JP6840207B2 - マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 - Google Patents
マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6840207B2 JP6840207B2 JP2019175105A JP2019175105A JP6840207B2 JP 6840207 B2 JP6840207 B2 JP 6840207B2 JP 2019175105 A JP2019175105 A JP 2019175105A JP 2019175105 A JP2019175105 A JP 2019175105A JP 6840207 B2 JP6840207 B2 JP 6840207B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mtb
- sample
- seq
- nucleic acid
- nos
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 83
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 55
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 293
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 257
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 121
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 104
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 103
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 86
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 74
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 74
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 68
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 50
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 44
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 44
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 44
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 34
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 30
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 24
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 21
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- -1 polyoxy Polymers 0.000 claims description 12
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims 7
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims 4
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 claims 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 claims 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 98
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 95
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 48
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 47
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 44
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 17
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 101710181935 Phosphate-binding protein PstS 1 Proteins 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 9
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 8
- 230000034994 death Effects 0.000 description 8
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 8
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 8
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 8
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 2-{2-[3,4-bis(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy}ethyl dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCC(OCCO)C1OCC(OCCO)C1OCCO HMFKFHLTUCJZJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 6
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 6
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 4
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 3
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 229960005206 pyrazinamide Drugs 0.000 description 3
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N pyrazinecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RGNHAWFQWRAADF-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 RGNHAWFQWRAADF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108010059247 Hydroxypyruvate reductase Proteins 0.000 description 2
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 241001312372 Mycobacterium canettii Species 0.000 description 2
