PT1338657E

PT1338657E - Sequências especificamente deletadas do genoma de mycobacterium tuberculosis e o seu uso em diagnóstico e como vacinas.

Info

Publication number: PT1338657E
Application number: PT02290458T
Authority: PT
Inventors: Stewart Cole; Roland Brosch; Stephen Glyn Hewinson Gordon; Karin Eiglmeier; Thierry Garnier
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2002-02-25
Publication date: 2007-06-21
Also published as: WO2003070981A2; AU2003208539A1; WO2003070981A8; CY1106584T1; JP4738740B2; DK1338657T3; ATE360097T1; CA2477195A1; ATE403752T1; JP2005518203A; DE60219589T2; DE60322674D1; US7977047B2; DE60219589D1; EP1478777A2; AU2003208539B2; CA2477195C; ES2286212T3; EP1478777B1; EP1338657B1

Description

DESCRIÇÃO

SEQUÊNCIAS ESPECIFICAMENTE DELETADAS DO GENOMA DE Mycobacterium tuberculosis E O SEU USO EM DIAGNÓSTICO E COMO

VACINAS A presente invenção diz respeito ao campo da biologia, mais particularmente o objecto da presente invenção consiste na identificação de uma sequência nucleotidica que torna possivel em particular distinguir uma infecção que resulta de Mycobacterium tuberculosis de uma infecção que resulta de Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettíí,

Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG. 0 objecto da presente invenção consiste também num método para detectar as sequências em questão pelos produtos de expressão destas sequências e os estojos para levar a cabo estes métodos. Finalmente, o objecto da presente invenção consiste em novas vacinas.

Apesar de ter passado mais de um século de pesquisa desde a detecção de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, esta doença permanece uma das principais causas de mortalidade humana. É esperado que M. tuberculosis mate 3 milhões de pessoas anualmente (Snider, 1989 Rev. Inf. Dis. S335) e o número de novas pessoas a serem infectadas cada ano está a aumentar e é estimado em 8,8 milhões. Embora a maioria destas esteja em países em desenvolvimento, a doença está a assumir importância renovada nos países ocidentais devido ao número crescente de pessoas sem abrigo, o impacto da epidemia da SIDA, a migração global variável, e os padrões de viagem. 1

A tuberculose precoce não é frequentemente reconhecida num indivíduo sob outros aspectos saudável. Métodos iniciais clássicos de diagnóstico incluem exame de uma amostra de expectoração sob um microscópio para micobactéria ácido-resistentes e uma radiografia dos pulmões. Contudo, numa vasta maioria de casos o exame da expectoração é negativo para Micobactéria nas fases iniciais da doença, e alterações pulmonares podem não ser óbvias numa radiografia até vários meses seguintes à infecção. Outro factor de complicação é que a bactéria ácido-resistente numa amostra de expectoração pode ser frequentemente outra espécie de Micobactéria. Antibióticos usados para tratar a tuberculose têm efeitos colaterais consideráveis, e devem ser tomados em combinação de três ou mais drogas durante um período de seis a doze meses. Além disso, a possibilidade de induzir o aparecimento de tuberculose resistente a droga previne a terapia de ser administrada sem sólida evidência para suportar o diagnóstico. Actualmente o único método de diagnóstico absolutamente seguro é baseado em cultura de M. tuberculosis da espécie clínica e identificá-la morfológica e bioquimicamente. Isto demora normalmente de três a seis semanas, durante tempo esse que um paciente pode ficar seriamente doente e pode infectar outros indivíduos. Assim, um teste rápido capaz de detectar com segurança a presença de M. tuberculosis é vital para a detecção precoce e tratamento. Foram desenvolvidos recentemente vários testes moleculares para a rápida detecção e identificação de M. tuberculosis, tal como a Sonda-Gen "Teste Directo de Mycobacterium tuberculosis Amplificado"; este teste amplifica o ARN ribossómico 16S de M. tuberculosis de espécimes respiratórias e usa uma sonda quimioluminescente para detectar o produto amplificado com uma sensibilidade relatada de cerca de 91%. A 2 descoberta do elemento de inserção IS6110 (Cave et al., Eisenach et al., 1990 J. Infectious Diseases 161: 977-981; Thierry et al. 1990 J. Clin. Microbiol. 28: 2668-2673) e a convicção que este elemento só pode estar presente no complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum e M. microti) gerou uma série completa de estratégias de diagnóstico rápidas (Brisson-Noel et al., 1991 Lancet 338: 364-366; Clarridge et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31: 2049-2056; Cormican et al. 1992 J. Clin. Pathology 1992,45: 601-604; Cousins et al., 1992 J. Clin. Microbiol. 30: 255-258; Del Portillo et al. 1991 J. Clin. Microbiol. 29:2163-2168; Folgueira et al., 1994 Neurology 44: 1336-1338; Forbes et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31: 1688-1694; Hermans et al. 1990 J. Clin. Microbiol. 28: 1204-1213; Kaltwasser et al. 1993 Mol. Cell. Probes 7: 465-470; Kocagoz et al. 1993 J. Clin. Microbiol. 31: 1435-1438; Kolk et al. 1992 J. Clin. Microbiol. 30: 2567-2575; Kox et al. 1994 J. Clin. Microbiol. 32: 672-678; Liu et al. 1994 Neurology 44: 1161-1164; Miller et al. 1994 J. Clin. Microbiol. 32: 393 — 397; Reischl et al. 1994 Biotechniques 17: 844-845; Schluger et al. 1994 Chest 105: 1116-1121; Shawar et al. 1993 J. Clin. Microbiol. 31: 61-65; Wilson et al 1993 J. Clin. Microbiol. 28: 2668-2673). Estes testes empregam várias técnicas para extrair ADN da expectoração. É usada PCR para amplificar sequências de ADN IS6110 do ADN extraído. A amplificação bem sucedida deste ADN é considerada como um indicador da presença de infecção por M. tuberculosis. Patentes U.S. Nos 5168039 e 5370998 que foram concedidas a Crawford et al. para a detecção baseada em IS6110 de tuberculose. A Patente Europeia EP 0461045 foi concedida a Guesdon para a detecção baseada em IS6110 de tuberculose. 3

Assim, estes ensaios moleculares usados para detectar M. tuberculosis dependem da sequência de inserção IS6110 (aproximadamente 10 cópias) ou do ARN ribossómico 16S (milhares de cópias). Contudo, estes métodos não proporcionam qualquer informação relativa ao sub-tipo da micobactéria. De facto são conhecidas várias dúzias de espécies de Micobactéria, e a maioria não é patogénica para humanos; a tuberculose é normalmente causada por infecção devida a M. tuberculosis, com alguns casos a serem causados por M. bovis, M. canettii, e M. africanum. De modo a escolher um tratamento apropriado e a conduzir investigações epidemiológicas é absolutamente necessário ser capaz de rapidamente e com precisão identificar os isolados, i.e. distinguir o sub-tipo de micobactéria do complexo Mycobacterium, originário de potenciais pacientes de tuberculose. Este é o problema que a presente invenção pretende resolver. O presente pedido descreve um ácido nucleico isolado ou purificado em que o dito ácido nucleico é seleccionado do grupo que consiste em: a) SEQ ID N°1 b) Ácido nucleico que tem uma sequência completamente complementar a SEQ ID N°l. c) Fragmento de ácidos nucleicos compreendendo pelo menos 8, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 nucleótidos consecutivos da SEQ ID N°1; d) Ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade de sequência após alinhamento óptimo com uma sequência definida em a) ou b); e) Ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com o ácido nucleico definido em a) ou b); 4

Contudo, o objecto da invenção é como reivindicado na reivindicação 1.

Tal como é aqui usado, os termos "isolado" e "purificado" de acordo com a invenção referem-se a um nivel de pureza que é alcançável usando tecnologia corrente. As moléculas da invenção não necessitam ser absolutamente puras (i.e., não conter absolutamente nenhuma molécula de outra macromolécula celular), mas deverão ser suficientemente puras de forma que um perito na arte reconhecerá que elas já não estão presentes no ambiente no qual foram originalmente encontradas (i.e., o meio celular). Assim, uma molécula purificada ou isolada de acordo com a presente invenção é uma que foi removida de pelo menos uma outra macromolécula presente no ambiente natural no qual foi encontrada. Mais preferivelmente, as moléculas da invenção são essencialmente purificadas e/ou isoladas, o que significa que a composição na qual estão presentes é praticamente completamente, ou mesmo absolutamente, livre de outras macromoléculas encontradas no ambiente no qual as moléculas da invenção são originalmente encontradas. Assim o isolamento e a purificação não ocorrem por adição ou remoção de sais, solventes, ou elementos da tabela periódica, mas têm que incluir a remoção de pelo menos algumas macromoléculas. Os ácidos nucleicos abrangidos pela invenção são purificados e/ou isolados por qualquer técnica apropriada do conhecimento do técnico comum. Tais técnicas são extensamente conhecidas, comumente praticadas, e bem dentro da perícia do técnico comum. Tal como é aqui usado, o termo "ácido nucleico" refere-se a uma sequência polinucleotídica tal como uma sequência de ADN de cadeia simples ou dupla, sequência de ARN, sequência de ADNc; uma tal sequência polinucleotídica foi isolada, purificada ou sintetizada e pode ser constituída 5 com nucleótidos naturais ou não naturais. Num modo de execução preferido a molécula de ADN da invenção é uma molécula de ADN de cadeia dupla. Tal como é aqui usado, os termos "ácido nucleico", "oligonucleótido", "polinucleótido" têm o mesmo significado e são indiferentemente usados.

Pretende-se que o termo "complexo Mycobacterium" tal como é aqui usado, signifique o complexo de micobactérias que causa tuberculose que são Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii e a estirpe de vacina Mycobacterium bovis BCG. 0 presente pedido descreve não só a sequência completa SEQ ID N° 1, o seu complemento, e a sua forma de cadeia dupla, mas qualquer fragmento desta sequência, o seu complemento, e a sua forma de cadeia dupla.

Tipicamente, o fragmento de SEQ ID N°1 compreende pelo menos aproximadamente 8 nucleótidos. Por exemplo, o fragmento pode ser de entre aproximadamente 8 e 30 nucleótidos e pode ser projectado como um iniciador para sintese polinucleotídica. Por exemplo, o fragmento da SEQ ID N°1 compreende aproximadamente entre 1500 e aproximadamente 2500 nucleótidos, e mais preferivelmente 2153 nucleótidos que correspondem à SEQ ID N°4. Tal como é aqui usado, "nucleótidos" é usado em referência ao número de nucleótidos num ácido nucleico de cadeia simples. Contudo, o termo também abrange moléculas de cadeia dupla. Assim, um fragmento que compreende 2153 nucleótidos de acordo com a invenção é uma molécula de cadeia simples compreendendo 2153 nucleótidos, e também uma molécula de cadeia dupla compreendendo 2153 pares 6 de bases (pb).

Tipicamente, o fragmento de ácidos nucleicos como descrito no presente pedido é especificamente deletado no genoma de Mycobacterium tuberculosis, e presente no genoma de Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii,

Mycobacterium mícrotí, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG. 0 fragmento de ácidos nucleicos como descrito no presente pedido é preferivelmente seleccionado do grupo que consiste em: a) SEQ ID N°4 b) Ácido nucleico tendo uma sequência completamente complementar à SEQ ID N°4. c) Fragmento de ácidos nucleicos compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 nucleótidos consecutivos da SEQ ID N°4; d) Ácido nucleico tendo pelo menos 90% da identidade da sequência após alinhamento óptimo com uma sequência definida em a) ou b); e) Ácido nucleico que hibridiza sob condições rigorosas com o ácido nucleico definido em a) ou b) ; Contudo, o objecto da invenção é como reivindicado na reivindicação 2. Tipicamente, as condições rigorosas sob as quais uma sequência de acordo com o pedido é determinada são condições que não são menos rigorosas que 5xSSPE, 2x solução Denhardt e dodecilsulfato sódico a 0,5% (m/v) a 65°C. Podem ser utilizadas condições mais rigorosas pelo técnico comum, e as condições próprias para uma determinada análise podem ser facilmente e rapidamente determinadas sem experimentação imprópria ou excessiva. Como modo de execução ilustrativo, as 7 condições de hibridação rigorosas usadas de forma a detectar especificamente um polinucleótido de acordo com a presente invenção são vantajosamente as seguintes: pré-hibridação e hibridação são executadas a 65°C um mistura contendo: - 5X SSPE (IX SSPE é NaCl 3M, citrato tri-sódico 30mM) - 2X solução de Denhardt - dodecilsulfato sódico (SDS) a 0,5% (m/v) -100 yg ml’1 de ADN de esperma de salmão.

