JP5391744B2 - アレイ用基板 - Google Patents

Description

本発明は、生化学分野にて用いられる、DNAアレイ等に用いられるアレイ用基板に関するものである。

遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常的に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。従来法である電気泳動では、電気泳動に時間を要し、発がん性物質を使用しなければならないなど、煩わしさや危険性がある。
一方、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出には高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出装置を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。

上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献１に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、ＬＡＭＰ法により遺伝子の増幅を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、乾燥した状態では蛍光は減弱し検出は不可能である。

特許文献２には、遺伝子の検出において、基板表面にプライマーDNA鎖を固定し、検体のDNAを鋳型としてプライマーを伸長させ、その際酵素を導入し、酵素反応により発色を行い可視化により検出を行う方法が開示されている。しかし、本方法は基板上でのDNAポリメラーゼによる伸長反応が必要である。この反応では伸長反応により酵素が多く入ることにより、ある程度の感度の確保ができるが、伸長反応を行わない一般のハイブリダイゼーションによる遺伝子の検出では、可視化による検出感度は低いものとなる。

メンブレンを用いて遺伝子を可視化検出する方法として、サザンブロッティング法やノーザンブロッティング法がある。これらの方法では、メンブレン内に三次元的に検出対象物質を捕捉する物質を固定化できるメリットがあるが、その一方で、メンブレン内の洗浄が不十分となりやすく、検出の際の非特異シグナル上昇につながることになり、検出の感度は低いものとなる。

特開２００４−１５４００８号公報 特開２００６−３２２７３９号公報

本発明の目的は、従来のアレイ用基板では達成できない可視化での感度を確保し、高価な蛍光試薬や高価な読み取り機を用いなくとも、簡易的な検査においては十分な感度を確保できる各種アレイ用基板を提供することにある。

発明者らは、鋭意検討の結果、基板全体又は、捕捉物質が固定化された部位が白色化することにより、可視化による検出において高い検出感度を得ることが出来ることを見出して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）溶液不溶性かつ溶液不透過性の担体表面に検出対象物質を捕捉する物質を固定化し、該検対象物質を含む検体溶液を添加し、固定化した捕捉する物質に捕捉させ、その捕捉の状態を発色による可視化により検出する際に用いるアレイ用基板であって、基板全体又は、捕捉物質が固定化された部位が白色であることを特徴とするアレイ用基板。
（２）前記基板が白色顔料を含有するガラス又はプラスチックである（１）記載のアレイ用基板。
（３）前記白色顔料の含有量が、０．２〜２５重量％である（２）記載のアレイ用基板。
（４）前記白色顔料が酸化チタンである（２）又は（３）記載のアレイ用基板。
（５）前記基板の材質が、熱可塑性樹脂である（１）〜（４）いずれか記載のアレイ用基板。
（６）前記熱可塑性樹脂が、ポリスチレンである（５）記載のアレイ用基板。
（７）発色による可視化検出が、還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により発色する基質を加え、該基質を発色させるものである（１）〜（６）いずれか記載のアレイ用基板。
（８）前記還元酵素が、アルカリホスファターゼである（７）記載のアレイ用基板。
（９）前記基質が、ブロモクロロインドリルりん酸（ＢＣＩＰ）である（７）記載のアレイ用基板。
（１０）前記基板の表面に含水性ポリマー層を有し、該ポリマー層に捕捉物質が固定化されるものである（１）〜（９）いずれか記載のアレイ用基板。
（１１）前記含水性ポリマーが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質、またはポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質、のいずれかである（１０）記載のアレイ用基板。
（１２）前記含水性ポリマー層の厚さが、１〜１００nｍである（１０）または（１１）記載のアレイ用基板。
（１３）（１）〜（１２）いずれか記載のアレイ用基板の検体捕獲部に、検出対象物質を捕捉する物質として生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したアレイ。

本発明によるアレイ用基板により、食品検査をはじめとする検査用途に適用できる、可視化で感度良く検出が可能なデバイスの供給が可能となる。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に使用する基板は、溶液不溶性かつ溶液不透過性の担体表面を有する必要がある。基板の材質としてはガラス又はプラスチックであることが好ましく、量産性を考慮するとプラスチックがより好適である。プラスチックの材質としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリル樹脂などの汎用性樹脂がコスト面から好適である。