- 101150047146 PAB gene Proteins 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088758 23kDa protein Proteins 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMOWNVWFJIUDIB-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethyl)naphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CC=CC2=C1N UMOWNVWFJIUDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 6,7-dihydro-3h-purin-2-amine Chemical compound C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 PGSPUKDWUHBDKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 101100291912 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) mpb64 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000211133 Mycobacterium caprae Species 0.000 description 1
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108700043532 RpoB Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013584 assay control Substances 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150086609 groEL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000012905 visible particle Substances 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
MTBの検出に有用な組成物および方法が本明細書に提供される。特に、特異的および高感度で試料中のMTBを検出する、核酸増幅および検出手段のためのキット、試薬、反応混合物およびそれらに関連する方法が本明細書に提供される。このような組成物および方法は、喀痰、気管支肺胞洗浄液(BAL)ならびに喀痰およびBAL試料のN−アセチル−L−システイン(NACL)−NaOH沈殿物のような異なるヒト試料中のMTB複合体を検出するためのプライマー、プローブ、プライマーセット、プライマーとプローブのセットおよび方法を含む。
ポリヌクレオチドは、試験試料中のMTBを増幅および/または検出するためのプライマーまたはプローブとして使用され得る。本明細書に提供されるプライマー/プローブセットは、少なくとも2つのプライマーおよび少なくとも1つのプローブを含む。これらのプライマー/プローブセットは核酸増幅技術に従って利用され得る。したがって、任意の特定のプライマー/プローブセットにおけるプライマーが標的配列を増幅させるために利用され得る。ほとんどの場合、プローブは、1つ以上のプライマーによって生成された標的配列のコピーにハイブリダイズし、一般に、増幅反応の過程の間に生成された標的配列の任意のコピーの検出を容易にする。プライマー/プローブセットの全ては、適切なプライマーおよびプローブが組み合わされる場合、MTBを特異的および高感度で検出するための核酸増幅手段に従って利用され得る。または、本明細書に提供されるプライマー/プローブセットの個々のプライマーおよびプローブは、代替的に本明細書に提供されるプライマー/プローブセットに記載されているもの以外のプライマーおよび/またはプローブと組み合わせて使用されてもよいことが意図される。いくつかの実施形態において、2つのプライマーおよびプローブセットが2つの異なるMTB標的配列を検出するために利用される。
1.MTB内部対照(4つのバイアル、1つのバイアル当たり0.4mL)、キャリアDNAを有する緩衝液中の0.01%未満の非感染性線状DNAプラスミド。
防腐剤:アジ化ナトリウムおよび0.15%のProClin(登録商標)950。
例示的なアッセイワークフロー
この実施例は、試料中のMTBを検出するためのリアルタイムPCRを行うための特定の効果的な手法を記載している。いくつかの実施形態において、リアルタイムPCR法は以下のステップを含み、または以下からなる:
1.不活性化試薬(IR)を使用した試料(例えば、喀痰、気管支肺胞洗浄液[BAL]ならびに喀痰およびBALのN−アセチル−L−システイン[NALC]沈殿物)におけるMTBの不活性化。いくつかの実施形態において、不活性化試薬は、イソプロパノール、水酸化ナトリウム、TWEEN(登録商標)−20および水を含み、またはそれらからなる。
2.DNAが試薬を使用して不活性化した試料から抽出される、試料調製;試料調製は自動m2000sp機器(Abbott Molecular)を使用して実施され、または手動で実施される。
3.精製された試料およびアッセイPCR成分が96ウェル光学反応プレートまたは他のマルチチャンバ反応支持体に一緒に加えられる、PCRアセンブリ;これはm2000spを使用して実施され、または手動で実施される。
4.96ウェル光学反応プレートの手動密閉およびm2000rt機器へのプレートの移送。
5.自動m2000rt機器を使用したPCR産物の増幅および検出;患者の結果はm2000rtワークステーションに自動的に報告される。このワークフローの図式的概要は図1に示されている。
標的選択およびプライマー/プローブ設計
いくつかの実施形態において、二重標的戦略がMTB複合体を検出するために利用される。2つの標的には挿入配列(IS)6110およびタンパク質抗原B(PAB)が含まれる。以下の表1を参照のこと:
試料不活性化
この実施例は試料不活性化ステップを行うための例示的な試薬および方法を記載している。
利用した材料:
・ポリプロピレンまたはガラス容器
・10M NaOH
・イソプロパノール
・TWEEN(登録商標)−20
・精製水
IRの調製:
500mLに必要な材料の体積
10M NaOH 20mL
精製水 179.1mL
イソプロパノール 300mL
TWEEN(登録商標)−20 0.9mL
1. 179.1mLの水を空のポリプロピレンまたはガラス容器(ポリスチレン容器の使用は避ける)に添加する。
2. 0.9mLのTWEEN(登録商標)−20を容器に添加する。
3. 20mLの10M NaOHを容器に添加する。
4. 300mLのイソプロパノールを容器に添加する。
5. 成分を20回反転させて混合する。
使用または最大1ヶ月間周囲温度にて保存。
1. 凍結した場合、検体を15から30℃にて解凍する。
2. 不活性化する検体の体積を推定する。
3. 1:3の比(例えば、1mLの検体+3mLのIR)(好ましい検体体積は0.3から10mLである。)にてIRを添加する。
4. 容器を反転させてIRと検体との間の接触を確実にする。
5. 混合物を20から30秒間ボルテックスする。
6. 混合物を周囲温度にて少なくとも1時間、好ましくは24時間以下の間インキュベートする。混合物をインキュベーション期間内の20から30分にて20から30秒間、最後に1回ボルテックスする。
試料調製法:
実施例1のMTBアッセイは、喀痰、BALおよび喀痰またはBAL試料のNACL−NaOH沈殿物を処理するためにAbbott自動m2000sp機器を使用し、または手動による方法を使用し、増幅および検出のためにAbbott自動m2000rt機器を使用する。両方のプロセスは試料からのDNA抽出を必要とし、両方のDNA精製はAbbott mSample Preparation SystemDNAからのDNA GPR(リスト6K12−24)試料調製試薬を使用して実施される。
96ウェル光学反応プレートにおけるPCR反応アセンブリ(手動またはm2000spによるいずれか)の後、96ウェルプレートを手動で密閉し、m2000rtに移して増幅およびリアルタイム蛍光検出反応を実施する。患者の結果はm2000rtワークステーションにおいて自動的に報告される。MTBアッセイは、試料の有効性対照、試料抽出および増幅効率の対照として内部対照核酸配列を検出する。表4は例示的なPCRサイクリング条件を提供する。
1.96個のIR処理した試料を1回の実行ごとに実施する。1つの陰性対照および1つの陽性対照が各実行に含まれ、したがって最大で94個のIR処理した試料を1回の実行ごとに処理することができる。
1.増幅試薬を15から30℃または2から8℃にて解凍する。このステップは試料調製手段の完了前に開始することができる。
実験データ−不活性化
