JPWO2007141912A1 - Ｒｎａ検出方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定ＤＮＡプライマーを含む基板を用いて、標的サンプルを含む反応系から当該標的サンプル由来の標的ＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法を提供する。

Description

本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を表面に固定化した担体を用いて、試料中のＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法に関する。
特許文献１には、固相支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ターゲットポリヌクレオチドの固相増幅を実行する技術が記載されている。さらに、このターゲットポリヌクレオチドとしては、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、およびＲＮＡが使用でき、特にｍＲＮＡは逆転写により仲介される増幅のための鋳型として直接使用できることが開示されている。
特許文献２には、ＰＣＲ反応の熱変性ステップにおいても安定的であり、かつ、タンパク質およびＤＮＡ／ＲＮＡの非特異的吸収容量が低く、有機化学物質に耐性なマイクロプレートを用いて、ＰＣＲ反応を行う技術が開示されている。さらに、このＰＣＲ反応に先立って、マイクロプレート表面に固定化されたオリゴヌクレオチドを用いて、粗細胞溶解物からＲＮＡまたはｍＲＮＡを精製することなく補足することができることが記載されている。
特許文献１および２の両方において、増幅過程でオリゴヌクレオチドを標識化して、検出することで細胞溶解物中にＲＮＡが含まれていたこと、およびおおよその定量を行うことが可能である旨記載されている。
このようなＲＮＡの定量には、具体的には、逆転写反応−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Reverse transcriptase polymerase chain reaction）法が有用であることが知られている。すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法で、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い解析法の１つとして、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出や塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析および生産等には欠かせないものになっている。この方法は診断的分子病理学を含む種々の分野で極めて有用な技術である。
しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は細胞収集、生体サンプルからＲＮＡ抽出と精製、逆転写反応、ＰＣＲ及び遺伝子検出など操作が非常に煩雑で、各工程におけるサンプルロスやコンタミネーションなどの問題点を有し、安定した遺伝子発現レベルの定量を行うには研究者の技術の熟練を要するのが現状である。とくに、完全なＲＮＡ分子の精製はＲＴ−ＰＣＲの成功を決定する第一のステップであり、これには細胞及び組織中のリボヌクレアーゼを除去または不活性化するための作業が要求される。
これらの問題を解決するため、自動ＲＮＡ抽出装置、ｍＲＮＡ精製キット及びワンステップＲＴ−ＰＣＲ試薬キット等の製品開発が盛んに行なわれている。例えば、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。しかし、いかなる製品を用いても時間の懸かる困難な処理操作ステップが要求される。
担体表面上にオリゴｄＴを固定化し、ｍＲＮＡが持つポリＡ鎖をハイブリダイゼーションにより捕捉し、精製を目的とする手法が一般的に用いられている。さらに、固相表面上で逆転写反応及びＰＣＲ反応を行うことで開発された（非特許文献１）。しかし、プラスチックの疎水性表面における非特異的吸着性のため、ＲＮＡ分解酵素の失活に用いられるタンパク質分解酵素やカオトロピック剤のコンタミネーション、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素の失活が問題となって十分な性能を得ていない。
特表２００３−５２３１８３号公報 特表２００２−５０５０８０号公報 Takashi Ishikawa et al．"Construction of cDNA bank from biopsy specimens for multiple gene analysis of cancer"，Clinical Chemistry，1997，Vol．43，No．5，764
本発明者等は、特許文献１，２などに代表される様々な基板を用いてＭＰＥＣ法（Multiple Primer Extension on a Chip）によるＤＮＡ鎖伸長反応を利用したＲＮＡ検出を行ったところ、感度において十分ではないという知見を得て、表面に所定の高分子物質を配した担体を用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
また、別の観点からは、ＤＮＡ鎖伸長反応を利用したＲＮＡ検出反応において、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応後に残存するＲＮＡはＤＮＡ鎖伸長反応を阻害することが問題となり得ることを見出し、表面に所定の高分子物質を配した担体を用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
本発明に係るＲＮＡ検出方法は、表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む表面を用いて、標的サンプルを含む反応系から当該標的サンプル由来の標的ＲＮＡ鎖を検出するものである。
このような表面としては、例えば固定ＤＮＡプライマーを固定させた担体の表面が挙げられる。また、反応空間は、ＰＣＲ用チューブあるいはＰＣＲ用マイクロプレートの形状、またはチューブあるいはウェルの形状であってもよい。
本発明によれば、迅速に多検体処理可能なＲＮＡ検出方法を提供することができる。
また、ある観点から、標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物のサンプルから高感度でＲＮＡの検出、定量を行うことができる。
また、別の観点から、標的サンプルからＤＮＡ鎖伸長反応を利用したＲＮＡの検出において、ＲＮＡを分解させる処理工程を含むことなく簡便かつ迅速にＲＮＡの検出、定量を行うことができる。
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
本発明の実施形態で用いる反応空間を提供する表面の一例としての基板の一部を模式的に示す図である。 本発明の実施形態で用いる反応空間を提供する表面の他の一例としての基板の一部を模式的に示す図である。 第一の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図２のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図２のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第二の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図５のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図５のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第三の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図８のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図８のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第四の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図１１のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図１１のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第五の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図１４のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図１４のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第六の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図１７のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図１７のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 第七の実施形態に係るＲＮＡ検出方法を示すフローチャートである。 図２０のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 図２０のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。 実施例の定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例の定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係るＲＮＡ検出方法は、表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む表面を用いて、標的サンプルを含む反応系から当該標的サンプル由来の標的ＲＮＡ鎖を検出するものである。
本実施形態で使用することができる基板の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記表面に固定化される。このような表面としては、例えば固定ＤＮＡプライマーが固定された担体、例えば基板の表面が挙げられる。
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体などの表面における鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリン基を下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
（化１）
Figure 2007141912
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；−Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；等の基を有することができる。
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
（化２）
Figure 2007141912
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
（化３）
Figure 2007141912
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
（化４）
Figure 2007141912
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
表面にプライマーが固定化される基板などの担体の場合、第一単位および第二単位のさらに具体的な構成の組合せとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
また、本実施形態で使用することができる基板などの担体のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
（化５）
Figure 2007141912
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板などの担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上への鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
なお、ここでは、本実施形態で用いることができる基板などの担体として、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものを説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
このような第二の高分子物質は、鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体、例えば基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。なお、特に担体として基板を採用し、かつ、材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
プラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、
ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
スチレン；等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、さらに耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