As lavagens são executadas como se segue: duas lavagens a temperatura de laboratório (aproximadamente 21-25°C) durante 10 min. na presença de 2X SSPE e SDS a 0,1%; e uma lavagem a 65°C durante 15 min. na presença de IX SSPE e SDS a 0,1%. A invenção também abrange o ácido nucleico isolado ou purificado da invenção em que o dito ácido nucleico compreende pelo menos uma deleção de um fragmento de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 2.

Os polinucleótidos como descrito no presente pedido podem ser caracterizados pela percentagem de identidade que eles apresentam com as sequências aqui descritas. Por exemplo, polinucleótidos que têm pelo menos 90% de identidade com os polinucleótidos como descrito no presente pedido, particularmente as sequências da listagem de sequências, são descritos no presente pedido. De preferência, as sequências apresentam pelo menos 90% de identidade com as da listagem de sequências. Mais preferivelmente, apresentam pelo menos, 92% de identidade, por exemplo 95% ou 99% de identidade. O técnico qualificado pode identificar sequências de acordo com a invenção como descrito no presente pedido pelo uso do software de análise de sequência BLAST (ver por exemplo, Coffin et al., eds., "Retroviruses", Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 723 - 755) . A percentagem de identidade é calculada usando o conjunto de programas de análise de sequência BLAST, Versão 2, disponível em NCBI (NIH). Todos os parâmetros de defeito são usados. BLAST (Ferramenta De Pesquisa De Alinhamento Local Básico) é o algoritmo de pesquisa heurístico empregue pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx, estando todos disponíveis pelo conjunto de software de análise BLAST no NCBI. Estes programas atribuem significância aos seus resultados usando os métodos estatísticos de Karlin e Altschul (1990,1993) com alguns acrescentos. Usando este conjunto de programas de análise de sequência disponível ao público, o técnico qualificado pode facilmente identificar polinucleótidos como descrito no presente pedido.

Está bem dentro da perícia do técnico na arte identificar regiões da sequência de ácidos nucleicos da invenção ou como previamente descrito, que serão úteis como sonda, iniciador, ou outra auxiliar experimental, de diagnóstico, ou terapêutico. Por exemplo, o técnico comum pode utilizar quaisquer programas de análises de sequência extensamente disponíveis para seleccionar regiões (fragmentos) destas sequências que são úteis para análises de hibridação tais como manchas a Sul, manchas a Norte, ensaios de ligação de ADN, e/ou hibridações in vitro, in situ, ou in vivo. Adicionalmente, o técnico comum, com as sequências da presente invenção, ou como previamente descrito, pode utilizar programas de análises de sequência extensamente disponíveis para identificar regiões que podem ser usadas 9 como sondas e iniciadores, bem como para projectar moléculas anti-sentido. A única limitação prática no fragmento escolhido pelo técnico comum é a capacidade do fragmento em ser útil para o propósito para o qual é escolhido. Por exemplo, se o técnico comum desejasse escolher uma sonda de hibridação, ele saberia como escolher uma de comprimento suficiente, e de estabilidade suficiente, para originar resultados significativos. As condições escolhidas seriam as tipicamente usadas em análises de hibridação desenvolvidas para fragmentos de ácidos nucleicos do comprimento escolhido aproximado.

Assim, a presente invenção proporciona oligonucleótidos curtos, úteis como sondas e iniciadores. Em modos de execução, a sonda e/ou iniciador compreende 8 a 30 nucleótidos consecutivos do polinucleótido de acordo com a invenção, ou do polinucleótido complementar deste. Tipicamente, um fragmento como aqui definido tem um comprimento de pelo menos 8 nucleótidos, que é aproximadamente o comprimento minimo que foi determinado para permitir hibridação especifica. Por exemplo, o fragmento nucleico tem um comprimento de pelo menos 12 nucleótidos e mais preferivelmente 20 nucleótidos consecutivos de qualquer das SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°4. A sequência, de acordo com a presente invenção, é seleccionada do seguinte grupo SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16, SEQ ID N°17, SEQ ID N°18. Mais precisamente, o par de iniciadores SEQ ID N°13/SEQ ID N°14, e SEQ ID N°15 e SEQ ID N°16 são específicos para o fragmento de ácidos nucleicos SEQ ID N°4. O par de iniciadores SEQ ID N°17/SEQ ID N°18 é específico para a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N°1 e flanqueiam o fragmento de ácidos nucleicos da SEQ ID N°4. 10

Assim, os polinucleótidos da SEQ ID N°1 e SEQ ID N°4 podem ser usados para seleccionar iniciadores nucleótidos, notavelmente para uma reacção de amplificação, tal como as reacções de amplificação posteriormente descritas. A PCR é descrita na Patente US de N° 4683202. Os fragmentos amplificados podem ser identificados por electroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, por uma electroforese capilar, ou alternativamente por uma técnica cromatográfica (filtração em gel, cromatografia hidrofóbica, ou cromatografia de troca iónica). A especificidade da amplificação pode ser assegurada por uma hibridação molecular usando como sondas nucleicas os polinucleótidos da SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°4, e os seus fragmentos, oligonucleótidos que são complementares destes polinucleótidos ou fragmentos destes, ou os seus próprios produtos de amplificação, ou mesmo sequenciação de ADN.

Também podem ser usadas as outras técnicas seguintes relacionadas com amplificação de ácido nucleico e são geralmente preferidas à técnica de PCR. A técnica de Amplificação por Deslocamento de Cadeia (SDA) é uma técnica de amplificação isotérmica baseada na capacidade de uma enzima de restrição em clivar uma das cadeias num sítio de reconhecimento (que está sob uma forma hemifosforotioato) e na propriedade de uma polimerase de ADN para iniciar a síntese de uma nova cadeia a partir da extremidade 3'OH gerada pela enzima de restrição e na propriedade desta polimerase de ADN em deslocar a cadeia previamente sintetizada a ser localizada a jusante. A técnica de amplificação SDA é mais facilmente executada que a PCR (é 11 necessário um único aparelho de banho de água termostatizado) , e é mais rápida do que os outros métodos de amplificação. Assim, a presente invenção também compreende o uso dos fragmentos de ácidos nucleicos de acordo com a invenção (iniciadores) num método de amplificação de ADN ou ARN de acordo com a técnica de SDA.

Quando o polinucleótido alvo a ser detectado é um ARN, por exemplo um ARNm, será usada uma enzima transcriptase reversa antes da reacção de amplificação de forma a obter um ADNc do ARN contido na amostra biológica. 0 ADNc gerado é subsequentemente usado como o ácido nucleico alvo para os iniciadores ou as sondas usadas num processo de amplificação ou num processo de detecção de acordo com a presente invenção.

Os polinucleótidos ou oligonucleótidos não-marcados da invenção podem ser directamente usados como sondas. Não obstante, os polinucleótidos ou oligonucleótidos são geralmente marcados com um elemento radioactivo (32p, 35S, 3H, 125I) ou por uma molécula não-isotópica (por exemplo, biotina, acetilaminofluoreno, digoxigenina, 5-bromodesoxiuridina, fluoresceína) de forma a gerar sondas que são úteis para numerosas aplicações. São descritos exemplos de marcação não-radioactiva de fragmentos de ácidos nucleicos na patente Francesa FR 78 10975 e por Urdea et al. (1988, Nucleic Acids Research 11: 4937-4957) ou Sanchez-Pescador et al. (1988, J. Clin. Microbiol. 26 (10): 1934-1938). Também podem ser usadas outras técnicas de marcação, tais como as descritas nas patentes Francesas FR 2 422 956 e FR 2 518 755. O passo de hibridação pode ser executado de modos diferentes. Ver, por exemplo, Matthews et al., 1988, Anal. Biochem. 169:1-25. Um 12 método geral compreende imobilizar o ácido nucleico que foi extraido da amostra biológica num substrato (por exemplo, nitrocelulose, nylon, poliestireno) e depois incubar, em condições definidas, o ácido nucleico alvo com a sonda. Subsequente ao passo de hibridação, a quantidade em excesso da sonda especifica é descartada e as moléculas híbridas formadas são detectadas por um método apropriado (radioactividade, fluorescência ou medição da actividade enzimática, etc.).

Os fragmentos nucleotídicos amplificados são úteis, entre outras coisas, como sondas usadas em reacções de hibridação para detectar a presença de um polinucleótido de acordo com a presente invenção ou de forma a detectar mutações. Os iniciadores também podem ser usados como sondas oligonucleotídicas para detectar especificamente um polinucleótido de acordo com a invenção.

As sondas oligonucleotídicas de acordo com a presente invenção também podem ser usadas num aparelho de detecção compreendendo uma biblioteca de matriz de sondas imobilizadas num substrato, estando a sequência de cada sonda de um determinado comprimento localizada numa troca de uma ou várias bases, uma de outra, sendo assim cada sonda da biblioteca de matriz complementar a uma sequência distinta do ácido nucleico alvo. Facultativamente, o substrato da matriz pode ser um material capaz de actuar como um dador de electrões, sendo a detecção das posições da matriz nas quais uma hibridação ocorreu subsequentemente determinada por um aparelho electrónico. Tais bibliotecas de matriz de sondas e métodos de detecção específica de um ácido nucleico alvo encontram-se descritos no pedido de patente Europeia 13 N° EP-0 713 016 (tecnologias Affymax) e também na patente US N° US-5202231 (Drmanac). Uma vez que quase todo o comprimento de um cromossoma micobacteriano é coberto por biblioteca de ADN genómico baseada em BAC- (i.e. 97% do cromossoma de M. tuberculosis é coberto pela biblioteca BAC 1-1945), estas bibliotecas de ADN terão um papel importante numa pluralidade de aplicações pós-genómicas, tais como em estudos de expressão de genes micobacterianos onde o conjunto canónico de BACs pode ser usado como uma matriz para estudos de hibridação. Assim também é descrito no presente pedido o proporcionar uns chips de ácidos nucleicos, mais precisamente chips de ADN ou chips de proteína que compreendem respectivamente um ácido nucleico ou um polipéptido como previamente descrito. A presente invenção também proporciona um vector compreendendo a molécula de ADN isolada da invenção. Um "vector" é um replicão no qual é ligado outro segmento de polinucleótido, de forma a conduzir a replicação e/ou expressão ao segmento ligado. Um vector pode ter um ou mais sítios de reconhecimento da endonuclease de restrição nos quais as sequências de ADN podem ser cortadas de uma determinada forma sem perda de uma função biológica essencial do vector, e nos quais um fragmento de ADN pode ser entrançado de forma a originar a sua replicação e clonagem. Os vectores podem adicionalmente proporcionar sítios iniciadores (e. g. para PCR), iniciação de transcrição e/ou tradução e/ou sítios de regulação, sinais de recombinação, replicões, marcadores seleccionáveis, etc. Para além do uso de recombinação homóloga ou enzimas de restrição para inserir um fragmento de ADN desejado no vector, também pode ser aplicada clonagem UDG de fragmentos de PCR (Patente US N°. 14 5334575), Clonagem T:A, e semelhantes. 0 vector de clonagem pode adicionalmente conter um marcador seleccionado adequado para uso na identificação de células transformadas com o vector de clonagem. O vector pode ser qualquer vector útil do conhecimento do técnico comum, incluindo, mas não limitado a, um vector de clonagem, um vector de inserção, ou um vector de expressão. Exemplos de vectores incluem plasmideos, fagos, cosmideos, fagemideo, cromossoma artificial de levedura (YAC), cromossoma artificial bacteriano (BAC), cromossoma artificial humano (HAC), vector virico, tal como vector adenovirico, vector retrovirico, e outras sequências de ADN que são capazes de replicar ou de serem replicadas in vitro ou numa célula hospedeira, ou de transportar um segmento de ADN desejado para um local desejado dentro de uma célula hospedeira. De acordo com um modo de execução preferido da invenção, o vector recombinante é um pBeloBACll de BAC no qual a região genómica de Mycobacterium bovis-BCG 1173P3 que abrange a região que corresponde ao locus 1760753 pb a 1830364 pb no genoma de M. tuberculosis H37Rv foi inserido no sitio de restrição HindIII; este vector recombinante é designado X229. Nesta região, os inventores demonstraram a deleção de um fragmento 2153 pb na vasta maioria de estirpes de M. tuberculosis. Esta é a razão pela qual os inventores designaram esta deleção TbDl ("deleção 1 especifica de M. tuberculosis ") . A TbDl é flanqueada pela sequência GGC CTG GTC AAA CGC GGC TGG ATG CTG e AGA TCC GTC TTT GAC ACG ATC GAC G. Podem ser usados iniciadores externos que hibridizam com tais sequências ou sequências complementares destas para a amplificação de TbDl para conferir a presença ou ausência da deleção de TbDl. Os inventores projectaram por exemplo os 15 seguintes iniciadores: 5'-CTA CCT CAT CTT CCG GTC CA-3' (SEQ ID N°17) 5'-CAT AGA TCC CGG ACA TGG TG-3'(SEQ ID N°18)

De forma a adquirir uma sonda de 500 pb especifica para experiências de hibridação, uma amplificação por PCR de um fragmento interno pode ser realizada usando o plasmideo X229 como matriz. A amplificação de um fragmento de aproximadamente 500 pb contido em TbDl pode ser executada usando os seguintes iniciadores: 5'-CGT TCA ACC CCA AAC AGG TA-3' (SEQ ID N°13) 5'-AAT CGA ACT CGT GGA ACA CC-3'(SEQ ID N°14) A amplificação de um fragmento de aproximadamente 2000 pb contidos em TbDl pode ser executada usando os seguintes: iniciadores: 5'-ATT CAG CGT CTA TCG GTT GC-3' (SEQ ID N°15) 5'-AGC AGC TCG GGA TAT CGT AG-3' (SEQ ID N° 16)

As condições de PCR são as seguintes: desnaturação 95°C, 1 min, em seguida 35 ciclos de amplificação [95°C durante 30 segundos, 58°C durante 1 min], em seguida elongação 72°C durante 4 min.