IR TB死滅効果を評価した。この実験において、MTB含有試料(不活性化前に既知のMTB濃度に希釈した培養MTBおよびMTB含有NALC−NaOH沈殿物)を実施例3の不活性化手段に供した。不活性化後、過剰の不活性化試薬を遠心分離/洗浄によって除去し、生存細胞を最大42日または6週間MGIT培養物に入れた。この期間はMTB培養に推奨される最も長い時間であり、ほとんどのMTB陽性検体は、培養の開始から20日以内に検出可能な培養物の増殖を生じる)。以下の表5は不活性化後、培養試料を試験したときに得られた結果を示す。不活性化していないMTBからなる陽性対照(PC)は、予想される20日のタイムフレーム内に増殖を実証したが、陰性対照(NC)は増殖を示さなかった。
分析的包括性
MTB複合体の8種の亜種および20個の試料(M.ツベルクロシス、M.アフリカヌム(M.africanum)、M.ボビス(M.bovis)、M.ボビスBCG(M.bovis BCG)、M.カネッティ(M.canettii)、M.ミクロティ(M.microti)、M.カプラエ(M.caprae)、M.ピンニペディ(M.pinnipedii.))をATCCから得(M.カネッティはPublic Health Research Instituteから受け取った。)、10から100個のゲノムDNAコピー/反応を試験した(表6を参照のこと)。8種全ての亜種を両方のレベルにおいて検出した。
分析的特異性
1e5から1e7個のゲノム/mLの標的濃度における異なるマイコバクテリア、ウイルスおよび他の微生物(n=80)ならびに1×106cfu/mLにおける培養微生物から精製した核酸をMTB陰性対照に添加して、MTB陰性検体についてのMTBアッセイの結果に対する潜在的交差反応物の効果を評価した。1×106から1×107個のゲノム/ミリリットルの標的濃度における異なるマイコバクテリア、ウイルスおよび他の微生物ならびに1e6cfu/mLにおける培養微生物から精製した核酸をMTB陽性試料に添加して、MTB陽性検体についてのMTBアッセイ結果に対する潜在的交差反応物の効果を評価した。陰性対照における熱不活性化したMTB細胞ストックを1000個のコピー/mL(ゲノムDNA曲線を使用して定量した)の標的濃度に希釈することによってMTB陽性試料を調製した。潜在的交差反応により試験したMTB陰性試料はどれも検出されなかった。潜在的交差反応により試験した80個全てのMTB陽性試料は検出された。
分析的感度
40cfu/mLにおけるMTBパネル、株H37Rvを、プールしたMTB陰性喀痰において連続希釈して感度パネルを生成した。各希釈液について16個の複製を試験した。160倍以下の全ての希釈において100%の検出率を観察した。結果を表8に示す。
臨床的特異性
培養陰性NACL試料(n=155)、喀痰(n=23)およびBAL(n=28)試料(NACL試料はMTBの疑いのある集団に由来した。喀痰およびBAL試料はTB症状を有さない患者に由来した。)を試験して臨床的特異性を決定した(以下の表10にまとめたデータを参照のこと)。喀痰およびBAL試料に対する特異性は100%であった。NALC試料に対する特異性は98.7%であり、全体の特異性は99%であった。
MTBアッセイの分析的および臨床的性能
この実施例はリアルタイムMTB検出アッセイの分析性能を記載している。
リアルタイムMTBアッセイについてのワークフローは図1に記載している。
以下の成分:20mLの10M NaOH、300mLのイソプロパノール、0.9mLのTween(登録商標)−20および179.1mLの精製水を組み合わせることによって500mLの不活性化試薬(IR)を調製した。調製すると、IRは室温にて最大1ヶ月間安定であった。凍結した場合、検体(未処理の検体または処理したNALC沈殿物)を15°から30℃にて解凍した。およそ3体積のIRを各体積の試料に添加した(最小の許容可能な検体体積は0.3mLである。)。試料の種類(未処理またはNALC沈殿物)に関係なく同じ体積比の試料:IRを維持した。最初の時間の室温のインキュベーションの間、混合物を各々20から30秒間で2回ボルテックスした。有効なインキュベーション時間は1から24時間であった。不活性化プロセスはバイオフード下で行った。完了すると、不活性化した試料をバイオフード下から取り除き、次いでバイオフードの外側で試料調製に供した。不活性化プロセスは、喀痰のNALC沈殿物に添加した培養MTB、MTB陽性臨床NALC沈殿物およびMTB塗抹/培養陽性喀痰試料を使用して3つの異なる実験室にてMTB生存率を効果的に減少させることが実証された(Qi C.ら、Effectiveness of the sample inactivation procedure employed by the new Abbott RealTime assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis、24th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) 2014年)。
IR処理した検体およびアッセイ対照をm2000sp機器上にロードし、そこで、グアニジニウムチオシアネート−磁性微粒子技術を使用してDNAを分離して核酸を捕捉し、続いて洗浄して未結合の成分を除去した。試料調製の開始時に内部対照(IC)を添加した。結合した核酸を溶出し、96ディープウェルプレートに移送した。試料調製の完了時に、m2000spを使用して、AmpliTaq Gold Polymerase、塩化マグネシウム活性化試薬ならびにプライマー、プローブおよびdNTPを含有するオリゴヌクレオチド試薬からなる増幅マスターミックスを作製した。m2000spを使用して、マスターミックスの25μlアリコート、続いて抽出した溶出液の25μlアリコートを96ウェル光学反応プレートに分注した。プレートを手動で密閉し、リアルタイムPCRのためにm2000rtに移送した。m2000spの代替として、試料調製、マスターミックス調製およびPCRプレートセットアップを手動で行うことができる。
m2000rt機器を増幅およびリアルタイム蛍光検出のために使用した。MTB複合体メンバーの検出(Warren RMら、Int J Tuberc Lung Dis 2006年;10巻:818−822頁)を2セットのプライマー;挿入エレメントIS6110を標的とするもの(Thierry Dら、Nucleic Acids Res 1990年;18巻:188頁)およびPAB遺伝子を標的とするもの(Anderson AB、Hansen EB Infect Immun 1989年;57巻:2481−2488頁)の使用によって達成した。MTB複合体検出のための信号は、蛍光標識したプローブの使用により生成した。MTB二重標的プローブは各々、5’末端においてフルオロフォアFAMおよび3’末端においてブラックホールクエンチャー(BHQ1)により標識する。したがって、IS6110およびPABの両方からのMTB信号を同じFAMチャネルにおいて検出する。FAM蛍光信号を検出する増幅サイクルは、元の試料中に存在するMTB DNA濃度の対数に比例する。内部対照(IC)についてのプローブを、ICおよび標的信号を単一のPCRウェルにおいて区別することができるように5’においてQuasarおよび3’末端においてブラックホールクエンチャーBHQ2により標識する。
最低でも陰性対照の1つの複製および陽性対照の1つの複製を使用して実行の妥当性を決定した。陰性対照はTE緩衝液および防腐剤からなった。陽性対照は、1.5g/mLのポリdA:dTおよび防腐剤を有するTE緩衝液中で希釈したIS6110およびPAB標的配列の両方を含有するプラスミドDNAからなった。ICは、1.5g/mLのポリdA:dTおよび防腐剤を有するTE緩衝液中で希釈したカボチャヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HPR)配列挿入物を含有するプラスミドDNAからなった。試料調製の開始時にICを添加し、これは、試料調製物回収、試料阻害および増幅効率についての対照として役立つ。ICは不活性化手段についての対照ではなかった。各試料と実行対照との間のIC閾値サイクル(Ct)値の差を使用して、各試料の結果の妥当性を評価した。
