-RNA som en sonde. I et slikt tilfelle må denne strengen isoleres og renses ved .bruk av en av flere metoder som foreligger for å utføre dette som beskrevet i Maniatis et al. 6. Sonde DNA erholdt i 5a, 5b og 5c må markeres på en slik måte at den kan identifiseres i måleblandingen.

Mange forskjellige typer markører kan brukes, og de hyppigst brukte markører ér radioaktivitet. Andre er fluorescens, enzymer og biotin. Standardmetoder brukes for å markere DNAet som beskrevet i Maniatis et al., ovenfor.

7. Gruppe spesifikk R-RNA genesekvens i kloningsvektoren foreligger i dobbeltstrenget tilstand". En av disse strenger er komplentær til R-RNA og vil hybridisere

med den. Den andre streng vil ikke hybridisere til R-RNA, men kan brukes for å fremstille spesifikke

sekvenser med markert gruppe komplementært til R-RNA. Dette gjøres ved å anvende en DNA eller RNA polymerase og nukleinsyrerorstadiet.molekyler som er markert. Enzymet vil anvende de markerte forstadier for syntese av DNA eller RNA ved bruk av DNA strengen som en mal. Det nye syntetiserte markerte molekyl vil være komplementært til R-RNA og kan brukes som en gruppe spesifikk sonde. Mal DNAet kan fjernes ved forskjellige vanlige midler og levner bare enkeltstrenget markert nukleinsyre som beskrevet i Maniatis et al. ovenfor, og artik-kelsen til Taylor et al. , i Biochemica and Biophys.. Acta (1976) 44_2, s. 324..

Fremgangsmåte B:

Flere enzymer kan anvende R-RNA fra enhver kilde som et mal for syntese av markert DNA komplementært til hele R-RNA sekvensen. Gruppe spesifikke sekvenser komplementære bare til R-RNA fra en spesiell klasse enzymer kan isoleres ved en hybridiseringsutvalgsprosess. Den fraksjon av det syntetiserte .markerte DNA som hybridiserer bare til R-RNAet fra. medlemmer, av en spesifikk klasse organismer kan isoleres ved standard hybridiseringsmetoder. Et eksempel på denne fremgangsmåten er beskrevet senere. En slik sonde kan fremstilles i tilstrek-kelige mengder til å klone som beskrevet i A. Basesekvensen.'. til dette klonet kan bestemmes ved standardmetoder og sekvensene brukes for direkte produksjon av prøven ved kjemisk syntese ved bruk av standardmetoder.

Fremgangsmåte C: Nukleotidsekvensene til R-RNA fra helt forskjellige organismer er bestemt. Gruppe spesifikke sekvenser lignende en spesifikk gruppe organismer kan identifiseres ved å sammenligne disse sekvenser. En sekvens komplementær til denne gruppe spesifikke R-RNA sekvens kan deretter syntetiseres kjemisk og markeres ved bruk av standard metodologi..

Fremstilling av spesifikke sonder

komplementære til t- RNA .

Skjønt spesifikke t-RNA sonder kan fremstilles på forskjellige måter, kan de samme grunnleggende metoder som er beskrevet for fremstilling av R-RNA sonder brukes for å fremstille t-RNA sonder. Standardmetoder foreligger for å isolere individuelle t-RNA arter og gener og. disse er velkjente. Sonden kan foreligger som DNA eller RNA og sortd.ens lengde kan være 12 til 1000 baser lang. Sonden behøver ikke å være perfekt komplementær til nukleinsyren den er spesifikk for,, dvs. målnukleinsyren, og hele lengden av sonden behøver ikke å være komplementær til målmolekylet.

Fremstilling av spesifikke sonder komplementære

til mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA

De samme grunnprinsipper som brukes for å fremstille spesifikke sonder komplementærer til R-RNA kan brukes for. å fremstille spesifikke sonder' for spesifikke klasser eller popula-sjonér av mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA. Metodene for å isolere hver klasse av RNA og ytterligere fraksjonere det er vilkjente. Igjen kan sonden foreligge som DNA eller RNA, og sondens lengde kan variere fra ca. 12 til 1000 baser lang. Sondens komplementære område behøver ikke å være perfekt komplementær med målnukleinsyren og hele lengden av prøven behøver ikke å være komplementær med målmolekylet.

Isolering av prøvenukleinsyre

Tidligere kjente standardmetoder kan brukes for å isolere nukleinsyre fra prøvene som skal måles.. En standardmetode for nukleinsyreisolering og rensing er å finne i eksempel-delen og er også omtalt i Maniatas et al., ovenfor.

En ny teknikk for å gjøre nukleinsyre tilgjengelig for hybridisering i løsning uten å utføre et rensetrinn er be.skrevet i det følgende.

Utførelse av nukleinsyrehybridisering

En riktig mengde markert sonde blandes med prøvenuklein-syren. Denne blandingen justeres så til en .spesifikk salt--' konsentrasjon (NaCl brukes normalt) og hele blandingen

... inkuberes ved en spesifikk temperatur og ét spesifikt tids-

rom. Ved.slutten av tidsrommet analyseres blandingen ved å utføre en hybridiseringsmåling. Mange forskjellige kombinasjoner av salt, løsningsmidler, nukleinsyrekonsentrasjoner, volumer og temperaturer foreligger som. muliggjør nukleinsyrehybridisering. Den foretrukne kombinasjon er avhengig av forholdene- ved målingen. Det er imidlertid viktig at kreteriet. (se "definisjoner") av hybridiseringstrinnene er identiske med kriterier som brukes for. å identifisere og utvelge gruppesonden. His kriteriene for hybridiserings-trinnet er forskjellig kan sondens spesifisitet forandres. Se: "Repeated Sequences in DNA" av Britten og Kohne, Science.

(1968) 161 s. 529; "Kinetics of Renaturation. of DNA", av Wetmur og Davidsen, J. Mol. Biol. (1968) 31 s. 349; "hydro-xyapaptite Techniques for Nucleic Acid Reassociatidn", av Kohne og Britten; Procedures in Nucleic Acid Research (1971), eds. Cantoni og Davies, Harpier and Row, Vol 2 s. 500.

To forskjellige muligheter anvendes med hensyn til mengden av sonde og prøve nukleinsyre tilstede i hybridiseringsblandingen. I en, overskuddssondemetoden, er det mer sonde tilstede enn prøvenukleinsyre, i dette tilfellet RNA. Med den andre, overskudd RNA metode er det mer R-RNA tilstede enn sonde. Overskuddsondemetoden er den foretrukne metode for å påvise nærvær av RNA i ukjente prøver. Den har flere fordeler som omtales nedenfor.. Se tabellene 1^og 2 for ytterligere omtale av disse to muligheter.

Bruk av overskuddssondemetoden, påvisning og kvantifisering kan utføres ved kun et låboratoriemålingspunkt hvis den riktige RNA sonde er tilgjengelig. Hvis hybridiseringen har forløpt fullstendig,, er den mengden sonde som har hybridisert et direkte mål på mengden av RNA tilstede i prøven. Det faktum at prøven hybridiserer overhodet viser at RNA er tilstede og den mengde sonde som hybridiserer angir mengden av RNA tilstede i prøven.

Det er viktig å sikre at hybridiseringen har forløpt fullstendig på en kjent tid for å kvanitifisere RNAet. Dette er

.lett å gjøre ved å tilsette nok sonde til å sikre at-hybri-

diseringen forløper fullstendig innenfor et valgt tidsrom.

Jo mer sonde som tilsettes, jo raskere nås avslutningen. Således gir overskuddssondemetoden et middel til å sikre

at hybridiseringen har forløpt fullstendig og vite når dette er tilfelle.

Derimot kan påvisning og kvantifisering av RNA ikke gjøres

med et laboratoriemålingspunkt når man bruker overskudds R-RNA metoden. I tillegg kan tidspunktet da prøvepunktet

bør tas ikke forutsies i overskudds RNA metoden. Ukjente prøver med små mengder RNA vil hybridisere meget langsommere enn.prøver med store mengder RNA.

Måling' av hybridisering

Signalet at RNA fra den spesifikke gruppe foreligger i prøven, er nærvær av dobbeltstrenget markert sonde. Mange forskjellige metoder som er godt beskrevet i litteraturen foreligger for å måle hybridiseringsblandingen med hensyn til nærvær av markert sonde i dobbeltstrenget form. Den aktuelle metode avhenger av metoden som velges for hybri-diseringstrinnet, sammensetningen av hybridiseringsblandingen, typen markør på sonden og andre faktorer. En meget brukt metode er beskrevet i det følgende. Se også Wetmur og Davidson, Kohne og Britten, og Thomas et al., ovenfor. Også artikkel

til Flavell et al.,Eur. J. Biochem. (1974) £7 s. 535. Og også artikkelen til Maxwell et al., Nucleic Acids Research

(1978) 5 s. 2033 .

I alle tilfeller er det imidlertid viktig å enten måle ved eller over de samme kriterier som brukes for hybridiserings-reaksjon eller ved et kriterium- ved hvilken hybridisering ikke kan forekomme.

Kvantifisering av nukleinsyresekvenser

ved nukleinsyrehybridisering

Mengden av nukleinsyre tilstede i en prøve kan bestemmes på fleire måter ved nukleinsyrehybridisering ved bruk av vel kjente metoder. De to metoder er beskrevet i det følgende som brukes eksempelet for kvantifisering av R-RNA.

Man vil forstå at foreliggende metode kan anvendes generelt

i alle tilfeller hvor det er nødvendig å bestemme nærvær eller fravær av organismer som inneholder RNA eller DNA,

og at slike omfatter biologiske prøver såsom spytt, serum, vev, saft og andre animalske væsker og vev, samt industrielle og farmasøytiske prøver og vann. Spesifikke detaljer ved ut-førelsen vil-avhenge av om RNA eller DNA kvantifiseres, men den generelle utførelse er den samme for både DNA og RNA.

BRUK AV SELEKTERTE SONDER KOMPLEMENTÆRE TIL BARE EN SPESIELL FRAKSJON AV R-RNA SEKVENSEN FRA EN SPESIELL KILDE FOR Å PÅVISE R-RNA I SAMMENLIGNING MED BRUK AV IKKE SELEKTERTE PRØVER KOMPLEMENTÆRE TIL HELE R-RNA SEKVENSEN FRA EN SPESIELL KILDE FOR

Å PÅVISE R- RNA

Et aspekt av foreliggende oppfinnelse hvilket.omfatter bruk

av spesifikt utvalgte sonder komplementære med bare en spesiell fraksjon av R-RNA sekvensene for å påvise, kvantifisere og identifisere R-RNA har viktige evner og fordeler fremfor et annet aspekt av oppfinnelsen', nemlig'|å anvende ikke selekterte sonder eller sekvenser komplementære til hele R-RNA sekvensen for. å påvise R-RNA. Fordelene, ved å bruke, en selektert sonde

i både overskudd R-RNA og overskudd sohdehybridiseringsmetolo-gier er angitt nedenunder.. Problemene med å bruke en . fullstendig representativ sonde er også omtalt.

Fordelene ved å bruke en selektert sonde fremfor en fullstendig representativ R-RNA sonde ved overskudd sonde hybridisering samt ved overskudd R-RNA hybridisering er forklart nedenunder.

Fordeler ved overskudd sonde hybridiseringsmetoden

Fordeler ved overskudds R- RNA hybridiseringsmetoden

Illustrerende utførelsesformer

Foreliggende oppfinnelse kan som illustrering"brukes til å bestemme om en prøve inneholder noe medlem av en bestemt gruppe levende organismer. Fremgangsmåten som er beskrevet i de følgende eksempler er. en prøve som kan brukes for å påvise og kvanitfisere nærværet av alle medlemmer av en bestemt gruppe bakterier i en prøve, selv i nærvær av store antall organismer som ikke er medlemmer av denne bestemte gruppen.

Som beskrevet i eksemplene innebefatter.foreliggende fremgangsmåte først dannelse av en gruppe spesifikk R-RNA sonde, som, ved et spesifikt kriterium, hybridiserer til R-RNA

fra et hvilket som helst medlem av den bestemte gruppe av interesse, men ikke hybridiserer til R-RNA fra noen andre organismer. Bruken av en slik sonde i en nukleinsyrehybridi-seringsprøve tillater påvisning av ethvert medlem av denne bestemte gruppen, selv i nærvær av store antall andre organismer .

Eksempler på praktisering av oppfinnelsen er oppført senere Hvert eksempel innebefatter dannelse av en markert nukleinsyresonde som vil hybridisere bare med R-RNA fra medlemmer av en- bestemt gruppe organismer.

Det grunnleggende prinsipp for fremgangsmåten som brukes

for å danne hver sonde er som følger:

1. Fremstill markert nukleinsyre komplementær til

R-RNA i et medlem av den aktuelle gruppe.

2. Hybridiser dette DNA til R-RNA fra et medlem av gruppen av grupper av organismer som evolusjonsmessig er nærmest beslektet med den gruppe organismer som sonden skal være -spesifikk for. Velg ut den fraksjon markert nukleinsyre som ved et spesifikt kriterium ikke hybridiserer til R-RNA fra et medlem av denne nærmest beslektede gruppe organismer. Denne fraksjon er spesifikk for R-RNAet fra organisme-

gruppen av interesse og hybridiserer ikke med R-RNA fra den nærmest beslektede gruppe eller grupper eller noen andre organismer.\_.

Eksempel 1: Fremstillinag av sonde som vil hybridisere

til R-RNA fra enhver bakterie

I en typisk situasjon dyrkes ca. 10 6 -10 7 pattedyrceller

i en vevskulturplate samtidig. Bakteriearter, spesielt medlemmer av den taksonomiske klasse Mollicutes er kjent for å kontaminere vevskulturcéller. Medlemmer av klassen Mollicutes er til forskjell fra de fleste andre bakterier ikke lette å bli kvitt med antibiotika, og er problematiske konta-minanter i cellekulturer. Mange forskjellige Mollicutes' arter er blitt påvist i vevskulturcéller. Hvis bare en av disse organismer er tilstede i kulturplaten, har den evne til å formere seg selv i nærvær av antibiotika og danne hundreder av organismer pr. celle. Slike organismer er i stand til å forandre cellenes aktivitet og derved påvirke resultatene av forskjellige studier og markedsføringsevnen til cellekulturproduktene.