担体の反応空間の形状については、マイクロチューブ、ＰＣＲ用及び定量的ＰＣＲ用のマイクロチューブ、また９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルマイクロタイタープレートなどを用いることができる。また、板状プラスチック表面を用いることができる。また、これらの担体に微細加工を施した微細流路内を用いることが出来る。特にＰＣＲ用及び定量的ＰＣＲ用のマイクロチューブは容器厚みが薄く、ＰＣＲ反応装置による反応温度コントロールの面で用いることが好ましい。
次に、反応空間を提供する表面への固定核酸プライマー（以下、「プライマー」という）の固定化方法について、担体の表面にプライマーを固定化する例を挙げて、説明する。なお、プライマーとしては、ＤＮＡプライマー、ＲＮＡプライマー、ＬＮＡ（locked nucleic acid）プライマー、ＥＮＡ(tm)（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）プライマーなどが挙げられる。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
上記工程（ｉ）において、鋳型ＲＮＡ断片とアニールするプライマーを担体上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を接触（または点着）させ、高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。また、プライマーを溶解または分散した液体を担体の表面に接触させるかわりに、点着させることにより、マイクロアレイ状にデザインすることもできる。
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
また、接触（または点着）後、担体表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
また、担体に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＲＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
以上により、本実施形態で使用することができる、表面にプライマーが固定化された担体が得られる。この担体は、図１−ａ、図１−ｂに示したように、担体１２の表面上にプライマー１４が固定化されている。また、担体１２の表面に設けられる反応空間としては、チューブ、ウェル、液体流路などＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことができる反応空間を提供できれば、どのような形状であってもよい。定量的ＰＣＲによって検出するためには、リアルタイムＰＣＲ装置に適合した、例えば透明な蓋を有するチューブ形状が望ましい。また、プライマー１４の長さは、目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
上記により得られるプライマーが固定化された担体は、一般的なプラスチック表面に比べ、ポリマーの親水性基の効果により担体表面への非特異的吸着が抑制されている。このため標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物などの生体由来成分が混在するサンプルから表面に固定化されたプライマーに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡのみが捕捉され、上清を取り除き、洗浄を行うことで捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡの精製を行うことができる。一般的なプラスチック表面では非特異的吸着があるために、捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡ以外にも表面への吸着がおこり、十分に精製することができない。ゆえに、非特異的な吸着が定量検出に悪影響を与える。
上記ポリマーを構成する親水性基は細胞表面をモチーフとするホスホリルコリン基を有しているため、固層表面において酵素反応を阻害しない。この効果により、捕捉したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を効率よく行うことができ、固相ｃＤＮＡを作製することができる。さらに、固相ｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲ反応を行うことにより出発物質に含まれるｍＲＮＡを定量することができる。
一般的に有機溶媒による抽出方法や磁気ビーズによる精製などのＲＮＡの精製方法では、工程が煩雑であり熟練の作業者が行わなくてはならない。また、精製工程におけるｍＲＮＡのロスや、ＲＮａｓｅやサンプル輸送におけるコンタミネーションの危険があるので、出発物質として大量のサンプル量を必要とし、また精製効率のばらつきが大きいために、分光光度計による精製物ごとのＲＮＡ量の定量を行う必要がある。しかしながら、本発明に係るＲＮＡ検出方法は、細胞溶解物から簡便な作業によりｍＲＮＡ精製、逆転写反応、ＰＣＲ反応を同一の反応溶液中で行うことができるため、従来において必要であった工程を省略することが可能になり、精製工程におけるｍＲＮＡのロスや、ＲＮａｓｅやサンプル輸送におけるコンタミネーションの危険が軽減されるとともに、ＲＮＡ検出も迅速に行うことができる。その結果、少量の出発物質からＲＮＡの定量を行うことができる。
また、表面に固定化されたプライマーに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡのみが捕捉された反応空間に対して、ランダムプライマーを含む逆転写反応液を添加することにより、固相に捕捉されたｍＲＮＡを鋳型として液相ｃＤＮＡを作製することができる。さらに、この液相ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行って、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することにより、増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡを用いてｍＲＮＡの定量を行うことができる。このようなＤＮＡまたはＲＮＡの増幅技術としては、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＴＲＣ（Transcription Reverse transcription Concerted reaction）法などが挙げられる。
また、本実施形態において、担体では、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成してもよい。この各アレイではそれぞれ固定核酸プライマーを固定することができる。基板をこのようなアレイ状にすることで、複数のアッセイを同時に行うことができ、スクリーニングなどが可能になる。
以下、この担体を用いたＲＮＡ検出方法の具体的な態様について説明する。
（第一の実施態様）
図２は、第一の実施態様としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図３Ａ〜図３Ｃおよび図４Ａ〜図４Ｄは、図２のフローチャートにしたがって担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、担体１２（例えば基板）に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２を導入し（ステップＳ１０）、この標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行う（ステップＳ２０、Ｓ３０）第１段階と、伸長反応により得られたＤＮＡ鎖１８を検出する（ステップＳ５０）第２段階とを含むものである。
図２によれば、ステップＳ１０では、図１−ａ、図１−ｂに示した担体１２の表面に固定化されたプライマー１４を含む反応空間２０に細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２が導入される（図３Ａ）。この細胞溶解物には、プライマー１４にアニールさせるＤＮＡ鎖伸長用の鋳型ＲＮＡ鎖１６（図４Ａ）が含まれているが、図３Ａのように細胞の可溶化がなされていない試料を用いる場合には、細胞を可溶化してＲＮＡを溶出する必要がある。
反応空間２０に導入される試料からなる反応系としては、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかのＤＮＡ鎖伸長用酵素系の存在下で、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど：ｄＮＴＰ）を含有するＭＰＥＣ用バッファを用いることができる。
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＲＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応するプライマー側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
図２に戻り、ステップＳ２０では、反応系の温度をプライマー１４と鋳型のＲＮＡ鎖１６とがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃にて保持する。このアニール処理により、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とがハイブリダイズして二本鎖になる（図３Ｂ、図４Ｂ）。なお、ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は二本鎖にならない。この反応系に対して、二本鎖を組まなかった未反応のＲＮＡ鎖などを除く洗浄処理を行わずにそのままステップＳ３０に進んでもよい。
ここで、従来では、アニール処理した後で伸長反応の前に、前記の洗浄処理が必須であった。本実施形態では、担体上に非特異的に吸着するＲＮＡ断片がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、担体の洗浄処理が必須ではなくなる。しかしながら、従来どおりに、前記の洗浄処理を行ってから、ステップＳ３０に進んでも差し支えない。
ステップＳ３０では、図３Ｃおよび図４Ｃに示したように、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こる。その結果、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される。また、ステップＳ１０で導入する試料２２に、ヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）の他に前述したような標識核酸を含めておくことで、担体１２上に形成されるｃＤＮＡ鎖１８をラベルすることができる（図３Ｃ、図４Ｃ）。
ステップＳ４０では、反応液を捨てて、担体１２を、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。
ステップＳ５０では、図３Ｃおよび図４Ｃに示したｃＤＮＡ鎖１８の検出を行う。
具体的には、ステップＳ１０にて導入したラベルされたヌクレオチドモノマー、例えばＣｙ３−ｄＵＴＰを用いた蛍光検出、または、アミノアリルを導入したヌクレオチドモノマーを用いての蛍光検出、さらにはビオチンを標識したヌクレオチドモノマーを用いて、蛍光標識したアビジンを反応させての蛍光による検出を行う。
また代わりにアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼを標識したアビジンにより酵素を導入し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬やＴＮＢＺ、ＯＰＤによる発色反応により、ｃＤＮＡ鎖の形成状況を可視化により確認することが出来る。アルカリフォスファターゼを導入し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬を用いると、図４Ｄに示したように、スポット状にｃＤＮＡ鎖が形成された反応空間が確認できる。ＴＭＢＺやＯＰＤによる発色反応では、プレートリーダーを用いて吸光度を計ることにより、ｃＤＮＡの形成度合いをより正確に把握することができる。
図４Ｄに示したように、担体１２上で反応空間２０を互いに独立して複数設けてアレイ状にすることにより、各反応空間２０での反応条件、例えばプライマーの種類、試薬の濃度、ＤＮＡ鎖伸長用酵素の種類などを変更して、スクリーニングを行うことができる。
（第二の実施態様）
図５は、第二の実施態様としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図６Ａ〜図６Ｄおよび図７Ａ〜図７Ｅは、図５のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２を導入し（ステップＳ１１０）、この標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖１８を形成する（ステップＳ１２０、Ｓ１３０）第１段階と、このＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前述した反応系のＲＮＡ鎖１６を分解処理する（ステップＳ１４０）第２段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し（ステップＳ１５０）、このｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１を合成する（ステップＳ１６０、Ｓ１７０、Ｓ１８０）第３段階と、この合成された二重鎖ＤＮＡ２１を検出する第４段階（ステップＳ２００）とを含むものである。