MTB複合体亜種:19個のMTB複合体亜種DNA試料はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC、Manassas、VA)から得、1個(M.カネッティ)は親切にもIbis Biosciences(Carlsbad、CA)によって与えられた。M.アフリカヌム25420、M.アフリカヌム35711、M.ボビス35735、M.ボビス19274、M.ボビスBCG 35746、M.ボビスBCG 35747D、M.カネッティ、M.カプラエBAA−824D、M.ミクロティ11152、M.ミクロティ19422、M.ピンニペディBAA−688D、MTB 25177D−5(H37Ra)、MTB 25618D−5(H37Rv)、MTB BAA−2236D、MTB BAA−2237D、MTB 27294D、MTB BAA−2234D、MTB 35822D、MTB 35838D、MTB BAA−2235Dを含む合計20個のMTB複合体株を試験した。さらに、3つの主要な遺伝子群および9つの遺伝子クラスターを含むMTB亜種の46個の株は、University of Medicine and Dentistry New Jersey(Newark、NJ)のDr.Barry Kreiswirthから得た(Mathema Bら、Current Insights、Clinical Microbiology Reviews 2006年;19巻:658−685頁)。ATCCおよびIbisから得た20種のMTB複合体亜種のDNAを、PicoGreen(登録商標)NanoDrop法によって決定されているように、報告されたDNA濃度を使用して直接試験した。他の46のDNA濃度は、3個の試料(このような測定は少ない体積および不純物に起因して得ることができなかった。)を除いてAbbott MolecularにおいてPicoGreen(登録商標)NanoDrop測定を使用して決定した。これらの3個の試料は1:600の試料対水の比にて希釈し、直接試験した。
MTB複合体亜種検出
この試験は、MTBアッセイに使用される特異的プライマーおよびプローブが、以下の8種のMTB複合体亜種:M.アフリカヌム、M.ボビス、M.ボビスBCG、M.カネッティ、M.カプラエ、M.ミクロッティ、M.ピンニペディおよびM.ツベルクロシスを検出するかどうかを決定するために行った。2セットの精製したMTB複合体DNAを試験した。第1のセットの20個の精製したDNAは代表的な前述のMTB亜種を含有した。各々の精製したDNAを2つの濃度(100および10個のゲノム/反応)にて試験し、1つの濃度につき4つの複製を試験した。1つの反応レベルにつき100個のMTBゲノムにおいて、20個のMTB株の各々の4個の全ての複製を検出した。1つの反応レベルにつき10個のMTBゲノムにおいて、17個の株の4個の全ての複製を検出した。3個の株(2個のM.ボビスおよび1個のM.ボビスBCG)について、4個の複製のうち2個を検出した(図4)。MTB亜種由来の46個のMTB株の第2のセットを2つの濃度:100個のゲノム/反応および25個のゲノム/反応にて試験した。各DNAの4つの複製を各濃度にて試験した。試験した複製の全ては両方の濃度にて陽性であった(図2)。
9つのレベルの希釈系列を、ガラスビーズで均質化した喀痰プール中で希釈したMTB株H37Rv細胞から作製した。希釈系列におけるパネルメンバーを以下の濃度:80cfu/mL、50cfu/mL、25cfu/mL、10cfu/mL、5cfu/mL、1cfu/mL、0.50cfu/mL、0.10cfu/mLおよび0.05cfu/mLに標的化した。各パネルメンバーの20個の複製を、AbbottリアルタイムMTBアッセイを使用して4回の実行にわたって試験した。この試験はMTBアッセイの1つのロットおよび対照試薬を使用して行った。この試験についての有意水準は0.05であった。各標的濃度について検出率を計算した(表11)。プロビット回帰モデルを、独立変数として標的濃度(X)および応答変数として検出率P(Y=1)により、SASにおけるPROC PROBITを使用して標的濃度および検出率に基づいて適合した。データのプロビット分析により、95%の確率で検出したMTBの濃度は2.45cfu/mL(95%CI 1.44−6.10cfu/mL)であることを決定した。AbbottリアルタイムMTBアッセイの主張されている分析的感度は、MTB H37Rv株を使用してプールした均質化した喀痰において17cfu/mLである。
80個の潜在的交差反応物の各々をMTB陽性試料およびMTB陰性試料の両方において試験した。1×105から1×107個のコピーまたはゲノム/mLの標的化濃度にて各々の潜在的に交差反応しているマイコバクテリウム、ウイルスまたは他の微生物由来の核酸をMTB陽性試料(1,000個のMTBゲノム/mLを含有する)およびMTB陰性試料に添加した。1×106cfu/mLの標的濃度にて培養した微生物をMTB陽性試料およびMTB陰性試料に添加した。80個全ての陰性試料についてのアッセイ結果を、「MTB非検出」と報告した。80個全てのMTB含有試料についてのアッセイ結果を、「MTB検出」と報告した(表7)。
試験結果における干渉についての可能性を、呼吸器系に存在し得る物質により評価した。MTB陰性およびMTB陽性(500個のコピー/mL)試料を、レベルを高めたウシ粘液、血液、ヒト細胞由来のDNA、胃酸、高張食塩水、生理食塩水、培養培地、NALCペレット材料および5種の抗TB薬(イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン、ピラジナミド、エタンブトール)を有する各々の潜在的干渉物質の非存在下または存在下で試験した(表12)。結果は、高レベルの血液、ヒト細胞由来のDNA、胃酸、高張食塩水、生理食塩水、培養培地、NALCペレット材料および5種の抗TB薬(イソニアジド、リファンピシン、ストレプトマイシン、ピラジナミド、エタンブトール)の存在下でMTBアッセイの性能の干渉を示さなかった。AbbottリアルタイムMTBアッセイの干渉は、ウシ粘液の存在下で8.3%(5個全ての複製は偽陰性であり、または阻害された。)および5.0%(5つの複製のうちの1つは偽陰性であった。)にて観察された。2.5%以下のウシ粘液濃度にて干渉は見られなかった。
AbbottリアルタイムMTBアッセイを使用する場合、高陽性MTB試料から陰性試料までのキャリーオーバーの可能性を評価するために、各々96個の試料(陽性対照、陰性対照、1×107個のコピー/mLにて46個の高陽性試料および46個の陰性試料)からなる5回のm2000システムを実行し、高陽性試料が陰性試料の中に散在していた。1×107個のコピー/mLの高陽性試料におけるMTB濃度は、MTBアッセイにより試験したMTB陽性集団の検体から得られた結果の95%以上より早いCt値をもたらした。このアッセイは、5回の実行において高陽性試料から230個の陰性試料までのキャリーオーバーを全く示さなかった。96回の試料実行は8時間未満で完了した。
再現性試験を実施して、m2000システムにおいてAbbottリアルタイムMTBアッセイの再現性およびAbbott m2000sp機器と手動の試料調製法との間の適合性を評価した。この試験は、主張しているLODレベルの3倍の陽性パネルおよび陰性パネルにより実施した。この試験はMTB増幅試薬の2つのロットを使用して4人の操作者によって行った:実施した2人の操作者はAbbott m2000sp機器を使用して実行し、実施した2人の操作者は手動の試料調製を使用して実行した。各々の試料調製法について、2人の操作者の各々は、AbbottリアルタイムMTB増幅試薬の1つの特有のロットを使用し、1つのパネルメンバー当たり、5日間で1日1回、8個の複製、合計40個の複製について各々のパネルメンバーを試験した(1つの方法につき1つのパネルメンバー当たり合計80個の複製;m2000sp機器試料調製により合計160個を試験し、手動試料調製により合計160個を試験した。)。予想される結果との全体の一致は、Abbott m2000sp機器または手動試料調製により調製した試料について98.1%のより低い95%CIで100%であった(159/159、1つの試料は機器のエラーのために無効であった。)。MTBアッセイは、Abbott m2000sp機器およびAbbott手動試料調製法の両方と適合する。
582人のTBの疑いのある患者の各々からの1つの喀痰または1つのNALC沈殿物を試験した。試料は、ロシア、南アフリカ、ウガンダ、米国およびベトナムから収集した。1つのアリコートでMTBならびに2番目のアリコートで塗抹および培養物の試験を可能にするように各検体を分割した。試験試料を盲目にし、最終結果のデコーディングをAM統計群によって実施した。MTB試験について、2つの検体は無効なIC結果を生じ、さらなる4つの検体の結果はm2000エラーコードを与えた。阻害によって測定した無効な結果を有する臨床検体の頻度は0.3%(2/582)であり、一方、阻害および機器のエラーの両方を含む無効率は1.0%(6/582)であった。本明細書に記載されているMTBアッセイおよび市販のMTB NAATの両方によって陽性であった5個の培養陰性検体は分析から除外した。合計571個の有効な試料をデータ分析のために含んだ。培養物に対する全体のMTB感度は93%(198/212)であった。アッセイ感度は塗抹陽性、培養陽性検体において99%(147/149)であり、塗抹陰性、培養陽性試料において81%(51/63)であった。特異性は97%(348/359)であった(表13)。MTB陰性試料のうちの76個は非結核性マイコバクテリア(NTM)を含んでいた。これらのうち、38個はMAC(M.アビウム複合体)であり、7個はM.ゴルドネであり、5個はM.カンサシであり、5個はM.ケロネー/アブセサスであり、3個はM.キセノピであり、18個は他のマイコバクテリ種を含んでいた。本明細書に記載されているMTBアッセイにより、NTM試料結果の全ては、40のアッセイカットオフと比較して遅いCN(>38)値を有する「MTB検出」結果を生じた2つの試料を除いて「MTB非検出」であった。NTM集団の試験から得られた97%の特異性値は、非NTM集団を試験したときに観察された特異性と同様である。さらに米国集団内から採取した500人の非TBと思われる患者の喀痰試料は100%のTB陰性試験結果を示した。