Assim, esta invenção diz também respeito a uma célula hospedeira recombinante que contém um polinucleótido ou vector recombinante de acordo com a invenção. A célula hospedeira pode ser transformada ou transfectada com um polinucleótido ou vector recombinante para proporcionar 16 expressão transitória, estável, ou controlada do polinucleótido desejado. Por exemplo, o polinucleótido de interesse pode ser subclonado num plasmideo de expressão num sitio de clonagem a jusante de um promotor no plasmideo e o plasmideo pode ser introduzido numa célula hospedeira onde a expressão pode ocorrer. A célula hospedeira recombinante pode ser qualquer hospedeiro adequado conhecido do perito na arte, tal como uma célula eucariótica ou um microorganismo. Por exemplo, o hospedeiro pode ser uma célula seleccionada do grupo que consiste em Escherichia coli, Bacillus subtilis, células de insecto, e leveduras. De preferência, a célula hospedeira recombinante é uma Escherichia coli DH10B comercialmente disponível (Gibco) contendo o designado X229 de BAC previamente descrito. Esta Escherichia coli DH10B (Gibco) contendo o designado X229 de BAC foi depositada com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Instituto Pasteur, Paris, França, em 18 de Fevereiro de 2002 com o número CNCMI-2799.

Outro aspecto da invenção consiste nos polipéptidos isolados ou purificados codificados por um polinucleótido da invenção, em particular o ácido nucleico das reivindicações 1 ou 2. O polipéptido purificado compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID N°2, N°8, N°10, N°12 e os seus fragmentos. Por exemplo, o polipéptido purificado da invenção pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°8, uma forma truncada de mmpL6. O polipéptido purificado da invenção pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°10, que é a sequência de aminoácidos da proteína mmpS6 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°12 uma forma truncada de mmpS6. 17 É actualmente fácil produzir proteínas em grandes quantidades através de técnicas de engenharia genética pelo uso de vectores de expressão, tais como plasmídeos, fagos, e fagemídeos. 0 polipéptido da presente invenção pode ser produzido por inserção do polinucleótido apropriado num vector de expressão apropriado na posição apropriada dentro do vector. Tal manipulação de polinucleótidos é bem conhecida e amplamente praticada pelo técnico comum. 0 polipéptido pode ser produzido destes vectores recombinantes in vitro ou in vivo. Todos os ácidos nucleicos isolados ou purificados que codificam o polipéptido da invenção encontram-se no âmbito da invenção. Um polipéptido descrito no presente pedido é um polipéptido codificado por um polinucleótido que hibridiza com qualquer uma das SEQ ID N° 1 ou N°4 sob condições rigorosas, como aqui definido.

Mais preferivelmente, o dito ácido nucleico isolado ou purificado de acordo com a invenção é seleccionado entre: - SEQ ID N°7 que codifica o polipéptido de SEQ ID N 8; - SEQ ID N°9 que codifica o polipéptido de SEQ ID N 10; - SEQ ID N°ll que codifica o polipéptido de SEQ ID N 12. O presente pedido também descreve um método para a detecção e identificação discriminatória de:

Mycobacterium tuberculosis versus,

Mycobacterium africanum, Mycobacterium , Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) isolamento do ADN da amostra biológica a ser 18 analisada ou produção de um ADNc a partir do ARN da amostra biológica, b) detecção das sequências de ácido nucleico das micobactérias presentes na dita amostra biológica, c) análise para a presença ou ausência de um fragmento de ácidos nucleicos como previamente descrito.

Pretende-se, especialmente, que amostra biológica de acordo com a presente invenção, signifique um fluido biológico, tal como expectoração, saliva, plasma, sangue, urina ou esperma, ou um tecido, tal como uma biópsia. A análise das sequências desejadas pode, por exemplo, ser levada a cabo através de electroforese em gel de agarose. Se é observada a presença de um fragmento de ADN que migra para o local esperado, pode ser concluído que a amostra analisada contem ADN de micobactéria. Esta análise também pode ser

levada a cabo pela técnica de hibridaçâo molecular usando uma sonda nucleica. Esta sonda será vantajosamente marcada com um elemento não-radioactivo (sonda fria) ou radioactivo. Vantajosamente, a detecção das sequências de ADN micobacteriano será levada a cabo usando sequências nucleotídicas complementares às ditas sequências de ADN. A título de exemplo, podem incluir sondas nucleotídicas marcadas ou não-marcadas; também podem incluir iniciadores para amplificação. A técnica de amplificação usada pode ser PCR mas também outra técnica alternativa tais como técnica SDA (Amplificação por Deslocamento de Cadeia) , técnica TAS (Sistema de Amplificação baseada em Transcrição), técnica NASBA (Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucleicos) ou técnica TMA (Amplificação Mediada por Transcrição) . 19

Os iniciadores em conformidade com a invenção têm uma sequência nucleotidica escolhida do grupo compreendendo SEQ ID N° 13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQID N°16, SEQ ID N°17, SEQ ID N° 18. Os pares SEQ ID N°13/SEQ ID N° 14, e SEQ ID N°15/SEQ ID N°16 específicos para o fragmento de ácidos nucleicos SEQ ID N° 4, e o par SEQ ID N°17/SEQ ID N°18 específico para o ácido nucleico da invenção.

Numa variante, o presente pedido também descreve um método para a detecção discriminatória e identificação de:

Mycobacterium tuberculosis versus,

Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis,

Mycobacterium bovis BCG numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) colocar a amostra biológica a ser analisada em contacto com pelo menos um par de iniciadores como acima definido, tendo sido o ADN contido na amostra, onde apropriado, tornado antecipadamente acessível à hibridação, b) amplificação do ADN da micobactéria, c) visualização da amplificação dos fragmentos de ADN.

Os fragmentos amplificados podem ser identificados por electroforese em gel de agarose ou poliacrilamida por electroforese capilar ou por uma técnica cromatográfica (filtração em gel, cromatografia hidrofóbica ou cromatografia de troca iónica). A especificação da amplificação pode ser controlada por hibridação molecular usando sondas, plasmídeos 20 contendo estas sequências ou os seus produtos de amplificação. Os fragmentos nucleotidicos amplificados podem ser usados como reagentes em reacções de hibridação com vista a detectar a presença, numa amostra biológica, de um ácido nucleico alvo tendo sequências complementares às dos ditos fragmentos nucleotidicos amplificados. Estas sondas e amplicões podem ser por outro lado marcados com elementos radioactivos ou com moléculas não-radioactivas tais como enzimas ou elementos fluorescentes. detecção e canettii, bovis, biológica, 0 presente pedido também descreve um estojo para a identificação discriminatória de:

Mycobacterium tuberculosis versus, Mycobacterium africanum, Mycobacterium Mycobacterium microti, Mycobacterium

Mycobacterium bovis BCG numa amostra compreendendo os elementos seguintes: a) pelo menos um par de iniciadores seleccionados entre fragmentos de ácidos nucleicos de acordo com as reivindicações 1 a 3, 6 e 7. b) os reagentes necessário para levar a cabo uma reacção de amplificação de ADN. 0 presente pedido descreve um estojo compreendendo facultativamente o elemento c): c) os componentes necessários que tornam possível verificar ou comparar a sequência e/ou o tamanho do fragmento amplificado.

De facto, dependendo do par de iniciadores usado, é possível obter resultados muito diferentes. Assim, o uso de 21 iniciadores que são internos à deleção, tais como por exemplo SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, é tal que não é detectável qualquer produto de amplificação em M. tuberculosis e que o produto de amplificação é detectável em Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG. Contudo, o uso de iniciadores externos à região de deleção não dá necessariamente o mesmo resultado, relativamente a por exemplo tamanho do fraqmento amplificado, dependendo do tamanho da região deletada em M. tuberculosis. Assim, o uso de par de iniciadores externos à deleção tal como SEQ ID N°17 e SEQ ID N°18 é provável dar origem a um amplicão em Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG de aproximadamente 2100 pb ao passo que o uso do par de iniciadores externos à deleção dará origem em M. tuberculosis a um amplicão de poucos pb.

Mais geralmente, a invenção diz respeito ao uso de pelo menos um par de iniciadores como reivindicado na reivindicação 16 para a amplificação de uma sequência de ADN de Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG. O objecto da invenção consiste também numa proteína, polipéptido ou fragmento polipeptídico que resulta da expressão da totalidade ou parte do fragmento de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 2. Pretende-se que a expressão "produto de expressão" signifique qualquer proteína, polipéptido ou fragmento polipeptídico que resulta da expressão da totalidade ou parte das sequências 22 nucleotídicas supra mencionadas. Entre os produtos de expressão, podemos citar as proteínas membranares mmpL6, mmpS6, e as suas formas truncadas ou rearranjadas devido a deleção do fragmento da invenção.

De facto, o presente pedido também descreve um método para a detecção discriminatória in vitro de anticorpos dirigidos contra Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium mícroti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG, numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) colocar a amostra biológica em contacto com pelo menos um produto como previamente definido, b) detectar o complexo antigene-anticorpo formado. 0 presente pedido também descreve um método para a detecção discriminatória de uma vacinação com Mycobacterium bovis BCG ou uma infecção por Mycobacterium tuberculosis, num mamífero, compreendendo os passos seguintes: a) preparação de uma amostra biológica contendo células, mais particularmente células do sistema imunitário do dito mamífero e mais particularmente células T, b) incubação da amostra biológica do passo a) com pelo menos um produto como previamente definido, c) detecção de uma reacção celular indicando sensibilização prévia do mamífero ao dito produto, em particular proliferação celular e/ou síntese, de proteínas tal como interferão gama. A proliferação celular pode ser medida, por exemplo, por incorporação de 3H-timidina. 23 0 pedido refere-se também a um estojo para o diagnóstico in vitro distintiva de uma infecção por Mycobacterium tuberculosis, num mamífero facultativamente antecipadamente vacinado com M. bovis de BCG compreendendo: a) um produto como previamente definido, b) onde apropriado, os reagentes para a constituição do meio adequado para a reacção imunológica, c) os reagentes permitindo a detecção dos complexos antigene-anticorpo produzidos pela reacção imunológica, d) onde apropriado, uma amostra biológica de referência (controlo negativo) livre de anticorpos reconhecidos pelo dito produto, e) onde apropriado, uma amostra biológica de referência (controlo positivo) contendo uma quantidade predeterminada de anticorpos reconhecidos pelo dito produto.