Tidligere kjente metoder for å påvise disse organismer er prinsipielt kvalitative prøver, idet de mest brukte er vekst-prøver, forskjellige fargeprøver og immunologiske målinger. Vekstprøvene tar 3 til 6 uker selv om de er temmelig sensitive. Dé har den ytterligere ulempe at mange organismer er-vanskelige eller umulige å dyrke.

Skjønt den aktuelle påvi-sningssensitivitet for fargemetoden ikke er kjent, er det kjent at mer enn flere organismer pr. celle må være tilstede...

Immunologiske prøver er kvalitative prøver og innebefatter bruk av antistoffer mot en spesiell art. Skjønt de kan utføres raskt, er de ikke meget sensitive, og videre ville mange . forskjellige antistoffer kreves, for å påvise alle typerMollicutes.

Utførelsesformen av foreliggende fremgangsmåte som er beskrevet nedenunder er en prøve som kan brukes for å påvise og kvantifisere tilstedeværelsen av ethvert medlem av gruppen av alle bakterier innebefattet den taksonomiske klasse Mollicutes for å påvise nærvær av Mollicutes i vevskultur, for å på-, vise nærvær av bakterier i vevskulturer som normalt er fri for bakterier og for å påvise nærværet av bakterier selv i nærvær av store antall pattedyrceller. Som angitt i eksempelet innebefatter foreliggende'fremgangsmåte først fremstilling av en spesifikk R-RNA sonde som er komplementær til R-RNA fra enhver bakterie, men ikke er komplementær . til pattedyrceller R-RNA. Bruken av en slik prøve i en nukleinsyrehybridiseringsprøve tillater påvisning av enhver bakterietype, selv i nærvær av store antall pattedyrceller.

En detaljert beskrivelsesform av oppfinnelsen følger: Fremstilling, av R- RNA fra pattedyr- og bakterieceller

Pattedyrceller resuspenderes i 0,3 M NaCl 0,02 M Tris,

pH = 7,4. Sarkosy.l tilsettes til en sluttkonsentrasjon på

1 prosent for å lyse céllene. Umiddelbart etter lysing

tilsettes et tilsvarende volum av en 1/1 blanding av fenol/ kloroform og den resulterende blanding'rystes kraftig i 2 minutter. Blandingen sentrifugeres så (80.00 x g i 10 minutter) for å adskille de vandige organiske faser. Den vandige fasen gjenvinnes, og til denne settes et nytt volum fenol/kloroform. Etter rysting og sentrifugering som ovenfor gjenvinnes den vandige fasen igjen. Til dette settes to volumdeler 95% etanol, og denne blanding plasserés ved -20°C i to timer for å hjelpe utfellingen av nukleinsyrene. Så sentrifugeres blandingen (8000 x g, 10 minutter) for å sedimentere utfellingen på bunnen av røret. Væsken fjernes deretter. Nuklein-syreklumpen oppløses på nytt i vann. Denne løsning innstilles så på 0,2 m Na Cl, 5 x lo~<3>m MgCl2, 5 x 10~<3>M CaCl2-

0,02 M Tris (pH = 7,4), 50 mg pr. ml deoksyribonuklease I og inkuberes ved 37°C i 1 time. Så tilsettes samme volum fenol/ kloroform og rystes som ovenfor. Man.sentrifugerer som ovenfor og isolerer den vandige fase. RNA utfelles med etanol

som ovenfor. Fellingen sentrifugeres som ovenfor og RNA

klumpen oppløses på nytt i vann. Denne løsning innstilles på 2 M LiCl og plasseres ved 4°C i 10 - 20 timer for å lette

utfellingen av RNA med høy molekylvekt. Denne løsning sentrifugeres for å samle utfellingen og utfellingen oppløses på nytt i vann. Dette preparat av RNA inneholder"-mer enn 9 5% R-RNA.

Bakterielt R-RNA isoleres på lignende måte med de følgende unntak. I disse tilfeller hvor detergent alene ikke lyser bakterieneyi. anvendes andre midler. Dette innebefatter normalt forbehandling av bakteriene med et enzym (lysozym) for å gjøre dem ømfintlige for lyse med sarkosyl. Etter lysing av bakteriene er isoleringsmetoden som beskrevet ovenfor.

Renset R-RNA lagres ved -70°C.

Fremstilling av radioaktivt DNA komplementært

( 3H- cDNA) til Mollicutes R- RNA..

'R-RNA fra artene Myco plasma hominis ( M. hominis), et medlem

av den taksonomiske klasse Mollicutes, brukes som en mal for å syntetisere radioaktivt cDNA komplementært til M. hominis R-RNA.

Dette cDNA fremstilles ved å anvende evnen til et enzym,

revers transkriptase til å anvende R-RNA som en mal og produsere<3>H-cDNA komplementært (cDNA) til R-RNA. Den reverse. transkriptase reaksjonsblariding.inneholder følgende: 50 mM

Tris . HCL (pH = 8,3), 8 mM MgCl,, 0,4 mM ditiotreitol,

50. mM KCL, 0,1 mM 3H-deoksytymidintr if osf at (50 cures pr. millimol), 0,2 mM deoksyadenosintrifosfat, 0,2 mM deoksycyti-dintrifosfat, 0,2 mM deoksyguanosintrifosfat, 200 mikrogram pr. ml oligodeoksyribonukleotid primer, fremstilt fra E. coli DNA, 50 mikrogram pr. ml M. hominis R-RNA og 50 enheter pr.

ml AMV revers transkriptase. Denne blandingen inkuberes ved 40°C i 30 minutter. Så tilsettes etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (pH = 7,3), natriumdodecylsulfat (SDS), NaCl og glykogen til sluttkonsentrasjoner pa.henholdsvis 10 -2M,

1 prosent, 0,3M og 100 mg pr. ml. Løsningen blandes så med-

en volumdel fenol/kloroform (1/1) og ristes kraftig i 2 minutter, sentrifugeres så (8000 x g i 10 minutter) Og den

. vandige fase isoleres. Nukleinsyrene felles ved tilsetning

2,5 volumdeler 95% etanol.- Fellingen isoleres ved sentrifugering og oppslemmes igjen i H„0. Denn3e løsning inneholder

malen R-RNA og det nye sentetiserte H-cDNA. »

Denne løsningen formuleres deretter til 0,3 M NaOH og inkuberes ved 50°C i 45 minutter og kjøles i is og nøytraliseres med 0,3 M HCl. To og en halv volumdeler 95% EtOH tilsettes så for å utfelle den gjenværende nukleinsyre, og den resulterende felling oppslemmes på nytt i vann. Denne løsning føres over en Sephadex G-100 kolonne ekvilibrert til 0,3 M NaCl,. 0,1 prosent sarkosyl og det ekskluderte volum isoleres. Denne løsningen felles med etanol og den resulterende felling oppslemmes igjen i en liten mengde vann. Fremgangsmåten som

er beskrevet i dette avsnitt fjerner mal R-RNAet og alt gjenværende forstadiumsmateriale fra<3>H-cDNA fremstillingen. 3 H-cDNA hybridiseres så o til M. hominis R-RNA for å sikre at det virkelig er komplementært til dette R-RNA. Hybridiseringsblandingen består av 0,05 mikrogram enkeltstrenget<3>H-cDNA 20 mikrogram M. hominis R-RNA, og 0,48 M PB (fosfatpuffer) i 1 ml. Denne blanding inkuberes i 2 timer ved 65°C og fortynnes deretter til 0,14 M PB og føres Over en hydroksyapatitt (HA) kolonne ekvilibrert til 0 ,14 M PB og 65°C..<3>H-cDNA hybridisert til R-RNA absorberer på hydroksyapatitt (HA) kolonnen, mens ikke hybridisert<3>H-cDNA går gjennom kolonnen. Det hybridiserte<3>H-cDNA gjenvinnes så ved eluering av HA kolonne med 0,3 M PB. Denne fraksjonen dialyseres så for å fjerne PB, felles med etanol for å konsentrere nukleinsyren, sentrifugeres og nukleinsyren oppløses igjen i vann. Denne løsningen blir så behandles med NaOH som beskrevet ovenfor for å fjerne R-RNAet. Etter nøytralisering, tilsetning av glykogenbærer og konsentrasjon ved eta.no lut f elling , oppslemmes på nytt 3H-cDNA i et lite volum vann. Denne løsningen inneholder bar<3>H-cDNA som er komplementært til M. hominis

R-RNA..

Seleksjon av 3 H-cDNA som er komplementær t' il M. hominis

RNA men ikke kompleme ntær til humant R- RNA

Det rensede. 3H-cDNA. fraksjoneres videre ved hybridisering med et stort overskudd human R-RNA. Hybridiseringsblandingen består av 0,05 mikrogram H-cDNA og 40 mikrogram human R-RNA i en ml' 0,48 M PB. Dette inkuberes ved 68°C' i 1'time og blandingen fortynnes så til 0,14 M PB<p>g føres over HA ekvilibrert til 55°C og 0,14 M PB. Fraksjonen (ca. 50% av det totale) som ikke adsorberer til HA (dvs.<3>H-cDNA ikke hybridisert til humant R-RNA) oppsamles. Denne fraksjonen føres på nytt over en ny HA kolonne under de samme.betingelser. Igjen oppsamles den ikke-adsorberte fraksjon. Denne fraksjonen dialyseres for å.fjerne PBet, felles med- etanol for å. konsentrere nukleinsyren og oppløses igjen i vann. Denne løsningen behandles med NaOH som beskrevet tidligere for å fjerne human R-RNAet. Etter nøytralisering, tilsetning av glykogenbærer, og konsentrering ved efanolutfelling, oppslemmes igjen<3>H-cDNA i et lite volum vann. Denne<3>H-cDNA felling er komplementær til M. hominis R-RNA men ikke komplementær til human R-RNA.

Hybridisering av selektrert<4>H-cDNA med

R- RNA fra forskjellig kilde

Fremstillingen av den utvalgte<3>H-cDNA sonde tillater påvisning av bakerier, innebefatter medlemmer av klassen Mollicutes i pattedyrsvevskulturceller og pattedyrsvev ved å påvise nærvær av bakterielt R-RNA ved- nukleinsyrehybridisering.

Et nødvendig krav til en slik prøve er at den utvalgte sonde ikke må hybridisere til R-RNA fra pattedyrceller som ikke inneholder, bakterier. At dette kravet er tilfredsstillet er vist i tabell 3V.

Tabell 3, delene II og III viser at sonden vil påvise alle medlemmer av klassen Mollicutes og bør påvise alle typer bakterier. F.eks. erLegionella p. og E. coli og Bacillus . subtilis representative for helt forskjellige bakterietyper, "og sonden hybridiserer med R-RNA fra hver av disse typer. Evolusjonsbetraktninger tyder på at denne sonden vil hybridisere til R-RNA fra praktisk, talt alle kjente eller ukjente bakterier. Dette skyldes den ekstreme bevaring av R-RNA nukleotidsekvensen under evolueringen-.

Denne utvalgte sonde er anvendelig' for å påvise nærvær

av en spesifikk klasse bakterier, Mollicutes i vevskulturcéller. I de fleste vevskulturcéller er antibiotika tilstede i vekstmediet, og dette forhindrer veksten av praktisk talt alle bakterier unntatt medlemmer av klassen Mollicutes. Således er enhver kontaminasjon av et vevskulturpreparat nesten sikkert på å skyldes et medlem av klassen Mollicutes.

Et viktig aspekt er evnen-til å bestemme antallet tilstedeværende organismer. I.de fleste tilfeller kastes cellelinjer og deres produkter når celler ved tidligere kjente metoder påvises å være kontaminerte. Evnen til å kvanitfisere disse organismer gjør det mulig å bedømme graden av alle virkninger som skyldes kontaminasjon. Graden av en kontaminasjon kan være meget svak, og bare en organisme tilstede pr. 1000 celler. Denne kontaminasjonsgrad vil ha meget liten innvirkning på cellene og i mange situasjoner behøver ikke celleproduktene å kastes. Man kan velge å beholde verdifulle cellelinjer inntil de blir sterkere kontaminert. Kvantitative betraktninger er viktige for å bedømme betydningen av enhver type bakterie-kontaminasjon.

Overskudds R-RNA hybridiseringer foretatt ved 68°C, 0,48 M

PB. Hybridiseringsmålinger foretas med hydroksyapatitt ved. 67°C i 0,14 M PB, 0, 005% natriumdodecylsulfat-.- Hybridiser-ingseksponeringen er tilstrekkelig til å sikre fullstendig reaksjon av<3>H-cDNA med kjerne R-RNA eller for mitokondrisk R-RNA. Ikke bakterielle R-RNA tellinger.på minst 2 x 10 3 oppnås ved pattedyr og fugler. Et ikke spesifikt signal på 1-2 prosent er trukket fra hybridiseringsverdiene som er angitt ovenfor.

Kvantifisering av R-RNA ved nuklein-

syrehybr idiser ing

Mengden av bakterielt R-RNA tilstede i en prøve kan bestemmes ved å måle hybridiseringskinetikken til den valgte

<3>H-C-DNA sonde med RNAet isolert fra et vev og sammenligne disse kinetikker med slike for en kjent standardblanding. Dette kan utføes selv i nærvær av et stort overskudd pattedyr, celle R-RNA fordi prøven ikke hybridiserer med dette R-RNA (se tabell 3, V).

For å måle kinetikkene inneholder hybridiseringsblandingene

-5 -4 3 3

k0 til 10 mikrogram av H-cDNA og 1 til 10 mikrogram av resnet prøve RNA i 0,01 til 0,1 ml av 0,48 M PB. Blandingen inkuberes så ved 68°C og alikvoter fjernes, fortynnes til 0,14 M PB og hybridiseringen måles ved forskjellige tidspunkter etter reaksjonens begynnelse. Hybridiseringsmålinger utføres ved å bruke hydroksyapatitt som.tidligere beskrevet. De erholdte resultater sammenlignes med hybridiseringen til.prøven omsatt med standard RNAer inneholdende kjente mengder av bakterielt R-RNA. Disse standarder er. blandinger fra pattedyrcelle RNA og kjente mengder av .et spesifikt bakterielt R-RNA.