不活性化試薬
この実施例は、MTB検出アッセイにおける使用のための不活性化試薬を記載している。このアッセイは、呼吸器検体(喀痰、気管支肺胞洗浄液(BAL)ならびに喀痰および気管支肺胞洗浄液(BAL)のN−アセチル−L−システイン(NALC)沈殿物中のMTB複合体DNAを検出するためのNAATである。バイオセーフティーキャビネットの外側で試料の安全な試験を可能にするために、粘性試料を液化し、MTB生存率を低下させるための試料不活性化試薬および手段を開発した。この試験は、試料不活性化手段の効果を評価し、不活性化試薬(IR)の安定性を決定することであった。
Claims (20)
- 生体試料中のマイコバクテリウム・ツベルクロシス(MTB)核酸を識別する方法であって、
a)前記生体試料を、不活性化試薬により不活性化して、不活性化試料を生成するステップと、
b)前記不活性化試料からDNAを抽出するステップと、
c)前記DNAを、配列番号1及び2のプライマー対、並びに配列番号3及び4のプライマー対、配列番号5及び6の核酸プローブ、配列番号7及び8のプライマー対、並びに配列番号9の核酸プローブに接触させるステップと、
d)増幅アッセイを行って、一又は複数のMTB核酸標的を増幅するステップと、
e)前記試料中の前記MTB核酸標的の存在を識別するステップと
を含む、方法。 - 前記試料が、喀痰である、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、気管支肺胞洗浄液(BAL)である、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、喀痰のBALのN−アセチル−L−システイン(NALC)の沈殿物である、請求項1に記載の方法。
- 前記不活性化試薬が、水、洗浄剤、アルコール、及びNaOHを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記不活性化試薬が、水、イソプロパノール、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、及びNaOHを含む、請求項1に記載の方法。
- プライマー及びプローブのうちの一又は複数が、標識を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 標識が、フルオロフォアを含む、請求項7に記載の方法。
- 標識が、フルオロフォア/クエンチャー対を含む、請求項7に記載の方法。
- 増幅アッセイが、リアルタイムPCRアッセイである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料を、配列番号10〜12、配列番号13〜15、配列番号16〜18、配列番号19〜21、配列番号22〜24、配列番号25〜27、配列番号28〜30、配列番号31〜33、及び配列番号34〜36からなる群から選択される一又は複数のプライマー及びプローブセットに接触させるステップをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料を、グアニジニウムチオシアネート及び磁性微粒子に接触させるステップをさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- a)配列番号1及び2、配列番号3及び4のプライマー対、配列番号5及び6の核酸プローブ、配列番号7及び8のプライマー対、並びに配列番号9の核酸プローブと、
b)核酸増幅反応を行うための少なくとも1つの不活性化試薬と
を含み、前記不活性化試薬が、水、洗浄剤、アルコール、及びNaOHを含む、又は、イソプロパノール、水酸化ナトリウム、ポリオキシエチレン(20)、ソルビタンモノラウレート、及び水を含む、キット。 - プライマー及びプローブのうちの一又は複数が、標識を含む、請求項13に記載のキット。
- 標識が、フルオロフォアを含む、請求項14に記載のキット。
- 標識が、フルオロフォア/クエンチャー対を含む、請求項15に記載のキット。
- 配列番号10〜36からなる群から選択される一又は複数の核酸配列をさらに含む、請求項13に記載のキット。
- グアニジニウムチオシアネートをさらに含む、請求項13に記載のキット。
- 磁性微粒子をさらに含む、請求項13に記載のキット。
- リアルタイムPCRのための一又は複数の試薬をさらに含む、請求項13に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462028527P | 2014-07-24 | 2014-07-24 | |
US62/028,527 | 2014-07-24 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017503844A Division JP6596066B2 (ja) | 2014-07-24 | 2015-07-07 | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020010714A JP2020010714A (ja) | 2020-01-23 |
JP6840207B2 true JP6840207B2 (ja) | 2021-03-10 |
Family
ID=55163935
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017503844A Active JP6596066B2 (ja) | 2014-07-24 | 2015-07-07 | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
JP2019175105A Active JP6840207B2 (ja) | 2014-07-24 | 2019-09-26 | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017503844A Active JP6596066B2 (ja) | 2014-07-24 | 2015-07-07 | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10072306B2 (ja) |
EP (4) | EP3578668B1 (ja) |
JP (2) | JP6596066B2 (ja) |
CN (2) | CN113652492A (ja) |
AP (1) | AP2017009731A0 (ja) |
BR (1) | BR112017001500A2 (ja) |
CA (1) | CA2955771C (ja) |
ES (3) | ES2752761T3 (ja) |
MX (1) | MX2017001134A (ja) |
RU (1) | RU2697502C2 (ja) |
WO (1) | WO2016014240A2 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113652492A (zh) | 2014-07-24 | 2021-11-16 | 雅培分子公司 | 用于检测和分析结核分枝杆菌的组合物和方法 |
WO2017011565A1 (en) * | 2015-07-14 | 2017-01-19 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis |
EP3501282A1 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Composition for processing a sputum sample |
JP7550055B2 (ja) * | 2018-11-13 | 2024-09-12 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | マイクロ流体デバイスを備える分析システムとマイクロ流体デバイスと関連方法 |
