CN103635575B - 用于测定人免疫缺陷病毒（hiv）的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组合物、方法和试剂盒，它们用于测定样品中存在或不存在HIV，特别是用于测定HIV‑1M组、HIV‑1O组和/或HIV‑2，特别是用于同时测定HIV‑1M组、HIV‑1O组和HIV‑2。

Description

用于测定人免疫缺陷病毒（HIV）的方法、组合物和试剂盒
技术领域
本发明涉及HIV并且包括用于检测它的方法、组合物和试剂盒。
背景技术
由于其遗传物质中的频繁突变，人免疫缺陷病毒(HIV)是一种遗传上多变的病毒。存在两种主要的基因型并且被指定为1型和2型。HIV 1 型(HIV-1)在世界范围内是最普遍的并且被分为多个组和多个亚型，其中M组B亚型是最常见的。在美国，HIV-1 M组的其他常见的亚型是：A、C、D、F和G。此外，这些亚型的基因组重组自然出现，产生了病毒的循环重组形式(HIV CRF)。两种最常见的CRF是CRF01(AE)和CRF02 (AG)。据信与M组和HIV-2相比，HIV-1 O组较不常见。
实现多种遗传变异体检测的一种常用的成熟方法是由保守的基因组区域设计探针或，如果不可行的话，则设计各自具有不同特异性的多种探针。然而后一种方法可能会降低测定灵敏度。
生物学测试检测大范围的病原体的遗传变异体的能力被定义为特异性。具有高特异性的测试能够在一次测试运行中检测大量的遗传变异体并且因此是理想的，因为它们提供了高水平的病原体安全性并且节约成本。测试灵敏度被定义为每单位样品能够检出的病原体的最低浓度，并且常常数字地表示为LOD(检出限)。LOD越低测试灵敏度越高。测试灵敏度和特异性通常被认为是互斥的，因为可能难以开发出一种兼具高灵敏性和高特异的生物学检测。
因此，仍然需要用于检测HIV的组合物和方法。
发明内容
一方面，提供了包括如下列出的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子：
5’-agg ccc tgc atg tac tgg gtg-3’(SEQ ID NO:1)；
5’-agg tcc tgc ctg tac tgg atg-3’(SEQ ID NO:2)；
5’-agg ccc tgc ctg ctg tgg atg-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-agg tcc tgc atg cac tgg atg-3’(SEQ ID NO:4)；
5’-agg ccc tgc atg tac tgg atg-3’(SEQ ID NO:5)；或
5’-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3’(SEQ ID NO:6)。
另一方面，本发明提供了包括如下列出的核苷酸序列的分离的核酸分子：
5’-agg pcc tgc mtg pwc tgg atg-3’(SEQ ID NO:7)；
其中p＝通用核苷酸；m＝a或c；并且w＝a或t。
在一些方面，本发明提供了包括如下列出的核苷酸序列的分离的核酸分子：
5’-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3’(SEQ ID NO:8)；或
5’-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3’(SEQ ID NO:9)；
其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷或胞苷类似物。
在其他方面，本发明提供了包括如下列出的核苷酸序列的分离的核酸分子：
5’-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3’(SEQ ID NO:10)；或
5’-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3’(SEQ ID NO:11)；
其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷类似物。
在更进一步的方面，本发明提供了包括如下列出的核苷酸序列的分离的核酸分子：
5’-agg pcc tgc atg pac tgg atg-3’(SEQ ID NO:12)；或
5’-agg pcc tgc ctg ptc tgg atg-3’(SEQ ID NO:13)；
其中p＝通用核苷酸。
在其他方面，本发明提供了包括如下列出的核苷酸序列的分离的核酸分子：
5’-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’(SEQ ID NO:14)；
5’-agt agt tcc tgc tat gtc act tc-3’(SEQ ID NO:15)；
5’-gag gac atc aag ggg ctt tac a-3’(SEQ ID NO:16)；
5’-cag caa tgt cac ttc ctg ttg-3’(SEQ ID NO:17)；
5’-ggc aga ggt agt gcc ag-3’(SEQ ID NO:18)；
5’-ggt cgc cca cac aat taa gc-3’(SEQ ID NO:19)；
5’-agg cac tct cag aag gct gca cg-3’(SEQ ID NO:20)。
5’-acc atc aat gag gaa gct gca gaa tgg gat-3’(SEQ ID NO:21)；或
5’-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3’(SEQ ID NO:22)。
一方面，本发明提供了用于扩增目标序列的方法。该方法包括使组合物与目标序列在PCR条件下接触，其中该组合物包括具有如在(SEQ ID NO:10)中列出的序列的第一寡聚核苷酸和具有如在(SEQ ID NO:11)中列出的序列的第二寡聚核苷酸，其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷类似物，其中该组合物进一步包括具有如在SEQ ID NO:14中列出的序列的第一正向引物和具有如在SEQ ID NO:15中列出的序列的第一反向引物，其中第一正向引物和第一反向引物各自能够在PCR条件下退火至目标序列从而扩增目标序列。
另一方面，本发明提供了用于测定样品中HIV的方法。该方法包括：
(a)利用在样品中的核酸模板、使用包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的正向引物和包括如在SEQ ID NO:15中列出的序列的反向引物进行PCR；以及
(b)使由正向和反向引物产生的扩增子与包括如在SEQ ID NO:10 中列出的序列的第一寡聚核苷酸和包括如在SEQ ID NO:11中列出的序列的第二寡聚核苷酸接触，其中扩增子的检测指示在样品中存在HIV。
在更进一步的方面，本发明提供了包括本发明的组合物和/或一种或多种核酸分子的试剂盒。
具体实施方式
一方面，现在提供了包括如在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中列出的核苷酸序列或它们的互补序列的分离的核酸分子。
另一方面，本发明提供了包括如在SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中p＝通用核苷酸；m＝a或c；并且w＝a或t。
在一些方面，本发明提供了包括如在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9 中列出的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷或胞苷类似物。
在其他方面，本发明提供了包括如在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11 中列出的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷类似物。
在更进一步的方面，本发明提供了包括如在SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中p＝通用核苷酸。
在一种实施方式中，通用核苷酸是3-硝基吡咯、2’-脱氧核苷和5-硝基吲哚。在其他实施方式中，通用核苷酸是6H,8H-3,4-二氢嘧啶并 [4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮。
在其他实施方式中，具有C-5修饰的胞苷类似物是dC的C-5-丙炔基或甲基类似物。例如，在优选的实施方式中，具有C-5修饰的胞苷类似物是dC的C-5-丙炔基类似物(例如[5-(1-丙炔基)-2’-脱氧胞苷(pdC)])。
在一些实施方式中，本发明的分离的核酸分子具有不多于100个核苷酸的长度，说明性地，不多于约：100、90、80、70、60、55、50、45、 40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11和10个核苷酸。
在另一种实施方式中，本发明提供了由或基本上由选自由SEQ ID NO:1-22组成的组中的核苷酸序列或它们的互补序列组成的分离的核酸分子。
本文中术语“核酸分子”包括由自然存在的核苷酸碱基、糖类和共价核苷间(主链)键以及具有功能相似的非自然存在的部分的核酸分子组成的聚合物。进一步地，术语“核酸分子”还包括双链的、单链的聚合物，包括RNA、DNA、修饰的RNA或DNA、RNA或DNA模拟物或它们的任何组合。
在一些实施方式中，寡核苷酸引物和探针可以源自在本文中公开的核酸序列。在多种实施方式中，引物和探针互相组合使用。本发明发现在多种不同应用中的用途，包括但不限于对于HIV的研究、医学和诊断用途。例如，核酸分子能够提供用于在例如HIV检测测试或试剂盒中使用的试剂从而扩展能够由该测试或试剂盒检测的HIV变异体的所有组成部分。
一般来说，探针是与目标核酸的核苷酸序列互补或基本上互补的寡核苷酸。探针可用于多种用途，包括但不限于，检测或捕获目标核酸或与目标物相对应的扩增子。例如，能够由位于利用两个选定的引物产生的扩增产物的序列内和/或包括该序列的任何序列来设计适用于在基于扩增的检测方法中使用的探针。
在其他实施方式中，探针包括如在SEQ ID NO:1至22中列出的核苷酸序列或其互补序列。
在一种实施方式中，探针包括SEQ ID NO:6或其互补序列。
在另一种实施方式中，探针包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9，其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷类似物。在一种实施方式中，p是6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮；并且n是[5-(1-丙炔基)-2’-脱氧胞苷(pdC)]。
本领域技术人员会认识到通过在Current Protocols in Molecular Biology(1999.Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG, Smith JA,Struhl K,editors.John Wiley&Sons,Inc.)中描述的标准分子生物学技术或通过化学合成或通过核酸类似物可以获得包括引物和/或探针在内的本发明的分离的核酸分子。涉及化学合成的方法可以是自动化的且是市售的，并且可以包括例如磷酸二酯法、磷酸三酯法或亚磷酰胺法。美国专利号US 4,458,066；US 4,415,732；以及Meth.Enzymol.197968:90和109，通过引用结合到本文中，公开了化学合成方法的实例。化学核酸合成使得能够向核酸分子中引入非天然的或修饰的碱基、以及多种标记部分。进一步地，修饰的主链化学物质例如肽键、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、2’-O-甲基RNA、2’-O-Mt RNA、P-乙氧基DNA和P-乙氧基2’-O-Mt RNA也是可容易利用的并且在本领域是众所周知的。更进一步地，在核酸杂交测定中使用可交联探针来交联至目标序列在本领域是众所周知的。例如，在美国专利号US 4,826,967和美国专利号US 5,082,934中描述了通过形成加合物连接至核酸分子的基于呋喃香豆素或补骨脂素的化合物，均通过引用结合于此，描述了包括在不存在中间碱基部分的情况下通过其苯环连接至核糖或脱氧核糖部分的1号位的香豆素部分的光可活化核苷类似物。