図５によれば、ステップＳ１１０では、図２のステップＳ１０と同様に、プライマー１４が固定化された反応空間２０に試料２２が導入される（図６Ａ、図７Ａ）。なお、図２では、反応空間２０に導入される試料のうち、ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておいてもよいとしていたが、本実施形態では、後述するｃＤＮＡ鎖を伸長する段階では、ラベルを導入しない。
ステップＳ１２０では、図２のステップＳ２０と同様に、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、アニール処理し、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とをハイブリダイズさせて二本鎖にする（図６Ｂ、図７Ｂ）。なお、第一の実施形態と同様に、ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は二本鎖にならない。
ステップＳ１３０では、図２のステップＳ３０と同様に、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される（図６Ｃ、図７Ｃ）。
ステップＳ１４０では、反応系にＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中に含まれるＲＮＡ鎖を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨを導入して、ＲＮＡ鎖１６のみを分解する。
ステップＳ１５０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有する伸長用ＤＮＡプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）を含むＭＰＥＣ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばKlenowフラグメントが挙げられる。また、ヌクレオチドモノマーには、図２のステップＳ１０で導入されるヌクレオチドモノマーのように、少なくとも一種にラベルを導入することができる。
ステップＳ１６０では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する担体上に形成されたｃＤＮＡ鎖や伸長用ＤＮＡプライマーが直鎖状の一本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ１７０に進む。
ここで、従来では、アニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、本実施形態では、担体上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片がないため、およびこのことがＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効に行われると推測され、担体の洗浄処理が不要になる。このようにして、ハイブリダイゼーション、洗浄、および酵素およびモノマー添加伸長の各処理を行っていたように、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを別々の液相で行っていたのを、本実施形態では、ハイブリダイゼーションと伸長反応とを同一の液相系、すなわち反応系をそのまま用いることができる。
ステップＳ１７０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８と、前記ＭＰＥＣ試料に含まれる伸長用ＤＮＡプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ１８０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、例えばKlenowフラグメントの作用によりｃＤＮＡ鎖１８と相補的なＤＮＡ鎖１９の伸長反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が合成される（図６Ｄ、図７Ｄ）。また、ステップＳ１５０で導入するＭＰＥＣ試料に、ヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）の他に前述したような標識核酸を含めておくことで、ＤＮＡ鎖１９をラベルすることができるため、担体１２上に形成されるｄｓＤＮＡ鎖２１をラベルすることができる。
ステップＳ１９０では、図２のステップＳ４０と同様に、反応液を捨てて、担体１２を、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。
ステップＳ２００では、図６Ｄおよび図７Ｄに示したｄｓＤＮＡ２１の検出を行う。具体的には、ステップＳ１５０にて導入したラベルされたヌクレオチドモノマー、例えばＣｙ３−ｄＵＴＰを用いた蛍光検出、またはビオチンなどを導入したヌクレオチドモノマーを用いてＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応により蛍光染色による蛍光検出、あるいはＥＬＩＳＡに用いる発色法を用いて、ｄｓＤＮＡ２１の検出を行う。図７Ｅに示したように、ｄｓＤＮＡ２１が形成された反応空間２０に相当する箇所が視覚化されて、視覚化された反応空間ではｄｓＤＮＡ２１が形成されたことがわかる。
第一の実施形態と同様に、図７Ｅに示したように、担体１２上で反応空間２０を互いに独立して複数設けてアレイ状にすることにより、各反応空間２０での反応条件、例えばプライマーの種類、試薬の濃度、ＤＮＡ鎖伸長用酵素の種類などを変更して、スクリーニングを行うことができる。
（第三の実施態様）
図８は、第三の実施態様としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図９Ａ〜図９Ｄおよび図１０Ａ〜図１０Ｅは、図８のフローチャートにしたがって担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２を導入し（ステップＳ２１０）、標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する（ステップＳ２２０、Ｓ２３０）第１段階と、ＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前述した標的細胞の細胞溶解物を含む反応系のＲＮＡ鎖１６を分解処理する（ステップＳ２４０）第２段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し（ステップＳ２５０）、このｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１を合成する（ステップＳ２６０、Ｓ２７０、Ｓ２８０）第３段階と、二重鎖ＤＮＡ２１を熱変成して（ステップＳ３００）得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡ２１を合成して、二重鎖ＤＮＡ２１を増幅する（ステップＳ３１０、Ｓ３２０）第４段階と、増幅された二重鎖ＤＮＡ２１を検出する（ステップＳ３３０）第５段階とを含むものである。
図８によれば、ステップＳ２１０では、図２のステップＳ１０と同様に、プライマー１４が固定化された反応空間２０に試料２２が導入される（図９Ａ、図１０Ａ）。なお、図２では、反応空間２０に導入される試料のうち、ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておいてもよいとしていたが、本実施形態では、後述するｃＤＮＡ鎖を伸長する段階では、ラベルを導入しない。
ステップＳ２２０では、図２のステップＳ２０と同様に、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、アニール処理し、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とをハイブリダイズさせて二本鎖にする（図９Ｂ、図１０Ｂ）。なお、第一の実施形態と同様に、ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は二本鎖にならない。
ステップＳ２３０では、図２のステップＳ３０と同様に、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される（図９Ｃ、図１０Ｃ）。
ステップＳ２４０では、反応系にＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中に含まれるＲＮＡ鎖を特異的に分解するリボヌクレアーゼＨを導入して、ＲＮＡ鎖１６のみを分解する。
ステップＳ２５０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有する伸長用ＤＮＡプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）を含むＭＰＥＣ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばKlenowフラグメントが挙げられる。また、第二の実施形態とは異なり、続いてＤＮＡ増幅反応が行われるため、ここで使用するヌクレオチドモノマーには、ラベルは導入しない。
ステップＳ２６０では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する担体上に形成されたｃＤＮＡ鎖や伸長用ＤＮＡプライマーが直鎖状の一本鎖になる。この反応系に対して、第二の実施形態と同様に、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ２７０に進む。
ステップＳ２７０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８と、前記ＭＰＥＣ試料に含まれる伸長用ＤＮＡプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ２８０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、例えばKlenowフラグメントの作用によりｃＤＮＡ鎖１８と相補的なＤＮＡ鎖１９の伸長反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が合成される（図９Ｄ、図１０Ｄ）。
ステップＳ２９０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８およびＤＮＡ鎖１９のそれぞれの一部と相補的な配列を有する各プライマー、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含むＰＣＲ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばＰＣＲで代表的に使用されるTaqポリメラーゼが挙げられる。
ステップＳ３００では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この反応系に対して、ステップＳ２６０と同様に、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ３１０に進む。
ステップＳ３１０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８またはＤＮＡ鎖１９と、前記ＰＣＲ試料に含まれるそれぞれに対応するプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ３２０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系の作用によりＤＮＡ増幅反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が増幅される（図１０Ｅ）。
ステップＳ３３０では、図１０Ｅに示したように、ステップＳ３２０にて増幅されたｄｓＤＮＡ２１の検出を行う。具体的には、二重鎖ＤＮＡを選択的に検出することができる試薬、例えばSYBR Greenを用いて蛍光により検出することができる。
第一の実施形態と同様に、担体１２上で反応空間２０を互いに独立して複数設けてアレイ状にすることにより、各反応空間２０での反応条件、例えばプライマーの種類、試薬の濃度、ＤＮＡ鎖伸長用酵素の種類などを変更して、スクリーニングを行うことができる。
（第四の実施形態）
図１１は、第四の実施形態としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図１２Ａ〜図１２Ｄおよび図１３Ａ〜図１３Ｅは、図１１のフローチャートにしたがって、担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２を導入し（ステップＳ１１０）、この標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖１８を形成する（ステップＳ１２０、Ｓ１３０）第１段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し（ステップＳ１５０）、このｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１を合成する（ステップＳ１６０、Ｓ１７０、Ｓ１８０）第２段階と、この合成された二重鎖ＤＮＡ２１を検出する第３段階（ステップＳ２００）とを含むものである。
本実施形態は、前記第二の実施形態において、ｃＤＮＡ鎖１８とハイブリダイズしているＲＮＡ鎖１６（図６Ｃ、図７Ｃ）を分解するための処理であるステップＳ１４０を行わない他は、第二の実施形態と同様である。
すなわち、図１１によれば、ステップＳ１１０では、図２のステップＳ１０と同様に、プライマー１４が固定化された反応空間２０に試料２２が導入される（図１２Ａ、図１３Ａ）。ステップＳ１２０では、図２のステップＳ２０と同様に、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、アニール処理し、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とをハイブリダイズさせて二本鎖にする（図１２Ｂ、図１３Ｂ）。ステップＳ１３０では、図２のステップＳ３０と同様に、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写（ＲＴ）反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される（図１２Ｃ、図１３Ｃ）。ステップＳ１５０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有する伸長用ＤＮＡプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）を含むＭＰＥＣ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばKlenowフラグメントが挙げられる。また、ヌクレオチドモノマーには、図２のステップＳ１０で導入されるヌクレオチドモノマーのように、少なくとも一種にラベルを導入することができる。ステップＳ１６０では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する担体上に形成されたＤＮＡ鎖や伸長用ＤＮＡプライマーが直鎖状の一本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ１７０に進む。ステップＳ１７０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８と、前記ＭＰＥＣ試料に含まれる伸長用ＤＮＡプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ１８０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、例えばKlenowフラグメントの作用によりｃＤＮＡ鎖１８と相補的なＤＮＡ鎖１９の伸長反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が合成される（図６Ｄ、図７Ｄ）。また、ステップＳ１５０で導入するＭＰＥＣ試料に、ヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）の他に前述したような標識核酸を含めておくことで、ＤＮＡ鎖１９をラベルすることができるため、担体１２上に形成されるｄｓＤＮＡ鎖２１をラベルすることができる。ステップＳ１９０では、図２のステップＳ４０と同様に、反応液を捨てて、担体１２を、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。ステップＳ２００では、図１２Ｄおよび図１３Ｄに示したｄｓＤＮＡ２１の検出を行う。具体的には、前述したようなＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬を用いた手法を用いて、担体１２上でｄｓＤＮＡ２１が形成された反応空間２０に相当する箇所が視覚化するようにしてｄｓＤＮＡ鎖２１の検出を行う（図１３Ｅ）。
（第五の実施形態）
図１４は、第四の実施形態としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図１５Ａ〜図１５Ｄおよび図１６Ａ〜図１６Ｅは、図１４のフローチャートにしたがって、担体の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２２を導入し（ステップＳ２１０）、標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する（ステップＳ２２０、Ｓ２３０）第１段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し（ステップＳ２５０）、このｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１を合成する（ステップＳ２６０、Ｓ２７０、Ｓ２８０）第２段階と、二重鎖ＤＮＡ２１を熱変成して（ステップＳ３００）得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡ２１を合成して、二重鎖ＤＮＡ２１を増幅する（ステップＳ３１０、Ｓ３２０）第３段階と、増幅された二重鎖ＤＮＡ２１を検出する（ステップＳ３３０）第４段階とを含むものである。
本実施形態は、前記第三の実施形態において、ｃＤＮＡ鎖１８とハイブリダイズしているＲＮＡ鎖１６（図９Ｃ、図１０Ｃ）を分解するための処理であるステップＳ１４０を行わない他は、第二の実施形態と同様である。
図１４によれば、ステップＳ２１０では、図２のステップＳ１０と同様に、プライマー１４が固定化された反応空間２０に試料２２が導入される（図１５Ａ、図１６Ａ）。ステップＳ２２０では、図２のステップＳ２０と同様に、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、アニール処理し、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とをハイブリダイズさせて二本鎖にする（図１５Ｂ、図１６Ｂ）。ステップＳ２３０では、図２のステップＳ３０と同様に、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写（ＲＴ）反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される（図１５Ｃ、図１６Ｃ）。ステップＳ２５０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有する伸長用ＤＮＡプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマー（ｄＮＴＰ）を含むＭＰＥＣ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばKlenowフラグメントが挙げられる。ステップＳ２６０では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する担体上に形成されたｃＤＮＡ鎖や伸長用ＤＮＡプライマーが直鎖状の一本鎖になる。この反応系に対して、第二の実施形態と同様に、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ２７０に進む。ステップＳ２７０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８と、前記ＭＰＥＣ試料に含まれる伸長用ＤＮＡプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ２８０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系の作用によりｃＤＮＡ鎖１８と相補的なＤＮＡ鎖１９の伸長反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が合成される（図１５Ｄ、図１６Ｄ）。ステップＳ２９０では、鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８およびＤＮＡ鎖１９のそれぞれの一部と相補的な配列を有する各プライマー、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含むＰＣＲ試料を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばＰＣＲで代表的に使用されるTaqポリメラーゼが挙げられる。ステップＳ３００では、試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この反応系に対して、ステップＳ２６０と同様に、洗浄処理は行わずに、そのままステップＳ３１０に進む。ステップＳ３１０では、前述したようなアニール処理を行い、ｃＤＮＡ鎖１８またはＤＮＡ鎖１９と、前記ＰＣＲ試料に含まれるそれぞれに対応するプライマーとが二本鎖になり、ステップＳ３２０に進み、ＤＮＡ鎖伸長酵素系の作用によりＤＮＡ増幅反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が増幅される（図１６Ｅ）。ステップＳ３３０では、図１６Ｅに示したように、ステップＳ３１０にて増幅されたｄｓＤＮＡ２１の検出を行う。具体的には、二重鎖ＤＮＡを選択的に検出することができる試薬、例えばSYBR Greenを用いて蛍光により検出することができる。
（第六の実施態様）
図１７は、第一の実施態様としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図１８Ａ〜図１８Ｄおよび図１９Ａ〜図１９Ｄは、図１７のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法であって、標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物を、前述した表面を有する反応空間に移し（ステップＳ４１０）、標的サンプル中のｍＲＮＡを固定核酸プライマーによってハイブリダイズし（ステップＳ４２０）、適切な緩衝液をもちいてＲＴ−ＰＣＲを該反応空間で行い（ステップＳ４５０、Ｓ４７０）、目的ＰＣＲ産物を検出する（ステップＳ４８０）各段階を含む。
すなわち、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば細胞溶解物を含む試料２２導入し（ステップＳ４１０）、ハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ４２０）第１段階と、洗浄を行う（ステップＳ４３０）第２段階と、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２３を導入し（ステップＳ４４０）、細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、固定ＤＮＡプライマー（プライマー１４）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する（ステップＳ４５０）第３段階と、ｃＤＮＡ鎖１８を含む反応系に伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料２４を導入し（ステップＳ４６０）、ｃＤＮＡ鎖１８を鋳型にして、ＰＣＲ反応を行い、二重鎖ＤＮＡ２１を増幅する（ステップＳ４７０）第４段階と、増幅された２重鎖ＤＮＡ２１を検出する（ステップＳ４８０）第５段階とを含むものである。
図１７によれば、ステップＳ４１０では、プライマー１４が固定化された反応空間２０に細胞溶解物を含む試料２２が導入される（図１８Ａ、図１９Ａ）。なお、前記細胞溶解物を含む溶液を、ＲＮａｓｅ活性を阻害するまたはＲＮａｓｅを不活性化するための試薬、例えばＤＥＰＣ（Diethylprocarbonate）を含み、かつ、ハイブリダイゼーションのためのｐＨ及び塩濃度を調整する緩衝液を用いて調製してもよい。このように、ステップＳ４１０にて導入される細胞溶解物中に、ステップＳ４５０および必要に応じてステップＳ４７０におけるＤＮＡ鎖伸長用酵素系による酵素反応を阻害しない場合、また酵素反応への阻害を低減させる工夫がある場合、細胞溶解物を含む試料２２にステップＳ４４０および必要に応じてステップＳ４６０にて導入する試料２３、試料２４に含めるＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびオリゴヌクレオチドモノマーを加え、ステップＳ３０の洗浄工程（ステップＳ４３０）およびｃＤＮＡ伸長反応液導入工程（ステップＳ４４０）を省略することができる。また、細胞溶解物などの標的サンプルが、グアニジン又はプロテアーゼ又はフェノールを含んでいてもよい。
ステップＳ４２０では、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、ハイブリダイゼーションを行い、鋳型のＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とを二本鎖にする。ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は二本鎖にならない。また、プライマー１４にオリゴｄＴプライマーを用いることにより、ｍＲＮＡがもつポリＡを捕捉することができる。標的ＲＮＡ鎖はｍＲＮＡに限らず、プライマー１４に特異的な配列をもつＤＮＡプライマーを用いることにより、特異的なＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖を捕捉することができる。
ステップＳ４３０では、反応空間２０を洗浄することで、プライマー１４とＲＮＡ鎖１６との二本鎖を残し反応空間内の試料２２を取り除くことができる（図１８Ｂ、図１９Ｂ）。洗浄において上記ポリマーをコートした表面は親水性基に標的サンプル、例えば細胞溶解物中に含まれる生体分子の非特異的な吸着を妨げる効果があるために、ハイブリダイズしたＲＮＡ鎖１６以外のＲＮＡ鎖は取り除かれ、純粋なｍＲＮＡとして精製することができる。前述した高分子物質を表面に有さないポリスチレン、ポリプロピレンなどのプラスチック表面を用いた場合、後工程の酵素反応阻害物質を取り除くことができず検出において悪影響を与える。
ステップＳ４４０では、ＲＮＡ鎖１６がプライマー１４により捕捉された反応空間２０に、ｃＤＮＡ伸長反応液（試料２３）を導入する。このｃＤＮＡ伸長反応液には、前述したようなＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーが含まれる。また、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系として、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液または、ｒＴｔｈポリメラーゼを含む反応溶液を用いる場合、ステップＳ４７０でのＰＣＲ反応を反応空間での緩衝液の交換なしで行うことができるため、ステップＳ４６０を省略することができる。