KR102368506B1 (ko) * | 2019-11-12 | 2022-02-28 | 에이비아이(주) | 결핵균과 비결핵 항산균 검출을 위한 객담의 전처리 조성물과 그 방법 및 프라이머와 프로브, 이를 이용한 장치 |
Family Cites Families (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
ATE124999T1 (de) | 1985-03-15 | 1995-07-15 | Antivirals Inc | Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren. |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5283174A (en) | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5491224A (en) | 1990-09-20 | 1996-02-13 | Bittner; Michael L. | Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture |
US5168039A (en) * | 1990-09-28 | 1992-12-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Repetitive DNA sequence specific for mycobacterium tuberculosis to be used for the diagnosis of tuberculosis |
DK51092D0 (da) | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
US5424414A (en) | 1991-12-17 | 1995-06-13 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for 3-phenyl-1-adamantaneacetic acids |
US5464746A (en) | 1991-12-17 | 1995-11-07 | Abbott Laboratories | Haptens, tracers, immunogens and antibodies for carbazole and dibenzofuran derivatives |
CA2119188A1 (en) * | 1993-04-05 | 1994-10-06 | Patricia A. Spears | Detection and identification of mycobacteria |
US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US5714330A (en) | 1994-04-04 | 1998-02-03 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
US5631130A (en) | 1994-05-13 | 1997-05-20 | Abbott Laboratories | Materials and methods for the detection of Mycobacterium tuberculosis |
CA2126952C (en) | 1994-06-28 | 2010-12-14 | Sithian Pandian | Probe, kit, and method of amplification for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
EP0777749B1 (en) | 1994-08-19 | 2002-10-30 | PE Corporation (NY) | Coupled amplification and ligation method |
US5695934A (en) | 1994-10-13 | 1997-12-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides |
US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
US6218529B1 (en) | 1995-07-31 | 2001-04-17 | Urocor, Inc. | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer |
CA2252048C (en) | 1996-04-12 | 2008-03-11 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detection probes, kits and assays |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
US6969488B2 (en) | 1998-05-22 | 2005-11-29 | Solexa, Inc. | System and apparatus for sequential processing of analytes |
US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
US6511803B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
JP2001519538A (ja) | 1997-10-10 | 2001-10-23 | プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 核酸アレイのレプリカ増幅 |
US6787308B2 (en) | 1998-07-30 | 2004-09-07 | Solexa Ltd. | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
US8143386B2 (en) | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
US7501245B2 (en) | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
US6818395B1 (en) | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
WO2001023610A2 (en) | 1999-09-29 | 2001-04-05 | Solexa Ltd. | Polynucleotide sequencing |
US6642000B1 (en) | 1999-11-12 | 2003-11-04 | University Of Chicago | PCR amplification on microarrays of gel immobilized oligonucleotides |
CA2415897A1 (en) | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Susan H. Hardin | Real-time sequence determination |
US7668697B2 (en) | 2006-02-06 | 2010-02-23 | Andrei Volkov | Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level |
US20110111389A1 (en) | 2001-11-07 | 2011-05-12 | Diagcor Bioscience Incorporation Limited | Rapid genotyping analysis for human papillomavirus and the device thereof |
PT1338657E (pt) * | 2002-02-25 | 2007-06-21 | Pasteur Institut | Sequências especificamente deletadas do genoma de mycobacterium tuberculosis e o seu uso em diagnóstico e como vacinas. |
AU2004209426B2 (en) | 2003-01-29 | 2008-04-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method for preparing single-stranded DNA libraries |