Påvisning og kvanitfisering av medlemmer av

klassen Mollicutes i vevskulturcéller

Tabell'4 angir data erholdt ved hybridisering av den utvalgte, sonde med RNA isolert (som tidligere beskrevet) fra tre forskjellige vevskulturcelleprøver. Bare cellelinje nr. 3 er påvise 1ig.kontaminert og reaksjonskinetikkene tydet på at ca. 5 x 10^ baktericeller er tilstede i vevskulturcellene.

Overskudd R-RNA hybridiseringer foretas ved 68°C i 0,48 M PB 1 et volum på 0,01 til 0,04 ml. Hver blanding inneholder 5 3 2 x 10 mikrogram H-cDNA sonde og 50 - 200 mikrogram prøve

RNA.

Det følgende eksempel er en annen utførelsesform av

metoden ifølge, foreliggende oppfinnelse brukt for å påvise meget små antall, selv et trypanosom i nærvær av en stor mengde blodceller..

Påvisning av trypanosomer er viktig fordi visse medlemmer

av gruppen Trypanosoma er patogene for mennesker og forår-saker sykdommer såsom øst-afrikansk sovesyke, vest-afrikansk sovesyke og•syd-amerikansk trypanosomiasis. Disse organismer er store og har forskjellige karakteristiske former, avhengig av stadiet i livssyklusen. Tidligere kjente metoder baserer

seg hovedsakelig på. serologisk differensial farging koblet med mikroskopisk undersøkelse og animalsk inokuleringsprose-dyrer for å påvise disse organismer hos mennesker. Disse serodiagnostiske metoder varierer i sensitivitet og spesifisitet og kan være vanskelige å tolke. De mikroskopiske metoder brukes mest, men små antall trypanosomer er ofte vanskelige å påvise i nærvær av store antall blodceller. Animalsk inoku-lering er en lang og kostbar prosess.

Utførelsesformen ifølge oppfinnelsen som angitt i det følgende eksempel er en metode som gjør det relativt lett å påvise nærværet av et trypanosom, selv når et stort antall blodceller samtidig er tilstede.

Eksempel 2

Fremstilling av et radioaktivt DNA komplementært til Trypanosom R- RNA

Radioaktivt DNA komplementært (3H-cDNAO) til trypanosoma brucei R-RNA fremstilles på samme måte som M. hominis

<3>H-cDNA som er beskrevet ovenfor i detalj, bortsett fra at Trypanosoma b. R-RNA brukes som en mal.

3

Utvalg av trypanosom H-cDNA Som.er komplementær til trypanosom R- RNA, men ikke komplementær til Human R- RNA

Dette foretas på samme måte som tidligere beskrevet for

M. hominis, unntatt at Trypanosoma b.<3>H-cDNA hybridiseres til human R-RNA.

Bruk av utvalgt trypanosom 3 H-cDNA for å påovise og kvantifisere trypanosomer i menneskelig vev eller væske

Fremstillingen av en utvalgt<3>H-cDNA sonde muliggjør påvisning og kvanitifisering av trypanosomer i prøver fra mennesker ved å påvise nærvær av trypanosom R-RNA. Et-nøvendig krav til en slik prøve er at den valgte sonde ikke må hybridisere til R-RNA fra menneskeceller som ikke inneholder trypanosomer. Tabell 5 viser at dette krav er oppfylt.

Overskudds R-RNA hybridiseringer foretas ved 65°C i 0,48

M PB. Reaksjonene kjøres i 24* timer og hybridiserings-eksponeringen er tilstrekkelig til å sikre fullstendig reaksjon av human nukleære eller mitokondriske R-RNAer og det bakterielle R-RNA. Hybridiseringsmålinger foretas med hydroksyapatitt ved 72°C i 0,14 M PB, 0,005% natriumdodecylsulfat.

En illustrerende sonde som er fremstilt for foreliggende . oppfinnelse er spesifikt bare for medlemmer av slekten Legionella. Sonden hybridierer med enn femti prosent med nukleinsyre fra forskjellige medlemmer av slekten Legionella, og hybridiserer ikke signifikant med nukleinsyrer fra patte-, dyr, gjær og en rekke vidt forskjellige bakteriestammer (tabell 8). Sonden hybridiserer godt selv med Legionalla arter såsom L^pneumophila og L^micdadei som viser lite eller ikke noe totalt DNA slektskap. Andre kjente Legionella arter kan påvises med denne sonden som brukes i tabell 6,

som oppført i tabell 7. Alle de kjente Legionella arter (hittil 23 forskjellige arter) er undersøkt og 'alle kan spesifikt påvises med sonden som brukes i tabell 6.

-. Denne sondens spesifisitet gjør det mulig å påvise og kvanti-

fisere nærværet av Legionalla arter, selv i nærvær av det store antall ikke beslektede bakterielle eller pattedyrceller. Således ble leverceller fra en L. pneumophila infisert hamster målt med hensyn til nærvær og.antall avLegionella organismer ved bruk av den spesifikke sonde og anerkjente nukleinsyrehybridiseringsfremgangsmåter.

Leveren var tidligere målt ved en mikrobiologisk vekst- . prøve som indikerte at ca. 10 Legionella organismer pr. gram forelå, i den infiserte lever. Nukleinsyrehybridiserings-analyse anga ca. 1-2 x 108.Legionella organismer pr. gram lever. Disse resultater, tyder på at pletteringsvirknings-graden i vekstprøven-er ca. 5-10 prosent.

Den spesifikke sonde muliggjør den meget følsomme og raske påvisning av Legionella organismer' selv i nærvær av det store antall pattedyrceller. En måling som tok mindre enn en dag var det lett å påvise i prøven i nærvær avca. 4 00 Legionella organismer som var blandet med 0,4 g lever (ca. 2 x 10^ celler).

Overskudds R-RNA hybridiseringer foretas ved 76°C, 0,48 M PB. Hybridiseringsmålinger foretas med hydroksyapatitt ved 72°C

i 0,14 M PB, 0,005% natriumdodecylsulfat. Hybridiserings-eksponeringen er tilstrekkelig til å sikre fullstendig omsét-ning av<3>H-cDNA med kjerne R-RNA eller for mitokondrisk R-RNA. Ikke-bakterielle R-RNA tellinger på minst 2 x 10 3 oppnås

i tilfellet pattedyr og fugler.

Eksempel 3: Fremstilling av e.n sonde -som vil hybridisere

bare til R- RNA fra medlemmer av slekten Legionella

Fremstilling av radioaktivt DNA komplementært til Legionella

R- RNA

R-RNA fra artene Legionella pneumophila brukes som én mal

for å syntetisere markert,, (radioaktivt) cDNA (komplementært DNA) komplementært til Legionella pneumophila R-RNA. Dette cDNA fremstilles ved å anvende evnen til et enzym, revers transkriptase, til å anvende R-RNA som en mal og fremstille<3>H-cDNA komplementært til R-RNA. Dette foretas på samme måte som beskrevet for fremstilling av Mj_ hominis 3H-cDNA bortsett fra at R-RNA fra Legionella pneumophila brukes som en mal.

Seleksjon av radioaktiv sonde som hybridiserer bare til R- RNA fra medlemmer av slekten Legionella

v

Det rensede 3 H-cDNA fraksjoneres ved å hybridis"ere det med et stort overskudd R-RNA fra E_^coli, Acheolaplasma laidlawaii og ProvidehtiaStuartii.Hybridiseringsblandingen består av 0,05 til 1 mikrogram<3>H-cDNA og 20 mikrogram av hvert bakterielt R-RNA i 1 ml 0,48 M PB. , Denne blandingen inkuberes ved 76°C il time, og blandingen fortynnes så til 0,14 M PB og føres gjennom HA ekvilibrert til 72°C, 0,14 M PB. Frak-3 3 sjonen av . H-cDNA som ikke adsorberer til HA (dvs. det H-cDNA som ikke er hybridisert til R-RNAet) samles. Denne fraksjon'føres så over HA under de samme betingelser som ovenfor, og ijgen oppsamles den ikke-adsorberte fraksjon. Dette 3H-cDNA konsentreres så og hybridiseres igjen med bakterielt R-RNA som beskrevet ovenfor. Den ikke-adsorberte fraksjon samles og: konsentreres og hybridiseres så med bakterielt R-RNA for tredje gang som beskrevet ovenfor og fraksjoneres på HA som ovenfor. Den ikke-adsorberte fraksjon oppsamles, base-. behandles for å fjerne alt R-RNA tilstede og konsentreres i

.3

vann. Dette H-cDNA preparat vil hybridisere til ethvert medlem av Legionellaslekten og vil ikke hybridisere til R-RNAer fra andre kilder.

Hybridisering av Legionella spesifikk 3 H-cDNA s■onde med R-RNA og R- RNA gener fra forskjellige kilder

Den selekterte prøve tillater påvisning av alle medlemmer av slekten Legionella i en prøve ved å påvise nærvær av Legionella R-RNA. ved nukleinsyrehybridisering. Et nødvendig krav til en slik prøve er at den Legionella spesifikke sonde ikke må hybridisere til R-RNA fra andre kilder. . Kvantifisering av Legionella R-RNA ved nukleinsyrehybridi-serings- overskudds R- RNA metode:

Mengden bakterielt R-RNA tilstede i en prøve kan påvises

ved å måle hybridiseringskinetikkene for den utvalgte<3>H-cDNA sonde med RNAet isolert fra en vevsprøve og sammenligne disse kinetikker med slike for en kjent standardbland-

ing. Dette kan gjøres også i nærvær av et stort overskudd pattedyrcelle R-RNA, fordi sonden ikke vil hybridisere med dette R-RNA. v

For å måle kinetikkene kan hybridiseringsblandingen f ..eks. inneholder 10~<5>til 10~4 mikrogram<3>H-cDNA og 0,01 til IO<3>mikrogram renset prøve RNA i 0,01 til 0,1 ml 0,48 M PB. Denne blandingen inkuberes ved 76°C og alikvoter fjernes, fortynnes til 0,14 M PB og hybridisering måles ved forskjellige tidspunkter etter reaksjonens begynnelse. Hybridiseringsmålinger

■utføres ved bruk av hydroksyapatitt som beskrevet tidligere. De erholdte resultater sammenlignes med hybridiseringskinetikkene for sonden omsatt med standard RNAer inneholdende kjente mengder bakterielt R-RNA. Disse standarder er blandinger av pattedyrcelle. RNA og.kjente mengder av et spesifikt bakterielt R-RNA.'

Tabell 8 angir -data for kvantifisering av Legionella pneumophila tilstede i vannprøver og i en infisert hamster-leverprøve. Vannprøvene og leverprøvene ble målt med hensyn til nærvær av L. pneum ved standard kvantitative vekstmålinger ved Center for Disease Control i Atlanta, Georgia.

Overskudd sondemeto. de

Mengden bakterielt R-RNA tilstede i en prøve kan også måles

ved å utføre hybridisering under betingelser hvor det foreligger et overskudd av den Legionella spesifikke<3>H-cDNA

sonde, i forhold til mengden av Legionella R-RNA tilstede. Denne blanding hybridiseres ferdig. På dette tidspunkt er. hvert

Legionalla, R-RNA molekyl tilstede i prøven mettet med sondemolekyler. Ved å sammenligne mengden av sonde hybridisert til R-RNAet med- en riktig konstruert standard" kalibrerings-kurve, kan mengden av R-RNA i en prøve bestemmes. En god vurdering av det totale antall Legionella pneumophila bakterier tilstede i prøven kan så beregnes med kjennskap til det gjennomsnittlige antall R-RNA molekyler pr. L. pneumophila bakterie.

Tabell 9 angir data for kvantifiseringen av L^pneumophila tilstede i vannprøver målt ved overskuddssonde akselerert hybridiseringshastighet - enzym-detergeht-prøvemetode beskrevet i detalj i en senere del. Vannprøvene ble målt med hensyn til nærvær av L^pneumophila ved standard kvantitative vekstmålinger. Disse målinger tar dager å fullføre mens hybridiseringsmålingen tar ca. 1 time.

A. Analyse av en vannprøve: Akselerert hybridiseringshastig-hetsmetode 1. Fremstilling av prøve og hybridiseringsinkubasjons-b.landing: Bland i følgende rekkefølge så raskt som mulig.

a) 9 mikroliter prøve

b) 2 mikroliter enzym-detergentblanding inneholdende:

5 milligram/ml proteinase K, 0,5 M tris (pH = 8,1),

8% natriumdodecylsulfat (SDS), 4% natriumsarkosinat, 0,25 M NaCl, 0,016 M EDTA, 0,016 EGTA

c) 1 mikroliter sonde oppløst i vann

d) 20 mikroliter 4,8 m; PB

2- Inkuber blandingen ved 7 6°C i tilstrekkelig tid til at

hybr idiser ingsreaks jonen blir fullstendig..

3. Hybridiseringsmålinger utføres som følger:

a) Tilsett inkuberingsblandingen 1 ml av en romtemperatur-løsning inneholdende: 0,05 gram hydroksyapatitt (HA),

0,054 M PB, 0,02% Zwittergent 14 (CalBiochem) (heretter-kalt Z-14)

b) Rist blandingen 3 0 sekunder ved romtemperatur, tilsett

5 ml 0,14 M PB, 0,02% Z-14, og inkuber .blandingen ved

72°C i 2 minutter..

c) Sentrifuger blandingen for å.klumpe HAet. Alle sentri-fugeringer foretas ved romtemperatur. Dekanter og ta vare

på den flytende fraksjon. Dette er vak 1.

d) Tilsett 6 ml 0,14 M PB, 0,02% Z-14 løsning til klumpen.

Oppslemm på nytt HA klumpen ,ved å virvle den. Sentrifuger

for å klumpe HAet og dekanter og ta vare på væskefraksjonen. Dette er vask / 2..

e) Gjenta trinn d. Dette fører til vask f- 3.

f) Tilsett 6 ml 0,03 og oppslemm igjen HA klumpen ved virvling.

Sentrifuger suspensjonen for å klumpe HAet og dekanter

væsken og mål den med hensyn til nærvær av sonden.

Denne fraksjonen inneholder den hybridiserte sonde hvis noe er tilstede.

Det er ikke nødvendig å eluere den hybridiserte sonde fra HAet under bestemte betingelser. Hvis sonden således er markert med en markør som kan påvises i nærvær, av HA, kan klumpen fra trinn e måles direkte med hensyn til sonde. I tilfellet av en markør såsom jod-125 kan røret inneholdende HA klumpen

.plasseres direkte i en gammapåvisningsmaskin.

Andre modifikasjoner kan også foretas for å gjøre prøven raskere og lettere. Således kan volum og mengde av HAet som brukes settes ned, og antallet vasker kan også reduseres

.. avhengig- av situasjonen. I andre tilfeller kan det være

ønskelig å øke volumene av HA.eller antallene av vasker.

En rekke andre salter enn natriumfosfat og andre detergenter kan også brukes i målingen. ~v

B. Analyse av en flytende prøver Standard hybridiserings-hastighetsmetode 1. Fremstilling av prøve og hybridiseringsinkuberingsblanding. Bland i følgende rekkefølge og så raskt som mulig.

a) 14 mikroliter prøve

b) 2 mikroliter enzym-detergen.tløsning beskrevet under A.

c) 1 mikroliter sonde

d) 3 mikroliter 3,2 M PB, 0,03 M EDTA, 0,03 M EGTA

2. Inkuber blandingen ved 7 6°C i tilstrekkelig tid til at hybridiseringen forløper, fullstendig.

3.Hybridiseringsmålingen utføres som følger:

a) Sett inkuberingsblandingen til 1 ml av én løsning inneholdende 0,14 M. PB, 0,02% Z-14, 0,05 gram HA. b) Fra dette punkt av er forskriftene identiske med den som er beskrevet under A.

C. Analyse av vevsprøve: Akselerert hybridiseringshastighets-metode

Et 10 prosent leverhomogenisat i vann brukes som vevsprøve.

1. Fremstilling av prøve og inkuberingsblanding.

Bland så raskt som mulig og i følgende rekkefølge:

■a) 8 mikroliter prøve. (10% leverhomogenisat)

b) . 3 milliliter enzym-detergentblanding inneholdende:

8% SDS, 4% natriumsarkosinat, 0,25 M NaCl, 0,016 M

EDTA, 0,016 MEGTA, 0,38 M tris (pH =8,2), 195 milli-gram/ml pronase. c) 1 mikroliter sonde spesifikk bare for Legionella R-RNA.

d) 20 mikroliter 4,8 M PB.

■ 2..Inkuber blandingen ved 76°C i tilstrekkelig tid til å sikre at hybridiseringsreaksjonen er fullstendig. 3. Hybridiseringsmålingen utføres som beskrevet i avsnittet for analyse av en vannprøve; akselerert hastig.hetsmetodé.

D. Analyse av vevsprøve: Standard hybridiseringshastighets-metode

Et 10 prosent leverhomogenisat i vann ble brukt som prøve.

1. Fremstilling av prøve og inkubasjonsblanding.

Bland så raskt som mulig i følgende rekkefølge.

a) 12 mikroliter prøve.

b) 4 mikroliter enzym-detergentløsning beskrevet i B.

c) 1 mikroliter sonde spesifikk bare for Legionella

R-RNA.

d) 3 mikroliter 3,2 M PB, 0,03 M EDTA, 0,03 M EGTA.

2. Inkuber blandingen i tilstrekkelig tid ved 76°C.

3. Hybridiseringsmålingen utføres som følger:

a) tilsett inkuberingsblandingen til 1 ml av en løs-

ning inneholdende 0,14 M PB, 0,02%.Z-14, 0,05 gram HA. b) fra dette punkt er målingen identisk med den som er beskrevet under A.

En nærmere detaljert beskrivelse av nukleinsyrehybridiserings-prøver for å påvise Legionella pneumophila bakterier i vann og leverprøver er angitt nedenunder.

Eksempel 4

Rask sensitiv påvisning av Legionella bakterier i vann-prøve: Akselerert hastighetsmetode 1. De følgende bestanddeler ble blandet så raskt som mulig og i den følgende rekkefølge.

a) 4,5 mikroliter av en vannprøve inneholdende ca. l0^

Legionella pneumophila bakterier pr. ml. Antallet bakterier i vannet ble bestemt ved Center of Disease Control i Atlanta ved en vekstprøve.

b) 1 mikroliter av enzymdetergentløsning beskrevet under

A.

c) 0,5 mikroliter Legionella spesifikk sonde.

Mengden av sonde tilsvarte 7,5 x 10 ^ mikrogram..

d) .10 mikroliter 4,8 M PB. Sett hybridiseringsblandingen sammen ca. 2 minutter. 2. Inkuber hybridiseringsblandingen i 36 minutter ved 76°C. 3. Utfør hybridiseringsmålingen som beskrevet under A.

Dette tar ca. 5 .minutter.

4. Mål fraksjonene med hensyn til nærvær av sonden.

Dette tar ca. 10. minutter.

Antallet Legionella bakterier tilstede i hybridiseringsblandingen var ca. 500. Dette antall organismer ble påvist og kvantifisert i ca. 1 time fra start, til slutt ved bruk av mindre enn 10 ~* mikrogram sonde. Tjuetre prosent sonde hybridiserte med Legionella R-RNA i denne prøven som ble kalt en overskuddssondehybridiseringsprøve. Kontroll-prøver ble foretatt under de samme betingelser, en uten tilsetning av bakterier' , og en med ca. 10 5 E^coli bakterier tilstede i hybridiseringsblandingen. I begge tilfeller opptrådde bare 1-2 prosent av sonden som om den var hybridisert.

Ovennevnte prøve kan modifiseres til å måle større volumer med . hensyn til'nærvær av Legionella bakterier.. Således ble 1 ml av en vannprøve inneholdende 10^ Legionella bakterier pr. ml sentrifugert i 30 minutter for å klumpe bakteriene. En liten mengde enzym-detergent ble satt til klumpen og en' hybridiseringsprøve ble .utført på denne blandingen ved bruk

av den akselererte hastighetsmetode og Legionella bakteriene var lette å påvise. Meget større prøvevolumer kan sentri-

fugeres og andre metoder for konsentrering av bakteriene innebefattet membranfiltrering, kan også brukes. Disse modifiseringer gjør det mulig å påvise et lite. antall bakterier i et stort prøvevolum. Luftprøver kan også konsentreres ved metoder innebefattet membranfiltrerings-metoder og: små antall bakterier kan påvises i store volumer av luftprøve.

Eksempel 5

Hurtig sensitiv påvisning av Legionella bakterier i hamster-leverprøve

1. De følgende bestanddeler ble blandet så raskt som mulig

. i den følgende rekkefølge..

a) 4 mikroliter av et 10 prosent leverhomogenisat fra en hamsterlever infisert med Legionella pneumophila. Dette

* 4 er ekvivalent med 4 00 mikrogram lever eller ca. 6 x 10'leverceller. Ca. 750 Legionella pneumophila var tilstede i denne prøven. b) 4 mikroliter av en enzym-detergentløsning sammensatt av: 45 milligram/ml Proteinase K, 8% SDS, 4% natriumsarkosinat, 0,5 M tris (pH.= 8,2), 0,008 M EDTA, 0,008 M EGTA, 0,25 M NaCl. c) 4 mikroliter Legionella spesifikk sonde. Sondemengden

-5

var ca. 10 mikrogram.

2.. Inkuber hybridiseringsblandingen ved 76°C i 3 timer.

3. Utfør hybridiseringsmålingen som beskrevet under A.

4. Mål de resulterende fraksjoner med hensyn til nærvær av sonde hybridisert til Legionella R-RNA.

Antallet Legionella bakterier tilstede i hybridiseringsblandingen var ca. 7 50 og mengden av R-RNA tilstede i dette antall Legionella celler er ca. 1,1 x 10 mikrogram. Antallet leverceller tilstede var ca. 6 x 10 4 og mengden av lever R-RNA tilstede var ca. et mikrogram. Ti, prosent av

•den. Legionella spesifikke sonde hybridiserte. Kontrollprøver ble foretatt med ikke infisert lever på samme måte, og mindre enn en prosent av sonden opptrådde som om den var hybridisert. Eksemplene 4 og 5 illustrerer bare to av de mange mulige former for en slik prøve. Prøver som anvender forskjellige volumer, salter, detergenter, sonder,.prøvetyper, proteolytiske enzymer, mengder.av HA, inkuberingsperioder, organismetyper, mengder av sonde, inkuberingstemperaturer og hybridiserings-hastighetsakselererende systemer kan med hell anvendes innenfor det generelle omfang av de her beskrevne prøver. Alle R-RNA sonder, kan brukes i et system sammenlignet med de som er beskrevet ovenfor. Ikke R-RNA sonder kan også brukes med godt resultat ved disse systemer med noen åpenbare modifikasjoner. F.eks. kan en prøve spesifikk for en bestemt DNA sekvens

i en spesifikk organisme eller gruppe av organismer utføres nøyaktig som beskrevet ovenfor hvis et trinn, inntas som,over-fører, det dobbeltstrengede DNA i den enkeltstrengede form.

I andre tilfeller må forskjellige modifikasjoner av metoden brukes. Bakterier såsom mykobakterier og Bacilli er vanskelige å bryte opp.. Et trinn som bryter opp disse bakterier

må deretter brukes i forbindelse med den ovenfor beskrevne metode. En enkel inkubering uten detergenter med enzymet lysozym vil ømfintliggjør de fleste Bacillus bakterier for lyseing med detergenter, f.eks. På den annen.side er Mycobakterier meget vanskelige å lyse og kan måtte brytes opp fysikalsk før de kan undersøkes.

En modifikasjon av den ovenfor nevnte metode kan også brukes

i forbindelse med enhver transfer RNA sonde eller en sonde spesifikk for ethvert annet RNA tilstede i en organisme.

Et trinn konsipert for å konsentrere små mengder av bakterier eller andre celler utfra større prøvevolumer såsom luft eller væske, kan også brukes i forbindelse, med hybridiserings-prøven for å påvise de fleste andre bakterielle organismer eller andre typer organismer.

Skjønt ovenfor i detalj er beskrevet fremstilling og bruk av en nukleinsyresonde som hybridiserer bare til nukleinsyrer fra medlemmer av slekten Legionella, vil..det for en fagmann være lett å forstå fra dette eksempel og andre at andre sonder kan fremstilles basert på de ovenfor illu-strerte fremgangsmåter. Således ville metoden for å fremstille slike andre prøver være som følger: 1. Fremstille markert nukleinsyre komplementært-til R-RNA fra et medlem av gruppen av interesse. 2. Hybridiser dette DNA til RNAet fra et medlem av gruppen av organismer evolusjonsmessig nærmest beslektet med gruppen av organismer som sonden er spesifikk for. Ut-velg den fraksjon av den markerte nukleinsyre som ved et spesifikt kriterium ikke hybridiserer til R-RNA fra et medlem av denne nærmest beslektede gruppe organismer. Denne fraksjon er spesifikk for organismegruppen av interesse.

Eksempler på disse er:

a. Fremstilling av markert'sonde som hybridiserer bare med R-RNA fra et medlem av bakterieslekten Leptospira og ikke hybridiserer med andre R-RNA kilder. b. Fremstillingen av en markert sonde som hybridiserer bare med R-RNA fra et medlem av bakterieslekten Mycoplasma og ikke hybr idiserer'imed R-RNA fra andre kilder. c. Fremstillingen av en markert sonde som hybridiserer bare. med R-RNA fra et medlem av bakteriefamilien Enterbacteri-aceae og ikke hybridiserer med R-RNA fra andre kilder. d. Fremstillingen av en markert sonde som hybridiserer bare med R-RNA fra et medlem av .den anaerobe gruppe av bakterier og ikke hybridiserer med R-RNA fra andre kilder.

e. Fremstilling av en markert sonde som hybridiserer bare med R-RNA fra et medlem av gruppen sopp og ikke hybridi-.

serer med R-RNA fra andre kilder.

f. Fremstilling av en markert sonde som baré^hybridiserer

med R-RNA fra ethvert medlem av Chlamydia gruppen og ikke hybridiserer med R-RNA fra andre kilder.

g. Fremstilling av en markert sonde som hybridiserer bare

med R-RNA fra ethvert medlem av bakteriefamilien Myco-, bacteriaceae og ikke hybridiserer med R-RNA fra andre kilder.

h. Fremstillingen av en markert prøve som hybridiserer

R-RNA fra enhver levende organisme.

i. Fremstillingen av en markert sonde som hybridiserer bare med R-RNA fra ethvert pattedyr og ikke hybridiserer med R-RNA fra andre kilder.

Illustrerende utførelsesform av bruken av sonder- for t— RNA for å påvise, kvantifisere og identifisere organismer

t-RNA sonder kan brukes på samme måten som R-RNA sondene for

å påvise, identifisere og kvantifisere organismer og i noen tilfeller virus. F.eks. kan en t-RNA sonde spesifikk for Legionella fremstilles og-lbrukes på lignende måte som beskrevet for R-RNA sonden spesifikk bare'for Legionella. Den illustrerende utførelsesform beskrevet for den Legionella spesifikke R-RNA sonde tjener således altså som en illustrering på en t-RNA spesifikk Legionella' sonde.

De tilstedeværende gener i mange DNA og RNA virus omfatter t-RNA gener som er spesifikke for virusen.

Illustrerende utførelsesform av bruken av sonder spesifikke for mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA for å: Påvise, kvantifisere og identifisere organismer, celler og virus i celler

Sonder spesifikke for mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA kan. brukes på analog måte med sådanne for R-RNA og t-RNA for å påvise, identifisere og kvantifisere en spesifikk stor eller liten gruppe organismer, celler eller virus i celler. Da den evolusjonelle bevaring av de individuelle gener som produserer slike forskjellige RNAer varirer sterkt, er det mulig å fremstille sonder som vil påvise medlemmer av meget store klasser av organismer og sonder som påviser medlemmer av relativt små klasser av organismer, celler eller virus i celler.

Et eksempel på meget bevarte genesekvenser er histongenene, en familie gener tilstede i eukaryotiske celler. Histoner er . nukleære strukturelle proteiner som er tilstede i alle eukaryotes. Histon DNA sekvensene viser stor likhet selv hos helt forskjellige organismer. Således er histongenene fra sjøpinnsvin og menneske like nok til å hybridisere sammen.