核酸类似物或模拟物与天然核酸分子具有相似的化学结构但具有独特的修饰。核酸类似物，如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代物，提高了传统核酸分子超越与标准核酸化学法(Karkare S and Bhatnagar D. Appl.Microbiol.Biotechnol.200671:575-586.)有关的限制的能力。此类核酸类似物极大地扩展并提高了检测和识别相关核酸序列的能力。
在一些方面，本发明的分离的核酸分子进一步包括一种或多种异源性核苷酸。在本文中术语“异源性核苷酸”是指不是分离的核酸分子的天然部分而是自然地或人工地加入至分离的核酸分子的一种核苷酸或多种核苷酸。异源性核苷酸序列的实例包括但不限于载体序列、与纯化探针的碱基序列互补的序列、以及包括一个或多个限制性酶位点的序列。
在一种实施方式中，一种或多种异源性核苷酸包括与纯化探针的碱基序列互补的序列。纯化探针能够连接(joined to)至固体载体如，例如游离在溶液中的基质或颗粒。固体载体的非限制性实例包括硝酸纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯、以及可被磁性吸引的颗粒。例如，纯化探针，其可以包括DNA或RNA序列，可以用胺或生物素标签通过交联剂来标记。然后这些被生物素和胺标记的纯化探针随后适于固定和检测方案，这些方案容许体外核酸:核酸或蛋白质: 核酸相互作用。因此，分离的核酸分子的异源性片段与它的纯化探针的互补碱基序列的退火可以促进与分离的核酸分子的病毒特异性序列片段退火的分子的样品纯化。美国专利号US 6,534,273(通过引用结合到本文中)，描述了将样品中的目标核酸分子捕获至固体载体上的方法。
在一种实施方式中，本发明的分离的核酸分子被连接至如以上描述的那些固体载体中。
在一些实施方式中，一种或多种异源性核苷酸包括一种或多种重复碱基序列，例如与纯化探针的一种或多种重复碱基序列互补的一种或多种重复碱基序列。重复碱基序列可以是规律重复的碱基序列，如由例如多聚腺嘌呤(An)、多聚胸腺嘧啶(Tn)、多聚胞嘧啶(Cn)、多聚鸟嘌呤(Gn) 和多聚尿嘧啶(Un)的核酸均聚物形成的那些。重复序列也可以包括混合聚合物，如AT重复[[AT]n]等。
分离的核酸分子的一种或多种异源性核苷酸的重复碱基序列的碱基数量可以等于、大于或小于纯化探针的重复碱基序列的碱基数量。互补重复序列的长度可以决定异源性片段:纯化探针复合物的熔点(Tm)。在一种实施方式中，异源性片段的重复碱基序列长于纯化探针的互补重复碱基序列。在另一种实施方式中，异源性片段或纯化探针的重复碱基序列可以具有至少约5个碱基的长度，例如约5至约40、约10至约30、或约15 至约20等。
在其他实施方式中，一种或多种异源性核苷酸包括可操作地连接的控制序列。在一种实施方式中，控制序列是由与该序列结合并起始转录以产生RNA转录本的RNA聚合酶特异性识别的增强子或启动子。由RNA聚合酶特异性识别的启动子的非限制性实例包括T3、T7或SP6。因此，可以在多种基于核酸的测定中使用分离的核酸分子，包括使用RNA聚合酶以产生多个RNA转录本的测定，例如在Nature 350:91-92(1991)；和美国专利号US 5,399,491(两者均通过引用结合与此)中描述的转录介导的扩增(TMA)测定。
在一种实施方式中，本发明的分离的核酸分子序列是被标记的，例如放射性标记的、化学发光标记的、荧光标记的、磷光标记的或用红外染料标记的或用表面增强拉曼标记物或等离子体共振颗粒(PRP)标记的。例如，核苷酸的修饰包括加入吖啶或其衍生物、AcryditeTM、胺、生物素、 BHQ-1TM、BHQ-2TM、BHQ-3TM、硼烷dNTP、碳间隔子(例如C3、C6、 C7、C9、C12或C18)、级联蓝(cascade blue)、胆固醇、香豆素或其衍生物、DABCYL、丹磺酰氯、地高辛、二硝基联苯、双生物素、EDANS、6-FAM、荧光素、3’-甘油基、HEX、IAEDANS、反向(倒置)dA(inverted dA)、反向dG、反向dC、反向dG、 IRD-700、IRD-800、JOE、拉霍亚蓝(La Jolla Blue)、金属簇如金纳米颗粒、苯基硼酸、磷酸补骨脂素、3’-或5’-磷酸化、芘、3’核糖腺苷、3’核糖鸟苷、3’核糖胞苷、(LC)Red640、(LC)Red705、罗丹明、ROX、巯基(SH)、隔离子、TAMRA、TET、SE、Marina OregonPacificQSY7TM、RhodamineRhodamine Rhodol四甲基罗丹明、TexasUni-Link NH2-修饰物、放射性标记(例如125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)和纳米颗粒。对本领域普通技术人员来说，已知多种标记技术。
标记物可以直接或间接地加入至分离的核酸分子中。例如，可以通过将可检测的基团(标记物)共价连接至内部或末端位置来进行核酸的标记。本领域技术人员知道存在多种使用容许加入标记物的反应性官能团用于使寡核苷酸衍生化的途径。多种方法可用于使标记物直接连接至核酸分子上并且用于使探针生物素化以使可以通过亲和素(avidin)来连接放射性标记物、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物或电子密度标记物。描述用于标记核酸的标记物和方法的参考文献的非限制性实例包括美国专利号US 4,605,735；美国专利号US 4,757,141；美国专利号US 6,965,020； Nucl.Acids Res.5:363(1978)；Nucl.Acids Res.13:1529(1985)；Nucl.Acids Res.15:3131(1987)；Nucl.Acids Res.15:6455(1987)；Nucl.Acids Res. 13:4485(1985)；Nucl.Acids Res.15:4837(1987)；以及Anal.Biochem. 169:1-25(1988)，因为它们的公开内容涉及使核酸标记，所以将它们通过引用结合到本文中。
在一些实施方式中，分离的核酸分子被标记以用于使用荧光共振能量转移(FRET)的检测方法。FRET涉及两种染料，供体染料和受体染料。如果所述受体本身是具有荧光性的，则可以亦或通过受体染料的荧光(“敏化荧光”)检测FRET，亦或如果所述受体是猝灭非荧光染料，则可以通过使供体染料荧光性猝灭检测FRET。如果供体染料随时间释放其荧光，则 FRET可以被延迟。这种方法被称为“TR-FRET”或“时间分辨FRET”。供体染料和受体染料也可以是相同，在此情况中通过得到的荧光去极化来检测FRET。染料也可以共价偶联以形成串联荧光染料或串联染料或串联共轭物。例如，单一的供体染料随后能够同时激发两个受体染料，使得发射多种波长的光。优选地，供体发射波长分布图与受体吸收波长分布曲线应该至少部分地重合。
可以使用的荧光染料包括但不限于(例如670)、 BODIPY FL、Cy5.RTM.、EDANS、FAM、荧光素、HEX、IAEDANS、JOE、Oregon(LC)Red640、(LC)Red705、 ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和Texas
670(Biosearch Technologies,Inc.Novato,CA)是在可见光谱的红光区域内发荧光的吲哚羰花青。
猝灭剂染料包括但不限于BHQ-1TM、BHQ-2TM、BHQ-3TM、DABCYL、金属簇如金纳米颗粒和QSY7TM。
可以使用的供体/受体对包括但不限于FAM/BHQ-1、/BHQ-2、 TET/BHQ-1、JOE/BHQ-1、HEX/BHQ-1、Oregon Green/BHQ-1、 TAMRA/BHQ-2、ROX/BHQ-2、Cy3/BHQ-2、Cy3.5/BHQ-2、Texas Red/BHQ-2、Texas Red/BHQ-2、Cy5/BHQ-3、Cy5.5/BHQ-3、萤光素/四甲基罗丹明、萤光素/萤光素、萤光素/QSY7、萤光素/LC RED640、萤光素/LC Red705、IAEDANS/萤光素、EDANS/DABCYL和BODIPY FLI/BODIPY FL。
在一种实施方式中，本发明提供了包括如在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10中列出的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子，其中核酸分子进一步包括可检测标记物。
在一些实施方式中，可检测标记物与适用于利用FRET检测的供体/ 受体对相对应。
在其他实施方式中，供体/受体对是FAM/BHQ-1。
在其他实施方式中，供体/受体对是Quasar 670/BHQ-2。
在更进一步的实施方式中，本发明提供了包括如在(SEQ ID NO:6) 中列出的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子，其中核酸分子包括在5’末端的Quasar 670和在3’末端的BHQ-2。
在一种实施方式中，本发明提供了包括如在(SEQ ID NO:10)或(SEQ ID NO:11)中列出的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子，其中p 是6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮并且n是[5-(1-丙炔基)-2’-脱氧胞苷(pdC)]，其中核酸分子包括在5’末端的FAM和在3’末端的BHQ-1。
在其他实施方式中，本发明的核酸分子可以提供用于同时使用两种以上利用供体-受体能量转移的探针，由此制备了例如具有不同颜色荧光团的分子信标(beacon)，使得可以进行在同一反应中同时检测多个不同目标物的测定。例如，多重测定可以包含多个不同的引物组，每个组都能使得能够扩增来自不同HIV的独特的基因序列，并且可以呈现相应数量的分子信标，每个分子信标都包含对多种扩增子中的一种特异的探针序列，并且用不同颜色的荧光团来标记每个分子信标。得到的荧光的颜色，确定样品中的HIV(如果有的话)，并且产生可检测的荧光所需的扩增循环次数提供了存在的目标生物体的数量的定量测量。如果在样品中存在多于一种类型的HIV，则所产生的荧光颜色识别存在哪一种类型的HIV。
一般来说，包括正向引物和反向引物的一对引物可以提供由引物侧接的目标核酸的特异性扩增(例如通过PCR)以产生扩增产物(也被称为“扩增子”)。关于此方面，每个引物都与其互补或基本互补的目标序列结合，由此通过加入核苷酸来为聚合酶提供用于结合并延伸每个引物的3’末端的位置，由此提供目标序列的互补拷贝。
在一种实施方式中，引物对包括具有如在SEQ ID NO:14中列出的序列的正向引物和具有如在SEQ ID NO:15中列出的序列的反向引物。
在另一种实施方式中，引物对包括具有如在SEQ ID NO:16中列出的序列的正向引物和具有如在SEQ ID NO:17中列出的序列的反向引物。
在其他实施方式中，引物对包括具有如在SEQ ID NO:18中列出的序列的正向引物和具有如在SEQ ID NO:19中列出的序列的反向引物。
在一种实施方式中，目标核酸至少是从HIV(例如HIV-1 M组、HIV-1 O组、HIV-2)的反转录的RNA制备的cDNA的片段。本领域普通技术人员会认识到可以利用在本领域内已知的方法来反转录RNA以为借助引物的扩增提供模板。
在另一种实施方式中，目标核酸至少是整合至宿主细胞(例如T-淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞)的DNA中的HIV(例如HIV-1 M组、 HIV-1 O组、HIV-2)前病毒DNA的片段。制备包括前病毒DNA的细胞 DNA在本领域内是众所周知的。
在其他方面，本发明提供了包括本发明的分离的核酸分子中的一种或多种的组合物。在某些实施方式中，组合物是缓冲溶液。在其他实施方式中，组合物是冻干的。
在一种实施方式中，组合物包括具有如在(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15)；(SEQID NO:16/SEQ ID NO:17)；或(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:19)中列出的序列的一对引物。在某些实施方式中，组合物包括这些对引物中的两对。在其他实施方式中，组合物包括全部三对寡核苷酸。
在其他实施方式中，组合物包括具有如在(SEQ ID NO:6)、(SEQ ID NO:10)或(SEQID NO:11)中列出的序列的核酸探针，其中组合物进一步包括具有如在(SEQ ID NO:14/SEQID NO:15)或具有如在(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:17)中列出的序列的一对引物。