US20080153084A1 (en) | 2003-07-29 | 2008-06-26 | Universite Laval | Obesity Markers And Uses Thereof |
US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
RU2338789C2 (ru) * | 2003-12-09 | 2008-11-20 | Каунсил Оф Сайентифик Энд Индастриал Рисерч | Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах |
GB0403039D0 (en) | 2004-02-11 | 2004-03-17 | Health Prot Agency | TB resistance assay |
JP4905130B2 (ja) * | 2004-04-26 | 2012-03-28 | 和光純薬工業株式会社 | 結核菌検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたヒト型結核菌の検出方法 |
US7482120B2 (en) | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
EP2230316A1 (en) | 2005-02-01 | 2010-09-22 | AB Advanced Genetic Analysis Corporation | Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension |
RU2376387C2 (ru) | 2005-12-26 | 2009-12-20 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций в днк микобактерий, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, на биологических микрочипах, набор праймеров, биочип и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе |
JP5178528B2 (ja) | 2005-12-29 | 2013-04-10 | アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド | 分子診断用増幅システムおよび方法 |
US7282337B1 (en) | 2006-04-14 | 2007-10-16 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing |
JPWO2007141912A1 (ja) | 2006-06-07 | 2009-10-15 | 住友ベークライト株式会社 | Rna検出方法 |
US20080241951A1 (en) | 2006-07-20 | 2008-10-02 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Method and apparatus for moving stage detection of single molecular events |
US8652782B2 (en) * | 2006-09-12 | 2014-02-18 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids |
CA2668100C (en) * | 2006-11-01 | 2014-12-23 | Immport Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunodominant antigens |
US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
EP2677309B9 (en) | 2006-12-14 | 2014-11-19 | Life Technologies Corporation | Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range |
ES2659145T3 (es) * | 2007-04-13 | 2018-03-14 | Abbott Molecular Inc. | Secuencia de cebador y sonda para detectar Chlamydia trachomatis |
US20100273854A1 (en) * | 2007-06-15 | 2010-10-28 | Hagar Kalinski | Compositions and methods for inhibiting nadph oxidase expression |
KR101685208B1 (ko) | 2007-06-19 | 2016-12-09 | 스트라토스 지노믹스 인코포레이티드 | 확장에 의한 고성능 핵산 서열분석 |
WO2009002150A1 (en) * | 2007-06-22 | 2008-12-31 | Keygene N.V. | Targeted nucleotide exchange with improved modified oligonucleotides |
US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
US20100301398A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
WO2010132054A1 (en) * | 2009-05-13 | 2010-11-18 | Immport Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunodominant antigens of mycobacterium tuberculosis |
WO2011140237A2 (en) | 2010-05-04 | 2011-11-10 | The Government Of The Usa Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Process for detection of multidrug resistant tuberculosis using real-time pcr and high resolution melt analysis |
KR101158649B1 (ko) | 2010-05-27 | 2012-06-26 | 울산대학교 산학협력단 | 이중 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용한 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법 |
KR101152061B1 (ko) * | 2010-05-27 | 2012-06-08 | 울산대학교 산학협력단 | 이중 중합효소연쇄반응법을 이용한 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법 |
WO2012057904A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Infectious Disease Research Institute | Mycobacterium tuberculosis antigens and combinations thereof having high seroreactivity |
CN102618625B (zh) | 2011-01-27 | 2013-09-11 | 博奥生物有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒 |
US10041106B2 (en) * | 2011-05-06 | 2018-08-07 | Progenity, Inc. | Methods and compositions for isothermal whole genome amplification |
CN103635575B (zh) * | 2011-06-15 | 2019-03-01 | 盖立复治疗公司 | 用于测定人免疫缺陷病毒(hiv)的方法、组合物和试剂盒 |