En sonde som er spesifikk for et bestemt histon mRNA eller for en populasjon av histon mRNAer kan påvise, identifisere, nærvær eller- fravær av ethvert medlem av en stor gruppe helt forskjellige organismer. Påvisningssensitiviteten for celler eller organismer forsterkes ved utbredelsen av histon-mRNAer. For å vokse må en celle eller organisme syntetisere histon mRNA i store mengder.

Et annet eksempel er bestemte genesekvenser som koder- for psRNA og ikke er bevart under evolusjonen. Slike genesekvenser fra en type organismer hybridiserer ikke til DNA fra fjernt beslektede arter. En sonde spesifikk for en spesiell psRNA sekvens eller en populasjon av forskjellige psRNA sekvenser fra en organismetype eller virustype kan brukes for å påvise, kvantifisere eller identifisere medlemmer av en liten gruppe nært beslektede organismer eller en liten gruppe nært beslektede virus som er i celler.

Et annet eksempel er utviklingen av en sonde spesifikk for en sekvens eller sekvenser av mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA som kan brukes for å undersøke kroppsvæsker med hensyn t.il spesifikk.celleskade og ødeleggelse..I bestemte sykdommer ødelegges celler og deres innhold innebefattet cellenuklein-. syrer spres i det sirkulerende blod. Leverskade som skyldes'

hepatitt er en slik situasjon og det er kjent at både DNA

og RNA fra leverceller går inn i det sirkulerende blod som et resultat av celleskade. En sonde kan fremstilles som er spesifikk for en RNA sekvens eller sekvenser som er karakteristiske bare for leverceller og ikke er tilstede i andre normale celletyper. Eksistensen av slike RNAer er velkjente. Denne, sonde kan så brukes for å påvise, identifisere og kvantifisere leverspesifikt mRNA, hnRNA, snRNA eller psRNA sekvenser i blodprøver ved nukleinsyrehybridi-seringsmetodology som er beskrevet. Leverskaden og dens utstrekning kan bestemmes fordi mengden av RNA tilstede i blodet vil henge sammen med graden av cellebeskadigelse.

Sonder spesifikke for en bestemt mRNA, hnRNA, snRNA eller. psRNA sékvens eller sekvenser tilstede bare i en spesifikk type levercelle kan også fremstilles og brukes for å

påvise og kvantifisere nærværet i blodet av RNA sekvensene som stammer fra skaden på. en spesifikk levercelletype.

Jo mer utstrakt den spesifikke RNA sekvens er i levercellen, jo høyere er åpenbart sensitivitetene for påvisningen av RNAet.

Skade på ethvert kroppsvev eller organ (innebefattet hjerte, nyre, hjerne, musker, bukspyttkjertel, galle- osv.) kan. påvises og kvantifiseres på denne måten. Andre1 kroppsvæsker er spinalvæske Og urin som også kan måles med hensyn til nærvær av disse spesifikke RNAer.

En anvendelig begynnelsesundersøkelse for vevsskade fra enhver kilde kan utføres ved å anvende en sonde spesifikk for R-RNA og undersøke blod eller andre kroppsvæsker med hensyn til nærvær av R-RNA eller t-RNA sekvenser. Kvantifisering av R-RNA eller t-RNA som er tilstede vil gi en indika-' sjon på graden av vevsskade uten identifikasjon av. kilden.

En annen prøve på bruken av nukleinsyrehybridiseringsforsøk og tilganger som her er beskrevet, er påvisningen og kvantifiseringen av E_^ coli celler inneholdende plasmidgener som koder for E^coli enterotoksinprotein. En slik prøve medfører bruk av en markert nukleinsyresonde komplementær til entero-.toksinprotein mRNA for å påvise og kvantifisere nærvær av E. coli bakterier inneholdende enterotoksin protein mRNA. Dette kan utføres ved å anvende hybridiseringsmetoder i." løsning som her er beskrevet.

Som tidligere omtalt her har bruken av en sonde komplementært til E^coli enterotoksin mRNA som et middel for å påvise og kvantifisere nærværet av coli bakterier som produserer E. coli enterotoksin og derfor inneholder enterotoksin mRNA ved bruk av nukleinsyrehybridiseringsmetoder betydelige fordeler fremfor slike metoder som er beskrevet i Falkow et al. patentet som tidligere er omtalt.

Det samme prinsipp som er beskrevet ovenfor" kan anvendes for å påvise det spesifikke geneprodukt fra en spesiell mikroorganisme som medfører resistens-overfor et spesielt antibiotikum eller et annet antimikrobielt middel. Genene som bestemmer resistens overfor de fleste antibiotika sitter nesten alltid i plasmidene i cellen. For at en organisme skal produsere den faktor som gir resistens, må genet for faktoren og mRNAet for faktoren være tilstede i cellen. Således kan en sonde spesifikk for .faktoren mRNA brukes

for å påvise, identifisere og kvantifisere organismene som produserer faktoren ved å anvende nukleinsyrehybridiseringsmetoder.

De ovennevnte eksempler på bruk av nukleinsyresonder spesi- .

fikke for bestemte sekvenser eller populasjoner av sekvenser av mRNA, hnRNA, snRNA. eller psRNA i hensikten påvisning,

identifisering og kvantifisering av spesielle grupper av

organismer, celler eller virus i celler inneholdende slike mRNA, hnRNA, snRNA eller ps.RNA sekvenser med nukleinsyrehybridiseringsmetoder.er bare illustrerende og ikke begren-sende .

Bestemmelse av sensitiviteten av mikroorganismer overfor antimikroorganismereagenser

Mange forskjellige kliniske situasjoner krever bestemmelse' av antimikrobielt reagens som virker på en rekke forskjellige bakterier og antibiotika (se "Antibiotics in Laboratory Medicine" av V. Lorian, Editor, Publisher, Williams, . and Wilken Baltimore, 1980). Alle disse situasjoner benytter en metode for påvisning og kvantifisering av bestemte.klasser mikroorganismer. I mange av disse situasjoner ville bruk av nukleinsyrehybridiseringsprøver beskrevet tidligere gjøre bestemmelsen av antimikrobiell reagensømfintlighet meget raskere.

Ettersom organismene i en prøve vokser og deler seg, øker mengden av RNA i.kulturen. En bobling av organismer fører til en togangers økning av mengden RNA av forskjellige typer som er tilstede i kulturen. Således kan organismevekst styres ved å bestemme den mengde RNA som er tilstede i kulturen på forskjellig tidspunkt etter starten av vekstinkubasjon. En økning i mengden RNA tilstede med tiden indikerer organismevekst. Økningens størrelse indikerer vekstgraden. Hastigheten av veksten er så graden av vekst pr. tidsenhet.. Sonder spesifikke for R-RNA, t-RNA, psR-RNA, pst-RNA, visse mRNAer eller psmRNAer. kan brukes enkeltvis eller i kombina- . sjon for å måle veksten av organismer fordi mengden av hver av disse RNAer i en kultur vil øke ettersom organismene vokser..

En kultur av en bestemt kategori organismer dyrket i nærvær av et middel eller midler som fullstendig inhiberer vekst, . vil ikke vise enøkning i RNA med tiden, mens kulturer som delvis inhiberes av et slikt middel vil vise en lavere grad av RNA akkumuleringen. En kultur som ikke inhiberes, vil vise den samme hastighet for RNAøkning som kontrollkulturen, hvilken ikke inneholder midlet.-

Et eksempel på dette er i bestemmelsen av ømfintligheten

til Mycobacteria tuberculosi tilstede i en klinisk spytt-

prøve. Det første diagnosetrinn for en slik prøve er å fremstille en direkte smørje av spyttet for farging for å påvise syrefaste bacilli. Det antas at det"kreves minst 10 - 10 tuberculosis organismer pr. ml spytt for å

gi en positiv direkte smørje. Imidlertid er bare 10 til 100 av disse organismer utvinnbare ved vekstkulturmetoder.

Hvis spyttprøven viser en positiv smørje, behandles prøven så slik at alle bakterier unntatt Mycobakterier drepes,

og en fortynning av denne behandlede prøve pletteres på agarmedium inneholdende, antimikrobielt. middel og. på kontrollagar som ikke inneholder dette middel. Formeringsdyktige enkeltbakterier vil danne kolonier på kontrollagaren, mens veksten vil inhiberes på agaren med det riktige antimikrobielle middel. Forholdet av antallet på kontrollagar til slike på agarbehandlede middelet er så et mål på det antimikrobielle middels virkningsgrad.

En liten koloni vil inneholde minst 10^ bakterier. Dette betyr at minst 20 delinger'kreves for å danne en koloni

fra en bakterie og hver deling vil ta minst 12 timer, . tilsammen 240 timer eller 10 dager minst. I de fleste tilfeller tar det 2-4 ganger så lengde (3 til 6 uker) før kolonier opptrer.

En metode beskrevet tidligere for Legionella ville sterkt redusere den nødvendige tid for å påvise det antimikrobielle middels virkning. En sonde spesifikk bare for R-RNA fra medlemmer av slekten' Mycpbacterium kunne brukes i en slik prøve. En slik sonde ville muliggjøre kvantifisering og en påvisningssensitivitet tilsvarende den som tidligere er beskrevet for Legionella. En nukleinsyrehybridiseringsprøve som.bruker de akselererte hybridiseringshastighetsbeting-elser og overskuddssondeformen for hybridisering ville lett muliggjør påvisning av ca. 200 Myeobacteria celler.

Et trinn ville tilføyes for å sikre opprivning av Mycobacteria celler, slik at R-RNA ville være fritt til å hybridisere.

Mycobacteria lyser ikke lett i nærvær av enzym-detergent løs-ninger. Som ovenfor nevnt inneholder en minimums positiv spytt-prøve (bestemt ved syrebeising) ca. 10 4 til 10 5Mycobacteria 2 ■

celler pr. ml og disse 10 til 10 celler kanvpåvises som kolonidannende enheter. For drogevirkningsstudier på agar tilsettes tilstrekkelig Mycobacteria til å kontrollere og., eksperimentell agaroverflate til å sikre at 40 til 50 kolonier vil opptre på kontrollagaren hvor ikke antimikrobielt middel er tilstede. Hvis en slik praksis følges ved bruk av en nukleinsyrehybridiseringsmåling, betyr dette at kulturen starter med ca. 50 M ycobacteria, og det vil da ta ca. 3 til 4 celledelinger eller ca. 2 til 3 dager for å oppnå en påvise-lig cellemengde. Hvis en- signifikant vekstinhibering av middelet er kommet, vil kontrollen være positiv og kulturen inneholdende middelet.vil være negativ. Det er klart,at bruken av.den meget sensitive nukleinsyrehybridiseringsmetode sterkt kan redusere den nødvendige tid for å bestemme virkningene med 5 til 10 ganger.

Dette er bare et eksempel på bruken av nukleinsyrehybridi-seringsprøver, slik som sådanne beskrevet for Legionella for å bestemme sensitiviteter av antimikrobielt middel. Sensitiviteten til enhver mikroorganisme kan bestemmes ved

å anvende en kombinasjon av standardvekstmetodologi og en måling av mikroorganismer basert på nukleinsyrehybridisering. I. tillegg muliggjør i mange tilfeller.nukleinsyre-hybridiseringsprøvenes spesifisitet og sensitivitet overfor mikroorganismer påvisning av antibiotisk sensitivitet av spesifikke organismer selv i nærvær av en stor mengde andre mikroorganismer eller eukaryotiske celler. Det er åpenbart at det samme prinsipp kan brukes for å.bestemme antimikro-organisme aktivitet i blod, urin, andre.kroppsvæsker og vev og i andre prøver. I dette tilfellet kan foreliggende nuklein-syrehybridiseringsfremgangsmåte brukes til å styre.og kvantifisere virkningen av''blod, urin eller annen. ■ prøve på veksten, av en spesifikk gruppe av mikroorganismer som bringes i kontakt med dette blod, urin eller andre prøver hvor vekst

forekommer hvis antimikrobiell aktivitet ikke<*>er tilstede.

En metode for å bestemme veksthastigheten til celler

Den totale hastighet av proteinsyntese i en célle bestemmes av antallet ribosomer, pr. celle. Hastigheten av t-RNA syntese henger også sammen med antallet ribosomer pr. celle. Inhibering av proteinsyntese i en celle fører til-opphør,

av R-RNA syntesen hos cellene..Å stoppe cellevekts med et hvilket som helst middel fører faktisk til opphør ay R-RNA syntese og retardasjon av cellevekst fører til en nedsett-else av R-RNA syntesen.

Det nylig syntetiserte R-RNA molekyl er større enn summen

av de ferdige R-RNA underenheter i ribosomet. F.eks. syntetiseres R-RNA fra E.. coli som et f or stadiumsmoleky 1 6000 baser langt. Forstadiumsmolekylet behandles så og gir R-RNA underenheter (tilsammen ca.. 4500 baser) som så innføres i-ribosomer og "ekstra" forstadie spesifikke R-RNA (ps R-RNA) sekvenser som eventuelt nedbrytes av cellen.

R-RNA syntetiseres ikke i ikke-voksende celler og derfor er. ingen forstadiespesifikk R-RNA sekvenser tilstede i disse celler. I dette tilfellet foreligger mange R-RNA molekyler i cellen, men ikke noe ps-RNA. sekvenser er tilstede.

I en' langsomt voksende celle syntetiseres en liten mengde R-RNA forstadium og en liten mengde ps R-RNA er tilstede.. . I -en hurtigvoksende celle syntetiseres en stor mengde R-RNA forstadium og flere tu sen:, ps R-RNA sekvenser er tilstede. Mangel på psR-RNA i en celle signaliserer at cellen ikke vokser. Forholdet av R-RNA til psR-RNA i en celle er en indikasjon på veksthastigheten til en celle.

Antimikrobielle midler inhiberer cellevekst. Celler som ikke har'voks inhibert av middelet, vil inneholde store mengder psR-RNA. I celler som.er bare delvis vekstinhiberte vil psR-, RNA være tilstede i en mindre mengde. Forholdet av R-RNA

.'til psR-RNA vil gi et mål på inhiberingsgraden.

. En nukleinsyresonde spesifikk for psR-RNA sekvensene til en bestemt gruppe mikroorganismer kan brukes i en nukleinsyre-hybr idiseringsprøve for å bestemme og kvanitfisere nærværet eller'fravær av psR-RNA i slike mikroorganismer når organismene dyrkes i nærvær eller fravær av et spesielt antimikroorganisme-middel eller en gruppe av slike midler. Dette kan foretas selv i nærvær av mange organismer som ikke er beslektet med mikro-organismegruppen av interesse.

Det er åpenbart at denne nukleinsyrehybridiseringsmetoden

også kan brukes til å bestemme nærværet av substanser med anti-mikroorganisme i blod, urin, andre kroppsvæsker og vev., og andre prøver.

Denne metoden for å bestemme cellevekst kan brukes til å. bestemme veksttilstanden til alle celler som syntetiserer R-RNA. Ovennevnte eksempel er bare et av mange på en slik metode.

En metode basert på'bruk av en sonde spesifikk for pst-RNA. sekvensene for en bestemt gruppe organismer eller celler kan også brukes til å bestemme veksttilstanden for slike organismer eller celler.

En fremgangsmåte basert på å anvende en spesifikk sonde for bestemte mRNAer, psmRNAer, hnRNAer, pshnRNA, snRNAer, eller pssr RNAer som utbredt i rasktvoksende organismer eller celler,

men mangler, eller er tilstede i liten mengde, i ikke-voksende eller langsomt voksende celler, kan også brukes for å bestemme veksttilstanden til disse organismer eller celler. F.eks.

er mRNA for et protein, RNA polyerase, tilstede i stor mengde, flere hundre kopier pr. celle, i rasktvoksendé celler. I ikke-voksende celler syntetiseres meget lite RNA og lite mRNA er. tilstede.

En. metode basert på anvendelse av en sonde spesifikk for bestemte virus mRNAer eller psmRNAer som er utbredte når virusen vokser raskt i en celle og mangler når virusen er tilstede i en celle, men ikke vokser, kan også anvendes" til å bestemme veksttilstanden for virus i celler.

Således er det i situasjoner hvor medlemmer av en bestemt kategori organismer er kjent å foreligge i en prøve, mulig å anvende en enkel sonde for å bestemme veksttilstanden til organismene. Hvis f.eks. ikke noe psR-RNA. kan påvises i organismene,- er de i en ikke-voksende tilstand. Hvis psR-RNA påvises i organismene, men i liten meng.de i forhold til antallet tilstedeværende organismer, vokser organismene langsomt. Hvis store mengder psRNA påvises i forhold til tilstedeværende antall organismer, vokser organismene raskt.

Et annet prinsipp for å bestemme veksttilstanden for en bestemt organisme eller klasse av organismer er basert på anvendelse

Q

av to prøver, hvorav hver vil hybridisere bare til RNA fra en bestemt kategori av organismer, en sonde.er spesifikk for et stabilt. RNA (R-RNA eller t-RNA), hvilket RNA er tilstede i organismene i omtrent samme mengde som i ikke-voksende organismer eller celler og raskt voksende organismer eller celler og den andre sonden er spesifikk for en spesiell mRNA, psmRNA, pst-RNA, pssnRNA, hnRNA, pshnRNA eller psR-RNA sekvens eller sekvenser, hvilket RNA er sterkt utbredt i rasktvoksendé celler eller organismer, og mangler eller er. tilstede i små mengder i ikke-voksende organismer eller celler. Disse sonder anvendes for å påvise, identifisere og kvantifisere mengden som er tilstede i prøvene av RNAene hver er spesifikk for. Forholdene mellom mengdene av disse RNAer er en indikasjon

på organismenes eller cellenes veksttilstand.

Et spesifikt eksempel på dette er bruk av to sonder., - en spesifikk for RNA fra medlemmer av en bestemt kategori organismer eller celler, og.den andre spesifikk for psR-RNAet fra den samme kategori av organismer eller celler for å påvise, identifisere og kvanitifis.ere R-RNAet og psR-RNAet tilstede i prøven. Forholdet mellom mengden av psRNA til R-RNA tilstede i prøven er en indikator på organismens- eller cellenes, veksttilstand. I rasktvoksendé celler er det minst flere tusen kopier av psR-RNA og psR-RNA/R-RNA forholdet er på et maksimum. I langsomt voksende celler foreligger en relativt liten mengde psR-RNA, og psR-RNA/R-RNA forholdet er meget

.. lavere. I ikke voksende celler bør psR-RNA ikke foreligge og

psR-RNA/R-RNA forholdet er på et minimum.

Denne samme tosondemetod.en kan brukes for flere, forskjellige kombinasjoner av sonder nevnt ovenfor, og kan utføres i nærvær av organismer eller celler som ikke er medlemmer av den bestemte kategori som påvises av sonden.

En åpenbar anvendelse av metodene beskrevet her for å bestemme . veksttilstanden til bestemte kategorier av organismer er bruken av disse metoder for å: bestemme nærvær av nærvær, av antimikrobielle midler i blod,.urin, andre kroppsvæsker eller vev, eller andre prøver, bestemme sensitiviteten til bestemte, kategorier av organismer overfor spesifikke antimikrobielle midler eller grupper av slike midler. F.eks. vil bakterier som er fullstendig vekstinhibert av et spesielt middel ha et minimum psR-RNA/R—RNA forhold.

Påvisning, identifisering og kvantifisering av virus

Det er ofte viktig raskt å kunne bestemme om en bestemt virus eller gruppe virus foreligger i en prøve. Dette kan utføres ved å.anvende nukleinsyrehybridiseringsprøver som her er beskrevet.

Den raske nukleinsyrehybridiseringsprøve som kombinerer:

a) metoden for raskt å gjøre nukleinsyre tilgjengelig for hybridisering i. løsning; b) metoden for sterkt å akselerere nukleinsyrehybridiseringens hastighet; c) og den raske metode for å måle nærvær av hybridisert prøve, er direkte anvendelig'til å påvise, identifisere og kvantifisere alle grupper DNA eller RNA virus tilstede i en prøve ved bruk av en nukleinsyresonde som er komplementær til virusgruppen av interesse.

Dertil kunne en slik virusmålemetode brukes til å bestemme virkningsgraden av bestemte antivirusmidler og å bestemme nærvær av antivirusaktivitet i blod, urin og andre prøver.

Metode, for å påvise mikroorganismeinfeksjoner ved undersøkelser på organismens fagocytiske celler

Den ekstremt høye sensibilitet og- spesifisitet ved påvisning karakteristisk for nukleinsyrehybridiseringsprøver spesifikke for R-RNA som er beskrevet, ovenfor, tillater en enkel løsning på problemet med å oppnå en passende klinisk prøve for mikro-organismediagnose. En enkel blodtestprøve som inneholder den hvite blodcelle (heretter kalt' WBC) fraksjon, vil.være tilstrekkelig i svært mange tilfeller.

En måte å bruke dette WBC prinsipp på er å først hybridisere WBC prøven med en markert sonde som vil hybridisere til R-RNA fra alle medlemmer av gruppen av alle bakterier, men ikke hybridiserer til R-RNA fra noen annen kilde. En slik prøve tjener som en generell prøveanordning for alle bakterier. Prøver som er positive med hensyn til bakterielt R-RNA måles så med en samling av andre sonder for å ytterligere identifisere de foreliggende bakterier.F.eks. kan en sonde som hybridiserer til R-RNA fra alle medlemmer av familien Enterbacter, men ikke til R-RNA fra noen annen kilde brukes for å påvise eller utelukke Enterbacter, mens en spesifikk prøve bare for anaerobe R-RNA ville brukes for å påvise anaerober.

Ovennevnte illustrasjon er bare en av mange mulige måter å bruke WBCer som den primære kliniske prøve for rask diagnose av mikroorganismeinfeksjoner ved nukleinsyrehybridisering. F.eks. avhengig av pasientens kliniske symptomer ville forskjellige kombinasjoner av sonder brukes for å oppnå

en diagnose.

De nedenfor oppførte.publikasjoner er av interesse i forbindelse med forskjellige aspekter av oppfinnelsen og inngår her som en del av beskrivelsen. 1. Repeated Sequences in DNA R. J. Britten og D.E. Kohne, Science (1968) 161 s. 529

2. Kinetics pf Renaturation of DNA

J.G. Wetmur og N. Davidson, J. Mol. Biol.

(1968) 31 s. 349 3. Hydroxyapatite Techniques for Nucleic Acid,Reassociation D.E. Kohne og R.J. Britten, i Procedures in"'Nucleic Acid Research (1971), eds Cantoni og Davies, Harper and Row Vol 2, s.. 500 4. Hybridization of Denatured RNA and Small Fragments Transferred to Nitrocellulose P.S. Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. (1980) 77_ s. 5201 5..DNA-DNA Hybridization on Nitrocellulose Filters:

General Considerations and Non-Ideal Kinetics

R. Flavell et al., Wur. J. Biochem. (1974)

47 s. 53 5 ' 6. Assay of DNA-RNA Hybrids av Si Nuclease. Digestion and Adsorption to DEAE-Cellulose Filters .

I. Maxwell et al. , Nucleic' Acids Research (1978) _5_ s'-. 2033

7. Molecular Cloning: A Laboratory Manual

T. Maniatis et al. , Cold Spring Harbor Publication (1982)

8. Efficient Transeription of RNA into DNA by Avian Sarcoma Virus Polymerase

J. Taylor et al■. Biochemica et Biophys. Acta (1976) , 4 4 2 s. 3 24. 9. Use of Specific Radioactive Probes to Stusy Trans-cription and Replication of the Influenze Virus Genome' J. Taylor et al. , J. Virology (1977) 21 ^.2, s. 530 10.,Virus Detection by Nucleic Acid Hybridization: Examination of Normal and ALs Tissue for the Presence of Poliovirus D. Kohne et al., Journal of General Virology (1981) 56 s. 223-233

11. Leukemogensis by Bovine Leukemia Virus

R. Kettmann et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1982) .79 /8 s. 2465-2469

12. Prenatal Diagnosis of a Thalassemia: Clinical Application of Molecular Hybridization

Y. Kan et al. , Nev/ England Journal of Medicine

(1976) 29J5 #21 s. 1165-1167

. 13. Gene Deletions in a Thalassemia Prove that the

5' Locus is Funtional L. Pressley et al. , Proe. Nat.1. Acad, Sei. USA

(1980) J2 /6 s. 3586-3589 14. Use of . Synthetic Olig.onucleotides as Hybridization Probes. S.V. Suggs et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA -(1981) 7£! s. 6613

15. Identification of Enterotoxigenic E^_ coli by

Colony Hybridization Using 3 Ehterotoxin Gene Probes S.L. Mosely el atl., J. of Infect. Diseases (1982) 145 / s. 863

16. DNA Reassociation in the Taxonomy of Enteric Bacteria D. Brenner, Int. J. Systematic Bacteriology (1973) 23 / s. 298-307 17. Comparative study of Ribosomal RNA Cistrons in Enterobacteria and .Myxobacteria

R. Moore et al., J. Bacteriology (1967)

94. s. 1066-1074

1-8. Ribosoma! RNA■ Similarities . in the Classif ication-

of Rhodococcus and. Related Taxa M. Mordarski et al., J. General Microbiology (1980) 118 s. 313-319 19. Retention of Common Nucleotide Sequences in the Ribosomal RNA DNA of Eukaryotes and Some of their Physical Characteristics.

J. Sinclair et al. , Biochemistry (1971) 10_ s. 2761

20. Homologies Among Ribosomal RNA and Messenger

RNA Genes in Chloroplasts, Mitochondria and

E. coli'

H. Bohnert et al., Molecular and General Genetics

(1980) 1T_ 9 s. 539-545

21. Heterogeneity of the Conserved Ribosomal RNA Sequences of Bacillus subtilis

R. Doe et al., J. Bacteriology (1966)

92 / s. 88 22. Isolation and Characterization of Bacterial Ribosomal RNA Cistrons

D. Kohne, Biophysical. Journal (1968).

8 ^10 s. 1104-1118 23. Taxonomic Relations Between Archaebacteria Including 6 Novel Genera Examined by Cross Hybridization of DNAs and 16S R-RNAs

J.Tu et al. , J. Mol. Evol. -(1982) 18 s. 109

24. R-RNA Cistron Homologies Among Hypohomicrobium and Various Other Bacteria, R. Moore, Canadian J. Microbiology (1977) 23 s. 478 25. Conservation of Transfer RNA and 5S RNA Cistrons in Enterobacteriaceae

D.J. Brenner et al., J. Bacteriology Vol 129

f (Mar 1977).s. 1435

26. Sequence Homology of Mitochondrial Leucul-tNA Cistron in Different Organisms

S. Jakovcic et al., Biochemistry Vol. 14 /10

(Mai 20, 1975), s. 2037

27. Synthetic Deoxyoligonucleotides as General Probes

for Chloroplast t-RNA Genes

J.A. Nickoloff and R.B. Hallick, Nucleic Acids Research, Vol. 10 /24 (1982) s. 8191-8210

28. Antibiotics in Laboratory Medicine

V. Lorian ed, Williams and Wilkens. (Baltimore/London)

. 198 0

29. Diagnostic Microbiology

Finegold and Martin, Editors, C.V. Mosby Co.

(St. Louis) 1982

30. Spotblot: A Hybridization Assay for Specific DNA Sequences in Multiple Samples

M. Cunningham, Analytical Biochemistry

Vol. 128 (1983) s. 415

31. (29) Analysis of Repeating DNA Sequences by Reassociation

R. Britten et al., in:.Methods in Enzumology'

XXIX, side 363, Eds..Grossman and Modave,

Academic Press, New York (1974)

32. Studies on Nucleic Acid Reassociation Kinetics: Retarded Rate of Hybridiation of RNA with Excess

DNA

G.Galau et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

Vol. 7. 4 # 6 (1974) s. 2306

33. Acceleration of DNA Renaturation Rates

J. Wetmur, Biopolymers Vol. 14 (1975) s. 2517

34. Room Temperature Method for Increasing the Rate of DNA Reassociation by Many Thousandfold: The Phenol Emulsion Reassociation Technique

D. Kohne ét al., Biochemistry Vol. 16 /24 (1977)

s. 5349

35.. MolecularBiology

D. Freifelder, Science Books International (Boston) Van Nostrand Reinhold Co. (New York) 1983

36. Gene Expression 2

B. Lewin, J. Wiley & Sons, Wiley-Interscience Publication (198 0) New York

37. Gene.Expression 1

B. Lewin, J. Wiley&Sons, Wiley-Interscience Publication (1974) New York'

Slik de er brukt her i beskrivelse og krav har følgende uttrykk følgende definisjoner:

D EFINISJON- AV. UTTRYKK '

Claims (51)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av nærvær av mikroorganismer som inneholder RNA i en prøve som kan inneholde slike Organismer, karakterisert ved at man a) danner en blanding av en alikvot av denne prøve med en lysingsløsning av en lysingsblanding og en løsning av en nukleinsyresonde for å bringe nukleinsyrene i prøven sammen med en sonde omfattende markerte nukleinsyremolekyler som er komplementære til RNAet til en eller flere organismer; b) inkuberer blandingen under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av sonden, hvilket indikerer nærvær av RNA i prøven.

2. Fremgangsmåte ved påvisning av nærværet av organismer' som inneholder RNA i en prøve som kan inneholde slike organismer, karakterisert ved at man: a) danner en blanding av en alikvot av denne prøve med en lysingsløsning av en detergent eller solubiliseringsmiddel og en løsning av en nukleinsyresonde for å bringe sammen nukleinsyrene i prøven med en sonde omfattende markerte nukleinsyremolekyler som er komplementære til RNA et til en eller flere organismer; b) inkuberer blandingen under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; og c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av sonden, hvilket angir nærvær av RNA i prøven.

3. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær av cellersom inne- ■ holder virus mRNA eller psRNA i en prøve søm kan inneholde slikt RNA, karakterisert ved at man: a) danner en blanding av en alikvot av denne prøven med én lysingsløsning av en detergent eller solubiliseringsmiddel og en løsning av en nukleinsyresonde for å bringe nukleinsyrene i prøven sammen med en1sonde omfattende nukleinsyremolekyler som er komplementære bare til dette virus RNA; b) inkubere blandingen under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; og c) måle den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av sonden, hvilket angir nærværet av RNA i prøven.

4. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær av ethvert medlem, av én spesifikk gruppe organismer som inneholder RNA, i en prøve som kan inneholde slike organismer, k a r alk t e r i - sert ved at man: a) danner en blanding av en alikvot av denne prøven med en lysingsløsning av en detergent eller solubiliseringsmiddel og et proteolytisk enzym og en løsning av en nukleinsyresonde for å bringe sammen nukleinsyrene i prøven med en sonde' omfattende nukleinsyremolekyler som bare er komplementære til R-RNAet fra medlemmer av denne bestemte gruppe organismer; b) inkuberer blandingen under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; og c) måler inkuberingsblandingen med hensyn til hybridisering av sonden, hvilket angir nærværet av RNA i. prøven.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at prøven også inneholder organismer som inneholder RNA, .men ikke er medlemmer av denne bestemte gruppe.

6. Fremgangsmåte ved bestemmelse av nærvær og identifikasjon av organismer inneholdende R-RNA i en prøve som kan inneholde slike organismer, karakterisert ved at-man : a) danner en blanding av en alikvot av denne prøve med en lysingsløsning av en detergent eller solubiliseringsmiddel av. en løsning av en nukleinsyresonde for å bringe sammen nukleinsyrene i prøven med en sonde omfattende nukleinsyremolekyler som er komplementære til disse organismers R-RNA; .. b) inkuberer blandingen under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av denne sonde, hvilket angir nærværet av RNA, og hvis sondehybridisering forekommer, deretter; d) bringer nukleinsyren fra prøven sammen med et batteri av ytterligere sonder hvori hver sonde adskiller seg fra de andre ved at hver ytterligere sonde omfatter nukleinsyremolekyler som er komplementære bare til R-RNAet fra en spesifikk undergruppe av disse organismer av interesse; e) inkuberer hver ytterligere sonde-prøveblanding under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; f) måler hver ytterligere blanding med hensyn til hybridisering av den ytterligere prøve, og hvis hybridisering av en av" de ytterligere sonder opptrer, deretter; g) bringer nukleinsyren fra prøven sammen med et ytterligere batteri av sonder som adskiller seg fra hverandre ved at hver slik sonde omfatter nukleinsyremolekyler som er kom plementære bare til R-RNAet fra en forskjellig underkategori av organismer tilhørende den undergruppe av organismer hvis sonde hybridiserte til prøve R-RNAet i (f); h) inkuberer hver ytterligere sonde-prøve blanding under hybridiseringsbetingelser i en bestemt tid; i) måler hver ytterligere sonde-prøve blanding med hensyn til hybridisering av sonden; j) hvis en positiv hybridisering av en av sondene fra trinn (g) forekommer, deretter gjentar trinnene (g), (h), (i) med et batteri av spesifikke sonder, som hver er spesifikke for en forskjellig underkategori av organismer tilhørende den undergruppe av organismer som representeres ved sonden eller sondene hvilke hybridiserte i (i); og k) fortsetter med suksessive trinn ved å bringe sammen, inkubere og måle ved bruk av batterier av sonder som representerer tiltagende mindre grupper av organismer for å identifisere nærmere organismen eller organismene av interesse i prøven.

7-. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at prøven også inneholder organismer inneholdende R-RNA ..som ikke er medlemmer av gruppene representert ved batteriene- av prøver brukt til-å identifisere de ukjente organismer av interesse.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, k a r a k ivt e r i - sert v e d at multiple sonder, hvor hver av sondene er forskjellig markert og hver av sondene er spesifikke for R-RNAet fra en forskjellig gruppe organismer, samtidig bringes sammen og hybridiseres med prøvenukleinsyren i prøven, og deretter bestemmes hybridiseringen av hver forskjellig markert sonde.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,2,3,4,5,6 eller 7, karakterisert ved at man ytterligere: a) bestemmer mengden av RNA tilstede i prøven; b) sammenligner mengden med. antallet av RNA molekyler normalt-tilstede i hver enkelt organisme som således er identifi-sert for å kvantifisere organismene i prøven'.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,2,3,4,5,6 eller 7, karakterisert ved at lysningsløsningen ytterligere omfatter et salt kjent for å fremskynde hybridisering.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,2,3,4,5,6 eller 7, karakterisert ved at ih kuberingen utføres,under overskudds RNA hybridiseringsbetingelser.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1,2,3,4,5,6 eller 7, karakterisert ved at inkuberingen utføres under overskudds prøve hybridiseringsbetingelser.

13..Sonde for påvisning av nærvær av en organisme inneholdende R-RNA i en prøve som kan inneholde forskjellige organismer, karakterisert ved at sonden omfatter: et nukleinsyremolekyl inneholdende en eller flere undersekvenser som er komplementære til en eller flere undersekvenser i R-RNAet til organismen hvis nærvær i prøven skal påvises, men som ikke er komplementær til R-RNA sekvensene i de forskjellige organismer.

14. Sonde ifølge krav 13, karakterisert ved at nukleinsyremolekylet foreligger i form av en enkel DNA eller RNA streng.. v

15. Fremgangsmåte til å tilgjengeliggjøre RNA i. en organisme, celle eller virusinfisert celle for hybridisering med spesifikk komplementære nukleinsyremolekyler for å påvise, identifisere og kvanitfisere denne organisme, celle eller virus i en celle, karakterisert ved at man bringer sammen en kjent mengde av en væske eller vevs-prøve som kan inneholder RNAet, med. en løsning inneholdende et proteolytisk enzym i en forut bestemt konsentrasjon, en detergent eller et solubiliseringsmiddel i en forutbestemt konsentrasjon og en puffer ved en forut bestemt pH.

16. Fremgangsmåte for tilgjengeliggjøring av RNA i en organisme, celle eller virusinfisert celle for hybridisering med spesifikke komplementære nukleinsyremolekyler for å påvise, identifisere og kvantifisere organismen, cellene eller virusen i en celle, karakterisert ved at man: a) blander en kjent mengde av en væske eller vevsprøve som kan inneholde dette RNA sammen med en løsning inneholdende et proteolytisk enzym i en forut bestemt konsentrasjon, en detergent eller solubiliseringsmiddel ved en forutbestemt konsentrasjon og en puffer ved en forutbestemt pH; b) inkuberer den resulterende blanding ved en forutbestemt temperatur i en forut bestemt tid.

17. Fremgangsmåte ved påvisning, identifisering og kvantifisering av organismer, celler eller virus i celler, hvilken fremgangsmåte medfører hybridisering av komplementære nukleinsyremolekyler, karakterisert ved at man a), blander en prøveløsning inneholdende RNA som er tilgjengelig for hybridisering, . med et salt med en forut bestemt konsentrasjon og holder blandingen på en forut bestemt temperatur i en forut bestemt tid, idet saltkonsentrasjonen er slik at hybridiseringshastigheten akseléres.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at RNAet er gjort tilgjengelig for hybridisering ifølge fremgangsmåten i kravene 15 eller 16.

19. Fremgangsmåte ved bestemmelse, av sensitiviteten til spesifikke mikroorganismer, celler eller virus i celler overfor antimikrobielle eller antivirus midler hvor veksttilstanden til mikroorganismene, cellene eller virusene i cellene i nærvær av d'e antimikrobielle eller anitvirus midler er kjent, karakterisert ved at man a) bringer mikroorganismene, cellene eller virusene i cellene i kontakt med et eller flere antimikrobielle eller antivirale midler under vekstbetingelser; b) inkuberer den resulterende'blanding i en forut bestemt tid; og c) måler veksttilstanden til mikroorganismene, cellene eller virusene i cellene ved å bestemme gjennom genetisk sonde- • hybridiseringsteknikk nærværet av spesifikke former av RNA i disse mikroorganismer, celler eller virus i celler kjent for å tilsvare spesifikke veksttilstander.

20. Fremgangsmåte og påvisning av sensitiviteten til en spesifikk kategori mikroorganismer inneholdende R-RNA eller t-RNA overfor et eller flere antimikrobielle midler, karakterisert ved at man: a) bringer disse mikroorganismer i kontakt med et eller flere antimikrobielle midler under vekstbetingelser; b) inkuberer den resulterende blanding; c) fjerner prøver fra denne blanding ved forutbestemte intervaller etter inkubasjonens begynnelse; d) bestemmer mengden av R-RNA eller t-RNA i hver således fjernet prøve; og e) sammenligner resultatene fra trinn (d) for å bestemme om mengden av R-RNA eller t-RNA i inkuberirigsvekstbland- ingen forandrer seg i tidens løp.

21. Fremgangsmåte og påvisning av nærvær av antimikrobielle eller antivirale midler i kroppsvæsker eller vev, karakterisert ved at man a) kontakter kroppsvæsken eller vevet med mikroorganismer, celler eller virus i celler under vekstbetingelser; b) inkuberer den resulterende blanding i et forutbestemt tidsrom, og c) bestemmer veksttilstanden til disse organismer, celler eller virus i celler ved å gjennom genetiske sondehybri-diseringsteknikker bestemmer nærværet av spesifikke former av RNA i disse mikroorganismer, celler eller virus i celler kjent for å tilsvare spesifikke veksttilstander.

22. Fremgangsmåte og påvisning av nærvær og identifikasjon av organismer inneholdende RNA i en prøve som kan inneholde, slike organismer, karakterisert ved at man: a) bringer sammen nukleinsyrene i prøven med en sonde omfat tende nukleinsyremolekyler som er komplementære til en spesifikk. RNA tilstede i alle organismer av interesse ved blanding av en alikvot av denne prøven med en lysings-løsning inneholdende sonden; b) inkuberer blandingen under hybridiseringsbetingelser i et bestemt tidsrom; c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av sonden, og. hvis sondehybridisering forekommer, deretter; d) bringer sammen nukleinsyre fra prøven med et batteri av ytterligere sonder, idet hver sonde adskiller seg fra de andre ved at hver slik sonde omfatter nukleinsyremolekyler ■som bare er komplementære til en spesifikk RNA-sekvens tilstede bare i en spesifikk gruppe av organismene av interesse; e) inkuberer hver sonde-prøveblanding under hybridiseringsbetingelser i.en bestemt tid; f) måler hver blanding, med hensyn til hybridisering av hver ytterligere sonde, og hvis hybridisering av en av sondene forekommér, deretter; g) bringer nukleinsyre fra prøven sammen med et annet batteri av mere spesifikke sonder idet hver av de mere spesifikke sonder adskiller seg fra de andre ved at hver slik sonde omfatter nukleinsyremolekyler som er komplementære til en spesifikk RNA sekvens tilstede bare i en forskjellig underkategori av organismer tilhørende gruppen av organismer . hvis sonde hybridiserte til prøvens RNA i (f); h) inkuberer hver sonde-prøveblanding under hybridiseringsbetingelser i et bestemt tidsrom; i) måler hver blanding med hensyn til hybridisering av hver av de mere spesifikke sonder; j) hvis en positiv hybridisering av en av. sondene forekommer, deretter gjentar trinnene (g) , (h)., (i) , med et batteri av enda mere spesifikke sonder, idet hver er spesifikk bare for RNAet til en forskjellig underkategori av organismen tilhørende gruppen av organismer representert ved sonden eller sondene som hybridiserte i (i); og k) fortsetter med suksessive trinn ved å bringe sammen, inkubere og måle ved bruk av batterier av prøver representative for progressivt mindre grupper av organismer for å identifisere nærmere organismen eller organismene av interesse tilstede i prøven.

23. Fremgangsmåte ved fremstilling av markerte eller ikke-markerte nukleinsyremolekyler som bare hybridiserer. med RNAet fra en bestemt kategori av organismer, karakterisert ved at man: a) fremstiller markerte eller ikke-markerte nukleinsyremolekyler komplementære til RNAet til en organisme som er et medlem av denne kategori av organismer; b) bringer de markerte eller ikke markerte nukleinsyremolekyler i kontakt med RNA eller DNA fra et medlem, av gruppen av organismer evolusjonært nærmest beslektet med denne kategori av organismer under forutbesteme hybridiseringsbetingelser; c.) velger ut den fraksjon av markerte eller ikke markerte nukleinsyremolekyler som ved et spesifikt kriterium ikke hybridiserer tilR NAet fra medlemmet av gruppen organismer evolusjonært nærmest beslektet med kategorier!-av organismer; og d) markerer de utvalgte ikke markerte sondemolekyler med enten en direkte eller indirekte markør om ønsket.

24. Fremgangsmåte ved fremstilling av markerte eller ikke-markerte nukleinsyremolekyler som bare hybridiserer med RNAet fra en spesifikk kategori av organismer, karakterisert ved at man: a) kloner ved rekombinant DNA metoder en nukleinsyresekvens valgt ifølge krav 23; b) bestemmer nukleotidsekvensen til det utvalgte nukleinsyremolekyl; c) syntetiserer disse nukleinsyremolekyler; og • d) markerer det ikke markerte syntetiserte nukleinsyremolekyl om ønsket. ■

25. Fremgangsmåte ved bestemmelse av veksttilstanden til medlemmer av en spesifikk kategori organismer som inneholder RNA i en prøve inneholdende disse organismer, karakterisert ved . at man: a) bringer sammen RNAet til organismene i en del av denne prøve, og en sonde omfattende nukleinsyremolekyler komplementære bare til det ferdige R-RNA hos denne organisme, og bringer sammen en andre del av prøven med en sonde omfattende nukleinsyremolekyler komplementære bare til psR-RNA hos disse organismer; b) separat inkuberer de resulterende blandinger av RNA og sonder under forutbestemte hybridiseringsbetingelser kjent for å gi fullstendig hybridisering; c) måler de resulterende inkuberte blandinger med hensyn til hybridisering av disse sonder; og d) bestemmer de relative mengder av R-RNA og ps R-RNA tilstede i disse organismer.

26. Fremgangsmåte ifølge krav krav 25, karakterisert ved at sondene hver markeres forskjellig, og begge sonder er tilstede i en hybridiseringsblanding.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 25 eller 26, karakterisert ved at prøven har et innhold av organismer som ikke er medlemmer av denne kategori.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 25 eller 26, karakterisert ved at disse sonder er komplementære til ferdig t-RNA molekyler, mens den andre, sonde er komplementær til pst-RNA molekyler.

29. Fremgangsmåte ved påvisning av veksttilstanden til medlemmer av en spesifikk kategori av organismer eller celler som inneholder RNA, i en prøve inneholdende disse organismer, karakterisert ved at man: a) bringer. RNAet fra organismene eller cellene i denne prøven sammen med en første og andre sonde, hvilken første sonde omfatter markerte nukleinsyremolekyler komplementære bare til et medlem valgt fra gruppen bestående av spesifikk ferdig mRNA, snRNA, hnRNA, og psmRNA, pst-RNA, pssuRNA,. pshuRNA, psR-RNA fra disse organismer eller celler, idet nærvær og mengde av disse organismer har direkte sammenheng med veksthastigheten eller celledelingen til disse organismer, og den andre sonde omfatter markerte nukleinsyremolekyler komplementære til et medlem valgt fra gruppen bestående av ferdig R-RNA og t-RNA hos disse mikroorganismer eller celler; b) inkuberer de resulterende blandinger fra trinn (a), under forut bestemte hybridiseringsbetingelser^ c) måler de resulterende blandinger med hensyn til hybridisering av disse sonder; og d) bestemmer de relative mengder av disse sondespesifikke RNAer i disse organismer.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at sondene markeres med en forskjellig markør, og begge sonder er tilstede i. en eneste hybridiseringsblanding.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at prøven også har et innhold av organismer som- ikke er medlemmer av denne kategori.

32. Fremgangsmåte ved bestemmelse.av veksttilstanden til en bestemt kategori av organismer eller celler som inneholder RNA i en prøve inneholdende en kjent mend.de av slike organismer eller celler, karakterisert ved at man: a) bringer RNAet fra disse organismer i denne prøve sammen med en sonde omfattende nukleinsyremolekyler komplementære til et medlem valgt fra gruppen bestående av pssnRNA, ps R-RNA, pst-RNA, en spesifikt ferdig m-RNA, spesifikt psm RNA, et spesifikt ferdig hn RNA og spesifikt ferdig sn RNA tilstede, i disse organismer eller celler; b) inkuberer blandingen resulterende fra trinn a) under forutbestemte betingelser; c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av denne sonde; d) bestemmer mengden av sondespesifikt RNA tilstede i denne prøve og forbinder denne mengden med antall av disse tilstedeværende organismer eller celler.

33. Fremgangsmåte ved bestemmelse av veksttilstanden hos kjente medlemmer av en bestemt kategori av virus, når disse virus er tilstede i celler, karakterisert ved at man: a) bringer RNA fra disse virusholdige celler sammen 'med en sonde komplementært til et medlem valgt fra gruppen bestående av virus spesifikt t-RNA, pst-RNA, m RNA og psm RNA; b) inkuberer den resulterende blanding fra trinn a) under forutbestemte hybridiseringsbetingelser; c) måler den resulterende blanding med hensyn til hybridisering av denne sonde; d) bestemme mengden av sonde spesifikt RNA tilstede i prøven og utregner derav antallet virus tilstede i cellene.

34. Fremgangsmåte ved måling av nukleinsyrehybridiserings-blandinger, karakterisert ved at man: a) bringer en hybridiseringsinkuberingsblanding i kontakt med hydroksyapatitt under forutbestemte betingelser av hydroksyapatittkonsentrasjon, bufferkonsentrasjon, pH og temperatur; b) blander den resulterende blanding; c) infører en forutbestemt mengde av en buffer og detergent i denne blanding; d) holder den resulterende blanding fra trinn c) på en forutbestemt temperatur i en forutbestemt tid'; e) sentrifugere den resulterende blanding fra trinn d) i en forutbestemt temperatur ved en forutbestemt gravitets-kraft for å klumpe hydroksyapatitten; f) dekantere eller suger av væsken fra den sentrifugerte klump og tar var på væsken; og g) seprat analyserer de ivaretatte væsker med hensyn på nærvær av markert sonde. ■

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34, karakterisert ved at klumpen som stammer fra trinn (f) måles direkte med hensyn til nærvær av markert sonde.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven omfatter den hvite blodcellefraksjon fra fullstendig blod.

37. Fremgangsmåte for måling av veksten av spesifikke kategorier av organismer eller celler som inneholder RNA, karakterisert ved at man: a) inkuberer en prøve inneholdende disse organismer eller celler under forutbestemte vekstbetingelser; b) periodisk bringer sammen ved forutbestemte tidsintervaller etter inkuberings start, en alikvot av denne prøve og sondemolekyler komplementære til en RNA art som er tilstede bare i medlemmer av denne kategori av organismer eller celler, og hvilken øker i mengde i prøven ettersom organismene eller cellene vokser og replikerer seg; c) inkuberer hver alikvot som kommer fra trinn b) under forut bestemte hybridiseringsbetingelser; d) måler hver inkubert alikvot med hensyn på hybridisering av sonden; e) bestemmer mengden av RNA komplementært til denne sonde for hver alikvot for hvert tidsintervall, og f) bestemmer om mengden av RNA i prøven forandres med tiden.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert v ed at prøven også har et innhold av organismer som ikke er medlemmer av nevnte kategorier av organismer eller celler.

39. Fremgangsmåte ved bestemmelse av veksttilstanden til medlemmer av en bestemt kategori av organismer eller celler som inneholder RNA, karakterisert ved at man: a) , bringer en prøve inneholdende disse organismer eller celler sammen med to markerte sonder idet en av disse sonder er komplementære bare til R-RNA eller til t-RNA fra disse organismer eller celler, og de andre av disse sonder er komplementære båre til ps R-RNA eller pst-RNA sekvenser tilstede i disse organismer eller celler, eller til ps m RNA, m RNA, pshn RNA, hn RNA, pssn RNA eller sn RNA tilstede i denne kategori av organismer eller celler idet sistnevnte sekvenser øker i mengde ettersom organismene eller cellene vokser og replikerer; b) inkuberer blandingen som kommer fra trinn a) under forutbestemte hybridiseringsbetingelser; c) måler blandingen som stammer fra trinn b) med hensyn til hybridisering av disse sonder; d) bestemmer mengden av RNA komplementær til hver sonde tilstede i prøven, og e) bestemmer forholdet av RNAer.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at prøven også inneholder organismer eller celler som ikke er medlemmer av denne kategori.

41. Fremgangsmåte ifølge krav. 3 9 eller 40, karakteri sert ved at sondene er markert med den samme mar-kø r og to separate alikvotblandinger av denne prøve brukes for inkuber ing.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at sondene er markert med forskjellige markø rer og foreligger i den samme måleblanding.

43. Fremgangsmåte ved bestemmelse av sensitiviteten til bestemte kategorier av organismer eller celler inneholdende RNA overfor beétemte antimikrobielle midler eller grupper av midler, karakterisert ved at man: a) inkuberer individuelle prøver av disse organismer eller celler under forutbestemte vekstbetingelser, idet en av disse prøver foreligger i nærvær av de spesifikke antimikrobielle midler eller grupper av antimikrobielle midler og den andre av disse prøver foreligger uten disse antimikrobielle midler; b) måler hver vekstblanding ved forutbestemte tidsintervaller etter starten av inkuberingen for å påvise forandringer i mengden av RNA spesifikt overfor disse kategorier av organismer eller cellearter.

44. Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at målingen utføres ifølge krav 34 eller 35.

45. Fremgangsmåte ved bestemmelse av nærværet av antimikrobielle substanser i blod, urin, andre kroppsvæsker, vev eller andre materialer inneholdende en slik substans, karakterisert ved at man: a) inkuberer to individuelle prøver på medlemmer av spesi fikke klasser av organismer under forutbestemte vekstbetingelser, idet en av disse prøver foreligger i nærvær av og den andre av disse prøver'uten deler av blod, urin, annen kroppsvæske, vev eller andre materialer inneholdende slike substanser som også kan inneholde antimikrobielle substanser; b) måle veksten til hver av disse prø veblandinger med forut bestemte tidsrom for å påvise enhver forandring i mengden av RNA spesifikk overfor visse organismer.

46.F remgangsmåte for påvisning av virkningen av behandlingen av en prøve inneholdende et eller flere medlemmer av en bestemt kategori mikroorganismer' med et eller flere antimikrobielle midler på veksten i prøven av disse mikroorganismer, karakterisert ved at man: a) bringer prøven inneholdende disse mikroorganismer sammen med et eller flere antimikrobielle midler; og b) måler på en forutbestemt tid etter behandlingen med det antimikrobielle middel eller midlene veksttilstanden til dette medlem eller medlemmene av denne spesifikke kategori av mikroorganismer ifølge fremgangsmåten i kravene 25,26,29,30,31,32,39,40,42 eller 43.

47. Fremgangsmåte ved bestemmelse av virkningen av behandling av en prøve inneholdende et eller flere medlemmer av en bestemt kategori mikroorganismer med et eller flere anti- ■ mikrobielle midler på veksten i prøven av disse mikroorganismer, karakterisert ved at man: a) bringer prøven inneholdende disse mikroorganismer sammen med et eller flere antimikrobielle midler; b) bringer .sammen på forutbestemte tidsintervaller etter eksponering av denne prøve overfor dette antimikrobielle middel eller midlene en del av RNAet i den behandlede prøve og en nukleinsyresonde som er komplementær bare til RNA tilstede i medlemmet eller medlemmene av denne mikro-organismekategori, og hvilket RNA forandrer seg i mengde ettersom mikroorganismen eller mikroorganismene replikerer; c) inkuberer den resulterende blanding under forutbestemte hybridiseringsbetingelser; d) bestemmer mengden av RNA komplementært til sonden for hvert tidsintervall; e) bestemmer mengden av forandringer i dette RNA som opptrer med tiden etter denne behandling.

48. Fremgangsmåte ved påvisning av virkningene på vekst av virus i celler i en prøve inneholdende celler infisert med medlemmer aven bestemt kategori virus, av. behandling med et antivirus middel eller midler, karakterisert ved at man: a) bringer denne prøve inneholdende virusinfiserte celler sammen med et antimikrobielt middel eller midler; og b) med periodiske intervaller etter behandlingen med det antimikrobielle middel eller midler måler vekstgraden av denne virus i prøven ifølge trinnene c, d, e, f, i krav 3 7.

49. (nytt) Fremgangsmåte ved bestemmelse av veksttilstanden til en spesifikk kategori av virus som er infisert med celler av en organisme, karakterisert ved at man: a) bringer sammen en første prøve inneholdende RNA fra de infiserte celler med en første sonde omfattende nukleinsyremolekyler komplementære bare til ferdig mRNA i dette virus; b) bringer en andre prøve inneholdende RNA fra de infiserte celler sammen med en andre sonde omfattende nukleinsyremolekyler komplementære bare til psmRNA fra dette virus; c) separat inkuberer de resulterende blandinger under hybridiseringsbetingelser; d) måler de inkuberte blandinger med hensyn til hybridisering av de første og andre sonder; og e) måler de relative mengder av ferdig mRMA og psRNA tilstede i de infiserte celler.

50. (Nytt) Fremgangsmåte for bestemmelse av sensitiviteten overfor antimikrobielle midler hos spesifikke kategorier av mikroorganismer kjent for å være tilstede i et individ infisert med disse mikroorganismer, karakterisert ved at man: a) behandler dette individ med minst et antimikrobielt middel; og b) fjerner en prøve av.væske eller vev fra dette individ etter et passende tidsrom og direkte måler veksttilstanden for mikroorganismene tilstede i denne prøve ved fremgangsmåten ifølge krav 25,26,29,31,32,39,40 eller 42.

51. (Nytt) Fremgangsmåte ved påvisning, av sensitiviteten overfor antivirus midler hos spesifikke kategorier virus kjent for å være tilstede i et individ infisert med disse virus, karakterisert ved åt man: a) behandler dette individ med minst et antivirus middel; og b) fjerner en prøve av væske eller vev fra dette individ etter et passende tidsrom og direkte måler veksttilstanden til denne virus i denne prøven ved fremgangsmåten ifølge kravene 33 eller 49.