在另一种实施方式中，提供了包括第一对引物、第二对引物和第三对引物的组合物，其中第一对引物具有如在(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15) 中列出的序列，其中第二对引物具有如在(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:17) 中列出的序列，其中第三对引物具有如在(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:19) 中列出的序列。在一种实施方式中，组合物就进一步包括第一探针、第二探针和第三探针，其中第一探针、第二探针和第三探针分别包括如在(SEQID NO:6)、(SEQ ID NO:10)和(SEQ ID NO:11)中列出的序列，其中第一探针、第二探针和第三探针各自包括适合于在多重实时PCR中使用的可检测标记物。在一些实施方式中，组合物就进一步包括具有如在(SEQ ID NO:20)中列出的序列的第四探针。
在一种实施方式中，除本发明的一种或多种核酸分子之外，组合物包括另外的试剂如适合浓度的DNA聚合酶、辅助因子和脱氧核糖核苷-5’- 三磷酸以提供目标核酸的扩增。以举例的方式，在一些实施方式中，其中组合物是PCR溶液，DNA聚合酶的最低量可以是至少约0.5单位/100μl 溶液，例如约0.5至约25单位/100μl溶液和约7至约20单位/100μl溶液。对于给定的扩增反应或系统来说，其他的量是可用的。可以将“单位”定义为在74℃下在30分钟内将10纳摩尔的全核苷酸(total nucleotides) (dNTP)加入至延伸中的核酸链所需的酶活性的量。以另一实例的方式，在其他实施方式中，在扩增中使用的每种引物的量可以是至少约0.075微摩尔，例如约0.075至约2微摩尔，但是对于指定的扩增反应或系统来说，其他的量是可用的。作为更进一步的实例，在一些实施方式中，在溶液中的每种dNTP的量可以是约0.25至约3.5毫摩尔，但是对于指定的扩增反应或系统来说，其他的量是可用的。
在其他方面，本发明提供了用于扩增与HIV相对应的目标序列的方法。例如，在一些实施方式中，目标序列可以是包括HIV前病毒DNA的细胞DNA或者目标序列可以是从HIV的RNA制备的cDNA。例如，用目标序列和各自的能够在适合的PCR条件下退火至目标序列的至少正向引物和反向引物进行PCR可以提供目标序列的扩增。
在一种实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的正向引物和包括如在SEQ ID NO:15 中列出的序列的反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-1 M组。
在另一种实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:16中列出的序列的正向引物和包括如在SEQ ID NO:17中列出的序列的反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括 HIV的样品的RNA制备的cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-1 O组。
在一种实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:18中列出的序列的正向引物和包括如在SEQ ID NO:19 中列出的序列的反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-2。
在其他实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的第一正向引物、包括如在SEQ ID NO:15中列出的序列的第一反向引物、包括如在SEQ IDNO:16中列出的序列的第二正向引物和包括如在SEQ ID NO:17中列出的序列的第二反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的 cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-1 M组和/或HIV-1 O组。
在其他实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的第一正向引物、包括如在SEQ ID NO:15中列出的序列的第一反向引物、包括如在SEQ IDNO:18中列出的序列的第二正向引物和包括如在SEQ ID NO:19中列出的序列的第二反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的 cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-1 M组和/或HIV-2。
在其他实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:16中列出的序列的第一正向引物、包括如在SEQ ID NO:17中列出的序列的第一反向引物、包括如在SEQ IDNO:18中列出的序列的第二正向引物和包括如在SEQ ID NO:19中列出的序列的第二反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的 cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV是HIV-1 O组和/或HIV-2。
在其他实施方式中，本发明提供了用于扩增目标序列的方法，该方法包括：用目标序列作为模板进行PCR，其中进行PCR包括为PCR提供包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的第一正向引物、包括如在SEQ ID NO:15中列出的序列的第一反向引物、包括如在SEQ IDNO:16中列出的序列的第二正向引物、包括如在SEQ ID NO:17中列出的序列的第二反向引物、包括如在SEQ ID NO:18中列出的序列的第三正向引物和包括如在 SEQ ID NO:19中列出的序列的第三反向引物。在一种实施方式中，目标序列与从包括HIV的样品的RNA制备的cDNA相对应。在另一种实施方式中，目标序列与HIV的前病毒DNA相对应。在一些实施方式中，HIV 是HIV-1 M组、HIV-1 O组和/或HIV-2。
在其他方面，本发明提供了用于测定样品中的HIV的方法。例如，样品可以包括HIVRNA和/或前病毒DNA，或者样品可以疑似包括它们。
在一种实施方式中，本发明提供了用于测定样品中的HIV的方法，该方法包括：
a.用在样品中的核酸模板、使用包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的正向引物和包括如在SEQ ID NO:15中列出的序列的反向引物进行 PCR；以及
b.检测由正向引物和反向引物产生的扩增子，其中扩增子的出现确定了在样品中的HIV。
在一种实施方式中，模板是从包括HIV的样品的RNA制备的cDNA。在另一种实施方式中，模板包括HIV的前病毒DNA。
在一些实施方式中，HIV是HIV-1 M组。在一种实施方式中，HIV-1 M组具有如由例如GENBANK登记号AF033819、AY173953或AY214024 公开的核酸序列，通过引用将它们中的每一个的全部内容结合到本文中。
在其他实施方式中，正向引物包括如在SEQ ID NO:16中列出的序列并且反向引物包括如在SEQ ID NO:17中列出的序列。在一种实施方式中， HIV是HIV-1 O组。在另一种实施方式中，HIV-1 O组具有如由例如 GENBANK登记号AY169802、AB485669.1或GQ351296.2公开的核酸序列，通过引用将它们中的每一个的全部内容结合到本文中。
在其他实施方式中，正向引物包括如在SEQ ID NO:18中列出的序列并且反向引物包括如在SEQ ID NO:19中列出的序列。在一种实施方式中， HIV是HIV-2。在另一种实施方式中，HIV-2具有如由例如GENBANK登记号X52223、AJ011222.1公开的核酸序列，通过引用将它们中的每一个的全部内容结合到本文中。
可以通过多种本领域普通技术人员已知的技术来进行检测的步骤。在一种实施方式中，可以使用为检测而标记的、并且可以直接或间接地与扩增子杂交的探针来检测扩增子。探针可以是可溶的或者连接于固体载体上的。
在一种实施方式中，探针包括与适用于使用FRET检测的供体/受体对相对应的可检测标记物，其中探针包括如在SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20中列出的序列或它们的互补序列。例如，在一些实施方式中，供体/受体对是FAM/BHQ-1、/BHQ-2 或它们的任何组合。
在另一种实施方式中，用于扩增目标核酸的一种或多种引物可以是例如用特异性结合部分标记的。可以用探针捕获标记的引物结合入其中所产生的引物延伸产物。使用适合的检测设备和在本领域内已知的步骤、通过检测标记的探针或标记的扩增的目标物的存在来实现与探针杂交的扩增的目标物的检测。
在其他实施方式中，用生物素标记用于扩增目标核酸的一种或多种引物并且生物素化的扩增的目标核酸与连接于固体载体上的探针杂交。然后在氧化剂(如过氧化氢)和适合的染料形成性组合物的存在下通过使它们接触链霉亲和素-过氧化物酶(streptayidin-peroxidase)共轭物来检测结合的目标物。
对本领域普通技术人员来说，众所周知的用于检测的其他技术包括但不限于涉及Southern印迹、斑点印迹技术或用标记的探针的非同位素捕获检测。
在其他实施方式中，本发明提供了用于测定在样品中的HIV-1 M组、 HIV-1 O组和/或HIV-2的方法，该方法包括：
a.使用(i)包括如在SEQ ID NO:14中列出的序列的第一正向引物和包括如在SEQID NO:15中列出的序列的第一反向引物；(ii)包括如在SEQ ID NO:16中列出的序列的第二正向引物和包括如在SEQ ID NO:17 中列出的序列的第二反向引物；和(iii)包括如在SEQID NO:18中列出的序列的第三正向引物和包括如在SEQ ID NO:19中列出的序列的第三反向引物对样品进行单一的PCR；以及
b.检测由(i)第一正向引物和第一反向引物、(ii)第二正向引物和第二反向引物、和/或(iii)第三正向引物和第三反向引物产生的扩增子，其中扩增子的出现确定了样品中的HIV。
在一种实施方式中，检测步骤包括在PCR中包括寡核苷酸探针，该探针包括与适于使用FRET检测的供体/受体对相对应的可检测标记物，其中该探针包括如在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中列出的序列或其互补序列。例如，在一些实施方式中，供体/受体对是FAM/BHQ-1、/BHQ-2或它们的任何组合。
在另一种实施方式中，检测步骤包括在PCR中包含包括如在SEQ ID NO:6中列出的序列的第一探针、包括如在SEQ ID NO:10中列出的序列的第二探针和包括如在SEQ ID NO:11中列出的序列第三探针。在一种实施方式中，第一探针、第二探针和第三探针各自包括作为标记物的相同的供体/受体对。例如，供体/受体对可以是但不限于FAM/BHQ-1。在另一种实施方式中，第一探针、第二探针和第三探针各自包括作为标记物的不同的供体/受体对。例如，在某些实施方式中，第一探针的供体/受体对是/BHQ-2，而第二探针和第三探针各自包括FAM/BHQ-1。
因此，在用于扩增和/或测定HIV的多种方法中可以单独或组合使用本发明的分离的核酸分子。因此，在某些实施方式中，本发明的组合物、方法和试剂盒提供了进行多重实时PCR测定，其在相同PCR扩增预混 (PCR master mix)中包括一组、两组或三组如本文所描述的引物和探针，它们各自对一种HIV目标物具有特异性。例如，根据本发明的多重实时PCR测定可以利用单次测试检测3种HIV基因型(即HIV-1 M组、HIV-1 O组、HIV-2)。关于此方面，引物和探针仅能够与它们的特异性目标物相互作用而不与存在于扩增预混中的其他引物和探针相互作用(例如，不形成引物二聚体)，从而在PCR、例如多重PCR中提供了高效的目标物扩增和检测。
在其他方面，本发明提供了包含包括本发明的引物和探针的分离的核酸分子的试剂盒。可以使用在本文中公开的核酸序列来开发试剂盒。这些序列可以用作核酸扩增反应中的引物，和/或作为核酸杂交方法中的探针。试剂盒可用于测定在样品中的HIV、特别是HIV-1 M组、HIV-1 O组和/ 或HIV-2核酸序列的存在。试剂盒中的组成可以是商业获得的或根据本领域众所周知的方法制造的。此外，试剂盒的组成可以是在溶液中的或是适当冻干的。在一种实施方式中，组成在同一隔室内，而在另一种实施方式中，组成在分开的隔室内。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括使用说明书。
在一种实施方式中，试剂盒包括正向引物、反向引物和探针，其中正向引物包括如在(SEQ ID NO:14)、(SEQ ID NO:16)或(SEQ ID NO:18) 中列出的正向引物核酸序列，其中反向引物包括如在(SEQ ID NO:15)、 (SEQ ID NO:17)或(SEQ ID NO:19)中列出的反向引物核酸序列，其中探针包括如在(SEQ ID NO:6)、(SEQ ID NO:10)、(SEQ ID NO:11)或 (SEQID NO:20)中列出的探针核酸序列。
在另一种实施方式中，试剂盒包括与用于测定HIV-1 M组的第一探针和第二探针组合使用的第一引物对、与用于测定HIV-1 O组的第三探针组合使用的第二引物对和与用于测定HIV-2的第四探针组合使用的第三引物对，其中第一引物对包括如在(SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15)中列出的序列，其中第一和第二探针分别包括如在SEQ ID NO:10和SEQID NO:11中列出的序列，其中第二引物对包括如在(SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:17)中列出的序列，其中第三探针包括如在SEQ ID NO:6中列出的序列，其中第三引物对包括如在(SEQID NO:18/SEQ ID NO:19)中列出的序列，其中第四探针包括如在SEQ ID NO:20中列出的序列。
提供了以下实施例，仅用于说明。
实施例
实施例1
通过多重PCR测定HIV
为了确定血浆样品中HIV RNA的存在，使用引物和探针进行同时 PCR测定，由此，提供的引物用于扩增从可能存在于样品中的HIV-1 M组、 HIV-1 O组和/或HIV-2制备的cDNA模板，并且通过为了由FRET检测而标记的扩增子特异性探针的杂交来实时检测所产生的扩增子。
选择三组相容的引物/探针组以确保高效扩增并检测HIV-1 M组、 HIV-1 O组和/或HIV-2 RNA。为了检测，每个探针都包括在5’末端的供体和在3’末端的受体。
为了确定在样品中HIV-1 M组的存在，采用了具有以下序列的引物和检测探针：
正向引物1：5’-gac atc aag cag cca tgc aaa t-3’(SEQ ID NO:14)
反向引物2：5’-agt agt tcc tgc tat gtc act tc-3’(SEQ ID NO:15)；
探针1：5’-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3’(SEQ ID NO:10)；和
探针2：5’-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3’(SEQ ID NO:11)；
其中p是6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮；并且n是[5-(1- 丙炔基)-2’-脱氧胞苷(pdC)]。
为了确定在样品中HIV-1 O组的存在，使用了具有以下序列的引物和探针：
正向引物3：5’-gag gac atc aag ggg ctt tac a-3’(SEQ ID NO:16)；
反向引物4：5’-cag caa tgt cac ttc ctg ttg-3’(SEQ ID NO:17)；和
探针3：5’-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3’(SEQ ID NO:6)。
为了确定在样品中HIV-2的存在，使用了具有以下序列的引物和探针：
正向引物5：5’-ggc aga ggt agt gcc ag-3’(SEQ ID NO:18)；
反向引物6：5’-ggt cgc cca cac aat taa gc-3’(SEQ ID NO:19)；和
探针4：5’-agg cac tct cag aag gct gca cg-3’(SEQ ID NO:20)。
制备了多重PCR扩增预混(MMX)，其包括：1×PCR缓冲液(50mM N,N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、115mM乙酸钾、8％甘油、pH 8.2)(可以替代地可以使用基于三羟甲基氨基甲烷(Tris)的缓冲液)；300μM dNTP；3％DMSO；3.5mM MgCl2；1×ROX参考染料(0.5μM)(以50×浓度供应ROX参考染料)。它由5-羧基-X-罗丹明的甘氨酸共轭物、在20 mM Tris-HCl(pH8.4)中的琥珀酰亚胺基酯(25μM)、0.1mM EDTA、 0.01％20(Invitrogen,Carlsbad,CA)(可以替代地可以使用被称为“低ROX”的ROX参照物的不同配制物(Eurogentec,Seraing,Belgium))； 100nM HIV-1 M组正向引物(正向引物1)；300nM HIV-1M组反向引物 (反向引物2)；100nM HIV-1 M组探针(探针1)；100nM HIV-1 group M 组探针(探针2)；100nM HIV-1 O组正向引物(正向引物3)；300nM HIV-1 O组反向引物(反向引物4)；100nM HIV-1 O组探针(探针3)；HIV-2 正向引物(正向引物5)；HIV-2反向引物(反向引物6)；100nM HIV-2 探针(探针4)；100nM内参(Internal Control)探针；20单位/反应的反转录酶(RT)；和2.5单位/反应的Taq DNA聚合酶组成。
使用在本领域内已知的病毒提取方法使MMX与从包含病毒的血浆样品中分离的病毒RNA结合。使用市售的实时PCR仪器(Applied Biosystems 7300或7500)，对结合的HIVRNA+MMX进行一步PCR，其中反转录、cDNA的扩增和检测在同一试管中发生。在表1中示出热循环条件：
表1：PCR循环条件
在PCR扩增后，使用仪器SDS软件来分析产生的信号。结果显示了具有低于30的CT值的强扩增曲线。因此，我们可以从抽取的血浆样品中检测所有三种HIV基因型，HIV-1 M组、HIV-1 O组和HIV-2。使用相同的荧光染料来标记存在于用于检测HIV-1 M组和HIV-2的测定中的探针，在此情况中，检测到两种基因型但是不能被区分开来。利用不同的荧光染料来标记用于检测HIV-1 O组的探针使得能够将HIV-1 O组与HIV-1 M组和HIV-2区分开来。
表2是基于不同的HIV-1 M组亚型和CRF的基因组区域的序列比对。
表2：与对应的HIV变异体序列互补的序列的比对
CRF01 5’-agg ccc tgc atg tac tgg gtg-3’(SEQ ID NO:1)
CRF02 5’-agg tcc tgc ctg tac tgg atg-3’(SEQ ID NO:2)
亚型G 5’-agg ccc tgc ctg ctg tgg atg-3’(SEQ ID NO:3)
亚型F1 5’-agg tcc tgc atg cac tgg atg-3’(SEQ ID NO:4)
亚型A 5’-agg ccc tgc atg tac tgg atg-3’(SEQ ID NO:5)
探针1 5’-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3’(SEQ ID NO:10)
探针2 5’-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3’(SEQ ID NO:11)
用于检测HIV-1 M组的探针1和探针2具有两个插入的通用嘧啶(表 2，在位点4和13)，6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮，其在探针序列中发挥着“补丁”的作用修补HIV-1 M组变异体之间的错配(多态性)位点。这两个与在表2中序列的位点4和13的互补物相对应的特殊位点的多态性，与在HIV基因组中被确定为嘌呤碱基(A或G)的多态性位点相对应。在探针中将通用嘧啶置于这些位点使得能够检测每个碱基，从而扩展了测定特异性。从相同基因组序列设计探针1和探针2，然而，探针1与HIV-1 M组A亚型、B亚型、C亚型、D亚型、F亚型和CRF01 具有更高的同源性，而探针2与G亚型和CRF02具有更高的同源性。在相同测试中同时使用两种探针可以提供所有6种M组亚型以及CRF01和 CRF02的检测。
探针1和探针2的所有胞苷碱基被丙炔-dC替换，丙炔-dC是具有连接于胞苷的5号碳原子的丙炔基的胞苷类似物。这种修饰提高了补偿“补丁”失稳效应且增进双螺旋形成的探针/目标物复合物的稳定性，从而既提高了测定特异性又增加了测定灵敏度。使用FAM和BHQ1来标记探针1 和探针2用于实时PCR检测，并且在实时PCR仪器上在同一过滤器中检测探针1和探针2。
用Quasar 670和BHQ2来标记用于检测HIV-1 O组的探针3，并且在不同的过滤器中检测探针3。通过在每个过滤器中降低荧光背景和提高信噪比，这种在不同过滤器之间探针的分离进一步增加了测定灵敏度。
PCR测定的扩增条件是一组时间和温度参数，其在PCR运行期间循环变化。扩增条件一般包括：变性步骤，在此期间核酸模板变性为单链的并且适合于引物和探针退火的状态、退火步骤，在此期间引物和探针退火至模板上和延伸步骤，在此期间由模板合成新的DNA拷贝。在RNA模板的情况下，在PCR之前加入反转录(RT)步骤以将RNA转录为cDNA。在实时PCR中，将退火和延伸结合至一个步骤中。可以基于引物的熔点 (Tm)和反应所需的严格程度来选择退火/延伸步骤的温度。较低的温度可以更多地容许在引物和/或探针中的错配，并且可以扩大测定特异性。另一方面，如果在引物和/或探针与模板之间不存在错配，由于核酸二级结构的不充分解链，过低的退火/延伸温度可能会而降低检测的灵敏度。本实施例使用了较低和较高的退火/延伸温度的组合以提高具有错配的变异体的检测(提高测定特异性)并确保不具有错配的变异体的灵敏检测(提高测定灵敏度)。

Claims (10)

1.一种作为用于测定HIV-1M组不同亚型的探针的分离的核酸分子，由以下列出的核苷酸序列组成：
5’-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3’(SEQ ID NO:10)；或
5’-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3’(SEQ ID NO:11)；
其中p＝通用核苷酸并且n＝具有C-5修饰的胞苷类似物。
2.根据权利要求1所述的分离的分子，其中，p是6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮，其中n是5-(1-丙炔基)-2’-脱氧胞苷。
3.根据权利要求1所述的分离的分子，其中，用FAM/BHQ-1标记所述分子。
4.一种包括权利要求1所述的分子的组合物，其中，所述组合物进一步包括由在SEQ IDNO:14中列出的序列组成的第一正向引物和由在SEQ ID NO:15中列出的序列组成的第一反向引物，其中所述第一正向引物和所述第一反向引物在PCR条件下各自能够退火至目标序列从而来扩增所述目标序列。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括：由在SEQ ID NO:6中列出的序列组成的寡核苷酸探针、由在SEQ ID NO:16中列出的序列组成的第二正向引物和由在SEQ ID NO:17中列出的序列组成的第二反向引物。
6.权利要求4所述的组合物在制备用于扩增目标序列的试剂中的应用，其中，所述扩增包括：
使所述试剂与所述目标序列在PCR条件下接触。
7.由在SEQ ID NO:14中列出的序列组成的正向引物和由在SEQ ID NO:15中列出的序列组成的反向引物在制备用于测定样品中的HIV的试剂中的应用，所述测定包括：
(a)用在样品中的核酸模板、使用所述试剂进行PCR；以及
(b)使由所述正向引物和所述反向引物产生的扩增子与权利要求1所述的作为用于测定HIV-1M组不同亚型的探针的分离的核酸分子接触，所述核酸分子包括由在SEQ ID NO:10中列出所述序列组成的第一寡核苷酸和由在SEQ ID NO:11中列出所述序列组成的第二寡核苷酸，其中所述扩增子的检测表示在所述样品中存在所述HIV。
8.一种包括权利要求1所述的分离的分子的试剂盒。
9.一种包括权利要求4所述的组合物的试剂盒。
10.一种包括权利要求5所述的组合物的试剂盒。
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