基板の全体の形状としては、特に制限はないが、従来からマイクロアレイ基板と使用されているスライドガラス形状が、反応操作等の際、従来のスライドガラス用の器具類の使用がそのまま可能となることから好適である。具体的には最大厚みは１ｍｍ程度、縦２５ｍｍ程度、横７５ｍｍ程度の寸法である。

基板は、基板全体または、基板表面の捕捉物質固定化部位が白色化されている。基板の白色化の方法としては、白色顔料を含有させることが好ましい。白色顔料としては、一般工業用で汎用性のある酸化チタンを用いるのが好ましい。白色顔料の含有量は、０．２〜２５重量％であることが好ましく、更に好ましくは０．３〜２０重量％である。下限値未満では十分な白色化を得られない恐れがある。上限値を超えると樹脂との混合性が低下する恐れがある。

捕捉物質固定化部位は親水性を有することが、検体の水溶液を供給する上で好ましく、発色による可視化反応においては、親水性ゲルの性質を有する含水性ポリマーをコートすることが有効である。親水性ゲルの性質を有する含水性ポリマーとは、該ポリマーをキャスティングなどにより製膜した場合、その膜が含水性や膨潤性を有し、さらに物質透過性を有するポリマーのことをいう。この親水性ゲルの性質を有する含水性ポリマーにより、発色した基質が、スポットの周りのゲル内にとどまり、発色したスポットがより鮮明に可視化認識を可能にすることができる。

さらに親水性ゲルの性質を有する含水性ポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基の内少なくとも１つと反応結合性を有することが好ましい。これにより、検体捕獲物質を共有結合させることが可能となり、DNA、RNAなどの核酸鎖、タンパク質、ペプチド、抗体や酵素、糖鎖などの生体由来物や、種々の合成薬物などの検体捕獲物を確実にポリマー上に固定化することが可能となる。

このようなポリマーしては、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質、又はポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質であることが好ましい。リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位としては、MPC（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）が好ましく、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基としては活性エステル基が好ましい。

また、これらのポリマーは、ＤＮＡやタンパク質などの生体由来物の非特異的な吸着が少なく、検体捕獲部のコートに用いるポリマーとして好適である。検体捕獲部平面の親水性ゲルの性質を有するポリマーの厚みは、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。下限値未満では、ポリマーをコートする効果が認められなくり、上限値を超えると、コート厚みの制御が難しく、コート厚みのバラつきが大きくなり、発色による可視化シグナルのばらつきが大きくなる恐れがある。また、ゲル内の洗浄が不十分となり、検出の際の非特異シグナルの上昇につながることになり、感度を下げる恐れがある。

アレイ用基板の検体捕獲部表面に、検出対象物質を捕捉する物質として生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化してアレイを作製する。検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定することができる。

検体捕獲部における、検出対象物の捕獲の状況は、検出対象物に酵素標識を施しておき、この酵素の発色基質を含有する溶液を添加し、酵素の反応により発色基質を発色させる。
酵素としては、生物化学の分野で検出に広く使用されているアルカリホスファターゼなどを用いることができる。発色基質としては、ウェスタンブロット等において使用されるブロモクロロインドリルりん酸（BCIP）を用いることが出来る。

《実施例１》
ポリスチレン樹脂に白色顔料である酸化チタンを０．３重量％配合したものを射出成形することにより、縦７５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ１ｍｍのスライドガラス形状の白色基板成形品を得た。白色基板の表面に縦３０ｍｍ×横１５ｍｍの大きさで検体捕獲部を設定し、この設定した検体捕獲部に、次のように表面にポリマーコート処理を施した。まず、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン‐ブチルメタクリレート‐ｐ‐ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（poly(MPC-co-BMA-coNPMA)(PMBN)溶液を調製し、本溶液を検体捕獲部にコートを行い、乾燥させた。乾燥状態でのポリマーコートの厚みは、エリプソメーターにより測定を行ったところ、５〜２０ｎｍであった。以上のように作製したアレイ用基板を、発色による可視化検出評価に供した。

《実施例２》
酸化チタンの配合量を１．５重量％にした樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして、アレイ用基板を作製した。

《実施例３》
酸化チタンの配合量を５重量％にした樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして、アレイ用基板を作製した。

《実施例４》
酸化チタンの配合量を２０重量％にした樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして、アレイ用基板を作製した。