Os reagentes que permitem a detecção dos complexos antigene-anticorpo podem transportar um marcador ou podem ser capazes de serem reconhecidos por sua vez por um reagente marcado, mais particularmente no caso onde o anticorpo usado não é marcado. 0 objecto da invenção consiste também em anticorpos mono- ou policlonais, nos seus fragmentos quiméricos ou anticorpos, capazes de reconhecer especificamente um produto como definido na reivindicação 13. 0 presente pedido refere-se assim também a um método para a detecção discriminatória da presença de um antigene de Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microtí, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis-BCG, numa amostra biológica 24 compreendendo os passos seguintes: a) colocar a amostra biológica em contacto com um anticorpo da invenção, b) detectar o complexo antigene-anticorpo formado. A invenção refere-se também a um estojo para a detecção discriminatória da presença de um antigene de Mycobacterium tuberculosis com deleção TbDl de acordo com SEQ ID N°4 ou Mycobacterium tuberculosis sem deleção TbDl ou Mycobacterium africanum ou Mycobacterium canettii ou Mycobacterium microti ou Mycobacterium bovis ou Mycobacterium bovis BCG numa amostra biológica compreendendo os elementos seguintes: a) um anticorpo como previamente reivindicado na reivindicação 19, b) os reagentes para constituir o meio adequado para a reacção imunológica, c) os reagentes que permitem a detecção dos complexos antigene-anticorpo produzidos pela reacção imunológica.

Os reagentes supracitados são bem conhecidos de um perito na arte que não terá dificuldade em os adaptar ao contexto da presente invenção. 0 presente pedido também descreve uma composição imunológica, caracterizada por compreender pelo menos um produto de expressão como previamente descrito.

Vantajosamente, a composição imunogénica em conformidade com o presente pedido entra na composição de uma vacina quando é facultada em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável e facultativamente com um ou mais adjuvante (s) de 25 imunidade tal como alúmen ou um representante da família de muramilpéptidos ou o adjuvante de Freund incompleto. 0 presente pedido refere-se também a uma vacina compreendendo pelo menos um produto de expressão como previamente definido em combinação com um veículo farmaceuticamente compatível e, onde apropriado, um ou mais adjuvante(s) de imunidade apropriado(s). A invenção também proporciona um método in vitro para a detecção e identificação de Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) isolamento do ADN da amostra biológica a ser analisado ou produção de um ADNc a partir do ARN da amostra biológica, b) detecção das sequências de ácidos nucleicos da micobactéria presente na dita amostra biológica, c) análise para a presença ou ausência de um fragmento de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 2 da invenção.

Além disso, o objecto da invenção é como reivindicado nas reivindicações 13, 14 e 15.

Noutro modo de execução, o presente pedido descreve um método in vitro para a detecção e identificação de Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) colocar a amostra biológica a ser analisada em contacto com pelo menos um par de iniciadores seleccionados entre fragmentos de ácidos nucleicos como 26 previamente definido, e mais preferivelmente seleccionados entre os iniciadores escolhidos do grupo compreendendo SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, tendo sido o ADN contido na amostra, onde apropriado, tornado antecipadamente acessível à hibridação, b) amplificar o ADN da micobactéria, c) visualizar a amplificação dos fragmentos de ADN. A invenção também proporciona um estojo para a detecçâo da deleção TbDl de acordo com SEQ ID N°2 em Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica compreendendo os elementos seguintes: a) pelo menos um par de iniciadores comportando 8 a 30 nucleótidos consecutivos do polinucleótido de acordo com as reivindicações 2, 3 e 6 seleccionado entre fragmentos de ácidos nucleicos, e mais preferivelmente seleccionados entre os iniciadores escolhidos do grupo compreendendo SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, b) os reagentes necessários para levar a cabo uma reacção de amplificação de ADN. O presente pedido também descreve um estojo compreendendo facultativamente o elemento c) : c) os componentes necessários que tornam possível verificar ou comparar a sequência e/ou o tamanho do fragmento amplificado. O presente pedido refere-se também a um método para a 27 contra detecção in vitro de anticorpos dirigidos

Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) colocar a amostra biológica em contacto com pelo menos um produto como previamente definido, b) detectar o complexo antigene-anticorpo formado.

Também é um objectivo da invenção usar a deleção TbDl de acordo com SEQ ID N°4 como marcador genético para a diferenciação de estirpes de Mycobacterium do complexo Mycobacterium tuberculosis. Também é um objectivo do presente pedido usar o polimorfismo mmpL6551 como marcador genético (ver SEQ ID N°20) para a diferenciação de estirpes de Mycobacterium do complexo Mycobacterium tuberculosis. 0 uso de tais marcadores genético (s) em associação com pelo menos um marcador genético entre RD1, RD2, RD3, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9, RD10, RD11, RD13, RD14, RvDl, RvD2, RvD3, RvD4, RvD5, katG463, gyrA95, oxyR285 , pncA57 permite a diferenciação de estirpes de Mycobacterium do complexo Mycobacterium tuberculosis (ver exemplo 4). 0 presente pedido descreve um método in vitro para a detecção e identificação de Mycobacteria do complexo Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) análise para a presença ou ausência de um fragmento de ácidos nucleicos da sequência TbDl, e b) análise de pelo menos um marcador genético adicional 28 seleccionado entre RD1, RD2, RD3, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9, RD10, RD11, RD13, RD14, RvDl, RvD2, RvD3, RvD4, RvD5, katG463, gyrA95, oxyR' 285 , pncA57.

Tipicamente, são usados dois marcadores adicionais, de preferência RD4 e RD9. A análise é executada por uma técnica seleccionada entre hibridação de sequência, amplificação de ácido nucleico, complexo antigene-anticorpo.

Também é um objectivo da presente invenção proporcionar um estojo para a detecção e identificação de Mycobacteria do complexo Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica compreendendo os elementos seguintes: a) pelo menos um par de iniciadores comportando 8 a 30 nucleótidos do polinucleótido de acordo com as reivindicações 2, 3 e 6, e mais preferivelmente seleccionado entre os iniciadores escolhidos do grupo compreendendo SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16, SEQ ID N°17, SEQ ID N°18, b) os reagentes necessários para levar a cabo uma reacção de amplificação de ADN, c) pelo menos um par de iniciadores específicos dos marcadores genéticos seleccionados entre RD1, RD2, RD3, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9, RD10, RD11, RD13, RD14, RvDl, RvD2, RvD3, RvD4, RvD5, katG463, gyrA95, oxyR' 285, pncA57. O presente pedido também descreve um estojo compreendendo facultativamente o elemento d): 29 d) os componentes necessários que tornam possível verificar ou comparar a sequência e/ou o tamanho do fraqmento amplificado.

Num modo de execução preferido, o estojo de acordo com a presente invenção é caracterizado por os ditos pares de iniciadores específicos de marcadores genéticos de acordo com serem: b) um par de iniciadores específicos dos marcadores genéticos RD4, e c) um par de iniciadores específico dos marcadores genéticos RD9.

As figuras e os exemplos apresentados em baixo são facultados como guia adicional para o perito na arte e não são para serem interpretados como limitativos da invenção sob qualquer aspecto.

FIGURAS

Figura 1: Amplicões obtidos de estirpes que têm a região genómica indicada presente ou deletada. Os tamanhos dos amplicões em cada grupo são uniformes. Os números correspondem à designação de estirpes usada em Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37: 2607-2618) (Ref. 8) e Supply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39: 3563-3571) (ref. 9).

Figura 2: Sequências na região TbDl obtidas de estirpes de várias regiões geográficas. * refere-se a grupos com base no polimorfismo de sequência de 30 katG463 IgyrA95 definido por Sreevatsan e colegas (Ref. 2) . Os números correspondem à designação de estirpes usada em Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37: 2607-2618) (Ref. 8) e Supply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39: 3563-3571) (ref.9).

Figura 3: Espoligótipos de estirpes de M. tuberculosis e M. bovis seleccionadas. Os números correspondem à designação de estirpes usada em Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37: 2607-2618) (Ref. 8) e Supply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39: 3563-3571) (ref. 9).

Figura 4: Esquema da via evolutiva proposta do bacilo tubérculo que ilustra perdas sucessivas de ADN em certas linhagens (caixas cinzentas). O esquema é baseado na presença ou ausência de regiões deletadas conservadas e em polimorfismos de sequência em cinco genes seleccionados.

De notar que as distâncias entre certas ramificações podem não corresponder a diferenças filogenéticas actuais calculadas por outros métodos.

As setas azuis indicam que as estirpes são caracterizadas por CTG (Leu) de katGc463, ACC (Tre) de gyrAc95, típicos para organismos do grupo 1. As setas verdes indicam que as estirpes que pertencem ao grupo 2 caracterizado por CGG (Arg) de katGc463, ACC (Tre) de gyrAc95. A seta vermelha indica que estirpes que pertencem ao grupo 3, caracterizado por CGG (Arg) de katGc463, AGC (Ser) de gyrAc95, como definido por Sreevatsan e colegas (Sreevastan et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sei USA 151: 9869-9874) (Ref. 2). 31

EXEMPLOS 1. MATERIAIS E MÉTODOS: 1.1. Estirpes bacterianas: O complexo de 100 estirpes de M. tuberculosis compreendia 46 estirpes isoladas de M. tuberculosis em 30 países, 14 estirpes M. africanum, 28 estirpes M. bovis originárias de 5 países, 2 estirpes da vacina BCG de M. bovis (Pasteur e Japão), 5 estirpes M. microti, e 5 estirpes M. canettii. As estirpes foram isoladas de fontes humanas e animais e foram seleccionadas para representar uma diversidade ampla incluindo 60 estirpes que foram usadas num estudo de multiplos-centro (8) . As estirpes M. africanum obtiveram-se da colecção Wadsworth Center, Departamento de Saúde do Estado de Nova Iorque, Albany, Nova Iorque, ao passo que a maioria dos isolados de M. bovis vieram da colecção da Universidade de Saragoça, Espanha. Quatro estirpes de M. canettii são da colecção de culturas do Instituto Pasteur, Paris, França. As estirpes foram extensivamente caracterizadas por métodos de tipagem, i.e., tipagem e espoligotipagem do polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição IS6110 (RFLP). M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra, M. tuberculosis CDC1551, M. bovis AF2122/97, M. microti OV254, e M. canettii CIPT 140010059 foram incluídas como estirpes de referência. O ADN foi preparado como previamente descrito (10). 1.2. Comparações do genoma e projecto de iniciador

Para comparações preliminares do genoma entre M. tuberculosis e M. bovis usaram-se os sítios da Web http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/ e http://www.sanger.ac.uk/Projects/M bovis/ bem como bancos de dados internos. Para projecto de iniciador, obtiveram-se 32 sequências dentro ou flanqueadoras das regiões RD e RvD dos mesmos sítios da Web. Os iniciadores foram projectados usando o iniciador 3 do sítio da Web http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgi que amplificaria fragmentos de ca. 500 pares de bases nas estirpes de referência (Tabela 1).

1.3. Análises RD-PCR

Foram levadas a cabo reacções em placas de 96 poços e continham por reacção 1,25 μΐ de 10 x tampão de PCR (600mM Tris HC1 pH 8,8, 20 mM MgCl2, 170 mM (NH4)2S04, 100 mM (β-mercaptoetanol), 1,25 μΐ de mistura de nucleótido 20mM, 50 nM de cada iniciador, 1-10 ng de ADN molde, DMSO a 10%, 0,2 unidades de Taq polimerase (Gibco-BRL) e água destilada esterilizada para perfazer 12,5 μΐ. Os ciclos térmicos foram executados num amplificador PTC-100 (MJ Inc.) com um passo de desnaturação inicial de 90 segundo a 95°C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 min a 58°C, e 4 min a 72°C.

1.4. Sequenciação das regiões de junção (RDs, TbDl) dos genes kalG, gyrA, oxyR e pncA

Os produtos de PCR foram obtidos como acima descrito, usando os iniciadores listados na Tabela 1.

Para eliminação de iniciador, incubaram-se 6 μΐ de produto de PCR com 1 unidade de Fosfatase Alcalina de Camarão (USB), 10 unidades de exonuclease I (USB) , e 2 μΐ de 5 x tampão (Tris HC1 200mM, pH 8,8, MgCl2 5mM) durante 15 min a 37°C e em seguida durante 15 min a 80°C. A esta mistura reaccional adicionaram-se 2 μΐ de mistura de sequenciação Big Dye (Applied Biosystems), 2 μΐ (2 μΜ) de iniciador e 3 μΐ de 5 x tampão (MgCl2 5mM, Tris HC1 200mM pH 8,8) e levados a cabo 35 33 ciclos (96°C durante 30 segundos; 56°C durante 15 segundos; 60°C durante 4 min) num termociclador (MJ-research Inc., Watertown, MA) . O ADN foi precipitado usando 80 yl de etanol a 76%, centrifugado, lavado com etanol a 70 %, e seco. As reacções foram dissolvidas em 2 μΐ de tampão formamida/EDTA, desnaturadas e carregadas em 48 cm de géis de poliacrilamida a 4% e executou-se electroforese em 377 sequenciadores de ADN automáticos (Applied Biosystems) durante 10 a 12 h.

Alternativamente, as reacções foram dissolvidas em tampão EDTA 0,3 mM e submetidas a sequenciação automática num sequenciador 3700 ADN (Applied Biosystems). As reacções geralmente deram entre 500-700 pb de sequência não ambígua. 1.5. Números de acesso A sequência da região TbDI da estirpe ancestral de M. tuberculosis n° 74 (Ref. 8) contendo os genes mmpS6 e mmpL6 foi depositada no banco de dados EMBL com o n°. de acesso AJ426486. As sequências contíguas RD4, RD7, RD8, RD9 e RD10 em BCG estão disponíveis com os números de acesso AJ003103, AJ007301, AJ131210, Y18604, e AJ132559, respectivamente. 2. DADOS EXPERIMENTAIS; A distribuição de 20 regiões variáveis que resultam de eventos de inserção-deleção nos genomas de bacilo tubérculo foi avaliada num total de 100 estirpes de Mycobacterium tuberculosis, M. africanum, M. canettii, M. microti e M. bovis. Esta abordagem mostrou que a maioria destes polimorfismos não ocorreu independentemente nas diferentes estirpes do complexo M. tuberculosis mas, ao invés, resultou de eventos genéticos irreversíveis primitivos, em estirpes progenitoras comuns. Com base na presença ou ausência de uma deleção específica de M. tuberculosis (TbDI), as estirpes de 34 M. tuberculosis podem ser divididas em estirpes ancestrais e "modernas", estas últimas compreendendo representativos de epidemias principais como os grupos de M. tuberculosis de

Beijing, Haarlem e Africana. Além disso, a perda sucessiva de ADN, reflectida por deleções de RD9 e outras subsequentes, foram identificadas numa linhagem evolutiva representada por M. africanum, M. microti e M. bovis que divergiu do progenitor da estirpe actual de M. tuberculosis antes de ter ocorrido TbDl. Estes resultados contradizem a hipótese frequentemente apresentada que M. tuberculosis, o agente etiológico de tuberculose humana evoluiu de M. bovis, o agente da doença bovina. As estirpes M. canettii e M. tuberculosis ancestral não têm nenhuma destas regiões deletadas e consequentemente parecem ser descendentes directos de bacilo tubérculo que existiu antes da linhagem M. africanum -» M. bovis se ter separado da linhagem M. tuberculosis. Tal sugere que o antepassado comum do bacilo tubérculo assemelha-se a M. tuberculosis ou M. canettii e poderia perfeitamente ter já sido um organismo patogénico humano.

As micobactérias agrupadas no complexo M. tuberculosis são caracterizadas por 99,9% de semelhança ao nivel dos nucleótidos e sequências de ARNr 16S idênticas (1,2) mas diferem amplamente em termos dos seus tropismos de hospedeiro, fenótipos e patogenicidade. Assumindo que são todos derivados de um antepassado comum, é intrigante que alguns são exclusivos de humanos (M. tuberculosis, M. africanum, M. canettii) ou agentes patogénicos de roedores (M. microti) ao passo que outros têm um amplo espectro de hospedeiro (M. bovis) . Qual foi a organização genética do último antepassado comum do bacilo tubérculo e em que 35 hospedeiro viveu? Que eventos genéticos podem ter contribuído para o facto de que o espectro de hospedeiro é tão diferente e frequentemente específico? Onde e quando M. tuberculosis evolui? As respostas a estas perguntas são importantes para uma melhor compreensão da patogenicidade e da epidemiologia global de tuberculosis e podem contribuir para antecipar tendências futuras na propagação da doença.

Devido ao invulgar elevado grau de conservação nos seus genes internos foi sugerido que os membros do complexo M. tuberculosis sofreram um engarrafamento evolutivo na altura da especiação, estimado ter ocorrido há aproximadamente 15000 20000 anos atrás (2). Também foi especulado que M. tuberculosis, o agente etiológico mais difundido da tuberculose humana evoluiu de M. bovis, o agente da tuberculose bovina, por adaptação específica de um agente patogénico animal no hospedeiro humano (3). Contudo, ambas as hipóteses foram propostas antes da sequência completa do genoma de M. tuberculosis (4) estar disponível e antes de genómicas comparativas terem revelado várias regiões genómicas variáveis nos membros do complexo M. tuberculosis. Vectores de hibridação diferenciais identificaram 14 regiões (RD1-14) variadas em tamanho de 2 a 12,7 kb que estavam ausentes da BCG Pasteur relativamente a H37Rv de M. tuberculosis (5,6). Paralelamente, seis regiões, RvDl-5, e TbDl, que estavam ausentes do genoma H37Rv de M. tuberculosis relativamente a outros membros do complexo M. tuberculosis foram reveladas por abordagens genómicas comparativas por uso de técnicas de electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (5,7) e em comparações in silico da sequência genómica praticamente complete AF2122/97 de M. bovis e a sequência H37Rv de M. tuberculosis. 36

No presente estudo os inventores analisaram a distribuição destas 20 regiões variáveis localizadas ao redor do genoma (Tabela 1) num conjunto representativo e diverso de 100 estirpes que pertencem ao complexo M. tuberculosis. As estirpes foram isoladas de diferentes hospedeiros, de uma ampla gama de origens geográficas, e exibiam um largo espectro de caracteristicas de tipagem tais como padrões de hibridação IS6110 e de espoligótipo ou repetição em tandem de número variável de unidades repetitivas espalhadas de micobactérias (MIRU-VNTR) (8,9). Os inventores constataram evidência surpreendente de que a deleção de certas regiões genómicas variáveis não ocorreu independentemente nas diferentes estirpes do complexo M. Mycobacterium, assumindo que existe pouca ou nenhuma recombinação de segmentos cromossómicos entre as várias linhagens do complexo, tal permite aos inventores propor um cenário completamente novo para a evolução do complexo M. tuberculosis e a origem da tuberculose humana.

Regiões genómicas variáveis e a sua ocorrência nos membros do complexo M. tuberculosis. O ensaio de rastreio PCR para as 20 regiões variáveis (Tabela 1) em 4 6 estirpes M. tuberculosis, 14 M. afrícanum, 5 M. canettii, 5 M. microti, 28 M. bovis e 2 BCG empregaram oligonucleótidos internos para conhecer os RDs e RvDs, bem como oligonucleótidos flanqueando estas regiões (Tabela 1) . Esta abordagem gerou um amplo conjunto de dados robusto, altamente fiável, e internamente controlado uma vez que os amplicões de PCR obtidos com o par de iniciadores internos eram correlacionados com a ausência de um amplicão de tamanho apropriado com o par de iniciadores flanqueadores, e vice- 37 versa .

De acordo com a conservação de sequências de junção que flanqueiam as regiões variáveis foram distinguidos três tipos de regiões, cada uma tendo importância diferente como marcador evolutivo. 0 primeiro tipo incluia elementos genéticos móveis, como os profagos phiRvl (RD3) e phiRv2 (RD11) e sequências de inserção IS1532 (RD6) e IS6110 (RD5), cuja distribuição nos bacilos tubérculos era altamente divergente (Tabela 2) . 0 segundo tipo de deleção é mediado por recombinação homóloga entre elementos de inserção adjacentes IS6110 resultando na perda do segmento de ADN de intervenção (RvD2, RvD3, RvD4, e RvD5 (7)) e é variável de estirpe para estirpe (Tabela 2) . 0 terceiro tipo inclui deleções cujas regiões genómicas contíguas não contêm tipicamente sequências repetitivas. Frequentemente este tipo de deleção ocorreu em regiões de codificação resultando no truncamento de genes que ainda estão intactos noutras estirpes do complexo M. tuberculosis. 0 mecanismo exacto que conduz a este tipo de deleção permanece obscuro, mas erros de deslizamento de cadeia raros mas possíveis do ADN polimerase podem ter contribuído para este evento. Como mostrado pormenorizadamente em baixo, os RD1, RD2, RD4, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13, RD14, e TbDl são representativos deste terceiro grupo cuja distribuição entre as 100 estirpes permite-nos propor um cenário evolutivo para os membros do complexo M. tuberculosis, que identificaram M. tuberculosis e/ou M. canettii como mais relacionadas com o antepassado comum do bacilo tubérculo. 38 2.1. Estirpes de M. tuberculosis: A investigação das 46 estirpes de M. tuberculosis por análises de deleção revelou que a maioria das regiões RD estavam presentes em todas as estirpes de M. tuberculosis testadas (Tabela 2) . Apenas as regiões RD3 e RD11, correspondendo aos dois profagos phiRvl e phiRv2 de H37Rv de M. tuberculosis (4), a RD6 contendo a sequência de inserção IS1532, e RD5 que é flanqueada por uma cópia de IS6110 (5) estavam ausentes em algumas estirpes. Esta é uma observação importante pois implica que as estirpes de M. tuberculosis são altamente conservadas com respeito a RD1, RD2, RD4, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13, e RD14, e que estas RDs representam regiões que podem diferenciar estirpes de M. tuberculosis independentemente da sua origem geográfica e das suas caracteristicas de tipagem de alguns de outros membros do complexo M. tuberculosis. Além disso, tal sugere que estas regiões podem estar envolvidas na especificidade de hospedeiro de M. tuberculosis.

Ao invés, a presença ou ausência de regiões RvD em estirpes M. tuberculosis era variável. A região que mostrou a maior variabilidade foi a RvD2, uma vez que 18 de 46 estirpes de M. tuberculosis testadas não transportavam a região RvD2. As estirpes com um número elevado de cópias de IS6110 (>14) perderam as regiões RvD2 a RvD5 mais frequentemente que as estirpes com apenas algumas cópias. Como exemplo, todas as seis estirpes testadas pertencendo ao grupo Beijing (8) não tinham as regiões RvD2 e RvD3. Tal está em conformidade com o envolvimento proposto de recombinação de duas cópias adjacentes de IS6110 neste evento de deleção (7).

Contudo, a constatação mais surpreendente relativa às regiões 39

RvD foi de que a TbDl estava ausente em 40 das estirpes de M. tuberculosis testadas (87%), incluindo estirpes representativas de epidemias principais tais como os grupos Haarlem, Beijing e África (8). Para acentuar este resultado designámos esta região por "deleção 1 especifica de M. tuberculosis" (TbDI). Comparação de sequência in silico de H37Rv de M. tuberculosis com a secção correspondente AF2122/97 de M. bovis revelou que em M. bovis este locus compreende dois genes que codificam proteínas membranares que pertencem a uma grande família, ao passo que em H37Rv de M. tuberculosis um destes genes (mmpS6) estava ausente e o segundo foi truncado (mmpL6) . Ao contrário das deleções RvD2-RvD5, a região TbDl não é flanqueada por uma cópia de IS6110 em H37Rv de M. tuberculosis, sugerindo que os elementos de inserção não estavam envolvidos na deleção do fragmento de 2153 pb. Para investigar adicionalmente se as 40 estirpes de M. tuberculosis às quais faltava a região TbDl tinham a mesma organização genómica deste locus como em H37Rv de M. tuberculosis, amplificámos as regiões de junção TbDl das várias estirpes por PCR usando iniciadores flanqueando a região deletada (Tabela 1) . Esta abordagem mostrou que o tamanho do amplicões obtidos de múltiplas estirpes eram uniformes (Fig. 1) e análises de sequência subsequentes dos produtos de PCR revelaram que em todas as estirpes deletadas em TbDl testadas a sequência das regiões de junção era idêntica à de H37Rv de M. tuberculosis (Fig. 2) . A conservação perfeita das sequências de junção em estirpes deletadas em TbDl de ampla diversidade geográfica sugere que o evento genético resultou na deleção ocorrida num progenitor comum. Contudo, seis estirpes M. tuberculosis, todas caracterizadas por muito poucas ou nenhuma cópia de IS6110 e espoligótipos parecidas entre elas (Fig. 3) ainda tinham a 40 região TbDl presente. Interessantemente, estas seis estirpes foram também agrupadas juntamente por análises MIRU-VNTR (9).

Análises das sequências parciais dos genes oxyR, pncA, katG, e gyrA que foram descritos como variáveis entre bacilos tubérculos diferentes (2, 11, 12, 13) revelaram que todas as estirpes de M. tuberculosis testadas apresentaram sequências parciais de oxyR e pncA típicas para M. tuberculosis (oxyR-nucleótido 285 (oxyRl285) :G, pncA-codão 57 (pncA51: CAC) . Com base no codão katG 463 (katG463) e polimorfismo de sequência do codão gyrA 95 (gyr^95), Sreevatsan e colegas (2) definiram três grupos entre os bacilos tubérculos, o grupo 1 apresentando katG463 CTG (Leu) , gyrA95 ACC (Tre) , o grupo 2 apresentando katG463 CGG (Arg) , gyrA95 ACC (Tre) , e o grupo 3 apresentando katG463 CGG (Arg) , gyrA95 AGC (Ser) . De acordo com este esquema, no nosso estudo 16 das 46 estirpes de M. tuberculosis testadas pertenciam ao grupo 1, ao passo que 27 estirpes pertenciam ao grupo 2 e apenas 3 isolados ao grupo 3. Das 40 estirpes que foram deletadas na região TbDl, 9 apresentaram características do grupo 1, incluindo as estirpes pertencendo ao grupo de Beijing, 28 do grupo 2, incluindo as estirpes dos grupos Haarlem e África e 3 do grupo 3, incluindo H37Rv e H37Ra. Mais interessante, todas as seis estirpes M. tuberculosis onde a região TbDl não foi deletada, continham uma leucina (CTG) em katG463, que foi descrita como característica de estirpes M. tuberculosis ancestrais (grupo 1) (2) . Como mostrado na Figura 4, tal sugere que durante a evolução de M. tuberculosis a mutação katG no codão 463 CTG (Leu) —» CGG (Arg) ocorreu numa estirpe progenitora que tinha a região TbDl deletada. Esta proposta é suportada pela constatação que estirpes que pertencem ao grupo 1 podem ou não ter deletado a região TbDl, ao passo que 41 todas as 30 estirpes que pertencem aos grupos 2 e 3 não tinham TbDl (Fig. 4) . Além disso, a todas as estirpes dos grupos 2 e 3 faltavam caracteristicamente as sequências separadoras 33-36 na região de repetição directa (DR) (Fig. 3) . Parece que tais separadores podem ser perdidos mas não ganhos (14). Assim, as estirpes com TbDl deletada serão referidas daqui em diante como estirpes M. tuberculosis "modernas." 2.2. M. canettii: M. canettii é uma variante lisa muito rara de M. tuberculosis, isolada normalmente de pacientes de, ou com ligação a, África. Embora partilhe sequências ARNr 16S idênticas com os outros membros do complexo M. tuberculosis, as estirpes M. canettii diferem em muitos aspectos incluindo polimorfismos em certos genes internos, número de cópias de IS1081, morfologia de colónia, e o conteúdo lipidico da parede celular (15,16). Assim, ficámos surpreendidos em constatar que em M. canettii todas as regiões RD, RvD, e TbDl excepto os profagos (phiRvl, phiRv2) estavam presentes. Ao invés, identificámos uma região (RDcan) estando especificamente ausente de todas de entre as cinco estirpes M. canettii que sobrepunham parcialmente RD12 (Fig. 4). A conservação das regiões RD, RvD, e TbDl no genoma de M. canettii juntamente com as diversas diferenças descritas e observadas sugerem que M. canettii divergiu do antepassado comum do complexo M. tuberculosis antes de RD, RvD e TbDl terem ocorrido nas linhagens do bacilo tubérculo (Fig. 4). Esta hipótese é suportada pelo facto de se ter mostrado que M. canettii transporta 26 sequências separadoras únicas na região repetida directa (14), que já não estão presentes em 42 qualquer outro membro do complexo M. tuberculosis. Consequentemente, M. canettii representa um bacilo tubérculo fascinante, cuja análise genómica pormenorizada pode revelar novos conhecimentos na evolução do complexo M. tuberculosis. 2.3. M. africanum: 0 isolado designado por M. africanum aqui estudado originou de fontes da África Oriental e Ocidental. 11 estirpes foram isoladas na Serra Leoa, Nigéria e Guiné e 2 estirpes no Uganda. Uma estirpe vem da Holanda.

Para os 11 isolados da África Ocidental, as análises RD indicaram que a todas estas estirpes faltava a região cobL contendo RD9. A análise de sequência da região de junção RD9 mostrou que a organização genética deste locus em estirpes da África Ocidental era idêntica à de M. bovis e M. microti pelo facto de a parte 5' de cobL bem como os genes Rv2073c e Rv2074c estavam ausentes. Além disso, seis estirpes (2 da Serra Leoa, 4 da Guiné) também não tinham RD7, RD8 e RD10 (Tabela 2) . As sequências de junção contíguas a RD7, RD8 e RD10, tal como as para RD9, eram idênticas às das estirpes M. bovis e M. microti. Relativamente aos dois profagos phiRvl e phiRv2, todas as estirpes da África Ocidental continham phiRv2, ao passo que o phiRvl estava ausente. Não foi observada variabilidade para as regiões RvD. RvDl-RvD5 e TbDl estavam presentes em todas as estirpes da África Ocidental testadas. Tal mostra que M. africanum prevalecente na África Ocidental pode ser diferenciada de M. tuberculosis "moderna" por pelo menos dois marcadores genéticos variáveis, designadamente a ausência da região RD9 e a presença da região TbDl. 43

Ao invés, para M. africanum da África Oriental e para o isolado da Holanda, não foi encontrado nenhum marcador genético que os pudesse diferenciar das estirpes M. tuberculosis. Com excepção do profago phiRvl (RD3) as 3 estirpes do Uganda e Holanda não exibiram nenhuma das deleções de RD, mas não tinham a região TbDl, como acontece com as estirpes M. tuberculosis "modernas". A ausência da região TbDl também foi confirmada por análise de sequência da região de junção TbDl, que se constatou ser idêntica às das estirpes M. tuberculosis deletadas em TbDl. Estes resultados indicam uma relação genética bastante próxima destas estirpes com M. tuberculosis e sugerem que deveriam ser consideradas como estirpes M. tuberculosis em vez de M. africanum. 2.4. M.microti:

Isolaram-se estirpes M. microti nos anos de 1930 de ratazanas (17) e mais recentemente de pacientes immuno-supressos (18). Estas estirpes são caracterizadas por um espoligótipo caracteristico idêntico, mas diferem nos seus perfis de IS6110. Ambos, os isolados de ratazana e o humano, não tinham regiões RD7, RD8, RD 9, e RD10 bem como uma região que é especificamente deletada de M. microti (RDmic) . RDmic foi revelada por um estudo genómico comparativo detalhado de isolados de M. microti (19) usando clones de um banco de Cromossomas Artificial Bacteriano (BAC) de M. microti. A RDmiC sobrepõe parcialmente RD1 de BCG (dados não mostrados). Além disso, os isolados de ratazana perderam parte da região RD5, ao passo que esta região estava presente no isolado humano. Como a região de junção RD5 em M. microti era diferente na de BCG (dados não mostrados), RD5 não foi usado como um marcador evolutivo. 44 2.5.M. bovis e M.bovis BCG: M. bovis tem um espectro de hospedeiro muito amplo infectando muitas espécies de mamíferos, incluindo o Homem. A colecção de estirpes de M. bovis que foram rastreadas para as regiões RD e RvD consistia em 2 estirpes BCG e 18 estirpes M. bovis "clássicas" geralmente caracterizadas por uma única ou duas cópias de IS6110 de bovino, fontes de lama e humanas para além de três isolados de cabra, três isolados de foca, dois isolados órix, e duas estirpes de M. bovis de humano que apresentaram um maior número de cópias de IS6110.

Excluindo os profagos, a distribuição de RDs permitiu-nos diferenciar cinco grupos principais entre as estirpes de M. bovis testadas. 0 primeiro grupo foi formado por estirpes a que faltava RD7, RD8, RD9, e RD10. Representativos deste grupo são três isolados de foca e dois isolados de humano contendo entre três e cinco cópias de IS6110 (dados não mostrados) . Dois isolados de órix albergando entre 17 e 20 cópias de IS6110 formaram o segundo grupo a que faltavam partes de RD5 para além de RD7-RD10, e assemelhavam-se bastante aos isolados de M. microti. Contudo, não apresentaram RDmic, a deleção característica de estirpes de M. microti (dados não mostrados). Análises de sequências parciais de oxyR e pncA de estirpes pertencendo aos grupos um e dois, mostraram polimorfismos de sequência característicos de estirpes M. tuberculosis (oxyR285 : G, pnca51: CAC, Ref. 12, 13) . O grupo três consiste em isolados de cabra a que faltam as regiões RDS, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, e RD13. Como previamente descrito por Aranaz e colegas, estas estirpes exibem uma adenosina na posição 285 do pseudogene oxyR que é 45 específico de estirpes de M. bovis "clássicas" ao passo que a sequência do polimorfismo pncA57 era idêntico ao de M. tuberculosis (20) . Tal está em conformidade com os nossos resultados de análises de sequência (Tabela 2) e a constatação que com excepção de RD4, os isolados de cabra exibiram as mesmas deleções que as estirpes M. bovis "clássicas". Analisado conjuntamente, tal sugere que a mutação (G —> A) ocorreu em estirpes M. bovis antes de RD4 ser perdido. Interessantemente, as estirpes M. bovis mais comuns (M. bovis "clássica"(21)), isoladas de gado da Argentina, Holanda, Reino Unido e Espanha, bem como de humanos (e.g. M. bovis resistentes a múltiplas-drogas da Espanha (22)) apresentam o maior número de deleções RD e parece terem sofrido a maior perda de ADN relativamente a outros membros do complexo M. tuberculosis. Estas regiões que faltam RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12 e RD13, confirmam resultados obtidos com estirpes de referência (5, 6) . Estas estirpes juntamente com as duas estirpes de BCG foram as únicas que apresentaram o polimorfismo pncA57 GAC (Asp) para além da mutação oxyR285 (G -» A) característica de M. bovis. Análises de estirpes BCG indicam que à BCG faltava a mesma região RD que a estirpe M. bovis "clássica" para além de RD1, RD2 e RD14 que aparentemente ocorreu antes e após o processo de atenuação (Fig. 4) (6, 23).

Ao contrário das RDs, as regiões RvD foram altamente conservadas nas estirpes M. bovis. Com excepção dos dois isolados de órix rico em IS6110, a que faltava RvD2, RvD3 e RvD4, todas as outras estirpes tinham as cinco regiões RvD. É de salientar particularmente que a TbDl estava presente em todas as estirpes de M. bovis.

Contudo, com excepção dos dois isolados humanos, contendo 46 entre três e cinco cópias de IS6110 do grupo 1, as estirpes designadas por M. bovís apresentaram um único polimorfismo de nucleótido na região TbDl no codão S51 (AAG) do gene mmpL6, relativamente às estirpes M. canettii, M. africanum e M. tuberculosis ancestral, que sã caracterizadas pelo codão AAC. Mesmo as estirpes isoladas de focas e de órix com loci oxyR ou pncA como os de M. tuberculosis e com menos regiões deletadas que as estirpes M. bovís clássicas, apresentaram o polimorfismo mmpL6 AAG típico de M. bovís e M. microti (Tabela 2, Fig. 4) . Como tal, este polimorfismo pode servir como marcador genético muito útil para a diferenciação de estirpes a que falta RD7, RD8, RD 9, e RD10 e foram classificadas como M. bovís ou M. africanum, mas podem diferir de outras estirpes do mesmo taxonomia.

3. DISCUSSÃO 3.1. Origem da tuberculose humana

Durante muitos anos, pensou-se que a tuberculose humana tinha evoluído da doença bovina por adaptação de um agente patogénico de animal no hospedeiro humano (3) . Esta hipótese baseia-se na propriedade da M. tuberculosis em ser quase exclusivamente um agente patogénico humano, ao passo que M. bovís tem uma gama de hospedeiro muito mais ampla. Contudo, os resultados deste estudo mostram inequivocamente que M. bovís sofreu numerosas deleções relativamente a M. tuberculosis. Isto é confirmado pelas análises preliminares da sequência genómica praticamente completa de M. bovís AF2122/97, uma estirpe de M. bovís "clássica" isolada de gado, que não revelou nenhum grupo de genes novo especificamente confinado a M. bovís. Tal indica que o genoma de M. bovís é menor que o de M. tuberculosis (24) . Parece 47 plausível que M. bovis é o membro final de uma linhagem separada representada por M. africanum (RD9), M. microti (RD7, RD8, RD 9, RD10) e M. bovis (RD4, RD 5, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13) (25) que se ramificou do progenitor de isolados de M. tuberculosis. Sucessivas perdas de ADN podem ter contribuído para a expansão clonal e o aparecimento de agentes patogénicos mais bem sucedidos em novos hospedeiros.

Se o progenitor de estirpes M. tuberculosis existentes já era um agente patogénico humano quando a linhagem M. africanum -> M. bovis se separou da linhagem M. tuberculosis é um assunto para especulação. Contudo, temos duas razões para acreditar que foi este o caso. Em primeiro lugar, as seis estirpes M. tuberculosis ancestrais (TbDl+, RD9+) (Fig. 3) que se assemelham ao último antepassado comum antes da separação de M. tuberculosis e M. africanum são todas agentes patogénicos humanos. Em segundo lugar, M. canettii, que provavelmente divergiu do antepassado comum das estirpes actuais de M. tuberculosis antes de qualquer outro membro conhecido do complexo M. tuberculosis também é um agente patogénico humano. Analisado em conjunto, tal significa que os bacilos tubérculos, que se pensa assemelharem-se ao progenitor de M. tuberculosis são agente patogénicos humanos e não de animais. Também é intrigante que a maioria destas estirpes eram de origem africana ou índia (Fig. 3). É provável que estas estirpes ancestrais originaram predominantemente de focos endémicos (15, 26), ao passo que estirpes de M. tuberculosis "modernas" que perderam TbDl podem representar estirpes M. tuberculosis epidémicas que foram introduzidas mais recentemente nas mesmas regiões geográficas como consequência da propagação mundial da epidemia da tuberculosis. 48 3.2.A escala de tempo evolutiva do complexo M. tuberculosis

Devido à elevada conservação de sequência em genes internos, Sreevatsan et al. colocaram previamente a hipótese de que os bacilos tubérculos encontraram um engarrafamento principal 15000 - 20,000 anos atrás (2). Como a conservação da sequência de junção TbDl em todas as estirpes deletadas em TbDl testadas sugerem descendência de um único clone, a deleção TbDl é um indicador perfeito que as estirpes M. tuberculosis "modernas" que são responsáveis pela vasta maioria dos casos actuais de tuberculosis sofreram definitivamente um tal engarrafamento e em seguida difundiram-se pelo mundo.

Como descrito em detalhes na secção de resultados, a nossa análise mostrou que as mutações katG463 CTG -> CGG e a subsequente gyrA95 ACC -» AGC, que foram usadas por Sreevatsan e colegas para designar os grupos 2 e 3 da via evolutiva por eles proposta dos bacilos tubérculos (2), ocorreu numa linhagem de estirpes de M. tuberculosis que já tinham perdido TbDl (Fig. 4) . Embora as deleções sejam marcadores mais estáveis que mutações pontuais, que podem estar sujeitas a reversão, foi observada uma correlação perfeita entre os dados de deleção e mutação pontual para as estirpes testadas.

Esta informação, juntamente com resultados de um estudo recente por Fletcher e colegas (27), que mostraram que ADNs de M. tuberculosis amplificados de aldeões húngaros naturalmente mumificados dos séculos 18 e 19 pertenciam aos grupos 2 e 3 katG463IgyrA95, sugere que a deleção TbDl ocorreu na linhagem de M. tuberculosis antes do século 18. Tal pode significar que o aumento dramático de casos de tuberculose mais tarde no século 18 na Europa envolveu principalmente 49 estirpes M. tuberculosis "modernas". Além disso, mostra que a tuberculose foi causada por M. tuberculosis e não M. bovis, um facto que também é descrito para casos na Inglaterra medieval rural (28) .

Existe forte evidência que ocorreram infecções por micobactéria no homem há vários milhares de anos atrás. Sabemos que ocorreu tuberculose no Egipto durante o reinado dos faraós porque foram identificadas lesões patognomónicas espinais e da costela por tuberculose em múmias daquele periodo (29). A identificação de bacilos ácido-resistentes bem como amplificação por PCR de IS6110 de múmias peruanas (30) também sugere que a tuberculose existiu em sociedades pré-colombianas da América Central e do Sul. Para estimar quando ocorreu o engarrafamento TbDl, seria muito interessante saber se as múmias egípcias e da América do Sul transportavam ADN de M. tuberculosis que tinha TbDl deletada ou não.

Os outros engarrafamentos principais, que parece terem ocorrido para membros da linhagem M. africanum —> M. microti -> M. bovis é reflectido pelas deleções RD9 e as subsequentes RD7, RD8 e RD10 (Fig. 4). Estas deleções parecem ter ocorrido no progenitor do bacilo tubérculo que actualmente apresenta espectros de hospedeiro naturais tão diverso quanto humanos em África, ratazanas nas Ilhas Orkney (UK), focas na Argentina, cabras em Espanha, e texugos no Reino Unido. Por este motivo é difícil imaginar que a expansão e adaptação de bactérias RD9-deletadas nos seus hospedeiros específicos pudesse ter aparecido dentro dos 15000-20000 anos postulados de especiação do complexo M. tuberculosis. 50

Contudo, poderia ser ganha melhor compreensão relativamente a esta matéria por análise RD de amostras de ADN primitivo, e.g. ADN de micobactéria isolado de um esqueleto de bisão com 17000 anos (31) . A micobactéria cujo ADN foi amplificado apresentou um espoligótipo que era mais relacionado com padrões de M. africanum e pode ter sido um representativo primitivo da linhagem M. africanum -> M. bovis. Com as sequências de junção TbDl e RD9 que aqui facultamos, análises de PCR de ADNs primitivos devem permitir levar a cabo estudos muito focalizados para aprender mais acerca da escala de tempo na qual os membros dos complexos de M. tuberculosis evoluíram. 3.3. Comentários finais O nosso estudo proporciona uma avaliação da diversidade e conservação de regiões variáveis numa ampla gama de bacilos tubérculos. Análise de deleção de 100 estirpes de vários hospedeiros e países identificaram algumas estirpes evolutivas "primitivas" M. canettii, M. tuberculosis, e M. africanum, cuja maioria era de origem africana, bem como estirpes M. tuberculosis "modernas", incluindo esta última representantes de grupos epidémicos principais tais como Beijing, Haarlem e África. O uso de análise de deleção juntamente com tipagem molecular e análise de mutações específicas foi mostrado representar uma abordagem muito poderosa para o estudo da evolução dos bacilos tubérculos e para a identificação de marcadores evolutivos. Numa perspectiva mais prática, estas regiões, principalmente RD9 e TbDl mas também RD1, RD2, RD4, RD7, RD8, RD10, RD12 e RD13 representam candidatos muito interessantes para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico poderosas pela 51 rápida e inequívoca identificação de membros do complexo M. tuberculosis (32) . Esta abordagem genética para diferenciação pode ser agora usada para substituir a divisão tradicional frequentemente confusa do complexo M. tuberculosis em subespécies rigorosamente definidas.

Além disso, análises funcionais mostrarão se a deleção de TbDl confere alguma vantagem selectiva relativamente a M. tuberculosis "moderna", ou se outras circunstâncias contribuíram para a pandemia de estirpes M. tuberculosis deletadas em TbDl. EXEMPLO 4

Os membros do complexo M. tuberculosis partilham um invulgar elevado grau de conservação tal que as sondas de ácido nucleico e ensaios de amplificação comercialmente-disponíveis não conseguem diferenciar estes organismos. Além disso métodos de identificação convencionais são frequentemente ambíguos, incómodos e lentos devido ao lento crescimento dos organismos.

Na presente invenção os inventores, por uma análise de deleção, resolvem o problema enfrentado por laboratórios de micobacteriologia clínica para a diferenciação no complexo M. tuberculosis.

Esta abordagem permite executar um diagnóstico num fluido biológico usando pelo menos três marcadores incluindo TbDl. A seguinte tabela 3 ilustra uma tal combinação suficiente para perceber a distinção entre os membros do complexo M. tuberculosis. 52

Tabela 3 MARCADORES ESTIRPE MYCOBACTERIUM RD4 RD 9 TBDl M. bovis BCG - - + M. bovis - - + M. africanum + - + M. tuberculosis + + - M. tuberculosis Ancestral + + + M. canettii + + +

Para além do marcador TbDl, devem ser usados de preferência pelo menos mais 2 marcadores. Exemplos de tais marcadores adicionais disponíveis na literatura encontram-se listados na tabela 1 seguinte. 53

Dados suplementares:

Tabela 1: Região ausente de BCG

Regiões RD, RvD e TbDl e iniciadores seleccionados

Gene Tamanho Iniciadores flanqueadores ou

Interno 22 par de iniciadores * interno (kb) par de incia- dores AC'·

pac-ja 5 CA ! <T‘-nA TTTflanco esquerdo STC ACiC C.AA OCC vAÁ A:CA G-TO: GGG s . ' SC: -flanco direito CAA C ΐ?· T" A·"" G A""A " ’ • v.- ví ·· ;: vi v···. : ϋ V:: CCA Ϊ?:·. .· < Λ-r :· ·ί>· · g g p;\·' :· V ·: :· ^ ¢ ::ç;.s ACC-flanco.F TAT AGC T CT CGG CAG V :: çrAr- \.':ív .. .. ...y. ,··. ·. ííAj CG C ACi A:. A CR A :S AAC-flanco.R v ·. ç > f v T.CVC"C CCT C£T ?TT C:A£ CCC GTA TC v: r ^ i v-f:. iíT T RA$> ΤΤΆ TCTTGCí CG'r'TííA CTS TC-T TOTs TTG- ccs :c CC ACC TA:' SCC-SC:C»:6';:C:,|\ SO:-Ai S£A A

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Região Gene Tamanho Iniciadores flanqueadores ou ausente de Interno 2° par de iniciadores * interno BCG (kb) par de incia- dores

RDv' v.O f:.DÚA,tv;}U-aJ:U-; :~:ί·;.$··;:·:.Ά ¥-·;$ $A$ v-OC $01 ·"<: ” ><> í : J \.· C9 '\t\t : >9>9A A :: STOOH TT$Ç.CTCTT $$' AOC CAA 00 00T 0 'ν' í \v ·.. : í9 v 1· ACA'' OO-OO :v0:r: 00 Í,y9>9 'v ' y.V ‘:9T'$t A'C? Ti,i9. :9αΤ ;.99· *·9Χν·:9': 00 ,·\·>\·\ ;*·>. .*·· ·>ν ;·. ,·\ V Λ\·Ν·ν. '> .;'·.·'>···*> :V ;· \·; ·;ν ο>· ,ν .^\·.\Α·; \ν\ν ; \ν > : >·· -,'·· 'Χ V,.: RAÒÒOÕXOÕOO S' $$?$¥> ÃOOASF 0 .O·-fianCo. p W Λ * : ν : \·. \.VVv ν,-Α-.ν ΐ :v.'V : %\A : '»':;>· : :;;;u-vi Α Τ$ ΑΑ SOA soa $ ΑΟΟ'-ΟηνΓΟ ΜΑ: AD$ -flanco.R ;,:,ΤΟ:·ΑΤΛΑ$$Τ';ΑΟ C A-19 CTC TTC vCC Ϊ R $0· '£&£. iv ;:·ί\ν: Ο&ΑΚΑΟΑ.γ ADA-flanco. F \>V > : \> 9. * :: :: >!:99> > \>Α V>\A v '-..'tt \>Vχ5:: '9' }' :9ί9.0 (<:ΑΤ \> ·$$ 'O:;···. 00 000·;·$Α $ 0 '0;: -flanco.R ΑΟΤ '1; "'00 Τ$Α OTO Ci9A ’^Λχ? ^H9 Ta:9 \>: :: >\ v, :.y: ·: •νηϊ /'v· 9 0 ΑΟΟΟΟ'Α $$:í-flanco.F COatoo t CAAvAOCA •9TC9 9>à:9 A9C Á'9C C-^A vi9' AAA >>TA A «OSOAR 000-flanco.R $Τ$$ΑΟ$ΤΟ:;$Α?$ΑΟ: SOS OAAOAO C$0 •ν..' : \> 1.9 OiOiO.xr AO 50-flanco.F çciTtACCO :9 : \v -..sAA Οΐν·Α Γν! ν· :9Α,·9 ’í $$T ACA 0 $000'$5$ AS': í:-fianco.R $'·0/·Λ0η0^θΑθ$0Α:;· :.-00 ΟΟ'ύ aao .:-0:0: AÇ >v SOO SAS ί·\·> < ί.Α : > ív;,; Λί; :>>· : ,9 R$ i Ο RíORisO SO;' 0$-$ C$$ $A-$ CTA o$A SÓ" A00 $$0 $AC C~C TOO C\”“ AO 55 (continuação)

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RD: ?-Evt3~T. ASA QGA Ase TTT GGG TGG TT RO Itflanco.F GCC A~ C AAG GTC MSAACCTF.D : 2-flanco.R CSGCCASGT MC AAG GAG-T

RD 53 Ro25&-RvUf’c 3.S RTU?!:Tr RD':· >-flanco.F SGATSTCÂGTCSGM C:GA TGS TST7TS TTS CGS GA GTG.AG ÃOA-iAÃ RD > J-flanco.R CAC C Sc G?v'T SAT GSA.TGGGCTCAG GSAGCGA TSAATACC SD'54 F.v-TíSiA', C‘5i 9.2 SD-i-AvrArõ Hf RGíá-flanco.F GTSGASCACCTT TTS ATT CSC :~AA. CA-4 GACGTG AT CTG AA F:CA4-Rv:" Vf τ· A RD'sí--flanco.R SSTCSAATA SSAGTC- GGg uTG GTT ACT ÒAACA QTCQATTC Região que falta a H37Rv de M. Tuberculosis RxS ί' C RsCA-ATÍF RilC: ··:«?.:=· AGC SCS TCG AAC SAGCCACTCCSA ACU O CO TGTTSACT í&D?-SS1R FSCU-MCR OCT 3AA TCC GCS-CAA CACGCSAACCCT TTO CAT ACS TAC AT ' Í3SKQ S, x RVS2.-.¥S1 F - RhfCÍÍASiSF STTC.TG CTSTCG AAC GGA CGGTSACÍAS CTC CA TST TTG TC SvSC-isa K K»3£-!íK2F: ACTTSA CCS C-TTTCA TffiG CCAACTTCT AT® TCT cc- GAS CT FAíCo RyC.J-sttF B:vC.>-|’|anco.I; ATCSATCSGGTCÍSTC AAA CCA TGC ASC ΑΛΤ SC GTC T GG CA FoCi-FlÃ FíiDí-flanco.R iAl.A L-UA· C-C-.A TU-.A A-.GA ' TT CTOt ;_-T T2C CTGSTTGA RvOT PPE g-erja 2.-S· rêTRCAHtír-FPE ND SSTTSCCAACSTTAC csA Tse SvCAASfAPFE ND CCG S TG GTG GPG SCG <3CT fMJS 4v Ra<S£!*F RsOS-flancoJ 56

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CGTGCG CTTATC;GT AGC GG TBDCftS.F

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Iniciadores de PCR e de sequenciação katG, gyrA, oxyR', pncA e mmpL6

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MG-21S4,S72-SB2-R AC A AGC TGA TCC ACC GAG AC

gyrA-7.4$l? CGG GTG CTC TÂT GCA ATG TT

oxyff-272S,S24-SEQ-R CAA AGC AGT GGT TCA GCA GT

s:t,cà. 2289.319-SEQ-R GGC GTC A G GAC CCT ATA TC

mmpLseqSF GTA TCA GAG GGA CCG A GC AG A nomenclatura RD usada nesta tabela baseia-se na usada por Brosch et al. (2000), (Ref. 25) e difere da proposta por Behr e colaboradores (1999), (Ref. 6). As sequências de iniciadores são apresentadas na direcção 5' —» 3' . 57

Regiões onde foi usado um segundo par de iniciadores * internos em vez de iniciadores flanqueadores, regiões repetitivas flanqueadoras, e/ou elementos móveis. devido a genéticos 58

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59

60

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<220> <221> CDS <400> 1 64 tçcegcgegg ec&tcsgcgs fcçaaetcfcgg gacofcgctac ecggctaççfc eatectfceegg 60 tecafctatee ficaaccggcc gcccacccag gaeaeggtge aagecetegt egaegaegtg 120 arsctcccca gcetcacccg atecaeeggt tgagtcageg gtgcgaatgg ctgggcaceg 180· ttgtggtgfce cggtcocg:ts ccgtactgtt gaatccgcgg atccccgcefc gaggtscggg 240 Segtggfccge geecçggges atagcgtcgc cggttat-cga. aaggçtaaçg ggtgçagggg .3.00 at&teegtga ctggectggt. câaacgeggc tggatggtgc Iggtfigccgt. ggeggtfgtg jse gçggfcçgçgc: gatteagcgi ctatcggttg cacggc&tct tcgfctegca cgaeaccâcc 420 tcgaeegceg gfcggtgtcge gascgsoatc aagccgttea aeccessaca ggtaaocetç 410 g&§gt.cttfeg gcgctceespg ã&eegtggea âegateaatt acetfgacgt ggafcgccasa 540 <,ct.cgae«)<jg tcctggaeac gaceetgecg tggtcataea ngatcacgac gacectgccc £00 gcggtetfceç; cçaatgttgt cge-gçaagge gasageaatt eeatcggctg cege&teaee $«0 gfceaacggtg tagfeoaagga cgsaaggate gtçaacgaag fcgegqgecfca tacettctgc 720 ctcg&c&agt cctc atg sgc aac cac cac cgc ccg Met Ser Aan His Hís Arg Fro 1 5 cgg cct tgg ttg ccg ârg Pr o Trp Leu Fr®·· %$> 770 CSC ACC Ate tga «39 ott oog ttg ttg ate ttg ctf ttt S&S SS* Mia Thr .! i í:· Ãrg arg Lfâsi ssr 'L«w FtO ; 5 a Mc Mac Fhe ttp Vai <3ly IS 20 2S 3¾ gec gee a:: a aoe sat §'££ fec s*s ccg ca a ttg «tf ftC 393 Vai Ala Ala X1« ?h;t Asa Ala Ala Vai Oro Ml a Ma úlu Vai Vai Gly 20 2S 40 S«S çat >à x$ C fte ges «ag aga tes a cg gat gac ccg teg ctg cag S14 sis 65

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico isolado ou purificado em que o dito ácido nucleico é seleccionado do grupo que consiste em: a) SEQ ID N°1; b) Ácido nucleico tendo uma sequência completamente complementar a SEQ ID N° 1;
2. Fragmento de ácidos nucleicos de SEQ ID N°1 de acordo com a reivindicação 1 seleccionado do grupo que consiste em: a) SEQ ID N°4; b) Ácido nucleico tendo uma sequência completamente complementar a SEQ ID N°4; c) Fragmento de ácido nucleico de SEQ ID N°4 compreendendo pelo menos 20 nucleótidos consecutivos de SEQ ID N°4;
3. Ácido nucleico isolado ou purificado da reivindicação 1 em que o dito ácido nucleico compreende pelo menos uma deleção de um fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2.
4. Polipéptidos isolados ou purificados codificados pelo ácido nucleico das reivindicações 1 ou 2.
5. Polipéptido da reivindicação 4 seleccionado entre polipéptidos com sequência SEQ ID N°8, N°10, N°12 e N°2.
6. Ácido nucleico isolado ou purificado que codifica o polipéptido de acordo com a reivindicação 5. 1
7. Ácido nucleico isolado ou purificado de acordo com a reivindicação 6 seleccionado entre: - SEQ ID N°7 que codifica o polipéptido de SEQ id N 8; - SEQ ID N°9 que codifica o polipéptido de SEQ ID N 10; - SEQ ID N°ll que codifica o polipéptido de SEQ ID N 12.
8. Vector recombinante compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos seleccionada entre os ácidos nucleicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 6 e 7.
9. Vector recombinante da reivindicação 8 que consiste no vector designado X229 introduzido na Escherichia coli recombinante depositada em CNCM em 18 de Fevereiro de 2002 com o N° 1-2799.
10. Célula recombinante compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos seleccionada entre os ácidos nucleicos de acordo com as reivindicações 1, 2, 6 e 7, e vectores de acordo com as reivindicações 8 e 9.
11. Célula recombinante de acordo com a reivindicação 10 que consiste na Escherichia coli depositada em CNCM em 18 de Fevereiro de 2002 com o N° 1-2799.
12. Método in vitro para a detecção e identificação de Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) isolamento do ADN da amostra biológica a ser analisada ou produção de um ADNc a partir do ARN da amostra biológica, b) detecção das sequências de ácido nucleico das micobactérias presentes na dita amostra biológica, 2 c) análise para a presença ou ausência de um fragmento de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 2.
13. Método como reivindicado na reivindicação 12, no qual a detecção das sequências de ADN micobacteriano é levada a cabo usando sequências nucleotidicas complementares às ditas sequências de ADN.
14. Método como reivindicado na reivindicação 12 ou 13, no qual a detecção das sequências de ADN micobacteriano é levada a cabo por amplificação destas sequências usando iniciadores.
15. Método da reivindicação 12, no qual a detecção das sequências de ADN micobacteriano é levada a cabo por amplificação destas sequências usando iniciadores compreendendo 8 a 30 nucleótidos consecutivos do polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 6, e seleccionados com vista a amplificar o fragmento de ácidos nucleicos da reivindicação 2.
16. Método como reivindicado na reivindicação 14 ou 15, no qual os iniciadores têm uma sequência nucleotidica escolhida do grupo compreendendo SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16, SEQ ID N°17 e SEQ ID N°18.
17. Uso de pelo menos um par de iniciadores como definido na reivindicação 16 para a amplificação de uma sequência de ADN de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, ou Mycobacterium bovis BCG. 3
18. Proteína, polipéptido ou fragmento polipeptídico que resulta da expressão da totalidade ou parte do fragmento de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 2.
19. Anticorpo mono- ou policlonal, os seus anticorpos ou fragmentos quiméricos, caracterizados por serem capazes de reconhecer especificamente um produto como definido na reivindicação 18.
20. Estojo para a detecção discriminatória da presença de um antigene de Mycobacterium tuberculosis com deleção TbDl de acordo com SEQ ID N°4, ou Mycobacterium tuberculosis sem deleção TbDl, ou Mycobacterium africanum, ou Mycobacterium canettii, ou Mycobacterium microti, ou Mycobacterium bovis, ou Mycobacterium bovis BCG, numa amostra biológica compreendendo os elementos seguintes: a) um anticorpo como reivindicado na reivindicação 19, b) os reagentes para constituir o meio adequado para a reacção imunológica, c) os reagentes que permitem a detecção dos complexos antigene-anticorpo produzidos pela reacção imunológica.
21. Estojo para a detecção da deleção TbDl de acordo com SEQ ID n°4 em Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo os seguintes elementos: a) pelo menos um par de iniciadores compreendendo 8 a 30 nucleótidos consecutivos do polinucleótido de acordo com as reivindicações 2, 3 e 6; b) os reagentes necessários para levar a cabo uma reacção de amplificação de ADN. 4
22. Estojo da reivindicação 21, em que o dito par de iniciadores é seleccionado entre os iniciadores escolhidos do grupo compreendendo SEQ ID N°13, SEQ ID N°14, SEQ ID N°15, SEQ ID N°16, SEQ ID N°17 e SEQ ID N°18.
23. Uso da deleção TbDl de acordo com SEQ ID N°4 como marcador genético para a diferenciação da estirpe Mycobacterium do complexo Mycobacterium tuberculosis.
24. Uso do marcador genético de acordo com a reivindicação 23 com pelo menos um marcador genético seleccionado entre RDl, RD2, RD3, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9, RD10, RDll, RD13, RDl 4, RvDl, RvD2, RvD3, RvD4, RvD5, katG463, gyrA95, fo o c EH oxyR , pncA para a diferenciação de estirpes de Mycobacterium do complexo Mycobacterium tuberculosis.
25. Uso da reivindicação 24 em que são seleccionados dois marcadores genéticos RD4 e RD9 para serem utilizados em associação com o marcador genético da reivindicação 24.
26. Uso da reivindicação 24 em que a análise é levada a cabo por uma técnica seleccionada entre hibridação de sequência, amplificação de ácido nucleico, complexo antigene-anticorpo.
27. Estojo de acordo com a reivindicação 21 ou 22, para a detecção e identificação de Mycobacteria do complexo Mycobacterium tuberculosis numa amostra biológica, compreendendo adicionalmente os elementos seguintes: c) pelo menos um par de iniciadores especifico dos marcadores genéticos seleccionados entre RDl, RD2, RD3, RD4, RD5, RD6, RD 7, RD8, RD9, RD10, RDll, RD13, RD14, RvDl, RvD2, RvD3, RvD4, RvD5, katG463, gyrA95, oxyR<285 e pncA57. 5
28. Estojo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por os ditos pares de iniciadores específico de marcadores genéticos de acordo com c) serem: d) um par de iniciadores específico do marcador genético RD4, e e) um par de iniciadores específico do marcador genético RD 9. 11-06-2007 6