ステップＳ４５０では、プライマー１４の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写（ＲＴ）反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、ＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８が担体１２の上に形成される（図１８Ｃ、図１９Ｃ）。なお、ｃＤＮＡ鎖１８が得られた後に、固定核酸プライマー１４とハイブリダイズさせたｍＲＮＡであるＲＮＡ鎖１６の除去なしに、ステップＳ４７０のＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅反応を行ってもよい。
ステップＳ４６０では、ｃＤＮＡ鎖１８を鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有するプライマー、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含むＰＣＲ反応液（試料２４）を導入する。ＤＮＡ鎖伸長酵素系としては、例えばＰＣＲで代表的に使用されるTaqポリメラーゼなどの耐熱性酵素が挙げられる。ステップＳ４８０において、定量的ＰＣＲ反応による蛍光色素による定量を行う場合、該反応液にＴａｑＭａｎプローブなどの検出用蛍光プローブやＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光分子を導入する必要がある。また、ＤＮＡマイクロアレイなどのハイブリダイゼーションによる検出を行う場合、ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種類をラベル化する必要がある。
ステップＳ４７０では、ｃＤＮＡ鎖１８とｃＤＮＡ鎖１８の一部と相補的な配列を有するプライマーとＤＮＡ鎖伸長酵素系の作用によりＤＮＡ増幅反応（ＰＣＲ）が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が増幅される（図１８Ｄ、図１９Ｄ）。
ステップＳ４８０では、図１８Ｄおよび図１９Ｄに示したｄｓＤＮＡ鎖２１の検出を行う。具体的には、図５のステップＳ２００のｄｓＤＮＡ鎖の検出技術と同様の技術を用いることができる。
なお、前述したように、ステップＳ４４０〜ステップＳ４７０において、ｃＤＮＡ合成を行う逆転写酵素等による反応と、ＰＣＲ反応を行うＤＮＡポリメラーゼ等による反応とを同一反応溶液で行うことができる１ステップタイプのＲＴ−ＰＣＲ反応液を用いる場合、ステップＳ４６０を省略することができる。
また、ステップＳ４５０で形成されたｃＤＮＡ鎖１８は担体１２表面にＤＮＡ鎖として安定に存在するため、固相ｃＤＮＡとして反応空間２０に保存することができる。
また、ステップＳ４８０での目的ＰＣＲ産物であるｄｓＤＮＡ鎖２１の検出後、反応空間に合成されたｃＤＮＡ鎖１８が固定化されたままの残るように洗浄し、前述したＲＴ−ＰＣＲを行う段階で用いたものと同じであるか、または異なる適切なプライマーを用いてＰＣＲを行い、そして目的ＰＣＲ産物を測定する段階をさらに含んでいてもよい。
また、さらに、洗浄を行う段階、ＰＣＲを行う段階および測定を行う段階を繰り返してもよい。
また、反応空間２０をＰＣＲ用チューブまたはＰＣＲ用マイクロプレートとすることができ、これによりスクリーニング技術に有用なＲＮＡ検出方法の提供が可能となる。
（第七の実施態様）
図２０は、第七の実施態様としてのＲＮＡ検出方法の手順を示すフローチャートである。図２１Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅおよび図２２Ａ〜図２２Ｃは、図２０のフローチャートにしたがって基板の反応空間で行われる反応を模式的に示す図である。
このＲＮＡ検出方法は、標的サンプル、例えば標的細胞の細胞溶解物を、前述した表面を有する反応空間に移し（ステップＳ５１０）、標的サンプル中のｍＲＮＡを固相核酸プライマーによってハイブリダイズし（ステップＳ５２０）、液相に逆転写反応用プライマーを含む逆転写反応液を導入し（ステップＳ５４０）、逆転写された液相ｃＤＮＡを作製する（ステップＳ５６０）各段階を含むものである。
すなわち、担体１２に設けられた反応空間２０に標的サンプル、例えば細胞溶解物を含む試料２２導入し（ステップ５１０）、ハイブリダイゼーションを行う（ステップＳ５２０）第１段階と、洗浄を行う（ステップＳ５３０）第２段階と、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系及びヌクレオチドモノマー及びＤＮＡ鎖伸長用プライマーを含む試料２５を導入し（ステップＳ５４０）、細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖１６を鋳型にして、ＤＮＡ鎖伸長用プライマー（プライマー１５）のＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖１９を形成する（ステップＳ５５０）第３段階と、ｃＤＮＡ鎖１９の一部と伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む反応系でＰＣＲ反応を行い、２重鎖ＤＮＡ２１を増幅する（ステップＳ５６０）第４段階と、増幅された２重鎖ＤＮＡ２１を検出する（ステップＳ５７０）第５段階とを含むものである。
図２０によれば、ステップＳ５１０では、図１７のステップＳ４１０と同様に、プライマー１４が固定化された反応空間２０に試料２２が導入される（図２１Ａ、図２２Ａ）。なお、前記細胞溶解物を含む溶液を、前述したようなＲＮａｓｅ活性を阻害するまたはＲＮａｓｅを不活性化するための試薬を含み、かつ、ハイブリダイゼーションのためのｐＨ及び塩濃度を調整する緩衝液を用いて調製してもよい。また、細胞溶解物などの標的サンプルが、グアニジン又はプロテアーゼ又はフェノールを含んでいてもよい。
ステップＳ５２０では、図１７のステップＳ４２０と同様に、必要に応じて試料２２からＲＮＡを溶出させて、ハイブリダイゼーションを行い、鋳型ＲＮＡ鎖１６の一部と相補的な配列を有するプライマー１４と、このＲＮＡ鎖１６とを二本鎖にする。なお、第一の実施形態と同様に、ＲＮＡ鎖１６の配列のどの部分とも相補的な関係の配列をも有さないプライマー１４は２本鎖にならない。また、プライマー１４にオリゴｄＴプライマーを用いることにより、ｍＲＮＡがもつポリＡを捕捉することができる。
ステップＳ５３０では、図１７のステップＳ４３０と同様に、反応空間２０を洗浄することで、プライマー１４とＲＮＡ鎖１６との二本鎖を残し反応空間内の試料２２を取り除くことができる（図２１Ｂ、図２２Ｂ）。
ステップＳ５４０では、反応空間２０にＤＮＡ鎖伸長用酵素系及びヌクレオチドモノマー及びＤＮＡ鎖伸長用プライマー１５を含むｃＤＮＡ伸長反応液（試料２５）の導入を行う。ＤＮＡ鎖伸長用プライマーは一般的に６塩基〜１０塩基程度のランダムな塩基配列のオリゴＤＮＡ（以下、ランダムプライマー）が用いることができる。また、ＲＮＡ鎖１６に特異的な相補性をもつ特定のオリゴＤＮＡを用いてもよい。なお、試料２５に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種に、ラベルされたものを用いてもよい。
ステップＳ５５０では、プライマー１４及び液相中のＲＮＡ鎖１６とハイブリダイズしたＤＮＡ鎖伸長用プライマー１５の３'末端において、ＲＮＡ鎖１６を鋳型としてＤＮＡ鎖伸長用酵素系の作用により逆転写（ＲＴ）反応が起こり、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こり、担体１２上にＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１８と、液相にＲＮＡ鎖１６に相補的なｃＤＮＡ鎖１９が形成される（図２１Ｄ、図２２Ｃ）。上記ＤＮＡ鎖伸長用プライマーにランダムプライマーを用いた場合、ＲＮＡ鎖１６に対し様々な部分をプライマーと相補的な関係になりうるために、形成されるｃＤＮＡ鎖１９は単一の長さではない。ステップＳ５４０において、ラベルされたヌクレオチドモノマーを導入した場合、ｃＤＮＡ鎖１８、１９をラベルすることができる。
ステップＳ５６０では、ステップ５５０において形成されたｃＤＮＡ鎖１９を鋳型ＤＮＡ鎖としてのｃＤＮＡ鎖１９の一部と相補的な配列を有するプライマー（不図示）、ＤＮＡ鎖伸長酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含むＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲ反応を行うことによりＤＮＡ増幅反応が起こり、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ２１が増幅される（図２２Ｅ）。ステップＳ５７０では、図２１Ｅに示したｄｓＤＮＡ鎖２１の検出を行う。具体的には、図５のステップＳ２００のｄｓＤＮＡ鎖の検出技術と同様の技術を用いることができる。ステップ５５０において形成されたｃＤＮＡ鎖１９は液相に存在するために分割することができ、様々なプライマーに対しＰＣＲ反応を行うことができる。また、ＤＮＡ鎖で存在するため、冷凍保存が可能である。また、液相中に存在するｃＤＮＡ鎖１９を用いて、さらにＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することもできる。この増幅方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法などが挙げられる。
また、反応空間２０をＰＣＲ用チューブまたはＰＣＲ用マイクロプレートとすることができ、これによりスクリーニング技術に有用なＲＮＡ検出方法の提供が可能となる。
この方法によれば、特に遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析を、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、細胞溶解物を試料として簡便な操作で行うことができるようになる。
（実施例１）
（ＰＭＢＮコート９６穴マイクロタイタープレートの作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形により９６ウェルマイクロタイタープレートを成形した。各ウェルをＰＭＢＮでコートし、この成形物底面にＰＭＢＮをコートし、本発明の実施形態であるＰＭＢＮコート９６穴マイクロタイタープレートを作製した。以下ＰＭＢＮプレートと称す。
（アルデヒド基導入９６穴マイクロタイタープレートの作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形により９６ウェルマイクロタイタープレートを成形した。成形した９６ウェルタイタープレートに酸素プラズマを施した後、アミノシランによりアミノ基を導入の後、グルタルアルデヒドにより、アミノ基にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基導入９６穴マイクロタイタープレートを作製した。以下、アルデヒドプレートと称す。
（プライマーの固定）
プライマーとして、下記表１に示したように、５'末端がアミノ基で修飾された配列１に示す大腸菌の２３ＳリボゾームＲＮＡに特異的な配列よりなるオリゴＤＮＡ、配列２に示す黄色ブドウ球菌の２３ＳリボゾームＲＮＡに特異的な配列よりなるオリゴＤＮＡ、ならびに、配列３に示す緑膿菌の２３ＳリボゾームＲＮＡに特異的な配列よりなるオリゴＤＮＡを各々０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、各々、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。各オリゴＤＮＡ溶液を上記ＰＭＢＮプレートおよびアルデヒドプレートの各ウェルに１０μｌ分注し、プレートを８０℃で１時間放置した。超純水により洗浄を行った後、各ウェルのブロッキング処理をおこなった。
このブロッキング処理とは、基板にオリゴＤＮＡを固定化させて、固定化プライマーとした後に、基板の表面に存在する未反応の活性エステルまたはアルデヒド基部分を不活性化して、試料中のＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖、その他たんぱく質などの生体由来物質などが非特異的に結合することを防止するための処理をいう。
具体的には、ＰＭＢＮプレートについては、各ウェルにブロッキング溶液として、１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ溶液を各ウェルに４００μｌ分注し、５分間室温で放置した後、ブロッキング液を除き、超純水により洗浄をおこなった。
アルデヒドプレートについては、１８０ｍｌのリン酸緩衝液に０．６ｇの水素化ホウ素ナトリウムと５０ｍｌのエタノールを溶解させた溶液をブロッキング溶液とし、各ウェルに４００μｌ分注し室温で５分間放置し、ブロッキング液を除き、超純水により洗浄をおこなった。
ブロッキング処理後、ＰＢＳ（−）に１重量％ＢＳＡを各ウェルに４００μｌを分注し、室温で２時間放置し、ＰＢＳ（−）に０．０５重量％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄溶液を４００μｌ分注し吸引除去を３回で洗浄を行った後、プレートを乾燥させた。
（表１）
Figure 2007141912
（大腸菌からトータルＲＮＡ溶液の調製）
培養した大腸菌より抽出したトータルＲＮＡ１μｇを含むＤＥＰＣ処理水溶液１００μｌを６５℃で５分間保温後、氷上で急冷した。反応液として、Reverse Transcriptase M-MLV（Rnase H-）、５×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、RNAse Inhibitor（Super）、１ｍＭビオチン標識ｄＵＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製しものを、上記ＲＮＡ溶液に加えた。この溶液を各ウェルに５０μｌを分注し、４２℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、TE buffer（10mMTris/HCl（pH8.5），1mMEDTA）を２００μｌ分注した後、TE bufferにて２回洗浄し、超純水にて洗浄し乾燥した。
ペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を分注し室温で３０分放置した後、ペルオキシダーゼ標識アビジン溶液を除去した後、ＰＢＳ（−）に０．０５重量％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄溶液を４００μｌ分注し吸引除去を３回で洗浄を行った後、ＰＯＤ発色基質溶液をウェルあたり１００μｌ分注し、遮光下１５分間放置し、発色反応を行った後、停止液１００μｌを各ウェルに分注し、発色の状況をプレートリーダーにより、吸光度を測定することにより行った。
基質の発色が確認されれば、ＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡが合成されていることを示し、その吸光度が高ければ効率良く、ｃＤＮＡの合成が出来ていることになる。
今回は、大腸菌より抽出したトータルＲＮＡをサンプルに用いており、大腸菌の２３ＳリボゾームＲＮＡに特異的な配列をもつオリゴＤＮＡをプライマーとして固定化したウェルのみが発色すれば、大腸菌を特異的に検出出来たことが確認できる。
ＰＭＢＮプレートとアルデヒドプレートとで各配列のオリゴＤＮＡをプライマーの配列に対応する、ＤＮＡ鎖をプライマーとして固定したウェルでの蛍光強度を下記表２に示す。なお、各ウェルの吸光度は、各々のプレートで、プライマーを固定していないウェルの吸光度の値を差し引いたものを各プライマーを固定したウェルの吸光度とした。
ＰＭＢＮプレートでは、大腸菌特異配列プライマーのみ逆転写がおこり、特異的に優れたＲＮＡの検出が可能であることがいえる。
（表２）
Figure 2007141912
（実施例２）
（ＰＭＢＮコートチューブの作製）
ＰＣＲ用チューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｓｔｒｉｐ Ｔｕｂｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内を一般式（２）のＰＭＢＮでコートし、本発明の実施形態であるＰＭＢＮコートチューブを作製した。以下ＰＭＢＮコートチューブと称す。
（アルデヒド基導入チューブの作製）
ＰＣＲ用チューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｓｔｒｉｐ Ｔｕｂｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内に酸素プラズマを施した後、アミノシランによりアミノ基を導入の後、グルタルアルデヒドにより、アミノ基にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基導入チューブを作製した。以下、アルデヒドチューブと称す。
（プライマーの固定）
プライマーとして、下記表３に示したように、５'末端がアミノ基で修飾された配列４に示すオリゴＤＮＡを各々０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。各オリゴＤＮＡ溶液を上記ＰＭＢＮコートチューブおよびアルデヒドチューブの各チューブに１０μｌ分注し、チューブを８０℃で１時間放置した。超純水により洗浄を行った後、各チューブのブロッキング処理をおこなった。
このブロッキング処理とは、担体表面にオリゴＤＮＡを固定化させて、固定化プライマーとした後に、担体の表面に存在する未反応の活性エステルまたはアルデヒド基部分を不活性化して、試料中のＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖、その他たんぱく質などの生体由来物質などが非特異的に結合することを防止するための処理をいう。
具体的には、ＰＭＢＮコートチューブについては、各ウェルにブロッキング溶液として、１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ溶液を各ウェルに４００μｌ分注し、５分間室温で放置した後、ブロッキング液を除き、超純水により洗浄をおこなった。
アルデヒドチューブについては、１８０ｍｌのリン酸緩衝液に０．６ｇの水素化ホウ素ナトリウムと５０ｍｌのエタノールを溶解させた溶液をブロッキング溶液とし、各ウェルに４００μｌ分注し室温で５分間放置し、ブロッキング液を除き、超純水により洗浄をおこなった。
ブロッキング処理後、ＰＢＳ（−）に１％ＢＳＡを各ウェルに４００μｌを分注し、室温で２時間放置し、ＰＢＳ（−）に０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有する洗浄溶液を４００μｌ分注し吸引除去を３回で洗浄を行った後、チューブを乾燥させた。
（表３）
Figure 2007141912
（HeLa細胞のトータルＲＮＡからｃＤＮＡの作製）
培養したHeLa細胞より抽出したトータルＲＮＡ１μｇを含むＤＥＰＣ処理水溶液１００μｌを６５℃で５分間保温後、氷上で急冷した。反応液として、Reverse Transcriptase M-MLV（Rnase H-）、５×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、RNAse Inhibitor（Super）、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製しものを、上記ＲＮＡ溶液に加えた。この溶液を各チューブに１０μｌを分注し、４２℃で１時間インキュベートした。一部のチューブに対し、インキュベート後、TE buffer（10mMTris/HCl（pH8.5），1mMEDTA）を２００μｌ分注した後、TE bufferにて２回洗浄し、超純水にて洗浄し乾燥した。また、一部のチューブに対し、インキュベート後、ＲＮａｓｅ Ｈを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、TE buffer（10mMTris/HCl（pH8.5），1mMEDTA）を２００μｌ分注した後、TE bufferにて２回洗浄し、超純水にて洗浄し乾燥した。
反応液として、ExTaq HS、１０×ExTaq Buffer、100μM Forwardプライマー（配列５）、１００μM Reverseプライマー（配列６）、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものを、各チューブに２０μｌを分注し、ＰＣＲ反応を行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表４に示す。
反応後、各チューブのＰＣＲ反応液を電気泳動によってＰＣＲ産物を確認した。
（表４）
Figure 2007141912
電気泳動を行ったゲル中のＰＣＲ産物をエチジウムブロマイドで染色し、そのバンドの濃淡を蛍光スキャナーを用いて数値化を行った。アルデヒドチューブのRNase処理なしにおけるバンドの濃さを１００として、下記表５に示す。この数値を比較することによりＰＣＲ反応よって得られた産物の量を知ることができる。数値が高いほどより多くの産物を得ることできており、効率よくＰＣＲ反応が起きていることになる。今回はＰＭＢＮコートチューブとアルデヒドチューブ、RNase処理の有無を比較することにより、チューブのＲＮＡ存在下でのＰＣＲ反応の効率を知ることができる。
（表５）
Figure 2007141912
（実施例３）（細胞溶解物からＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ）
（ＰＭＢＮコートチューブの作製）
市販ＰＣＲ用８連チューブ（ポリプロピレン製）に対し各チューブを２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートーｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ―ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、チューブ表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、ＰＭＢＮコ−トチューブを得た。以下ＰＭＢＮチューブと称す。
（アルデヒドチューブの作製）
市販ＰＣＲ用８連チューブ（ポリプロピレン製）に対し低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒドチューブが得られた。
（プライマーの固定）
ＰＭＢＮチューブおよびアルデヒドチューブへのプライマーの固定は、実施例２に示した方法と同様の方法にて行った。
（HeLa細胞からｍＲＮＡの精製）
培養したＨｅＬａ細胞を数回洗浄後、遠心分離によりチューブにペレットを作製し、グアニジンを含む細胞溶解物を加え、ピペッティング等によりよく攪拌し、ＨｅＬａ細胞の標的サンプルとしての細胞溶解物を得た。この溶液段階的に希釈したものをＰＭＢＮコートチューブとアルデヒドチューブに５０μｌを分注し、室温で15分静置した。静置後、界面活性剤を含む緩衝液を２００μｌ分注、吸引を繰り返し2回洗浄した。
チューブ表面上のｄＴプライマーによりポリＡを有するｍＲＮＡが捕捉されており、細胞溶解物に含まれるｍＲＮＡ以外の生体由来物質を除去することができる。
（ｍＲＮＡから固相ｃＤＮＡの合成）
反応液として、Reverse Transcriptase M-MLV（Rnase H-）、５×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、RNAse Inhibitor（Super）、２０ｍＭｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製した。この溶液を各チューブに５０μｌを分注し、４２℃で１５分以上インキュベートした。インキュベート後、溶液の除去を行った。
（固相ｃＤＮＡからＰＣＲ反応）
反応液として、ExTaq HS（タカラバイオ製）、１０×ExTaq Buffer、１０μM PCR Forwardプライマー（配列５）、１０μM PCR Reverseプライマー（配列６）、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものを各チューブに５０μｌを分注し、定量的ＰＣＲを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表４に示す。
反応後、各チューブのＰＣＲ反応液を電気泳動によってＰＣＲ産物を確認した。
（固相ｃＤＮＡから定量ＰＣＲ反応）
反応液として、Premix ExTaq Hot Start Version（タカラバイオ製）、１０μＭ PCR Forwardプライマー（配列５）、１０μM PCR Reverseプライマー（配列６）、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものを各チューブに５０μｌを分注し、定量的ＰＣＲを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表４に示す。
（１ステップ試薬によるＲＴ−ＰＣＲ反応）
現在試薬メーカー各社から逆転写反応用酵素類及びＰＣＲ反応用の酵素類が混合された１ステップ型のＲＴ−ＰＣＲ反応液が市販されている。この試薬を用いることによりｍＲＮＡから固相ｃＤＮＡの合成の工程と固相ｃＤＮＡからＰＣＲ反応及び定量的ＰＣＲの工程を同一反応溶液で行うことができる。
反応液として、One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（タカラバイオ製）、１０μM PCR Forwardプライマー（配列５）、１０μM PCR Reverseプライマー（配列６）、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものを各チューブに５０μｌを分注し、定量的ＰＣＲを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表４に示す。
電気泳動より得られるＰＣＲ産物のバンドの濃さをもちいて数値化を行った。ＰＭＢＮコートチューブのＰＣＲ産物のバンドの濃さを１００として、下記表６に示す。この数値を比較することによりＰＣＲ反応によって得られた産物の量を知ることができる。数値が高いほど多くの産物を得ることができており、効率よくＰＣＲ反応がおきていることになる。また、同条件で行ったＰＣＲ反応の場合数値にバラツキが小さいほど安定的に細胞溶解物からＰＣＲ産物までの工程が実施され、再現性があることになる。
（表６）
Figure 2007141912
定量的ＰＣＲによって得られる増幅曲線を図２３に示す。増幅曲線により得られるＣｔ値を下記表７に示す。Ｃｔ値は定量的ＰＣＲ反応の出発時における鋳型ＤＮＡ量に依存した数値が得られる。つまり、Ｃｔ値が小さな値をしめすほど出発時のＤＮＡ量が多いことを示し、Ｃｔ値のバラツキが小さいほど安定的に細胞溶解物からＰＣＲ産物までの工程が実施され、再現性があることになる。
（表７）
Figure 2007141912
（実施例４）（ランダムプライマーによるｃＤＮＡ作製）
（HeLa細胞からｍＲＮＡの精製）
培養したＨｅＬａ細胞を数回洗浄後、遠心分離によりチューブにペレットを作製し、グアニジンを含む細胞溶解物を加え、ピペッティング等によりよく攪拌し、ＨｅＬａ細胞の標的サンプルとしての細胞溶解物を得た。この溶液段階的に希釈したものをＰＭＢＮコートチューブとアルデヒドチューブに５０μｌを分注し、室温で15分静置した。静置後、界面活性剤を含む緩衝液を２００μｌ分注、吸引を繰り返し2回洗浄した。
（ｍＲＮＡから液相ｃＤＮＡの合成）
反応液として、Reverse Transcriptase M-MLV（Rnase H-）、５×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、１０μｌRandom Primer、RNAse Inhibitor（Super）、２０ｍＭｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製した。この溶液を各チューブに５０μｌを分注し、４２℃で１５分以上インキュベートした。
この溶液を段階的に希釈した溶液を作製し、反応液としてSYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ製）、１０μM PCR Forwardプライマー（配列５）、１０μM PCR Reverseプライマー（配列６）、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものとともにＰＣＲチューブに分注し、定量的ＰＣＲを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表４に示す。
定量的ＰＣＲによって得られる増幅曲線を図２４に示す。増幅曲線により得られるＣｔ値を下記表８に示す。Ｃｔ値は定量的ＰＣＲ反応の出発時における鋳型ＤＮＡ量に依存した数値が得られる。つまり、Ｃｔ値が小さな値をしめすほど出発時のＤＮＡ量が多いことを示し、Ｃｔ値のバラツキが小さいほど安定的に細胞溶解物からＰＣＲ産物までの工程が実施され、再現性があることになる。
（表８）
Figure 2007141912
以下に、本発明の具体的態様を示す。
（Ａ−１）
表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基 を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定ＤＮＡプライマーを含む 基板を用いて、標的細胞の細胞溶解物を含む反応系から標的ＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法；
（Ａ−２）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板に設けられた反応空間に前記細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行う第１段階と、
伸長反応により得られたＤＮＡ鎖を検出する第２段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−３）
（Ａ−２）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−４）
（Ａ−２）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第１段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−５）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板に設けられた反応空間に前記細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
前記ＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前記反応系のＲＮＡ鎖を分解処理する第２段階と、
前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
前記合成された二重鎖ＤＮＡを検出する第４段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−６）
（Ａ−５）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第３段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−７）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板に設けられた反応空間に前記細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
前記ＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前記反応系のＲＮＡ鎖を分解処理する第２段階と、
前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
前記二重鎖ＤＮＡを熱変成して得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡを合成して、二重鎖ＤＮＡを増幅する第４段階と、
前記増幅された二重鎖ＤＮＡを検出する第５段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−８）
（Ａ−５）から（Ａ−７）のいずれかに記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−９）
（Ａ−５）か（Ａ−７）のいずれかに記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第３段階では、
前記反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げることを全処理を同一の液相系で行うことにより、前記伸長用ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖の伸長反応が行われることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１０）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホス ホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１１）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記固定ＤＮＡプライマーが、前記基板の反応空間の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１２）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１３）
（Ａ−１）または（Ａ−１２）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１４）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板が、プラスチック材料からなることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ａ−１５）
（Ａ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記基板は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−１）
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有するとともに少なくとも１つ以上の反応空間が設けられた担体を用いて、標的細胞の細胞溶解物を含む反応系から標的ＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法であって、
前記担体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させてプライマー固定化担体を作製する第1段階と、
前記担体に設けられた反応空間に前記細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第２段階と、
前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
前記合成された二重鎖ＤＮＡを検出する第４段階とを含み、第２段階から第３段階への移行の際ＲＮＡ鎖の分解処理を行わないことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−２）
（Ｂ−１）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第３段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−３）
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有するとともに少なくとも１つ以上の反応空間が設けられた担体を用いて、標的細胞の細胞溶解物を含む反応系から標的ＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法であって、
前記担体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させてプライマー固定化担体を作製する第1段階と、
前記担体に設けられた反応空間に細胞溶解物、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該細胞溶解物に含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第２段階と、
前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
前記二重鎖ＤＮＡを熱変成して得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡを合成して、二重鎖ＤＮＡを増幅する第４段階と、
前記増幅された二重鎖ＤＮＡを検出する第５段階とを含み、第２段階から第３段階への移行の際ＲＮＡ鎖の分解処理を行わないことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−４）
（Ｂ−１）から（Ｂ−３）のいずれかに記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−５）
（Ｂ−１）から（Ｂ−３）のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記第３段階では、
前記反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げることを全処理を同一の液相系で行うことにより、前記伸長用ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖の伸長反応が行われることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−６）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−７）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用のプライマーが、前記担体の反応空間の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該担体表面に固定化されることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−８）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−９）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記担体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−１０）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記反応空間がチューブ又はウェルの形状であることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−１１）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＲＮＡ検出方法；
（Ｂ−１２）
（Ｂ−１）又は（Ｂ−３）に記載のＲＮＡ検出方法において、
前記担体は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれＤＮＡ伸長用のプライマーが固定されていることを特徴とするＲＮＡ検出方法。

Claims (37)

  1. 表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を有するとともに、少なくとも一つ以上の反応空間が設けられ、当該反応空間には固定された固定核酸プライマーを含む表面を用いて、標的サンプルを含む溶液から当該標的サンプル由来の標的ＲＮＡ鎖を検出するＲＮＡ検出方法。
  2. 請求項１に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記表面は、固定ＤＮＡプライマーを含む担体の表面であることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  3. 請求項２に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体は、基板であることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  4. 請求項２または３に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体に設けられた反応空間に前記標的サンプル、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行う第１段階と、
    伸長反応により得られたＤＮＡ鎖を検出する第２段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  5. 請求項４に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  6. 請求項４に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第１段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  7. 請求項２または３に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体に設けられた反応空間に前記標的サンプル、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
    前記ＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前記反応系のＲＮＡ鎖を分解処理する第２段階と、
    前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
    前記合成された二重鎖ＤＮＡを検出する第４段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  8. 請求項７に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第３段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  9. 請求項２または３に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体に設けられた反応空間に前記標的サンプル、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
    前記ＤＮＡ鎖伸長反応を行った後に、前記反応系のＲＮＡ鎖を分解処理する第２段階と、
    前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第３段階と、
    前記二重鎖ＤＮＡを熱変性して得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡを合成して、二重鎖ＤＮＡを増幅する第４段階と、
    前記増幅された二重鎖ＤＮＡを検出する第５段階とを含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  10. 請求項７から９のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  11. 請求項７から９のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第３段階では、
    前記反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
    前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げることの全処理を同一の液相系で行うことにより、前記伸長用ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖の伸長反応が行われることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  12. 請求項２または３に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体に設けられた反応空間に前記標的サンプル、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
    前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第２段階と、
    前記合成された二重鎖ＤＮＡを検出する第３段階とを含み、第１段階から第２段階への移行の際ＲＮＡ鎖の分解処理を行わないことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  13. 請求項１２に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第２段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  14. 請求項２または３に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体に設けられた反応空間に前記標的サンプル、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、当該標的サンプルに含まれるＲＮＡ鎖を鋳型にして、前記固定ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を行って、ｃＤＮＡ鎖を形成する第１段階と、
    前記ｃＤＮＡ鎖を含む反応系に、伸長用ＤＮＡプライマー、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系およびヌクレオチドモノマーを含む試料を導入し、このｃＤＮＡ鎖を鋳型にして、二重鎖ＤＮＡを合成する第２段階と、
    前記二重鎖ＤＮＡを熱変性して得られる各一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、それぞれ二重鎖ＤＮＡを合成して、二重鎖ＤＮＡを増幅する第３段階と、
    前記増幅された二重鎖ＤＮＡを検出する第４段階とを含み、第１段階から第２段階への移行の際ＲＮＡ鎖の分解処理を行わないことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  15. 請求項１２から１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第１段階で用いるＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、逆転写酵素、またはＤＮＡリガーゼおよび逆転写酵素の組合せのいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  16. 請求項１２から１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記第３段階では、
    前記反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、
    前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げることの全処理を同一の液相系で行うことにより、前記伸長用ＤＮＡプライマーのＤＮＡ鎖の伸長反応が行われることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  17. 請求項１に記載のＲＮＡ検出方法において、
    逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法であって、
    標的サンプルを、請求項１に記載の表面を有する反応空間に移し、
    前記標的サンプル中のｍＲＮＡを固定核酸プライマーによってハイブリダイズし、
    適切な緩衝液をもちいてＲＴ−ＰＣＲを該反応空間で行い、
    目的ＰＣＲ産物を検出する各段階を含むＲＮＡ検出方法。
  18. 請求項１７に記載のＲＮＡ検出方法において、
    検出する段階において、ＰＣＲ産物を、核酸染色を用いて蛍光測定的にまたは蛍光若しくは化学ルミネセンスを発生させることによって定量するＲＮＡ検出方法。
  19. 請求項１７または１８に記載のＲＮＡ検出方法において、
    ＲＴ−ＰＣＲを行う段階が、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液、またはｒＴｔｈポリメラーゼを含む反応溶液を用いて反応空間で緩衝液の交換なしにまたは固定核酸プライマーとハイブリダイズさせたｍＲＮＡの除去なしに行なう液相ＲＴ−ＰＣＲであるＲＮＡ検出方法。
  20. 請求項１７または１８に記載のＲＮＡ検出方法において、
    ＲＴ−ＰＣＲを行う段階が、固定核酸プライマーでのハイブリダイゼーションの後、捕捉したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、反応物を除去後、ＰＣＲをＤＮＡポリメラーゼを用いて行なうＲＴ−ＰＣＲであるＲＮＡ検出方法。
  21. 請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    目的ＰＣＲ産物の検出後、反応空間に合成されたｃＤＮＡが固定化されたままの残るように洗浄し、ＲＴ−ＰＣＲを行う段階で用いたものと同じであるか、または異なる適切なプライマーを用いてＰＣＲを行い、そして目的ＰＣＲ産物を測定する段階をさらに含むＲＮＡ検出方法。
  22. 請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    洗浄を行う段階、ＰＣＲを行う段階および測定を行う段階を繰り返すＲＮＡ検出方法。
  23. 請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記ＲＴ−ＰＣＴを行う段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  24. 請求項１に記載のＲＮＡ検出方法において、
    標的サンプルを、請求項１に記載の表面を有する反応空間に移し、
    前記標的サンプル中のｍＲＮＡを固相核酸プライマーによってハイブリダイズし、
    液相にＤＮＡ鎖伸長用プライマーを含む逆転写反応液を導入し、
    逆転写された液相ｃＤＮＡを作製する各段階を含むＲＮＡ検出方法。
  25. 請求項２４に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記液相ｃＤＮＡを用いて、さらにＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させる段階をさらに含むＲＮＡ検出方法。
  26. 請求項２４または２５に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記逆転写反応液を導入する段階にて導入される試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  27. 請求項１、１７〜２６のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    反応空間がＰＣＲ用チューブまたはＰＣＲ用マイクロプレートであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  28. 請求項１、１７〜２７のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    固相核酸プライマーがオリゴｄＴである記載のＲＮＡ検出方法。
  29. 請求項１、１７〜２８に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記標的サンプルが、グアニジン又はプロテアーゼ又はフェノールを含むＲＮＡ検出方法。
  30. 請求項１、１７〜２９のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記標的サンプルが、ＲＮａｓｅ活性を阻害するまたはＲＮａｓｅを不活性化するための試薬を含み、かつ、ハイブリダイゼーションのためのｐＨ及び塩濃度を調整する緩衝液を用いて調製されるＲＮＡ検出方法。
  31. 請求項１、２、３、７、９、１２、１４、１７または２４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  32. 請求項１、２、３、７、９、１２、１４、１７または２４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記固定核酸プライマーが、前記表面の反応空間の表面に位置するカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該表面に固定化されることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  33. 請求項１、２、３、７、９、１２、１４、１７または２４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  34. 請求項１、２、３、７、９、１２、１４、１７、２４または３３のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記表面は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  35. 請求項２、３、７、９、１２または１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  36. 請求項２、３、７、９、１２または１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記反応空間がチューブ又はウェルの形状であることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
  37. 請求項２、３、７、９、１２または１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ検出方法において、
    前記担体は、複数の互いに独立した反応空間を有するアレイを構成し、各アレイではそれぞれ固定ＤＮＡプライマーが固定されていることを特徴とするＲＮＡ検出方法。
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