《比較例１》
酸化チタンを配合しない樹脂を用いた以外は実施例１と同様にして、アレイ用基板を作製した。

（発色による可視化検出評価用マイクロアレイの作製）
上記で作製したアレイ用基板の検体捕獲部にＤＮＡプローブを固定した。先ず、５’末端をアミノ基で修飾した、配列ＴＧＴＡＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴ（配列番号１）のＤＮＡプローブ（２５塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのＤＮＡプローブ溶液を調製した。この溶液をマイクロアレイ作製装置（日立ソフトウェアエンジニアリング製ＭＡＲＫＳ−１）を用いて、６００μｍ径のピンで、それぞれの基板の検体捕獲部にスポットし固定化した。検体捕獲部に３０スポット固定化をおこない、ＤＮＡプローブの固定化の後、ブロッキング処理を行い、アレイを作製し、以下評価実験に供した。

（発色による可視化検出評価）
上記ＤＮＡプローブに相補配列を有し、５‘末端にビオチンが導入された、配列ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡ（配列番号２）の３５塩基のＤＮＡ断片溶液をDNA濃度０．２μMに調製した。
上記にて作製した各アレイのＤＮＡプローブ固定化した検体捕獲部にＤＮＡ断片溶液を滴下し、ポリスチレン製のカバー（寸法：縦５０ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．７ｍｍ）を被せ、ＤＮＡプローブスポット部全体に溶液をいきわたらせ、ハイブリダイゼーションを行った。

上記にてハイブリダイゼーションを行った後、アルカリホスファターゼ標識したアビジン溶液をＤＮＡプローブスポット部に供給し、上記と同様のポリスチレン製のカバーを被せてアビジン溶液をいきわたらせ１０分間放置した。次いでカバーを外し、洗浄用緩衝液で洗浄したのち、乾燥させ、次にＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を供給し、上記と同様のポリスチレン製カバーで覆い２０分間放置し、発色反応を行った。各ＤＮＡプローブスポットにおける発色度合いを画像処理により数値化し、シグナル強度の比較をおこなった。

結果を、表１に示す。（Ｓ）は、３０スポットの数値化したシグナル強度の平均値であり、（Ｎ）は、検体捕獲部のＤＮＡプローブをスポットしていない部分３０点での強度の平均値であり、Ｓ／Ｎの比較によりシグナル感度の比較ができる。実施例１、２、３、４では、比較例１に比較し、格段に感度が高いことが確認された。

本発明のアレイ用基板を用いて作製されたアレイは、発色での可視化による簡易的な検出を可能とし、可視化検出において高い感度を実現することが可能であり、高価な測定器を用いずに低コストで各種検査の実現を図ることができる。

Claims (12)

1. 溶液不溶性かつ溶液不透過性の担体表面に検出対象物質を捕捉する物質を固定化し、
   該検出対象物質を含む検体溶液を添加し、固定化した捕捉する物質に捕捉させ、
   その捕捉の状態を発色による可視化により検出する際に用いるアレイ用基板であって、
   基板全体又は、捕捉物質が固定化された部位が白色であり、
   前記基板が白色顔料を含有するガラス又はプラスチックであることを特徴とするアレイ用基板。
2. 前記白色顔料の含有量が、０．２〜２５重量％である請求項１記載のアレイ用基板。
3. 前記白色顔料が酸化チタンである請求項１又は２記載のアレイ用基板。
4. 前記基板の材質が、熱可塑性樹脂である請求項１〜３いずれか記載のアレイ用基板。
5. 前記熱可塑性樹脂が、ポリスチレンである請求項４記載のアレイ用基板。
6. 発色による可視化検出が、還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により発色する基質を加え、該基質を発色させるものである請求項１〜５いずれか記載のアレイ用基板。
7. 前記還元酵素が、アルカリホスファターゼである請求項６記載のアレイ用基板。
8. 前記基質が、ブロモクロロインドリルりん酸（ＢＣＩＰ）である請求項６記載のアレイ用基板。
9. 前記基板の表面に含水性ポリマー層を有し、該ポリマー層に捕捉物質が固定化されるものである請求項１〜８いずれか記載のアレイ用基板。
10. 前記含水性ポリマーが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質、またはポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質、のいずれかである請求項９記載のアレイ用基板。
11. 前記含水性ポリマー層の厚さが、１〜１００ｎｍである請求項９または１０記載のアレイ用基板。
12. 請求項１〜１１いずれか記載のアレイ用基板の検体捕獲部に、検出対象物質を捕捉する物質として生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したアレイ。