US9045803B2 (en) | 2012-02-29 | 2015-06-02 | Abbott Molecular Inc. | Hepatitis B virus typing and resistance assay |
CN103312221A (zh) | 2012-03-13 | 2013-09-18 | 鸿富锦精密工业(深圳)有限公司 | 太阳能板清洁系统 |
US9249398B2 (en) | 2012-05-30 | 2016-02-02 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Use of mycobacterium smegmatis trehalose dimycolate hydrolase |
CN105392896B (zh) | 2013-03-15 | 2017-10-20 | 达雅高生命科技有限公司 | 快速并灵敏基因型鉴定及核酸检测 |
CA2930305A1 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Brandeis University | Multiplex target detection assay |
CN113652492A (zh) * | 2014-07-24 | 2021-11-16 | 雅培分子公司 | 用于检测和分析结核分枝杆菌的组合物和方法 |
JP6599606B2 (ja) | 2014-10-24 | 2019-10-30 | アサヒビール株式会社 | 非発酵ビール様発泡性飲料 |
US10582714B2 (en) | 2015-07-10 | 2020-03-10 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional compositions and methods for promoting cognitive development |
WO2017011565A1 (en) | 2015-07-14 | 2017-01-19 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis |
-
2015
- 2015-07-07 CN CN202110659815.0A patent/CN113652492A/zh active Pending
- 2015-07-07 US US14/793,241 patent/US10072306B2/en active Active
- 2015-07-07 EP EP19180548.0A patent/EP3578668B1/en active Active
- 2015-07-07 JP JP2017503844A patent/JP6596066B2/ja active Active
- 2015-07-07 RU RU2017102991A patent/RU2697502C2/ru active
- 2015-07-07 MX MX2017001134A patent/MX2017001134A/es active IP Right Grant
- 2015-07-07 ES ES15824241T patent/ES2752761T3/es active Active
- 2015-07-07 CA CA2955771A patent/CA2955771C/en active Active
- 2015-07-07 ES ES20215353T patent/ES2962636T3/es active Active
- 2015-07-07 BR BR112017001500A patent/BR112017001500A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-07-07 EP EP23191529.9A patent/EP4282961A3/en active Pending
- 2015-07-07 AP AP2017009731A patent/AP2017009731A0/en unknown
- 2015-07-07 CN CN201580049410.8A patent/CN106715718B/zh active Active
- 2015-07-07 EP EP15824241.2A patent/EP3191607B1/en active Active
- 2015-07-07 WO PCT/US2015/039362 patent/WO2016014240A2/en active Application Filing
- 2015-07-07 EP EP20215353.2A patent/EP3835430B1/en active Active
- 2015-07-07 ES ES19180548T patent/ES2864855T3/es active Active
-
2018
- 2018-09-10 US US16/126,251 patent/US10975446B2/en active Active
-
2019
- 2019-09-26 JP JP2019175105A patent/JP6840207B2/ja active Active
-
2021
- 2021-03-10 US US17/197,236 patent/US11932911B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6840207B2 (ja) | マイコバクテリウム・ツベルクロシスの検出および分析のための組成物および方法 | |
Bell et al. | Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR | |
Stoddard | Detection of pathogenic Leptospira spp. through real-time PCR (qPCR) targeting the LipL32 gene | |
JP5665548B2 (ja) | クロストリジウム・ディフィシレの検出 | |
EP2557156B1 (en) | Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same | |
Alli et al. | Direct molecular detection of Mycobacterium tuberculosis complex from clinical samples–An adjunct to cultural method of laboratory diagnosis of tuberculosis | |
Mota et al. | Recombinase polymerase amplification in the molecular diagnosis of microbiological targets and its applications | |
US20100233717A1 (en) | Methods for detecting toxigenic microbes | |
US20180016623A1 (en) | Compositions and methods for detecting nucleic acids in sputum | |
JP2015513921A (ja) | 任意のポリメラーゼ伸長活性の高感度定量的測定と生細胞存在の決定とに有用なポリメラーゼ活性測定方法 | |
Irfan et al. | Innovations in Molecular Identification of Mycobacterium tuberculosis. | |
Kalland et al. | 11 Molecular Microbial Diagnostics | |
CA2994606C (en) | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis | |
CN103866045B (zh) | Hav检测 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191007 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191007 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210202 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210216 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6840207 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |