JP2002544508A - 未修飾生体高分子のフッ化アシル活性化基質への固定化 - Google Patents
未修飾生体高分子のフッ化アシル活性化基質への固定化Info
- Publication number
- JP2002544508A JP2002544508A JP2000618493A JP2000618493A JP2002544508A JP 2002544508 A JP2002544508 A JP 2002544508A JP 2000618493 A JP2000618493 A JP 2000618493A JP 2000618493 A JP2000618493 A JP 2000618493A JP 2002544508 A JP2002544508 A JP 2002544508A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solid support
- biopolymer
- unmodified
- reagent
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 title claims abstract description 172
- 150000001265 acyl fluorides Chemical class 0.000 title claims abstract description 54
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 164
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 71
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 41
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 22
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 22
- 238000007639 printing Methods 0.000 claims description 21
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 13
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 13
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical group [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 7
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 5
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002508 contact lithography Methods 0.000 claims description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 2
- POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M sodium;carbonic acid;hydrogen carbonate Chemical compound [Na+].OC(O)=O.OC([O-])=O POECFFCNUXZPJT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 claims 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims 3
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 claims 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 claims 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 11
- 238000003491 array Methods 0.000 description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CSJLBAMHHLJAAS-UHFFFAOYSA-N diethylaminosulfur trifluoride Chemical compound CCN(CC)S(F)(F)F CSJLBAMHHLJAAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 8
- 229920005648 ethylene methacrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 8
- DIOSHTLNZVXJOF-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-oxobutanoylamino)benzenesulfonic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)NC1=CC=C(NC(=O)CC(C)=O)C(S(O)(=O)=O)=C1 DIOSHTLNZVXJOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 7
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 7
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 229920006242 ethylene acrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007641 inkjet printing Methods 0.000 description 2
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- ZQXCQTAELHSNAT-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-3-nitro-5-(trifluoromethyl)benzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(Cl)=CC(C(F)(F)F)=C1 ZQXCQTAELHSNAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197637 Actin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710197641 Actin-5 Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100033040 Carbonic anhydrase 12 Human genes 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101000867855 Homo sapiens Carbonic anhydrase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- VMKJWLXVLHBJNK-UHFFFAOYSA-N cyanuric fluoride Chemical compound FC1=NC(F)=NC(F)=N1 VMKJWLXVLHBJNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920003214 poly(methacrylonitrile) Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
未修飾生体高分子、特に未修飾ポリヌクレオチドを固形支持体に直接結合する方法が提供される。この方法には、（ａ）未修飾生体高分子を用意すること、（ｂ）フッ化アシル官能基側鎖を含む表面が少なくとも１つある固形支持体を用意すること、（ｃ）前記未修飾生体高分子と前記固形支持体とが結合できる条件下で、前記生体高分子と前記固形支持体を接触させることが含まれる。前記未修飾生体高分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体であってもよい。前記未修飾ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであってもよい。ＤＮＡは１本鎖でも２本鎖でもよい。固形支持体と、該固形支持体のフッ化アシル官能基側鎖との反応で前記固形支持体に結合した未修飾生体高分子を含む装置も提供される。本発明の方法と装置はハイブリダイゼーションアッセイとイムノアッセイに利用される。
Description
【０００１】
本発明は、一般的には、生体高分子が固定化された固形支持体に関し、具体的
には、未修飾生体高分子が固定化された固形支持体と、未修飾生体高分子を固形
支持体に固定化する方法とに関する。
には、未修飾生体高分子が固定化された固形支持体と、未修飾生体高分子を固形
支持体に固定化する方法とに関する。
【０００２】
生体高分子の合成と生体高分子の分析には、生体高分子を固形支持体に結合す
る必要がしばしばある。例えば、有機および無機材料が、ペプチド、オリゴヌク
レオチドおよび低分子有機分子の固相合成に利用される。この合成は、アミノ酸
誘導体または核酸誘導体のような活性化モノマーを、固形支持体に一方の端が結
合した成長中のオリゴマー鎖に１つずつ付加していくことを伴う。合成が完了す
ると、新たに合成された生体高分子は前記固形支持体から切断されて、生化学的
な研究または診断への応用に利用され、あるいは、前記固形支持体から生体高分
子を切断せずに利用される。
る必要がしばしばある。例えば、有機および無機材料が、ペプチド、オリゴヌク
レオチドおよび低分子有機分子の固相合成に利用される。この合成は、アミノ酸
誘導体または核酸誘導体のような活性化モノマーを、固形支持体に一方の端が結
合した成長中のオリゴマー鎖に１つずつ付加していくことを伴う。合成が完了す
ると、新たに合成された生体高分子は前記固形支持体から切断されて、生化学的
な研究または診断への応用に利用され、あるいは、前記固形支持体から生体高分
子を切断せずに利用される。
【０００３】 生体高分子の分析のためには、生体高分子はいくつかの方法で固形支持体に結
合される。ブロッティング技術では、天然の生体高分子はまず膜の上に捕捉され
、その後、熱、放射線または化学的な技術により前記膜上に固定化される。こう
して固定化された生体高分子は、サザンブロット法と逆ハイブリダイゼーション
解析技術のような分析に利用することができる。
合される。ブロッティング技術では、天然の生体高分子はまず膜の上に捕捉され
、その後、熱、放射線または化学的な技術により前記膜上に固定化される。こう
して固定化された生体高分子は、サザンブロット法と逆ハイブリダイゼーション
解析技術のような分析に利用することができる。
【０００４】 さらに、合成または天然のオリゴヌクレオチドが、活性化されたオリゴヌクレ
オチドを固形支持体に共有結合で結合することにより固定化されている。核酸を
固形支持体（基質）に共有結合で結合するための現在の方法は、ＤＮＡ（または
ＲＮＡ）の修飾を伴う。例えば、オリゴヌクレオチドは通常５’−アミノ末端に
変化した誘導体となり、前記ＤＮＡを活性化した表面に共有結合するうえでより
反応しやすくなる。他の結合方法は、末端のリン酸基またはスルフィドラル基と
表面のカルボジイミドその他の活性化合物との反応を用いている（Ｌｕｎｄら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６巻、１０８６１−８０頁、１９８８年
およびＢｉｓｃｈｏｆｆら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４巻、３３６
−３４４頁、１９８７年を参照せよ）。
オチドを固形支持体に共有結合で結合することにより固定化されている。核酸を
固形支持体（基質）に共有結合で結合するための現在の方法は、ＤＮＡ（または
ＲＮＡ）の修飾を伴う。例えば、オリゴヌクレオチドは通常５’−アミノ末端に
変化した誘導体となり、前記ＤＮＡを活性化した表面に共有結合するうえでより
反応しやすくなる。他の結合方法は、末端のリン酸基またはスルフィドラル基と
表面のカルボジイミドその他の活性化合物との反応を用いている（Ｌｕｎｄら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６巻、１０８６１−８０頁、１９８８年
およびＢｉｓｃｈｏｆｆら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４巻、３３６
−３４４頁、１９８７年を参照せよ）。
【０００５】 天然のポリヌクレオチド中に存在する反応基は弱く、結合の効率が悪いと一般
に理解されている。さらに、天然オリゴヌクレオチドが反応性が高い表面の原子
団に曝されると、過剰な架橋が起こりうる。この架橋は、結合した核酸が完全に
ハイブリダイゼーションに参加することを阻む。これらの条件は２本鎖ＤＮＡの
短い断片やオリゴヌクレオチドの場合には最も著しい。そこで、オリゴヌクレオ
チドは、効率的な結合のために、例えば５’−アミノ末端に変化した誘導体とな
るといった修飾を加えられなければならないことが多い。前記５’−アミノリン
カーにより、アミノ基を含むＤＮＡは、シリル化されたスライドにチップ表面の
アルデヒド基とシッフ基反応により選択的に結合することが可能になる。天然の
未修飾ＤＮＡに比べてアミノ基が修飾されたＤＮＡの選択性はｃＤＮＡでは約１
０：１で、１本鎖１５量体については約１０，０００：１である。これらの中間
の長さのＤＮＡ分子はこれらの中間の選択比を示す。さらに、前記５’末端での
アミノ基を介するＤＮＡとチップとの結合により、ハイブリダイゼーション反応
の間に結合した分子に立体的に接近することが許容される。したがって、後から
修飾することは、例えばオリゴヌクレオチドプローブをアレイ作成のために結合
させるためには必須だと考えられてきた。かかる事後修飾の過程には相当な費用
と時間のかかる追加のステップが必要である。
に理解されている。さらに、天然オリゴヌクレオチドが反応性が高い表面の原子
団に曝されると、過剰な架橋が起こりうる。この架橋は、結合した核酸が完全に
ハイブリダイゼーションに参加することを阻む。これらの条件は２本鎖ＤＮＡの
短い断片やオリゴヌクレオチドの場合には最も著しい。そこで、オリゴヌクレオ
チドは、効率的な結合のために、例えば５’−アミノ末端に変化した誘導体とな
るといった修飾を加えられなければならないことが多い。前記５’−アミノリン
カーにより、アミノ基を含むＤＮＡは、シリル化されたスライドにチップ表面の
アルデヒド基とシッフ基反応により選択的に結合することが可能になる。天然の
未修飾ＤＮＡに比べてアミノ基が修飾されたＤＮＡの選択性はｃＤＮＡでは約１
０：１で、１本鎖１５量体については約１０，０００：１である。これらの中間
の長さのＤＮＡ分子はこれらの中間の選択比を示す。さらに、前記５’末端での
アミノ基を介するＤＮＡとチップとの結合により、ハイブリダイゼーション反応
の間に結合した分子に立体的に接近することが許容される。したがって、後から
修飾することは、例えばオリゴヌクレオチドプローブをアレイ作成のために結合
させるためには必須だと考えられてきた。かかる事後修飾の過程には相当な費用
と時間のかかる追加のステップが必要である。
【０００６】 そこで、生体高分子、特に未修飾生体高分子を固形支持体に結合するためのよ
り効率的な方法を開発することが望ましい。ポリヌクレオチドのような未修飾生
体高分子を固形支持体に直接結合する方法を開発することが特に望ましい。
り効率的な方法を開発することが望ましい。ポリヌクレオチドのような未修飾生
体高分子を固形支持体に直接結合する方法を開発することが特に望ましい。
【０００７】 発明の概要 本発明は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡの短い断片と長い断片の両方とも、スペ
ーサーアームなしで、かつ、これらのポリヌクレオチドを修飾せずに、直接フッ
化アシルで活性化された支持体に効率よく結合することができるという発見に基
づいている。本発明はまた、プロテインＡ、抗体、ストレプトアビジン等のよう
な他の生体高分子もこれらの生体高分子を修飾することなく固形支持体に結合す
ることができるという発見にも基づいている。
ーサーアームなしで、かつ、これらのポリヌクレオチドを修飾せずに、直接フッ
化アシルで活性化された支持体に効率よく結合することができるという発見に基
づいている。本発明はまた、プロテインＡ、抗体、ストレプトアビジン等のよう
な他の生体高分子もこれらの生体高分子を修飾することなく固形支持体に結合す
ることができるという発見にも基づいている。
【０００８】 したがって、本発明の１の局面は、未修飾の生体高分子を固形支持体に結合す
る方法を提供することである。この方法は、（ａ）未修飾の生体高分子を用意す
ること、（ｂ）フッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面がある固形
支持体を用意すること、（ｃ）前記未修飾生体高分子と前記固形支持体との結合
が起こるのに十分な条件下で、前記生体高分子と前記固形支持体を接触させるこ
とを含む。
る方法を提供することである。この方法は、（ａ）未修飾の生体高分子を用意す
ること、（ｂ）フッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面がある固形
支持体を用意すること、（ｃ）前記未修飾生体高分子と前記固形支持体との結合
が起こるのに十分な条件下で、前記生体高分子と前記固形支持体を接触させるこ
とを含む。
【０００９】 本発明の実施態様によると、前記生体高分子は、核酸、タンパク質、糖質、脂
質およびこれらの類似体でもかまわない。本発明の１の実施態様では、前記生体
高分子はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、合成されたオリ
ゴヌクレオチド、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、
ＰＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。また、本発明の実施態様による
と、前記固形支持体は、高分子材料、カラス、セラミック、天然繊維、シリコン
、金属およびこれらの複合材料であってもよい。
質およびこれらの類似体でもかまわない。本発明の１の実施態様では、前記生体
高分子はオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは、合成されたオリ
ゴヌクレオチド、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、
ＰＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。また、本発明の実施態様による
と、前記固形支持体は、高分子材料、カラス、セラミック、天然繊維、シリコン
、金属およびこれらの複合材料であってもよい。
【００１０】 本発明の別の局面は、サンプル中の生体高分子のターゲットを分析する方法を
提供することである。この方法は、（ａ）フッ化アシル基側鎖を少なくとも１つ
の表面に有する材料で作製された固形支持体を用意すること、（ｂ）前記生体高
分子のターゲットと複合体を形成することができ、第２の生体高分子を含む試薬
を用意すること、（ｃ）未修飾試薬または未修飾生体高分子のいずれかが前記固
形支持体と結合できる条件下で、前記固形支持体を前記未修飾試薬または前記未
修飾生体高分子のターゲットと接触させること、（ｄ）前記試薬と前記生体高分
子のターゲットを含む複合体が形成できる条件下で、前記未修飾試薬と結合した
固形支持体を前記生体高分子のターゲットと接触させるか、あるいは前記未修飾
生体高分子のターゲットと結合した固形支持体を前記試薬と接触させること、（
ｅ）前記サンプル中に含まれる前記生体高分子のターゲットの有無または量の測
定値として、前記複合体の存在を検出し測定することを含む。
提供することである。この方法は、（ａ）フッ化アシル基側鎖を少なくとも１つ
の表面に有する材料で作製された固形支持体を用意すること、（ｂ）前記生体高
分子のターゲットと複合体を形成することができ、第２の生体高分子を含む試薬
を用意すること、（ｃ）未修飾試薬または未修飾生体高分子のいずれかが前記固
形支持体と結合できる条件下で、前記固形支持体を前記未修飾試薬または前記未
修飾生体高分子のターゲットと接触させること、（ｄ）前記試薬と前記生体高分
子のターゲットを含む複合体が形成できる条件下で、前記未修飾試薬と結合した
固形支持体を前記生体高分子のターゲットと接触させるか、あるいは前記未修飾
生体高分子のターゲットと結合した固形支持体を前記試薬と接触させること、（
ｅ）前記サンプル中に含まれる前記生体高分子のターゲットの有無または量の測
定値として、前記複合体の存在を検出し測定することを含む。
【００１１】 本発明のさらなる局面は、複数の未修飾生体高分子と固形支持体を含まれる装
置を提供することである。前記固形支持体はフッ化アシル官能基側鎖を含む少な
くとも１つの表面を有し、前記生体高分子は前記フッ化アシル官能基側鎖との反
応によって前記固形支持体を結合している。
置を提供することである。前記固形支持体はフッ化アシル官能基側鎖を含む少な
くとも１つの表面を有し、前記生体高分子は前記フッ化アシル官能基側鎖との反
応によって前記固形支持体を結合している。
【００１２】 本発明は、ジェノセンサーアレイ（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ ａｒｒａｙｓ）の
ようなポリヌクレオチドアレイと、差次的遺伝子発現マイクロアレイのようなそ
の他のアレイを基本とするシステムの製作に利用するのに好適である。前記ポリ
ヌクレオチドアレイは、生物活性を評価し同定するために使用される。本発明は
、ポリヌクレオチドの配列決定を目的とするポリヌクレオチドアレイの製作にも
利用できる。さらに、本発明はハイブリダイゼーションアッセイおよびイムノア
ッセイに利用できる。
ようなポリヌクレオチドアレイと、差次的遺伝子発現マイクロアレイのようなそ
の他のアレイを基本とするシステムの製作に利用するのに好適である。前記ポリ
ヌクレオチドアレイは、生物活性を評価し同定するために使用される。本発明は
、ポリヌクレオチドの配列決定を目的とするポリヌクレオチドアレイの製作にも
利用できる。さらに、本発明はハイブリダイゼーションアッセイおよびイムノア
ッセイに利用できる。
【００１３】 本発明は多くの利点を提供する。本発明により、未修飾の生体高分子は固形支
持体に直接結合することが可能になる。よって、本発明は、生体高分子のアレイ
を作るための過程を簡単にし、さらに多目的に利用できるようにする。
持体に直接結合することが可能になる。よって、本発明は、生体高分子のアレイ
を作るための過程を簡単にし、さらに多目的に利用できるようにする。
【００１４】 本発明には、技術的な利点とともに経済的な利点がある。第１に、アミノ修飾
されたＤＮＡのような、修飾された生体高分子をコストをかけて生産することを
回避できる。オリゴヌクレオチドを事後修飾する作業は時間がかかり、コストも
２倍と相当増大する。第２に、事後修飾の過程がもはや不要になるため、アレイ
をつくる仕事が非常に簡単になる。
されたＤＮＡのような、修飾された生体高分子をコストをかけて生産することを
回避できる。オリゴヌクレオチドを事後修飾する作業は時間がかかり、コストも
２倍と相当増大する。第２に、事後修飾の過程がもはや不要になるため、アレイ
をつくる仕事が非常に簡単になる。
【００１５】 発明の詳細な説明 本発明の１の局面は、未修飾生体高分子を固形支持体に結合する方法を提供す
ることである。この方法は、（ａ）未修飾生体高分子を用意すること、（ｂ）フ
ッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を有する固形支持体を用意す
ること、（ｃ）前記未修飾生体高分子が前記固形支持体と結合できる条件下で、
前記生体高分子を前記固形支持体と接触させることを含む。
ることである。この方法は、（ａ）未修飾生体高分子を用意すること、（ｂ）フ
ッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を有する固形支持体を用意す
ること、（ｃ）前記未修飾生体高分子が前記固形支持体と結合できる条件下で、
前記生体高分子を前記固形支持体と接触させることを含む。
【００１６】 ここで用いられる「生体高分子」という用語は、核酸、ポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体を指す。ここで用い
られる「ポリヌクレオチド」という用語は、分離した断片として、またはより大
きな構築体の構成部分となった、デオキシリヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドのポリマーを指す。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のようなＤＮＡの類似体または合成されたオリゴヌ
クレオチドであってもよい。前記ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖か、あるいはＰ
ＣＲ技術により増幅されたＤＮＡであってもよい。前記ＲＮＡはｍＲＮＡであっ
てもよい。前記オリゴヌクレオチドの長さは３ｂｐないし１０ｋｂでよい。本発
明の１の実施態様に従うと、ポリヌクレオチドの長さは約５０ｂｐないし１０ｋ
ｂの範囲内であり、１００ｂｐないし１．５ｋｂであることが好ましい。本発明
の別の実施態様に従うと、合成されたオリゴヌクレオチドの長さは、約３ないし
１００個のヌクレオチドの範囲内である。本発明のさらなる実施態様に従うと、
前記オリゴヌクレオチドの長さは約１５ないし２０個のヌクレオチドの範囲内で
ある。
リペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体を指す。ここで用い
られる「ポリヌクレオチド」という用語は、分離した断片として、またはより大
きな構築体の構成部分となった、デオキシリヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドのポリマーを指す。ここで用いられる「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のようなＤＮＡの類似体または合成されたオリゴヌ
クレオチドであってもよい。前記ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖か、あるいはＰ
ＣＲ技術により増幅されたＤＮＡであってもよい。前記ＲＮＡはｍＲＮＡであっ
てもよい。前記オリゴヌクレオチドの長さは３ｂｐないし１０ｋｂでよい。本発
明の１の実施態様に従うと、ポリヌクレオチドの長さは約５０ｂｐないし１０ｋ
ｂの範囲内であり、１００ｂｐないし１．５ｋｂであることが好ましい。本発明
の別の実施態様に従うと、合成されたオリゴヌクレオチドの長さは、約３ないし
１００個のヌクレオチドの範囲内である。本発明のさらなる実施態様に従うと、
前記オリゴヌクレオチドの長さは約１５ないし２０個のヌクレオチドの範囲内で
ある。
【００１７】 ここで用いられる「ポリペプチド」は、あるアミノ酸のα−カルボキシル基が
別のアミノ酸のα−アミノ基とペプチド結合により結合している、アミノ酸のポ
リマーを指す。タンパク質はジスルフィド結合で結びつけられた１つまたは複数
のポリペプチドを含むこともある。前記タンパク質の例には、抗体、抗原、リガ
ンド、レセプター等が含まれるが、これらに限られない。
別のアミノ酸のα−アミノ基とペプチド結合により結合している、アミノ酸のポ
リマーを指す。タンパク質はジスルフィド結合で結びつけられた１つまたは複数
のポリペプチドを含むこともある。前記タンパク質の例には、抗体、抗原、リガ
ンド、レセプター等が含まれるが、これらに限られない。
【００１８】 本発明の生体高分子は該生体高分子を修飾することなく固形支持体に結合でき
ることが、本発明の発見である。例えば、本発明の１の実施態様に従うと、オリ
ゴヌクレオチド、プロテインＡ、抗体またはストレプトアビジンのような、しか
しこれらに限らない、生体高分子は、該生体高分子を何ら修飾することなく固形
支持体に結合することができる。
ることが、本発明の発見である。例えば、本発明の１の実施態様に従うと、オリ
ゴヌクレオチド、プロテインＡ、抗体またはストレプトアビジンのような、しか
しこれらに限らない、生体高分子は、該生体高分子を何ら修飾することなく固形
支持体に結合することができる。
【００１９】 本発明の目的のためには、本発明の固形支持体は該固形支持体の少なくとも１
つの表面にフッ化アシル官能基を形成するために誘導体とすることができるいか
なる材料であってもよい。固形支持体の例には、高分子材料、ガラス、セラミッ
ク、天然繊維、シリコン、金属およびこれらの複合材料が含まれるが、これらに
限られない。
つの表面にフッ化アシル官能基を形成するために誘導体とすることができるいか
なる材料であってもよい。固形支持体の例には、高分子材料、ガラス、セラミッ
ク、天然繊維、シリコン、金属およびこれらの複合材料が含まれるが、これらに
限られない。
【００２０】 本発明の１の実施態様に従うと、本発明の固形支持体は、フッ化アシル官能基
側鎖を有する少なくとも１つの表面がある高分子材料で作製されてもよい。前記
固形支持体の詳しい説明および前記固形支持体の製造方法は、「生体高分子を固
定化するためのポリマー試薬」という名称の出願中の米国特許出願第０８／７９
７，２２２号明細書に記載されており、関連する内容は引用によりここにその全
体が取り込まれている。
側鎖を有する少なくとも１つの表面がある高分子材料で作製されてもよい。前記
固形支持体の詳しい説明および前記固形支持体の製造方法は、「生体高分子を固
定化するためのポリマー試薬」という名称の出願中の米国特許出願第０８／７９
７，２２２号明細書に記載されており、関連する内容は引用によりここにその全
体が取り込まれている。
【００２１】 簡潔には、固形支持体の作製に適するポリマー材料は、前記固形支持体の少な
くとも１つの表面にフッ化アシル官能基側鎖を形成することができるように誘導
体とすることができるいかなる材料でもかまわない。例えば、カルボキシル官能
基側鎖を有するポリマー材料またはカルボキシル基を支持するように改変するこ
とができるポリマー材料は、適当な試薬を用いてフッ化アシル官能基を形成する
ように反応させることができる。本発明の１の実施態様では、固形支持体はエチ
レンアクリル酸コポリマー、エチレンメタクリル酸コポリマーまたは誘導ポリプ
ロピレンで製造される。本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、カルボキ
シル基を支持するように誘導体とすることができるポリマー材料で、前記カルボ
キシル基が表面のフッ化アシル官能基を提供するように改変することができる材
料には、広範囲の材料が含まれることを認識するはずである。例えば、フッ化ア
シルに変換するのに適したカルボキシル基を提供するために、無水コハク酸のよ
うな環状無水物と反応させられたアミノ化ポリプロピレンは特に有用である。
くとも１つの表面にフッ化アシル官能基側鎖を形成することができるように誘導
体とすることができるいかなる材料でもかまわない。例えば、カルボキシル官能
基側鎖を有するポリマー材料またはカルボキシル基を支持するように改変するこ
とができるポリマー材料は、適当な試薬を用いてフッ化アシル官能基を形成する
ように反応させることができる。本発明の１の実施態様では、固形支持体はエチ
レンアクリル酸コポリマー、エチレンメタクリル酸コポリマーまたは誘導ポリプ
ロピレンで製造される。本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、カルボキ
シル基を支持するように誘導体とすることができるポリマー材料で、前記カルボ
キシル基が表面のフッ化アシル官能基を提供するように改変することができる材
料には、広範囲の材料が含まれることを認識するはずである。例えば、フッ化ア
シルに変換するのに適したカルボキシル基を提供するために、無水コハク酸のよ
うな環状無水物と反応させられたアミノ化ポリプロピレンは特に有用である。
【００２２】
【化１】
【００２３】 他の適当なポリマー材料には、カルボキシル基側鎖を露出するために鹸化され
たメチルメタクリレートまたはメチルアクリレートが含まれる。
たメチルメタクリレートまたはメチルアクリレートが含まれる。
【００２４】 さらに他のポリマー材料で、反応性のあるカルボキシル基を提供するために容
易に分子の一部を変更できるものは、水酸化ポリアクリロニトリルまたは水酸化
ポリメタクリロニトリルである。
易に分子の一部を変更できるものは、水酸化ポリアクリロニトリルまたは水酸化
ポリメタクリロニトリルである。
【００２５】
【化２】
【００２６】 本発明に従うと、前記固形支持体の少なくとも１つの表面にフッ化アシル官能
基を形成するための適当な試薬には、カルボキシル反応性のフッ素化試薬が広く
含まれる。最も好ましい試薬は、以下の反応でカルボキシル基側鎖と反応する、
ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｐｈｕ
ｒ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＤＡＳＴ））である。
基を形成するための適当な試薬には、カルボキシル反応性のフッ素化試薬が広く
含まれる。最も好ましい試薬は、以下の反応でカルボキシル基側鎖と反応する、
ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｐｈｕ
ｒ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＤＡＳＴ））である。
【００２７】
【化３】
【００２８】 他の試薬にはフッ化シアヌールが含まれる。
【００２９】
【化４】
【００３０】 ヘキサフルオロリン酸テトラメチルフルオロホルムアミジニウムも含まれる。
【００３１】
【化５】
【００３２】 本発明の最も好ましい実施態様では、厚さ約０．５ｍｍのシートに成形された
エチレンアクリル酸コポリマーまたはエチレンメタクリル酸コポリマーの少なく
とも１つの表面を、５％のＤＡＳＴ溶液に数時間曝して修飾する。ジクロロメタ
ンとアセトニトリルの洗浄を用いた反応停止後、このフィルムは、以下に記載の
とおり、生体高分子を固定化または合成するためにいつでも使用できる。有利な
ことには、フッ化アシルで活性化されたポリマー材料は常温で驚異的に安定であ
り、涼しく乾いた環境で保存すると、貯蔵寿命が無限であることが発見された。
エチレンアクリル酸コポリマーまたはエチレンメタクリル酸コポリマーの少なく
とも１つの表面を、５％のＤＡＳＴ溶液に数時間曝して修飾する。ジクロロメタ
ンとアセトニトリルの洗浄を用いた反応停止後、このフィルムは、以下に記載の
とおり、生体高分子を固定化または合成するためにいつでも使用できる。有利な
ことには、フッ化アシルで活性化されたポリマー材料は常温で驚異的に安定であ
り、涼しく乾いた環境で保存すると、貯蔵寿命が無限であることが発見された。
【００３３】 本発明の固形支持体は、エチレンアクリル酸コポリマーまたはエチレンメタク
リル酸コポリマー製の固形支持体を用意すること、該固形支持体の少なくとも１
つの表面を活性化試薬と反応させることにより、該表面を誘導体にすることを含
む方法により準備されてもよい。適当な活性化試薬はアクリルまたはメタクリル
のカルボキシル基と反応して、例えば活性化アシル官能基のような、反応性のあ
る側鎖の官能基を形成することができる試薬である。
リル酸コポリマー製の固形支持体を用意すること、該固形支持体の少なくとも１
つの表面を活性化試薬と反応させることにより、該表面を誘導体にすることを含
む方法により準備されてもよい。適当な活性化試薬はアクリルまたはメタクリル
のカルボキシル基と反応して、例えば活性化アシル官能基のような、反応性のあ
る側鎖の官能基を形成することができる試薬である。
【００３４】 本発明の別の実施態様に従うと、本発明の固形支持体は、不活性の固形支持体
にフッ化アシル官能基側鎖を含むポリマー材料でコーティングすることにより調
製してもよい。例えば、ポリグルタミン酸のカルボキシル基は、ＤＡＳＴのよう
な適当なフッ化試薬によりフッ化アシルに変換されうる。この変換されたポリマ
ー材料をマイクロタイタープレート等の固形支持体にコーティングするために使
用してもよい。
にフッ化アシル官能基側鎖を含むポリマー材料でコーティングすることにより調
製してもよい。例えば、ポリグルタミン酸のカルボキシル基は、ＤＡＳＴのよう
な適当なフッ化試薬によりフッ化アシルに変換されうる。この変換されたポリマ
ー材料をマイクロタイタープレート等の固形支持体にコーティングするために使
用してもよい。
【００３５】 本発明の固形支持体は生物活性の評価または同定のための生体高分子アレイの
調製に特に有用であるため、前記固形支持体は少なくとも１つの平らな表面を有
する素子の形状とすることが好ましい。前記固形支持体のサイズはいろいろであ
ってもよいが、固定化生体高分子の最終的な用途に依存する。本発明の技術分野
の通常の技量を有する者は、小型化された固形支持体上に固定化された生体高分
子のアレイが多年にわたり開発中であることを承知している。これらの固形支持
体は平方ミリメートルの単位で計測でき、異なる生体高分子が前記小型化された
固形支持体の異なる部位特異的な場所に結合した、多数の異なる固定化生体高分
子をこれらの固形支持体は有することができる。ディップスティック形状の固形
支持体も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術分野に知られているとおり、デ
ィップスティックは各辺が数センチメートルの矩形をしているのが典型的である
。反対に、ゲノム全体の配列決定に用いられるポリヌクレオチドアレイのような
大きな生体高分子アレイは、１メートル以上の単位の大きさであってもかまわな
い。
調製に特に有用であるため、前記固形支持体は少なくとも１つの平らな表面を有
する素子の形状とすることが好ましい。前記固形支持体のサイズはいろいろであ
ってもよいが、固定化生体高分子の最終的な用途に依存する。本発明の技術分野
の通常の技量を有する者は、小型化された固形支持体上に固定化された生体高分
子のアレイが多年にわたり開発中であることを承知している。これらの固形支持
体は平方ミリメートルの単位で計測でき、異なる生体高分子が前記小型化された
固形支持体の異なる部位特異的な場所に結合した、多数の異なる固定化生体高分
子をこれらの固形支持体は有することができる。ディップスティック形状の固形
支持体も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術分野に知られているとおり、デ
ィップスティックは各辺が数センチメートルの矩形をしているのが典型的である
。反対に、ゲノム全体の配列決定に用いられるポリヌクレオチドアレイのような
大きな生体高分子アレイは、１メートル以上の単位の大きさであってもかまわな
い。
【００３６】 特殊な検査機器を含む多数の異なる検査技術に適応するために、適当な固形支
持体はさまざまな形状のいずれの形をとってもよい。例えば、固形支持体の作製
用と同じポリマー材料で生体高分子アレイホルダーを成形することは有利である
。かかるシステムでは、前記ホルダーは固形支持体であり、ロボットアームが反
応ステーションと検出ステーションの間で生体高分子アレイを移動する自動診断
システムによって容易に取り扱われる形状を含めて、いかなる形状であってもよ
い。かかるホルダーが固形支持体のときには、該ホルダーは生体高分子を結合す
るために適した平らなまたは連続的な表面を取り込んでいることが好ましい。
持体はさまざまな形状のいずれの形をとってもよい。例えば、固形支持体の作製
用と同じポリマー材料で生体高分子アレイホルダーを成形することは有利である
。かかるシステムでは、前記ホルダーは固形支持体であり、ロボットアームが反
応ステーションと検出ステーションの間で生体高分子アレイを移動する自動診断
システムによって容易に取り扱われる形状を含めて、いかなる形状であってもよ
い。かかるホルダーが固形支持体のときには、該ホルダーは生体高分子を結合す
るために適した平らなまたは連続的な表面を取り込んでいることが好ましい。
【００３７】 本発明の１の実施態様に従うと、本発明の固形支持体は多孔質または非孔質の
材料でできたものであってもよい。本発明の別の実施態様に従うと、本発明の固
形支持体は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、板等の構造の形状をと
ることができる。本発明のさらなる実施態様に従うと、固形支持体は、ウェルか
、槽か、台か、疎水性または親水性のパッチか、打ち抜き接着性貯留部か、ウェ
ルまたはその他の液体の流れの物理的な障壁を形成する積層された打ち抜きガス
ケットかの形状をした隔離された領域を有する平らな素子の形状をしたプラスチ
ックで作製されていてもよい。かかる固形支持体の例には、マイクロプレートま
たはこれに類するものが含まれるが、これらに限られない。
材料でできたものであってもよい。本発明の別の実施態様に従うと、本発明の固
形支持体は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、板等の構造の形状をと
ることができる。本発明のさらなる実施態様に従うと、固形支持体は、ウェルか
、槽か、台か、疎水性または親水性のパッチか、打ち抜き接着性貯留部か、ウェ
ルまたはその他の液体の流れの物理的な障壁を形成する積層された打ち抜きガス
ケットかの形状をした隔離された領域を有する平らな素子の形状をしたプラスチ
ックで作製されていてもよい。かかる固形支持体の例には、マイクロプレートま
たはこれに類するものが含まれるが、これらに限られない。
【００３８】 本発明の生体高分子は、未修飾の前記生体高分子と本発明の固形支持体との結
合ができる条件下で、前記生体高分子を前記固形支持体と接触させることにより
、該固形支持体と結合される。前記未修飾生体高分子を固形支持体に共有結合で
結合するための条件は、前記生体高分子が前記固形支持体のフッ化アシルと反応
することができる場合に十分である。理論に拘束されることを望むわけではない
が、本発明の条件下では未修飾生体高分子は固形支持体に含まれるフッ化官能基
が生体高分子の求核官能基と置換することにより、前記固形支持体と結合するの
かもしれない。
合ができる条件下で、前記生体高分子を前記固形支持体と接触させることにより
、該固形支持体と結合される。前記未修飾生体高分子を固形支持体に共有結合で
結合するための条件は、前記生体高分子が前記固形支持体のフッ化アシルと反応
することができる場合に十分である。理論に拘束されることを望むわけではない
が、本発明の条件下では未修飾生体高分子は固形支持体に含まれるフッ化官能基
が生体高分子の求核官能基と置換することにより、前記固形支持体と結合するの
かもしれない。
【００３９】 本発明の１の実施態様に従うと、未修飾ポリヌクレオチドにフッ化アシルとの
反応を起こさせるような条件下で、前記固形支持体のフッ化アシルで活性化され
た表面を接触させるステップは、ｐＨが好ましくは中性または塩基性の水性バッ
ファーの存在下で、前記固形支持体の表面を前記未修飾ポリヌクレオチドに曝す
ことにより達成される。中性または塩基性のｐＨ条件下で前記フッ化アシル官能
基を前記未修飾ポリヌクレオチドと接触させることにより、前記オリゴヌクレオ
チドは前記固形支持体の表面に直接結合されることになる。本発明の目的のため
には、塩基性のｐＨ条件とは、８より高いｐＨ条件をいう。塩基性のｐＨ条件に
より前記ポリヌクレオチドの前記固形支持体への結合が可能になるとき、この塩
基性のｐＨ条件は十分である。本発明の１の実施態様に従うと、本発明の塩基性
のｐＨ条件とは、約９ないし１２のｐＨである。用いる方法に応じて前記塩基性
ｐＨ条件は異なることを理解すべきである。本発明の技術分野の通常の技量を有
する者は、本発明の開示を考慮して、特定の結合反応の塩基性のｐＨ条件を容易
に確かめることができる。
反応を起こさせるような条件下で、前記固形支持体のフッ化アシルで活性化され
た表面を接触させるステップは、ｐＨが好ましくは中性または塩基性の水性バッ
ファーの存在下で、前記固形支持体の表面を前記未修飾ポリヌクレオチドに曝す
ことにより達成される。中性または塩基性のｐＨ条件下で前記フッ化アシル官能
基を前記未修飾ポリヌクレオチドと接触させることにより、前記オリゴヌクレオ
チドは前記固形支持体の表面に直接結合されることになる。本発明の目的のため
には、塩基性のｐＨ条件とは、８より高いｐＨ条件をいう。塩基性のｐＨ条件に
より前記ポリヌクレオチドの前記固形支持体への結合が可能になるとき、この塩
基性のｐＨ条件は十分である。本発明の１の実施態様に従うと、本発明の塩基性
のｐＨ条件とは、約９ないし１２のｐＨである。用いる方法に応じて前記塩基性
ｐＨ条件は異なることを理解すべきである。本発明の技術分野の通常の技量を有
する者は、本発明の開示を考慮して、特定の結合反応の塩基性のｐＨ条件を容易
に確かめることができる。
【００４０】 本発明の固形支持体は、当業者に知られた方法により、未修飾生体高分子と接
触することができる。例えば、接触のステップは、ジェットプリント法、固形素
子または開放キャピラリー素子接触プリント法、マイクロフルイディックチャン
ネルプリント法、シルクスクリーン法、および電気化学的または電磁的な力に基
づく印刷素子を用いる技術によって実行されるものでもかまわない。代替策とし
ては、前記接触のステップは前記未修飾生体高分子を前記固形支持体にスポット
をすることにより実行されるものでもかまわない。
触することができる。例えば、接触のステップは、ジェットプリント法、固形素
子または開放キャピラリー素子接触プリント法、マイクロフルイディックチャン
ネルプリント法、シルクスクリーン法、および電気化学的または電磁的な力に基
づく印刷素子を用いる技術によって実行されるものでもかまわない。代替策とし
ては、前記接触のステップは前記未修飾生体高分子を前記固形支持体にスポット
をすることにより実行されるものでもかまわない。
【００４１】 例えば、１の実施態様では、前記固形支持体は手作業でスポットすることによ
り未修飾オリゴヌクレオチドに曝される。手作業でのスポットの例には、ピペッ
ターまたはビオメックのピンツールでの手作業のスポットが含まれるが、これら
に限られない。この場合には、好ましい水溶性塩基は、ｐＨが９ないし１０の範
囲の炭酸水素ナトリウム−炭酸である。他の実施態様では、前記固形支持体はジ
ェットプリント法の技術により未修飾ポリヌクレオチドに曝される。商業的に入
手可能なジェットプリンターを使用する熱インクジェットプリント技術と、米国
特許第４，８７７，７４５号明細書に記載の圧電マイクロジェットプリント技術
とが、未修飾ポリヌクレオチドを固形支持体にスポットするのに利用できる。こ
の場合には、水溶性塩基はｐＨが約１０ないし１２のＬｉＣｌ塩溶液である。
り未修飾オリゴヌクレオチドに曝される。手作業でのスポットの例には、ピペッ
ターまたはビオメックのピンツールでの手作業のスポットが含まれるが、これら
に限られない。この場合には、好ましい水溶性塩基は、ｐＨが９ないし１０の範
囲の炭酸水素ナトリウム−炭酸である。他の実施態様では、前記固形支持体はジ
ェットプリント法の技術により未修飾ポリヌクレオチドに曝される。商業的に入
手可能なジェットプリンターを使用する熱インクジェットプリント技術と、米国
特許第４，８７７，７４５号明細書に記載の圧電マイクロジェットプリント技術
とが、未修飾ポリヌクレオチドを固形支持体にスポットするのに利用できる。こ
の場合には、水溶性塩基はｐＨが約１０ないし１２のＬｉＣｌ塩溶液である。
【００４２】 本発明の固形支持体は、生体高分子が前記固形支持体との接触が起こるかぎり
、いかなる方法によって前記生体高分子に曝されてもかまわないことを理解すべ
きである。ここに明示的に記載されていない他の水性バッファーシステムであっ
ても、ひとたび生体高分子と固形支持体が互いに接触すると両者の結合が起こる
のに十分な条件をかかる水性バッファーが提供するものであるかぎり、本発明に
用いてもかまわないことも理解すべきである。
、いかなる方法によって前記生体高分子に曝されてもかまわないことを理解すべ
きである。ここに明示的に記載されていない他の水性バッファーシステムであっ
ても、ひとたび生体高分子と固形支持体が互いに接触すると両者の結合が起こる
のに十分な条件をかかる水性バッファーが提供するものであるかぎり、本発明に
用いてもかまわないことも理解すべきである。
【００４３】 本発明の実施態様に従うと、水様液中に含まれる未修飾生体高分子の濃度は、
分子のタイプ、分子のサイズ、分子の構造および前記分子の溶解度に影響を与え
うる他の因子に応じて、異なるものであってもよい。例えば、結合したポリマー
がポリヌクレオチドのときには、該ポリヌクレオチドは５ｎＭないし４０：Ｍの
範囲であることが好ましい。５ｎＭないし５：Ｍの範囲であることがより好まし
い。
分子のタイプ、分子のサイズ、分子の構造および前記分子の溶解度に影響を与え
うる他の因子に応じて、異なるものであってもよい。例えば、結合したポリマー
がポリヌクレオチドのときには、該ポリヌクレオチドは５ｎＭないし４０：Ｍの
範囲であることが好ましい。５ｎＭないし５：Ｍの範囲であることがより好まし
い。
【００４４】 本発明に従うと、生体高分子の固形支持体への結合に続いて、望ましくない反
応を防ぐために未反応のフッ化アシル官能基をブロックすることが好ましい。本
発明の目的のためには、前記固形支持体に残存するフッ化アシル基は、残存する
表面の反応基を不活性化できるいかなる化学物質によってブロックされてもよい
。例えば、未反応のフッ化アシル官能基は、カルボキシアミドを形成する水酸化
アンモニウムまたはエステルを形成するエタノールと反応させてもかまわない。
しかし、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、多くのブロック反応が可
能であることを認識している。
応を防ぐために未反応のフッ化アシル官能基をブロックすることが好ましい。本
発明の目的のためには、前記固形支持体に残存するフッ化アシル基は、残存する
表面の反応基を不活性化できるいかなる化学物質によってブロックされてもよい
。例えば、未反応のフッ化アシル官能基は、カルボキシアミドを形成する水酸化
アンモニウムまたはエステルを形成するエタノールと反応させてもかまわない。
しかし、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、多くのブロック反応が可
能であることを認識している。
【００４５】 前記のとおり、固定化生体高分子を利用する多くの用途では、生体高分子が固
形支持体表面の部位特異的な場所に固定化されることが要求される。グリッドと
、各生体高分子が部位特異的な場所に位置する１ｘｎの碁盤の目状の固定化生体
高分子とを含む、規則正しい生体高分子のアレイを調製するためには、前記活性
化ポリマー材料の予め選択された部位が、所望の未修飾生体高分子溶液に曝され
る。本発明に従うと、これは、ある量の未修飾生体高分子溶液を前記固形支持体
の予め選択された位置に、手作業でアプライ、すなわち適用することにより達成
することができる。代替策として、商業的に入手可能なジェットプリンターを使
用する熱インクジェットプリント技術と、米国特許第４，８７７，７４５号明細
書に記載の圧電マイクロジェットプリント技術とが、選択された固形支持体表面
の部位に選択された未修飾生体高分子をスポットするために利用できる。
形支持体表面の部位特異的な場所に固定化されることが要求される。グリッドと
、各生体高分子が部位特異的な場所に位置する１ｘｎの碁盤の目状の固定化生体
高分子とを含む、規則正しい生体高分子のアレイを調製するためには、前記活性
化ポリマー材料の予め選択された部位が、所望の未修飾生体高分子溶液に曝され
る。本発明に従うと、これは、ある量の未修飾生体高分子溶液を前記固形支持体
の予め選択された位置に、手作業でアプライ、すなわち適用することにより達成
することができる。代替策として、商業的に入手可能なジェットプリンターを使
用する熱インクジェットプリント技術と、米国特許第４，８７７，７４５号明細
書に記載の圧電マイクロジェットプリント技術とが、選択された固形支持体表面
の部位に選択された未修飾生体高分子をスポットするために利用できる。
【００４６】 本発明の１の実施態様に従うと、少なくとも１ないし約１５３６個の異なる未
修飾生体高分子を、本発明の固形支持体の少なくとも１ないし約１５３６箇所の
別々の隔離された領域に結合することができる。
修飾生体高分子を、本発明の固形支持体の少なくとも１ないし約１５３６箇所の
別々の隔離された領域に結合することができる。
【００４７】 フッ化アシルで活性化された固形支持体に未修飾生体高分子を結合することは
、ジェノセンサーおよび差次的遺伝子発現マイクロアレイのようなアレイに基づ
くシステムの構築に利用するのに好適である。本発明の未修飾生体高分子が結合
した固形支持体は、リガンド結合アッセイ用あるいは逆ハイブリダイゼーション
法（プローブが結合したもの）またはサザンブロット法（ターゲットが結合した
もの）のいずれかのよるハイブリダイゼーションアッセイ用の装置として使用し
てもかまわない。かかる装置はイムノアッセイ法にも使用できる。
、ジェノセンサーおよび差次的遺伝子発現マイクロアレイのようなアレイに基づ
くシステムの構築に利用するのに好適である。本発明の未修飾生体高分子が結合
した固形支持体は、リガンド結合アッセイ用あるいは逆ハイブリダイゼーション
法（プローブが結合したもの）またはサザンブロット法（ターゲットが結合した
もの）のいずれかのよるハイブリダイゼーションアッセイ用の装置として使用し
てもかまわない。かかる装置はイムノアッセイ法にも使用できる。
【００４８】 したがって、本発明の１の局面はサンプル中の生体高分子ターゲットを解析す
るための方法を提供する。この方法は、（ａ）少なくとも１つの表面にフッ化ア
シル官能基側鎖を有する材料でできた固形支持体を用意すること、（ｂ）前記生
体高分子ターゲットと複合体を形成できる第２の生体高分子を含む試薬を用意す
ること、（ｃ）前記試薬と前記生体高分子ターゲットはともに未修飾であり、前
記試薬または前記生体高分子ターゲットのいずれかが前記固形支持体に結合でき
る条件下で、前記固形支持体を前記試薬または前記生体高分子ターゲットのいず
れかと接触させること、（ｄ）前記未修飾試薬と前記未修飾生体高分子ターゲッ
トとの複合体が形成できる条件下で、前記試薬と結合した固形支持体を前記生体
高分子ターゲットと接触させることあるいは前記生体高分子ターゲットと結合し
た固形支持体を前記試薬と接触させること、（ｅ）サンプル中に含まれる前記生
体高分子ターゲットの有無または量の測定値として前記複合体の有無を検出し測
定することを含む。
るための方法を提供する。この方法は、（ａ）少なくとも１つの表面にフッ化ア
シル官能基側鎖を有する材料でできた固形支持体を用意すること、（ｂ）前記生
体高分子ターゲットと複合体を形成できる第２の生体高分子を含む試薬を用意す
ること、（ｃ）前記試薬と前記生体高分子ターゲットはともに未修飾であり、前
記試薬または前記生体高分子ターゲットのいずれかが前記固形支持体に結合でき
る条件下で、前記固形支持体を前記試薬または前記生体高分子ターゲットのいず
れかと接触させること、（ｄ）前記未修飾試薬と前記未修飾生体高分子ターゲッ
トとの複合体が形成できる条件下で、前記試薬と結合した固形支持体を前記生体
高分子ターゲットと接触させることあるいは前記生体高分子ターゲットと結合し
た固形支持体を前記試薬と接触させること、（ｅ）サンプル中に含まれる前記生
体高分子ターゲットの有無または量の測定値として前記複合体の有無を検出し測
定することを含む。
【００４９】 本発明の目的のためには、前記生体高分子ターゲットか前記試薬かのいずれか
が本発明の固形支持体と結合できる。例えば、サザンブロット法またはノザンブ
ロット法では、生体高分子ターゲットが先に固形支持体と結合する。好ましくは
標識されたプローブが、前記生体高分子ターゲットの存在を検出するために、前
記固形支持体と接触するために用いられる。反対に、リガンド結合アッセイ法ま
たはアフィニティ精製アッセイ法では、プローブが先に固形支持体と結合するこ
とが好ましい。
が本発明の固形支持体と結合できる。例えば、サザンブロット法またはノザンブ
ロット法では、生体高分子ターゲットが先に固形支持体と結合する。好ましくは
標識されたプローブが、前記生体高分子ターゲットの存在を検出するために、前
記固形支持体と接触するために用いられる。反対に、リガンド結合アッセイ法ま
たはアフィニティ精製アッセイ法では、プローブが先に固形支持体と結合するこ
とが好ましい。
【００５０】 本発明の目的のためには、本発明の試薬は、前記生体高分子ターゲットを認識
し前記生体高分子ターゲットと結合することができる生体高分子を含む。試薬は
、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体からなる
グループから選択される生体高分子を含む。例えば、前記生体高分子ターゲット
がポリヌクレオチドのときには、前記試薬はこのターゲットのポリヌクレオチド
と相補的なポリヌクレオチドを含む。前記生体高分子ターゲットがレセプターま
たはリガンドのときには、前記試薬は、前記生体高分子を認識し、前記生体高分
子と結合することができるリガンドまたはレセプターを含む。生体高分子ターゲ
ットが抗原のときには、前記試薬は前記抗原を認識する抗原を含むものであって
もよく、その逆であってもよい。さらに、前記生体高分子ターゲットは結合試薬
で標識されてもよい。この場合には、前記試薬は標識された生体高分子を認識す
る結合試薬を含む。例えば、本発明の生体高分子はビオチンで標識されてもよい
。この場合には、前記試薬は前記生体高分子ターゲットのビオチンと結合可能な
ストレプトアビジンを含む。
し前記生体高分子ターゲットと結合することができる生体高分子を含む。試薬は
、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体からなる
グループから選択される生体高分子を含む。例えば、前記生体高分子ターゲット
がポリヌクレオチドのときには、前記試薬はこのターゲットのポリヌクレオチド
と相補的なポリヌクレオチドを含む。前記生体高分子ターゲットがレセプターま
たはリガンドのときには、前記試薬は、前記生体高分子を認識し、前記生体高分
子と結合することができるリガンドまたはレセプターを含む。生体高分子ターゲ
ットが抗原のときには、前記試薬は前記抗原を認識する抗原を含むものであって
もよく、その逆であってもよい。さらに、前記生体高分子ターゲットは結合試薬
で標識されてもよい。この場合には、前記試薬は標識された生体高分子を認識す
る結合試薬を含む。例えば、本発明の生体高分子はビオチンで標識されてもよい
。この場合には、前記試薬は前記生体高分子ターゲットのビオチンと結合可能な
ストレプトアビジンを含む。
【００５１】 本発明の目的のためには、条件は、前記試薬が前記生体高分子ターゲットと結
合して複合体を形成することができる場合には十分である。かかる条件は、分子
のタイプと結合のタイプに応じて異なる。本発明の技術分野の通常の技量を有す
る者は、本発明の開示を考慮して、適当な結合条件を容易に決定することができ
る。
合して複合体を形成することができる場合には十分である。かかる条件は、分子
のタイプと結合のタイプに応じて異なる。本発明の技術分野の通常の技量を有す
る者は、本発明の開示を考慮して、適当な結合条件を容易に決定することができ
る。
【００５２】 本発明の実施態様に従うと、前記生体高分子ターゲットと本発明の試薬の両方
とも、レポーター分子で標識することができる。レポーター分子の例には、化学
発光化合物、酵素、蛍光化合物、金属複合体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、
電波発信器および放射発光化合物が含まれるが、これらに限られない。本発明の
技術分野の通常の技量を有する者は、ひとたび生体高分子ターゲットが決定され
ると、使用すべきレポーター分子のタイプを決定することが容易にできる。
とも、レポーター分子で標識することができる。レポーター分子の例には、化学
発光化合物、酵素、蛍光化合物、金属複合体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、
電波発信器および放射発光化合物が含まれるが、これらに限られない。本発明の
技術分野の通常の技量を有する者は、ひとたび生体高分子ターゲットが決定され
ると、使用すべきレポーター分子のタイプを決定することが容易にできる。
【００５３】 本発明の別の局面は、ハイブリダイゼーションアッセイ法、イムノアッセイ法
その他のアッセイ法を実行するための素子を提供することでもある。本発明の素
子は、複数の未修飾生体高分子と固形支持体とを含む。前記固形支持体はフッ化
アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を有し、前記生体高分子は、前記
フッ化アシル官能基側鎖との反応により、前記固形支持体と結合する。
その他のアッセイ法を実行するための素子を提供することでもある。本発明の素
子は、複数の未修飾生体高分子と固形支持体とを含む。前記固形支持体はフッ化
アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を有し、前記生体高分子は、前記
フッ化アシル官能基側鎖との反応により、前記固形支持体と結合する。
【００５４】 本発明の目的のためには、前記結合した生体高分子は同じものであっても異な
るものであってもよい。前記生体高分子が異なる場合には、アレイを形成する固
形支持体の別々の隔離された領域に位置することが好ましい。例えば、固形支持
体はマイクロプレートであってもよい。アレイを形成するために、異なる生体高
分子をマイクロプレートの異なるウェルに結合してもよい。本発明の１の実施態
様に従うと、プローブのような、少なくとも１ないし１５３６個の未修飾生体高
分子が、マイクロプレートの少なくとも１ないし１５３６個のウェルに結合して
もよい。
るものであってもよい。前記生体高分子が異なる場合には、アレイを形成する固
形支持体の別々の隔離された領域に位置することが好ましい。例えば、固形支持
体はマイクロプレートであってもよい。アレイを形成するために、異なる生体高
分子をマイクロプレートの異なるウェルに結合してもよい。本発明の１の実施態
様に従うと、プローブのような、少なくとも１ないし１５３６個の未修飾生体高
分子が、マイクロプレートの少なくとも１ないし１５３６個のウェルに結合して
もよい。
【００５５】 マイクロプレートのような前記装置の固形支持体は、フッ化アシル官能基で処
理された表面であってもよく、生体高分子を前記フッ化アシル官能基側鎖との反
応によって前記固形支持体に結合してもよい。代替策として、本発明の生体高分
子はフッ化アシル官能基側鎖を含むプラスチックディスクの表面にプリントされ
たものであってもよく、前記ディスクは前記マイクロプレートの底に挿入されて
もよい。
理された表面であってもよく、生体高分子を前記フッ化アシル官能基側鎖との反
応によって前記固形支持体に結合してもよい。代替策として、本発明の生体高分
子はフッ化アシル官能基側鎖を含むプラスチックディスクの表面にプリントされ
たものであってもよく、前記ディスクは前記マイクロプレートの底に挿入されて
もよい。
【００５６】 以下の実施例は本発明の範囲を例示することを意図するものであって、限定す
るものではない。かかる実施例は使用されるであろうものの典型的なものである
が、本発明の技術分野の通常の技量を有する者に知られた他の手順が代替的に使
用されてもかまわない。実際、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、本
明細書の開示に基づき、過度の実験を伴うことなく、さらなる実施態様を予見し
作成することが容易にできる。
るものではない。かかる実施例は使用されるであろうものの典型的なものである
が、本発明の技術分野の通常の技量を有する者に知られた他の手順が代替的に使
用されてもかまわない。実際、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は、本
明細書の開示に基づき、過度の実験を伴うことなく、さらなる実施態様を予見し
作成することが容易にできる。
【００５７】
実施例１ ｃＤＮＡの未修飾ポリヌクレオチドがプリントされたアレイへのハイブリダイ ゼーション プライマーのアレイのプリント アクチン、Ｇ３ＰＤＨ、ｐ５３およびＴＮＦアルファの遺伝子の増幅に用いる
未修飾オリゴヌクレオチドプライマーを、ＬｉＣｌ：水を体積比６０：２５でお
およそ飽和した飽和ＬｉＣｌ、ｐＨ１２のストック溶液に希釈することにより調
製した。得られたプリントインクは、オリゴヌクレオチドの最終濃度が１０μＭ
であった。ＢｉｏＤｏｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒシステムを使用して、それぞれの
インクを１２．５ｎｌジェット噴射することにより、フッ化アシルで活性化され
たエチレンメタクリル酸コポリマー（ＥＭＡ）製の成形されたピース（バイオチ
ップ）の上にプライマーを付着してアレイを形成した。９ｘ８のアレイは、４個
の遺伝子について３’と５’のプライマーの対のそれぞれを９回繰り返してスポ
ットしたものからなる（９ｘ２ｘ４＝７２個のスポット）。プリント後、前記ア
レイは終夜真空乾燥し、残存する表面の反応基を２時間エタノール中で不活性化
（ブロック）した。ハイブリダイゼーションに使用する準備として、前記アレイ
を短時間水でリンスした。
未修飾オリゴヌクレオチドプライマーを、ＬｉＣｌ：水を体積比６０：２５でお
およそ飽和した飽和ＬｉＣｌ、ｐＨ１２のストック溶液に希釈することにより調
製した。得られたプリントインクは、オリゴヌクレオチドの最終濃度が１０μＭ
であった。ＢｉｏＤｏｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒシステムを使用して、それぞれの
インクを１２．５ｎｌジェット噴射することにより、フッ化アシルで活性化され
たエチレンメタクリル酸コポリマー（ＥＭＡ）製の成形されたピース（バイオチ
ップ）の上にプライマーを付着してアレイを形成した。９ｘ８のアレイは、４個
の遺伝子について３’と５’のプライマーの対のそれぞれを９回繰り返してスポ
ットしたものからなる（９ｘ２ｘ４＝７２個のスポット）。プリント後、前記ア
レイは終夜真空乾燥し、残存する表面の反応基を２時間エタノール中で不活性化
（ブロック）した。ハイブリダイゼーションに使用する準備として、前記アレイ
を短時間水でリンスした。
【００５８】 ｃＤＮＡプローブアレイのプリント 同様の手法で、２本鎖ＤＮＡプローブをフッ化アシルで活性化された基質にプ
リントした。ｃＤＮＡはビオチン標識を取り込むことなく第１鎖ＤＮＡをＰＣＲ
で増幅した。ｃＤＮＡのＰＣＲ産物（ｃＤＮＡアンプリコン）は、プライマーと
、ｄＮＴＰｓと、補助因子と、Ｔａｑ酵素とを除去するために、ゲル濾過スピン
カラム（Ｘｔｒｅｍｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して精製した
。前記アンプリコンは脱イオン水で前記カラムから溶出し、１Ｍ ＬｉＣｌ、ｐ
Ｈ１２に希釈して、ｃＤＮＡの最終濃度５ｎＭでＬｉＣｌ：水が体積比１：１の
インクができるようにプリント用に調製した。アレイがアクチンｃＤＮＡ、ベー
タミクログロブリンｃＤＮＡ、Ｇ３ＰＤＨｃＤＮＡ、ｐ５３ｃＤＮＡ、トランス
フェリンｃＤＮＡおよびＴＮＦアルファｃＤＮＡという６個の遺伝子について９
回の繰り返しからなる（９ｘ６＝５４個のスポット）ことを除いて、プライマー
プリントについて記載したのと同じスポット手順が用いられた。分注された液滴
のサイズは約１６ｎｌであった。
リントした。ｃＤＮＡはビオチン標識を取り込むことなく第１鎖ＤＮＡをＰＣＲ
で増幅した。ｃＤＮＡのＰＣＲ産物（ｃＤＮＡアンプリコン）は、プライマーと
、ｄＮＴＰｓと、補助因子と、Ｔａｑ酵素とを除去するために、ゲル濾過スピン
カラム（Ｘｔｒｅｍｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して精製した
。前記アンプリコンは脱イオン水で前記カラムから溶出し、１Ｍ ＬｉＣｌ、ｐ
Ｈ１２に希釈して、ｃＤＮＡの最終濃度５ｎＭでＬｉＣｌ：水が体積比１：１の
インクができるようにプリント用に調製した。アレイがアクチンｃＤＮＡ、ベー
タミクログロブリンｃＤＮＡ、Ｇ３ＰＤＨｃＤＮＡ、ｐ５３ｃＤＮＡ、トランス
フェリンｃＤＮＡおよびＴＮＦアルファｃＤＮＡという６個の遺伝子について９
回の繰り返しからなる（９ｘ６＝５４個のスポット）ことを除いて、プライマー
プリントについて記載したのと同じスポット手順が用いられた。分注された液滴
のサイズは約１６ｎｌであった。
【００５９】 ハイブリダイゼーション ｃＤＮＡアレイが結合したバイオチップを、ハイブリダイゼーションの直前に
、１５分間２００μｌの変性剤（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）
中で変性し、ストリンジェンシーバッファー（２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ
、ｐＨ７．０）でリンスした。プライマーアレイのバイオチップの場合には、変
性のステップは用いられなかった。以下のとおり、第１鎖ｃＤＮＡのプール（肝
臓）由来のアクチン、Ｇ３ＰＤＨ、ｐ５３およびＴＮＦアルファのビオチン標識
されたＰＣＲ産物を、プライマーアレイまたはｃＤＮＡアレイとのハイブリダイ
ゼーションのために調製した：１０μｌのＰＣＲ溶液を１０μｌの水で希釈し５
０μｌの変性剤を加えた。この溶液を１０分間常温でインキュベーションして、
その後、１５０μｌの中和バッファー（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、２
．４ｘＳＳＣ、０．０２％ ＳＤＳ）を添加した。混合した後、この溶液を２４
穴ポリプロピレン細胞培養プレートのウェルに入れ、前記バイオチップを浸した
。ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡアレイについては６０分間２５°Ｃ、プ
ライマーアレイについては６０°Ｃ６０分間、加湿チャンバー中で振盪しながら
行った。前記バイオチップはその後ハイブリダイゼーション溶液から取り出して
、２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳを含む別のウェルに（ハイブリダイゼーショ
ンに用いたのと同じ温度での）１０分間のストリンジェンシーリンスのために移
した。前記ストリンジェンシーバッファーでの最後のリンスの後、前記バイオチ
ップは過剰の溶液を除くためにブロットし、すなわち吸い取り紙で乾かし、スト
レプトアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温で静置した
。ストリンジェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを
再度ブロットし、ＥＬＦ試薬（アルカリフォスファターゼ用の蛍光基質、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．）中に置いてシグナルを現像した。前記シ
グナルは３０分間現像した。短時間の水でのリンスの後、このアレイのシグナル
はＣＣＤカメラシステムを用いて読みとられた。
、１５分間２００μｌの変性剤（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）
中で変性し、ストリンジェンシーバッファー（２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ
、ｐＨ７．０）でリンスした。プライマーアレイのバイオチップの場合には、変
性のステップは用いられなかった。以下のとおり、第１鎖ｃＤＮＡのプール（肝
臓）由来のアクチン、Ｇ３ＰＤＨ、ｐ５３およびＴＮＦアルファのビオチン標識
されたＰＣＲ産物を、プライマーアレイまたはｃＤＮＡアレイとのハイブリダイ
ゼーションのために調製した：１０μｌのＰＣＲ溶液を１０μｌの水で希釈し５
０μｌの変性剤を加えた。この溶液を１０分間常温でインキュベーションして、
その後、１５０μｌの中和バッファー（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、２
．４ｘＳＳＣ、０．０２％ ＳＤＳ）を添加した。混合した後、この溶液を２４
穴ポリプロピレン細胞培養プレートのウェルに入れ、前記バイオチップを浸した
。ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡアレイについては６０分間２５°Ｃ、プ
ライマーアレイについては６０°Ｃ６０分間、加湿チャンバー中で振盪しながら
行った。前記バイオチップはその後ハイブリダイゼーション溶液から取り出して
、２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳを含む別のウェルに（ハイブリダイゼーショ
ンに用いたのと同じ温度での）１０分間のストリンジェンシーリンスのために移
した。前記ストリンジェンシーバッファーでの最後のリンスの後、前記バイオチ
ップは過剰の溶液を除くためにブロットし、すなわち吸い取り紙で乾かし、スト
レプトアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温で静置した
。ストリンジェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを
再度ブロットし、ＥＬＦ試薬（アルカリフォスファターゼ用の蛍光基質、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｉｎｃ．）中に置いてシグナルを現像した。前記シ
グナルは３０分間現像した。短時間の水でのリンスの後、このアレイのシグナル
はＣＣＤカメラシステムを用いて読みとられた。
【００６０】 結果 図１ａに示すとおり、アクチンとＧ３ＰＤＨ由来の標識されたターゲットｃＤ
ＮＡはこれらに対応する固相のプライマーと特異的なハイブリダイゼーションを
したが、ｐ５３由来のｃＤＮＡはＧ３ＰＤＨプライマーと交差的なハイブリダイ
ゼーションを示した。ＴＮＦアルファもアクチンおよびｐ５３の３’プライマー
と交差的なハイブリダイゼーションをした。これらの結果は、同じ手順で固定化
したプローブｃＤＮＡとハイブリダイゼーションをした標識ｃＤＮＡターゲット
を用いた結果と同様である（図１ｂ）。
ＮＡはこれらに対応する固相のプライマーと特異的なハイブリダイゼーションを
したが、ｐ５３由来のｃＤＮＡはＧ３ＰＤＨプライマーと交差的なハイブリダイ
ゼーションを示した。ＴＮＦアルファもアクチンおよびｐ５３の３’プライマー
と交差的なハイブリダイゼーションをした。これらの結果は、同じ手順で固定化
したプローブｃＤＮＡとハイブリダイゼーションをした標識ｃＤＮＡターゲット
を用いた結果と同様である（図１ｂ）。
【００６１】 ｃＤＮＡターゲットの未修飾オリゴヌクレオチドプライマーの対の手作業でス ポットされたアレイへのハイブリダイゼーション プライマーアレイの手作業でのスポット アクチン、ｐ５３およびＴＮＦアルファの増幅用オリゴヌクレオチドプライマ
ーは、０．５Ｍ 炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ９中で、以下のスポット
用濃度で調製された。 プライマー μＭ（最終濃度） アクチン ３’ ５．０１ アクチン ５’ ５．００ ｐ５３ ３’ ３．７３ ｐ５３ ５’ ３．８３ ＴＮＦ ３’ ３．８０ ＴＮＦ ５’ ３．７０
ーは、０．５Ｍ 炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ９中で、以下のスポット
用濃度で調製された。 プライマー μＭ（最終濃度） アクチン ３’ ５．０１ アクチン ５’ ５．００ ｐ５３ ３’ ３．７３ ｐ５３ ５’ ３．８３ ＴＮＦ ３’ ３．８０ ＴＮＦ ５’ ３．７０
【００６２】 これらのそれぞれについて約１μｌの液滴を、フッ化アシルで活性化されたプ
ラスチック支持体（ＥＭＡ）上に、手動のピペッターを使用してスポットし、図
２に示すパターンと同様のアレイを作った。
ラスチック支持体（ＥＭＡ）上に、手動のピペッターを使用してスポットし、図
２に示すパターンと同様のアレイを作った。
【００６３】 スポット後、前記アレイは加湿したチャンバーで２５°Ｃ、１時間インキュベ
ーションを行った。これらは、その後、前記チャンバーから取り出して、２５分
間常温で風乾し、次に３０°Ｃで１０分間さらに乾燥した。前記プラスチック支
持体をエタノール中に６０分間浸して残存する表面の反応基をブロックし、最後
に１０分間脱イオン水中に浸した。
ーションを行った。これらは、その後、前記チャンバーから取り出して、２５分
間常温で風乾し、次に３０°Ｃで１０分間さらに乾燥した。前記プラスチック支
持体をエタノール中に６０分間浸して残存する表面の反応基をブロックし、最後
に１０分間脱イオン水中に浸した。
【００６４】 ハイブリダイゼーション 第１鎖ｃＤＮＡプール（肝臓）由来のアクチン、ｐ５３およびＴＮＦアルファ
のビオチン標識ＰＣＲ産物を以下のとおりプライマーアレイとのハイブリダイゼ
ーション用に調製した：１０μｌのＰＣＲ溶液を１０μｌの水で希釈し、３０μ
ｌの変性剤を加えた。この溶液を１０分間常温でインキュベーションした後、１
５０μｌの中和バッファーを加えた。混合した後、この溶液を２４穴ポリプロピ
レン細胞培養プレートのウェルに入れて、バイオチップを浸した。ハイブリダイ
ゼーションは６０分間６０°Ｃで加湿チャンバー中で振盪しながら進行させた。
前記バイオチップはその後ハイブリダイゼーション溶液から取り出して、２ｘＳ
ＳＣ、０．０１％ ＳＤＳを含む別のウェルに置いて６０°Ｃ１０分間ストリン
ジェンシーリンスを行った。前記ストリンジェンシーバッファー中での最後のリ
ンスの後、前記バイオチップをブロットして余分な溶液を除き、ストレプトアビ
ジン−アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温に置いた。ストリンジ
ェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを再度ブロット
して、シグナル現像用のＥＬＦ試薬中に置いた。シグナルは３０分間現像された
。短時間の水でのリンスに続いて、アレイのシグナルはＣＣＤカメラシステムを
使用して読みとられた。
のビオチン標識ＰＣＲ産物を以下のとおりプライマーアレイとのハイブリダイゼ
ーション用に調製した：１０μｌのＰＣＲ溶液を１０μｌの水で希釈し、３０μ
ｌの変性剤を加えた。この溶液を１０分間常温でインキュベーションした後、１
５０μｌの中和バッファーを加えた。混合した後、この溶液を２４穴ポリプロピ
レン細胞培養プレートのウェルに入れて、バイオチップを浸した。ハイブリダイ
ゼーションは６０分間６０°Ｃで加湿チャンバー中で振盪しながら進行させた。
前記バイオチップはその後ハイブリダイゼーション溶液から取り出して、２ｘＳ
ＳＣ、０．０１％ ＳＤＳを含む別のウェルに置いて６０°Ｃ１０分間ストリン
ジェンシーリンスを行った。前記ストリンジェンシーバッファー中での最後のリ
ンスの後、前記バイオチップをブロットして余分な溶液を除き、ストレプトアビ
ジン−アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温に置いた。ストリンジ
ェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを再度ブロット
して、シグナル現像用のＥＬＦ試薬中に置いた。シグナルは３０分間現像された
。短時間の水でのリンスに続いて、アレイのシグナルはＣＣＤカメラシステムを
使用して読みとられた。
【００６５】 結果 図３はハイブリダイゼーションの結果を示す。ビオチン標識ｃＤＮＡターゲッ
トは、対応する固定化プライマープローブに対して特異的にハイブリダイゼーシ
ョンをした。アクチンおよびｐ５３のターゲットは表面につながれた非相補的な
プライマープローブに対してほとんど交差的なハイブリダイゼーションが見られ
なかった。しかし、ＴＮＦのターゲットは、特に３’プライマーに対して顕著な
交差的なハイブリダイゼーションを示した。
トは、対応する固定化プライマープローブに対して特異的にハイブリダイゼーシ
ョンをした。アクチンおよびｐ５３のターゲットは表面につながれた非相補的な
プライマープローブに対してほとんど交差的なハイブリダイゼーションが見られ
なかった。しかし、ＴＮＦのターゲットは、特に３’プライマーに対して顕著な
交差的なハイブリダイゼーションを示した。
【００６６】 実施例３ ビオチン標識オリゴヌクレオチドターゲットのアミノ修飾または未修飾のオリ ゴヌクレオチドプローブのプリントされたアレイとのハイブリダイゼーション Ｆｉｂプローブアレイのプリント ５’アミノ修飾（Ｆｉｂ−ａ）および未修飾オリゴヌクレオチド（Ｆｉｂ）プ
ローブは、飽和ＬｉＣｌ、ｐＨ１２への希釈により、飽和ＬｉＣｌ：水が体積比
６０：２５となるプリント用インクで、最終濃度がＦｉｂについては１０μＭか
ら４０μＭ、Ｆｉｂ−ａについては１０μＭとなるように調製された。ＢｉｏＤ
ｏｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒシステムを使用して、各プローブについて９回の繰り
返しスポットを、それぞれのインクを１６ｎｌずつジェット噴射することにより
、フッ化アシルで活性化されたエチレンメタクリル酸コポリマー（ＥＭＡ）製の
成形されたピース（バイオチップ）の上に付着してアレイを形成した。プリント
後、前記アレイは終夜真空乾燥し、残存する表面の反応基を２時間エタノール中
で不活性化（クエンチ）した。ハイブリダイゼーションに使用する準備として、
前記アレイを短時間水でリンスした。
ローブは、飽和ＬｉＣｌ、ｐＨ１２への希釈により、飽和ＬｉＣｌ：水が体積比
６０：２５となるプリント用インクで、最終濃度がＦｉｂについては１０μＭか
ら４０μＭ、Ｆｉｂ−ａについては１０μＭとなるように調製された。ＢｉｏＤ
ｏｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒシステムを使用して、各プローブについて９回の繰り
返しスポットを、それぞれのインクを１６ｎｌずつジェット噴射することにより
、フッ化アシルで活性化されたエチレンメタクリル酸コポリマー（ＥＭＡ）製の
成形されたピース（バイオチップ）の上に付着してアレイを形成した。プリント
後、前記アレイは終夜真空乾燥し、残存する表面の反応基を２時間エタノール中
で不活性化（クエンチ）した。ハイブリダイゼーションに使用する準備として、
前記アレイを短時間水でリンスした。
【００６７】 Ｆｉｂプローブ： ５’−ＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧ−３’ Ｆｉｂ−ａプローブ： ５’−ＮＨ２− ＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＧ−３’ Ｆｉｂターゲット： ５’−ビオチン−ＣＴＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’
【００６８】 ハイブリダイゼーション Ｆｉｂターゲット（最終濃度１００ｎＭ）を２０μｌの１μＭストック溶液と
３０μｌの変性剤を混合して調製した。前記ターゲットを１０分間常温で変性条
件下に置いた後、１５０μｌの中和バッファーを加えた。前記バイオチップを２
４穴ポリプロピレン細胞培養プレートのウェルに入れた前記溶液中に浸し、該プ
レートを６０分間６０°Ｃで加湿チャンバー中に置いた。２ｘＳＳＣ、０．０１
％ ＳＤＳ、ｐＨ７．０のストリンジェンシーバッファー中での１０分間のリン
スに続き、ストリンジェンシーバッファー中で調製されたストレプトアビジン−
アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温でインキュベーションした。
ストリンジェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを２
回ストリンジェンシーバッファーでリンスして未結合の結合体を除き、シグナル
を現像するためにＥＬＦ試薬中に３０分間浸した。短時間の水でのリンスに続い
て、バイオチップのアレイのシグナルはＣＣＤカメラシステムを使用して読みと
られた。
３０μｌの変性剤を混合して調製した。前記ターゲットを１０分間常温で変性条
件下に置いた後、１５０μｌの中和バッファーを加えた。前記バイオチップを２
４穴ポリプロピレン細胞培養プレートのウェルに入れた前記溶液中に浸し、該プ
レートを６０分間６０°Ｃで加湿チャンバー中に置いた。２ｘＳＳＣ、０．０１
％ ＳＤＳ、ｐＨ７．０のストリンジェンシーバッファー中での１０分間のリン
スに続き、ストリンジェンシーバッファー中で調製されたストレプトアビジン−
アルカリフォスファターゼ結合体中で３０分間常温でインキュベーションした。
ストリンジェンシーバッファー中での大量のリンスの後、前記バイオチップを２
回ストリンジェンシーバッファーでリンスして未結合の結合体を除き、シグナル
を現像するためにＥＬＦ試薬中に３０分間浸した。短時間の水でのリンスに続い
て、バイオチップのアレイのシグナルはＣＣＤカメラシステムを使用して読みと
られた。
【００６９】 結果 図４は、ビオチン化Ｆｉｂターゲットオリゴヌクレオチドが、アレイのアミノ
修飾および未修飾の両方の相補的なプローブに対してハイブリダイゼーションを
したことを示す。
修飾および未修飾の両方の相補的なプローブに対してハイブリダイゼーションを
したことを示す。
【００７０】 前記アレイの各プローブスポットについての平均シグナル強度の画像解析は、
３個の別々のバイオチップアレイについて行った。図５は、標準偏差から推測さ
れる数値範囲を考慮すると、アミノ修飾プローブと未修飾プローブに対するハイ
ブリダイゼーションがほぼ同レベルであったことを示す。
３個の別々のバイオチップアレイについて行った。図５は、標準偏差から推測さ
れる数値範囲を考慮すると、アミノ修飾プローブと未修飾プローブに対するハイ
ブリダイゼーションがほぼ同レベルであったことを示す。
【００７１】 実施例４ フッ化アシルで活性化したポリプロピレンフィルム上のアレイに並べられたｃ ＤＮＡの調製とキャラクタリゼーション ポリプロピレンフィルムの活性化 高周波プラズマ（米国特許第５，５５４，５０１号）により表面をアミノ化し
、アミン官能基を無水コハク酸との反応によりカルボキシル基に変換した。フッ
化アシルによる活性化は、共に出願中の米国特許出願第０８／７９７，２２２号
出願明細書に既に記載のとおり、ＤＡＳＴ試薬を使用して達成された。フッ化ア
シルで活性化されたポリプロピレンフィルムは、アルゴン存在下−２０°Ｃで乾
燥状態で必要なときまで保存された。
、アミン官能基を無水コハク酸との反応によりカルボキシル基に変換した。フッ
化アシルによる活性化は、共に出願中の米国特許出願第０８／７９７，２２２号
出願明細書に既に記載のとおり、ＤＡＳＴ試薬を使用して達成された。フッ化ア
シルで活性化されたポリプロピレンフィルムは、アルゴン存在下−２０°Ｃで乾
燥状態で必要なときまで保存された。
【００７２】 ｃＤＮＡアレイのプリント 第１鎖ｃＤＮＡ（肝臓腫瘍）のＰＣＲ増幅由来の未修飾ｃＤＮＡは、プライマ
ーと、ｄＮＴＰｓと、補助因子と、Ｔａｑ酵素とを除去するために、ゲル濾過ス
ピンカラム（Ｘｔｒｅｍｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して精製
した。この精製ｃＤＮＡは水でカラムから溶出され、カップリングのために０．
５Ｍ 炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ９で希釈された。３８４本ピンＨＤ
ＲＴシステムを備えたＢｉｏｍｅｋ２０００（登録商標）ロボットシステムが基
質にｃＤＮＡ溶液をプリントするために使用された。ＢＡＰＡマーカー、すなわ
ち５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
も前記フィルムの両端にプリントし、これにより結合したｃＤＮＡを挟んだ。ハ
イブリダイゼーションと無関係にストレプトアビジン−酵素結合体と結合するＢ
ＡＰＡは、アッセイがうまくいっていること（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）について
の内部対照の役割を果たす。プリント後、前記フィルムを３５°Ｃ１５分間乾燥
してから、残存する表面の反応基をブロックするために２時間エタノール中に浸
した。前記フィルムを脱イオン水で短時間リンスして、風乾した。８ｃｍｘ１２
ｃｍのフィルムを１２枚に分割し、それぞれの短冊（ｓｔｒｉｐ）には各ｃＤＮ
Ａの３ｘ３の繰り返しを２回と、前記ＢＡＰＡマーカーの３ｘ３の繰り返しを６
回とが含まれた。得られたｃＤＮＡアレイフィルムをハイブリダイゼーションま
で−２０度または室温で乾燥状態で保存した。
ーと、ｄＮＴＰｓと、補助因子と、Ｔａｑ酵素とを除去するために、ゲル濾過ス
ピンカラム（Ｘｔｒｅｍｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して精製
した。この精製ｃＤＮＡは水でカラムから溶出され、カップリングのために０．
５Ｍ 炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ９で希釈された。３８４本ピンＨＤ
ＲＴシステムを備えたＢｉｏｍｅｋ２０００（登録商標）ロボットシステムが基
質にｃＤＮＡ溶液をプリントするために使用された。ＢＡＰＡマーカー、すなわ
ち５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
も前記フィルムの両端にプリントし、これにより結合したｃＤＮＡを挟んだ。ハ
イブリダイゼーションと無関係にストレプトアビジン−酵素結合体と結合するＢ
ＡＰＡは、アッセイがうまくいっていること（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）について
の内部対照の役割を果たす。プリント後、前記フィルムを３５°Ｃ１５分間乾燥
してから、残存する表面の反応基をブロックするために２時間エタノール中に浸
した。前記フィルムを脱イオン水で短時間リンスして、風乾した。８ｃｍｘ１２
ｃｍのフィルムを１２枚に分割し、それぞれの短冊（ｓｔｒｉｐ）には各ｃＤＮ
Ａの３ｘ３の繰り返しを２回と、前記ＢＡＰＡマーカーの３ｘ３の繰り返しを６
回とが含まれた。得られたｃＤＮＡアレイフィルムをハイブリダイゼーションま
で−２０度または室温で乾燥状態で保存した。
【００７３】 ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションのために、それぞれのフィルムの短冊を、顕微鏡用ガ
ラス製スライド上に分注した１５０μｌの変性剤中で１５分間変性した。この変
性のステップに続いて、前記フィルムの短冊を前記スライドから取り出して、残
存する変性剤を除去するためにストリンジェンシーバッファー中でリンスした。
第１鎖ｃＤＮＡのプール（肝臓腫瘍）由来のアクチン、Ｇ３ＰＤＨおよびＴＮＦ
アルファのビオチン標識されたＰＣＲ産物の混合物を、１５ｍｌポリプロピレン
試験管中で以下のとおりハイブリダイゼーション用に調製した：それぞれのｃＤ
ＮＡのＰＣＲ溶液１５μｌを混合し１８０μｌの水で希釈した。そして３３７．
５μｌの変性剤を添加した。変性を１０分間常温で行い、１６８７．５μｌの中
和バッファーを前記試験管に添加した。１５０μｌのアリコートを顕微鏡用ガラ
ス製スライドに移し、フィルムアレイを、ＤＮＡの結合した面を下にして、この
溶液の上に載せた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバー中で振盪しながら
６０分間６０°Ｃで行った。前記フィルムの短冊を前記ハイブリダイゼーション
溶液から取り出し、５０ｍｌポリプロピレン製ねじ蓋付き培養試験管に移して、
まず短時間リンスした後、６０°Ｃに予め加熱した４０ｍｌの２ｘＳＳＣ、０．
０１％ ＳＤＳバッファーに６０°Ｃ１０分間ストリンジェンシーリンスのため
に浸した。このストリンジェンシーバッファー中での最後のリンスの後、前記フ
ィルムをブロットして余分な溶液を除き、３０分間常温でストレプトアビジン−
アルカリフォスファターゼ結合体の溶液を顕微鏡用ガラス製スライド上に置いた
。大量のストリンジェンシーバッファー中でのリンスに続き、前記フィルムを再
度ブロットして、シグナル現像用のＥＬＦ試薬中に置いた。シグナルは３０分間
現像した。短時間水でリンスした後、アレイシグナルはＣＣＤカメラシステムを
使用して読みとられた。
ラス製スライド上に分注した１５０μｌの変性剤中で１５分間変性した。この変
性のステップに続いて、前記フィルムの短冊を前記スライドから取り出して、残
存する変性剤を除去するためにストリンジェンシーバッファー中でリンスした。
第１鎖ｃＤＮＡのプール（肝臓腫瘍）由来のアクチン、Ｇ３ＰＤＨおよびＴＮＦ
アルファのビオチン標識されたＰＣＲ産物の混合物を、１５ｍｌポリプロピレン
試験管中で以下のとおりハイブリダイゼーション用に調製した：それぞれのｃＤ
ＮＡのＰＣＲ溶液１５μｌを混合し１８０μｌの水で希釈した。そして３３７．
５μｌの変性剤を添加した。変性を１０分間常温で行い、１６８７．５μｌの中
和バッファーを前記試験管に添加した。１５０μｌのアリコートを顕微鏡用ガラ
ス製スライドに移し、フィルムアレイを、ＤＮＡの結合した面を下にして、この
溶液の上に載せた。ハイブリダイゼーションは加湿チャンバー中で振盪しながら
６０分間６０°Ｃで行った。前記フィルムの短冊を前記ハイブリダイゼーション
溶液から取り出し、５０ｍｌポリプロピレン製ねじ蓋付き培養試験管に移して、
まず短時間リンスした後、６０°Ｃに予め加熱した４０ｍｌの２ｘＳＳＣ、０．
０１％ ＳＤＳバッファーに６０°Ｃ１０分間ストリンジェンシーリンスのため
に浸した。このストリンジェンシーバッファー中での最後のリンスの後、前記フ
ィルムをブロットして余分な溶液を除き、３０分間常温でストレプトアビジン−
アルカリフォスファターゼ結合体の溶液を顕微鏡用ガラス製スライド上に置いた
。大量のストリンジェンシーバッファー中でのリンスに続き、前記フィルムを再
度ブロットして、シグナル現像用のＥＬＦ試薬中に置いた。シグナルは３０分間
現像した。短時間水でリンスした後、アレイシグナルはＣＣＤカメラシステムを
使用して読みとられた。
【００７４】 結果 対応するｃＤＮＡの混合物のハイブリダイゼーションによって決定したところ
、ｃＤＮＡとＢＡＰＡマーカーのアレイをフッ化アシルで活性化されたポリプロ
ピレンフィルム上にプリントすることには成功していた（図６）。図６は、（３
枚の別々のフィルム短冊に７日目にハイブリダイゼーションを行った）フッ化ア
シルで活性化されたポリプロピレンフィルム上のｃＤＮＡとＢＡＰＡマーカーの
ＢｉｏｍｅｋＨＤＲＴによるプリントを示す。フィルムアレイの保存は、常温で
も−２０°Ｃでも、約３箇月の期間ではハイブリダイゼーションに悪影響を与え
なかった（図７）。図７は、ポリプロピレンを用いたｃＤＮＡアレイの安定性を
示す。長期にわたるアッセイ条件の相違を説明するために、シグナル強度をＢＡ
ＰＡマーカー強度に対して規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。全てのｃＤＮ
Ａプローブについて、どちらの保存条件でもハイブリダイゼーション効率が変わ
らなかった。ＴＮＦのシグナルはＢＡＰＡマーカーのシグナルよりもいつも弱か
ったが、他のｃＤＮＡハイブリダイゼーションシグナルはＢＡＰＡマーカーのシ
グナルとほぼ同じ強度のままであった。
、ｃＤＮＡとＢＡＰＡマーカーのアレイをフッ化アシルで活性化されたポリプロ
ピレンフィルム上にプリントすることには成功していた（図６）。図６は、（３
枚の別々のフィルム短冊に７日目にハイブリダイゼーションを行った）フッ化ア
シルで活性化されたポリプロピレンフィルム上のｃＤＮＡとＢＡＰＡマーカーの
ＢｉｏｍｅｋＨＤＲＴによるプリントを示す。フィルムアレイの保存は、常温で
も−２０°Ｃでも、約３箇月の期間ではハイブリダイゼーションに悪影響を与え
なかった（図７）。図７は、ポリプロピレンを用いたｃＤＮＡアレイの安定性を
示す。長期にわたるアッセイ条件の相違を説明するために、シグナル強度をＢＡ
ＰＡマーカー強度に対して規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。全てのｃＤＮ
Ａプローブについて、どちらの保存条件でもハイブリダイゼーション効率が変わ
らなかった。ＴＮＦのシグナルはＢＡＰＡマーカーのシグナルよりもいつも弱か
ったが、他のｃＤＮＡハイブリダイゼーションシグナルはＢＡＰＡマーカーのシ
グナルとほぼ同じ強度のままであった。
【００７５】 実施例５ タンパク質の固定化 タンパク質、バッファーおよびその他の試薬 １．ビオチン化アルカリフォスファターゼ：Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒ
ｅ（登録商標）（ロット番号＃９５１２０７７４） ２．ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州（ロット番号＃２
１１２０９８） ３．3. ヤギ抗ビオチンＩｇＧ：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
．（ロット番号＃１１６Ｈ８８４２）、アフィニティ精製抗体、ＰＢＳ中に１ｍ
ｇ／ｍｌで再構成。 ４．プロテインＡ：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州（ロット番号＃２１２１２４１６）
；脱イオン水２ｍｌ中に５ｍｇを再構成（２．５ｍｇ／ｍｌ）。 ５．ストレプトアビジン（Ｓ．ａｖｉｄｉｎｉｉ由来）：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア
州（ロット番号＃７０５３６１２８）；脱イオン水１ｍｌ中に５ｍｇを再構成（
５ｍｇ／ｍｌ）。 ６．カゼイン：Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ（ロット番号＃ＢＤＨ４４０２０） ７．カップリングバッファー：１Ｍ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９または１０をタン
パク質溶液で０．８Ｍに希釈 ８．ＥＬＦ（登録商標）試薬（ＥＬＦ（登録商標）−９７内在性フォスファター
ゼ検出キット）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン
州（ロット番号＃６７７１） ９．高塩濃度バッファー：１．０Ｍ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
５（Ｄｉｇｅｎｅ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）；Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州（ロット番
号＃００９４ＭＸ９５） １０．クエンチ／ブロックバッファー：１ｍｇ／ｍｌ カゼイン、５０ｍＭ 炭
酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５ １１．ＴＢＳ：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
ｅ（登録商標）（ロット番号＃９５１２０７７４） ２．ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州（ロット番号＃２
１１２０９８） ３．3. ヤギ抗ビオチンＩｇＧ：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
．（ロット番号＃１１６Ｈ８８４２）、アフィニティ精製抗体、ＰＢＳ中に１ｍ
ｇ／ｍｌで再構成。 ４．プロテインＡ：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａ
ｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州（ロット番号＃２１２１２４１６）
；脱イオン水２ｍｌ中に５ｍｇを再構成（２．５ｍｇ／ｍｌ）。 ５．ストレプトアビジン（Ｓ．ａｖｉｄｉｎｉｉ由来）：Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア
州（ロット番号＃７０５３６１２８）；脱イオン水１ｍｌ中に５ｍｇを再構成（
５ｍｇ／ｍｌ）。 ６．カゼイン：Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ（ロット番号＃ＢＤＨ４４０２０） ７．カップリングバッファー：１Ｍ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９または１０をタン
パク質溶液で０．８Ｍに希釈 ８．ＥＬＦ（登録商標）試薬（ＥＬＦ（登録商標）−９７内在性フォスファター
ゼ検出キット）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン
州（ロット番号＃６７７１） ９．高塩濃度バッファー：１．０Ｍ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．
５（Ｄｉｇｅｎｅ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）；Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州（ロット番
号＃００９４ＭＸ９５） １０．クエンチ／ブロックバッファー：１ｍｇ／ｍｌ カゼイン、５０ｍＭ 炭
酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５ １１．ＴＢＳ：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
【００７６】 方法 タンパク質のバイオチップへの固定化 タンパク質（プロテインＡ、ストレプトアビジン、ウサギ抗ヤギＩｇＧ）ｑ１
Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ９または１０で０．５−１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希
釈した。これらのタンパク質溶液をフッ化アシルで活性化したプラスチック製バ
イオチップの表面に０．５μｌの液滴として添加した。チップは加湿したチャン
バー中で２５°Ｃ１時間インキュベーションをした。チップを前記チャンバーか
ら取り出し、完全に風乾した（約１５分）後、クエンチ／ブロック溶液中に置い
た。チップを２４穴プレート中で１．０ｍｌの溶液に入れ、最小限３０分間激し
くｖｏｒｔｅｘで撹拌することにより、クエンチした。クエンチ後、チップを脱
イオン水で１０分間振盪しながらリンスして、風乾した。
Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ９または１０で０．５−１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に希
釈した。これらのタンパク質溶液をフッ化アシルで活性化したプラスチック製バ
イオチップの表面に０．５μｌの液滴として添加した。チップは加湿したチャン
バー中で２５°Ｃ１時間インキュベーションをした。チップを前記チャンバーか
ら取り出し、完全に風乾した（約１５分）後、クエンチ／ブロック溶液中に置い
た。チップを２４穴プレート中で１．０ｍｌの溶液に入れ、最小限３０分間激し
くｖｏｒｔｅｘで撹拌することにより、クエンチした。クエンチ後、チップを脱
イオン水で１０分間振盪しながらリンスして、風乾した。
【００７７】 ＥＬＦ試薬によるアルカリフォスファターゼの検出 それぞれのチップについて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の手順（す
なわち１９部の試薬Ｂを１部の試薬Ａに加える）に従って５０μｌのＥＬＦ試薬
を調製して、前記チップの表面に適用した。ＥＬＦ試薬が付着したチップを、湿
度を維持するために水を半分満たした箱の中で３０分間インキュベーションをし
た。その後、前記チップを脱イオン水で３回リンスした。前記チップを３６５ｎ
ｍの紫外線励起光と５２０ｎｍのレンズフィルターで写真撮影した。ＣＣＤカメ
ラの露出時間は１０秒が典型的であった。
なわち１９部の試薬Ｂを１部の試薬Ａに加える）に従って５０μｌのＥＬＦ試薬
を調製して、前記チップの表面に適用した。ＥＬＦ試薬が付着したチップを、湿
度を維持するために水を半分満たした箱の中で３０分間インキュベーションをし
た。その後、前記チップを脱イオン水で３回リンスした。前記チップを３６５ｎ
ｍの紫外線励起光と５２０ｎｍのレンズフィルターで写真撮影した。ＣＣＤカメ
ラの露出時間は１０秒が典型的であった。
【００７８】 実験結果 プロテインＡのバイオチップへの固定化 シグナル現像と検出： ＴＢＳ中に１：１００希釈したウサギ抗ヤギＩｇＧで１時間、続けて、ＴＢＳ中
のヤギ抗ビオチンＩｇＧで１時間、その後２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ中の
ビオチン−アルカリフォスファターゼ結合体で１時間、それぞれインキュベーシ
ョンした。ＥＬＦで現像した。固定化されたプロテインＡはここに記載のサンド
イッチイムノアッセイ法においてウサギ（Ｒｂ）抗体を捕捉する機能があること
が証明された。
のヤギ抗ビオチンＩｇＧで１時間、その後２ｘＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ中の
ビオチン−アルカリフォスファターゼ結合体で１時間、それぞれインキュベーシ
ョンした。ＥＬＦで現像した。固定化されたプロテインＡはここに記載のサンド
イッチイムノアッセイ法においてウサギ（Ｒｂ）抗体を捕捉する機能があること
が証明された。
【００７９】 ストレプトアビジンのバイオチップへの固定化 ０．８Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ９中で１ｍｇ／ｍｌに調製された。室温で１
時間インキュベーションをした。異なるブロック試薬（１ｍｇ／ｍｌ）中でＶｏ
ｒｔｅｘｅｒにより１時間撹拌してクエンチした。
時間インキュベーションをした。異なるブロック試薬（１ｍｇ／ｍｌ）中でＶｏ
ｒｔｅｘｅｒにより１時間撹拌してクエンチした。
【００８０】 シグナル現像と検出 ２ｘＳＳＣ，０．０１％ ＳＤＳバッファー中で１：１００に希釈したビオチ
ン化アルカリフォスファターゼを１時間インキュベーションした。ＥＬＦ試薬の
インキュベーションは３０分間室温で行った。固定化ストレプトアビジンは、非
特異的結合を減少させることを目的とするさまざまなブロック条件下で、ビオチ
ン化酵素を特異的に捕捉する機能があることが証明された（図９）。
ン化アルカリフォスファターゼを１時間インキュベーションした。ＥＬＦ試薬の
インキュベーションは３０分間室温で行った。固定化ストレプトアビジンは、非
特異的結合を減少させることを目的とするさまざまなブロック条件下で、ビオチ
ン化酵素を特異的に捕捉する機能があることが証明された（図９）。
【００８１】 抗体のバイオチップへの固定化 ヤギ抗ビオチンＩｇＧはバイオチップに以下のとおり固定化された： １．ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１．０ｍｇ／ｍｌ、３０分間のインキュベーション
２．ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１．０ｍｇ／ｍｌ、６０分間のインキュベーション
３．０．８Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ１０中の０．５ｍｇ／ｍｌ、３０分間のイ
ンキュベーション ４．０．８Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ１０中の０．５ｍｇ／ｍｌ、６０分間のイ
ンキュベーション
２．ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１．０ｍｇ／ｍｌ、６０分間のインキュベーション
３．０．８Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ１０中の０．５ｍｇ／ｍｌ、３０分間のイ
ンキュベーション ４．０．８Ｍ 炭酸バッファー、ｐＨ１０中の０．５ｍｇ／ｍｌ、６０分間のイ
ンキュベーション
【００８２】 シグナル現像と検出： 高塩濃度バッファー中で１：１００希釈したビオチン−アルカリフォスファタ
ーゼ結合体と、抗体とのインキュベーションと同じ時間インキュベーションをし
た。ＥＬＦ試薬による現像は室温で３０分間行った。ヤギ抗ビオチンＩｇＧとい
う抗体の固定化はｐＨ７．２でもｐＨ１０でも成功したことが、ビオチン標識さ
れたレポーター酵素（アルカリフォスファターゼ）の特異的な捕捉により証明さ
れた。
ーゼ結合体と、抗体とのインキュベーションと同じ時間インキュベーションをし
た。ＥＬＦ試薬による現像は室温で３０分間行った。ヤギ抗ビオチンＩｇＧとい
う抗体の固定化はｐＨ７．２でもｐＨ１０でも成功したことが、ビオチン標識さ
れたレポーター酵素（アルカリフォスファターゼ）の特異的な捕捉により証明さ
れた。
【００８３】 以上は本発明の範囲を例示することを目的とするものであって、限定すること
を目的とするものではない。実際、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は
、ここでの開示に基づいて過度の実験を伴うことなく、さらなる実施態様を予見
し作成することができる。
を目的とするものではない。実際、本発明の技術分野の通常の技量を有する者は
、ここでの開示に基づいて過度の実験を伴うことなく、さらなる実施態様を予見
し作成することができる。
【００８４】 本発明の特長とその入手方法は、添付する図面とともに以上の説明を参照する
ことにより、より明確となり、最もうまく理解できる。これらの図面は本発明の
典型的な実施態様のみを描写しており、本発明の範囲を限定するものではない。
ことにより、より明確となり、最もうまく理解できる。これらの図面は本発明の
典型的な実施態様のみを描写しており、本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】 図１ａはアクチン、Ｇ３ＰＤＨ、ｐ５３およびＴＮＦ由来の標識されたターゲ
ットｃＤＮＡの、これらに対応する固相プライマーに対するハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示す。 図１ｂは標識されたｃＤＮＡターゲットの、同じ手順で固定化されたこれらに
対応するプローブｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
ットｃＤＮＡの、これらに対応する固相プライマーに対するハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示す。 図１ｂは標識されたｃＤＮＡターゲットの、同じ手順で固定化されたこれらに
対応するプローブｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図２】 手動ピペッターでのスポットにより作られたアレイパターンを示す。
【図３】 ｃＤＮＡターゲットの、未修飾オリゴヌクレオチドプライマーの対を手作業で
スポットしたアレイに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
スポットしたアレイに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】 ビオチン化Ｆｉｂターゲットオリゴヌクレオチドの、アレイのアミノ修飾およ
び未修飾の相補的なプローブに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
び未修飾の相補的なプローブに対するハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図５】 アレイの各プローブのスポットについての平均シグナル強度の画像解析である
。
。
【図６】 フッ化アシルで活性化されたポリプロピレンフィルム上のｃＤＮＡとＢＡＰＡ
マーカーのＢｉｏｍｅｋＨＤＲＴによるプリントを示す。
マーカーのＢｉｏｍｅｋＨＤＲＴによるプリントを示す。
【図７】 ポリプロピレンに基づくｃＤＮＡアレイの安定性を示す。
【図８】 プロテインＡの固定化を示す。
【図９】 ストレプトアビジンの固定化を示す。
【図１０】 ヤギ抗ビオチンＩｇＧ抗体の固定化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ (72)発明者 マトソン、 ロバート エス アメリカ合衆国 92869 カリフォルニア 州 オレンジ イースト キャンドルベリ ー サークル 8324 (72)発明者 ミルトン、 レイモンド シー アメリカ合衆国 90631 カリフォルニア 州 ラ アブラ トパーズ アヴェニュー 2210 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA04 CA05 CA09 CA11 CA12 HA08 HA11 HA12 HA13 HA15 4B033 NA01 NA02 NA43 NB02 NB04 NB14 NB15 NB34 NB35 NB36 NB63 NB65 NB66 NB67 NC05 ND05 ND06 ND07 ND12 ND20 NE02 4B063 QA08 QA13 QA19 QA20 QQ02 QQ05 QQ42 QQ53 QQ79 QQ96 QR10 QR14 QR20 QR31 QR32 QR36 QR38 QR41 QR42 QR50 QR56 QR58 QR66 QR82 QS22 QS24 QS25 QS32 QS33 QS34 QS35 QS36 QX01
Claims (71)
- 【請求項１】（ａ）未修飾生体高分子を用意するステップ、（ｂ）フッ化ア
シル官能基側鎖を含む表面が少なくとも１つある固形支持体を用意するステップ
、（ｃ）前記未修飾生体高分子と前記固形支持体とが結合できるのに十分な条件
下で、前記生体高分子を前記固形支持体と接触させるステップを含む、未修飾生
体高分子を固形支持体と結合する方法。 - 【請求項２】前記生体高分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質、
脂質およびこれらの類似体からなるグループから選択される、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】前記生体高分子は、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、抗体ま
たはストレプトアビジンからなるグループから選択される、請求項２に記載の方
法。 - 【請求項４】前記生体高分子は、ポリヌクレオチドである。請求項３に記載
の方法。 - 【請求項５】前記ポリヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチド、増幅され
たＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲ
ＮＡからなるグループから選択される、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】前記ポリヌクレオチドの長さは約３ｂｐないし１０ｋｂの範囲
内にある、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】前記ポリヌクレオチドの長さは約１００ｂｐないし１．５ｋｂ
の範囲内にある、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】前記オリゴヌクレオチドの長さは約３ないし１００個のオリゴ
ヌクレオチドの範囲内にある、請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】前記オリゴヌクレオチドの長さは約１５ないし２０個のオリゴ
ヌクレオチドの範囲内にある、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記固形支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、天
然繊維、シリコン、金属およびこれらの複合材料からなるグループから選択され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記固形支持体は、エチレンアシル酸、エチレンメタルリル
酸、カルボキシ化ＰＶＤＦ、カルボキシ化ポリプロピレンまたはカルボキシ化ポ
リエチレンおよびこれらのコポリマーからなるグループから選択されるポリマー
材料である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】前記（ｂ）のステップには、さらに不活性の固形支持体を、
フッ化アシル官能基側鎖を含むポリマー材料か、あるいはフッ化アシル官能基側
鎖を支持することができるポリマー材料でコーティングすることを含む、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１３】前記固形支持体の材料は多孔質または非孔質である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記固形支持体の形状は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜
、ビーズ、板およびこれらに類する構造である、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１５】前記固形支持体は、ウェルか、槽か、台か、疎水性または親
水性のパッチか、打ち抜き接着性貯留部か、その他の液体の流れの物理的な障壁
かの形状をした隔離された領域を有する平らな素子の形状をしたプラスチックで
作製される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】前記固形支持体はマイクロプレートである、請求項１５に記
載の方法。 - 【請求項１７】前記プラスチックはフッ化アシル官能基で処理された表面を
有するポリプロピレンである、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１８】前記接触のステップは、ジェットプリント法、固形素子また
は開放キャピラリー素子接触プリント法、マイクロフルイディックチャンネルプ
リント法、シルクスクリーン法および電気化学的または電磁的な力に基づく印刷
素子を用いる技術からなるグループから選択される技術により実行される、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１９】前記接触のステップは前記未修飾生体高分子を前記固形支持
体にスポットすることにより実行される、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】前記条件は塩基性ｐＨ条件である、請求項１に記載の方法。
- 【請求項２１】前記塩基性ｐＨ条件はプリント溶液をｐＨ約８ないし１３に
維持される、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】前記プリント溶液は塩を含む、請求項２１に記載の方法。
- 【請求項２３】前記塩はＬｉＣｌである、請求項２２に記載の方法。
- 【請求項２４】前記プリント溶液は炭酸水素ナトリウム−炭酸バッファーを
含む、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２５】前記塩基性条件はｐＨ９ないし１２である、請求項２０に記
載の方法。 - 【請求項２６】前記生体高分子はポリヌクレオチドで、該ポリヌクレオチド
はｐＨ９ないし１０の条件下で前記固形支持体にスポットされる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項２７】前記生体高分子はポリヌクレオチドで、該ポリヌクレオチド
をｐＨ１０ないし１２の条件下でジェットプリントする、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項２８】サンプル中の生体高分子ターゲットを分析する方法であって
、（ａ）フッ化アシル基側鎖を少なくとも１つの表面に有する材料で作製された
固形支持体を用意するステップと、（ｂ）前記生体高分子ターゲットと複合体を
形成でき、第２の生体高分子を含む試薬を用意するステップと、（ｃ）前記試薬
および前記生体高分子ターゲットはともに未修飾で、前記試薬または前記生体高
分子ターゲットのいずれかを前記固形支持体と結合できる条件下で、前記未修飾
試薬または前記未修飾生体高分子ターゲットのいずれかと前記固形支持体を接触
させるステップと、（ｄ）前記未修飾試薬と前記生体高分子ターゲットとが複合
体を形成できる条件下で、前記未修飾試薬と結合した前記固形支持体を前記生体
高分子ターゲットと接触させるステップまたは前記未修飾生体高分子と結合した
固形支持体を前記試薬と接触させるステップと、（ｅ）前記サンプル中に含まれ
る前記生体高分子ターゲットの存在の測定値として、前記複合体の存在を検出し
測定するステップとを含む、サンプル中の生体高分子ターゲットを分析する方法
。 - 【請求項２９】前記（ｃ）のステップにおいて前記試薬は前記固形支持体の
表面に結合し、前記（ｄ）のステップにおいて、前記試薬と前記生体高分子ター
ゲットを含まれる複合体を形成できる条件下で、前記未修飾試薬と結合した前記
固形支持体は前記生体高分子ターゲットと接触する、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】前記（ｃ）のステップにおいて前記生体高分子ターゲットは
前記固形支持体の表面に結合し、前記（ｄ）のステップにおいて、前記未修飾生
体高分子ターゲットと結合した前記固形支持体は、前記試薬と前記生体高分子タ
ーゲットを含む複合体を形成できる条件下で、前記試薬と接触する、請求項２８
に記載の方法。 - 【請求項３１】前記生体高分子ターゲットは、核酸、ポリペプチド、タンパ
ク質、糖質、脂質およびこれらの類似体からなるグループから選択される、請求
項２８に記載の方法。 - 【請求項３２】前記生体高分子ターゲットは、ポリヌクレオチド、プロテイ
ンＡ、抗体またはストレプトアビジンからなるグループから選択される、請求項
２８に記載の方法。 - 【請求項３３】前記試薬は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質
およびこれらの類似体からなるグループから選択される生体高分子を含む、請求
項２８に記載の方法。 - 【請求項３４】前記試薬は、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、抗体または
ストレプトアビジンからなるグループから選択される生体高分子を含む、請求項
２８に記載の方法。 - 【請求項３５】前記生体高分子ターゲットはポリヌクレオチドで、前記試薬
は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドプローブを含む、請求項２８
に記載の方法。 - 【請求項３６】前記複合体は前記ポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチド
プローブを含み、前記複合体は前記ポリヌクレオチドプローブと前記ポリヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションにより形成される、請求項３５に記載の方法
。 - 【請求項３７】前記生体高分子はタンパク質で、前記試薬は該蛋白質を認識
する抗体を含む、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３８】前記複合体は前記タンパク質と該タンパク質に対する抗体を
含み、前記複合体は前記抗体の前記タンパク質への結合により形成される、請求
項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】前記生体高分子はリガンドで、前記試薬は該リガンドと結合
できるレセプターを含む、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４０】前記生体高分子はレセプターで、前記試薬は該レセプターと
結合できるリガンドを含む、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４１】前記複合体は前記リガンドと前記タンパク質を含み、前記複
合体は前記リガンドと前記レセプターとの結合により形成される、請求項３９ま
たは４０に記載の方法。 - 【請求項４２】前記（ｃ）のステップにおいて、前記試薬または前記生体高
分子ターゲットは前記固形支持体の表面に共有結合により結合する、請求項２８
に記載の方法。 - 【請求項４３】前記複合体はさらに色素、化学発光化合物、酵素、蛍光化合
物、金属複合体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、電波発信器および放射発光化
合物からなるグループから選択されるレポーター分子を含む、請求項２８に記載
の方法。 - 【請求項４４】前記固形支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、天
然繊維、シリコン、金属およびこれらの複合材料からなるグループから選択され
る、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４５】前記固形支持体は、エチレンアシル酸、エチレンメタルリル
酸、カルボキシ化ＰＶＤＦ、カルボキシ化ポリプロピレンまたはカルボキシ化ポ
リエチレンおよびこれらのコポリマーからなるグループから選択されるポリマー
材料である、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４６】前記（ａ）のステップには、さらに不活性の固形支持体を、
フッ化アシル官能基側鎖を含むポリマー材料か、あるいはフッ化アシル官能基側
鎖を支持することができるポリマー材料かでコーティングすることを含む、請求
項２８に記載の方法。 - 【請求項４７】前記固形支持体の形状は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜
、ビーズ、板およびこれらに類する構造である、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４８】前記固形支持体は、ウェルか、槽か、台か、疎水性または親
水性のパッチか、打ち抜き接着性貯留部か、その他の液体の流れの物理的な障壁
かの形状をした隔離された領域を有する平らな素子の形状をしたプラスチックで
作製される、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項４９】前記固形支持体はマイクロプレートである、請求項４８に記
載の方法。 - 【請求項５０】前記プラスチックはフッ化アシル官能基で表面処理されたポ
リプロピレンである、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５１】前記試薬または前記生体高分子ターゲットは、フッ化アシル
官能基側鎖を含むプラスチックディスクの表面にプリントされ、該ディスクは前
記マイクロプレートのウェルの底に挿入され、前記未修飾試薬または未修飾生体
高分子ターゲットと結合した固形支持体を形成する、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項５２】同じまたは異なる未修飾試薬か、前記生体高分子ターゲット
かを前記平らな素子の異なる隔離された領域に結合してアレイを形成する、請求
項４８に記載の方法。 - 【請求項５３】少なくとも１ないし約１５３６個の未修飾試薬または生体高
分子を平らな素子の少なくとも１ないし約１５３６箇所別々の隔離された領域に
結合する、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５４】前記平らな素子はマイクロプレートで、前記隔離された領域
は該マイクロプレートのウェルである、請求項５３に記載の方法。 - 【請求項５５】複数の未修飾生体高分子と固形支持体を含む素子であって、
該固形支持体はフッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を有し、該
フッ化アシル官能基側鎖との反応により前記生体高分子は前記固形支持体と結合
する素子。 - 【請求項５６】前記生体高分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、糖質
、脂質およびこれらの類似体からなるグループから選択される、請求項５５に記
載の素子。 - 【請求項５７】前記生体高分子は、ポリヌクレオチド、プロテインＡ、抗体
またはストレプトアビジンからなるグループから選択される、請求項５５に記載
の素子。 - 【請求項５８】前記生体高分子はポリヌクレオチドである、請求項５５に記
載の素子。 - 【請求項５９】前記オリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチド、増幅
されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたは
ｍＲＮＡからなるグループから選択される、請求項５８に記載の素子。 - 【請求項６０】前記生体高分子は同じものでも異なるものでもよい、請求項
５５に記載の素子。 - 【請求項６１】前記固形支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、天
然繊維、シリコン、金属およびこれらの複合材料である、請求項５５に記載の素
子。 - 【請求項６２】前記固形支持体は、エチレンアシル酸、エチレンメタルリル
酸、カルボキシ化ＰＶＤＦ、カルボキシ化ポリプロピレンまたはカルボキシ化ポ
リエチレンおよびこれらのコポリマーからなるグループから選択されるポリマー
材料である、請求項５５に記載の素子。 - 【請求項６３】前記固形支持体の形状は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜
、ビーズ、板およびこれらに類する構造である、請求項５５に記載の素子。 - 【請求項６４】前記固形支持体は、ウェルか、槽か、台か、疎水性または親
水性のパッチか、打ち抜き接着性貯留部か、その他の液体の流れの物理的な障壁
かの形状をした隔離された領域を有する平らな素子の形状をしたプラスチックで
作製される、請求項５５に記載の素子。 - 【請求項６５】前記固形支持体はマイクロプレートである、請求項６４に記
載の素子。 - 【請求項６６】前記プラスチックはフッ化アシル官能基で表面処理されてい
る、請求項６４に記載の素子。 - 【請求項６７】前記プラスチックは、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ
スルホン、ポリエチレンおよびこれらのコポリマーからなるグループから選択さ
れる、請求項６６に記載の素子。 - 【請求項６８】前記生体高分子は異なる隔離された領域に結合してアレイを
形成し、該生体高分子は同じものでも異なるものでもよい、請求項６４に記載の
素子。 - 【請求項６９】前記素子は、（ａ）複数の未修飾生体高分子を用意すること
、（ｂ）フッ化アシル官能基側鎖を含む少なくとも１つの表面を揺する固形支持
体を用意すること、（ｃ）前記複数の未修飾生体高分子のそれぞれが前記固形支
持体と該固形支持体の別々の場所で結合することができる条件下で、前記複数の
生体高分子と前記固形支持体を接触することを含む方法により調製される、請求
項５５に記載の素子。 - 【請求項７０】前記固形支持体は複数の隔離された場所を有し、前記生体高
分子は前記固形支持体とそれぞれの隔離された場所で結合する、請求項６９に記
載の素子。 - 【請求項７１】前記生体高分子は同じものまたは異なるものである、請求項
７１に記載の素子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/312,095 US6268141B1 (en) | 1999-05-12 | 1999-05-12 | Immobilization of unmodified biopolymers to acyl fluoride activated substrates |
| US09/312,095 | 1999-05-12 | ||
| PCT/US2000/012729 WO2000070088A2 (en) | 1999-05-12 | 2000-05-10 | Immobilization of unmodified biopolymers to acyl fluoride activated substrates |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002544508A true JP2002544508A (ja) | 2002-12-24 |
| JP2002544508A5 JP2002544508A5 (ja) | 2007-06-21 |
| JP4608107B2 JP4608107B2 (ja) | 2011-01-05 |
Family
ID=23209859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000618493A Expired - Lifetime JP4608107B2 (ja) | 1999-05-12 | 2000-05-10 | 未修飾生体高分子のフッ化アシル活性化基質への固定化 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6268141B1 (ja) |
| EP (1) | EP1208226B1 (ja) |
| JP (1) | JP4608107B2 (ja) |
| AT (1) | ATE401419T1 (ja) |
| DE (1) | DE60039519D1 (ja) |
| ES (1) | ES2310167T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000070088A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016521129A (ja) * | 2013-03-07 | 2016-07-21 | アプライド ディーエヌエー サイエンシズ インコーポレイテッド | Ｄｎａタガントを固定するためのアルカリ活性化 |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7027932B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-04-11 | Olympus Optical Co., Ltd. | Biochemical examination method |
| WO2002081683A2 (en) * | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Nextgen Sciences Ltd. | Protein analysis by means of immobilized arrays of antigens or antibodies |
| US20030092062A1 (en) * | 2001-10-24 | 2003-05-15 | Reddy M. Parameswara | Immobilizing biological molecules |
| US6989175B2 (en) * | 2002-03-08 | 2006-01-24 | Beckman Coulter, Inc. | Acyl fluoride activation of carboxysilyl-coated glass substrates |
| US20050158848A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-07-21 | Ulrich Sieben | Method for immobolizing molecules on surfaces |
| US20030198967A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Matson Robert S. | Multi-functional microarrays and methods |
| US6984485B2 (en) * | 2002-04-23 | 2006-01-10 | Beckman Coulter, Inc. | Polymer-coated substrates for immobilization of biomolecules and cells |
| US6841379B2 (en) * | 2002-05-15 | 2005-01-11 | Beckman Coulter, Inc. | Conductive microplate |
| US20040049351A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Matson Robert S. | Immunosorbent assay in microarray format |
| US20040229226A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-11-18 | Reddy M. Parameswara | Reducing microarray variation with internal reference spots |
| EP1682261B1 (en) | 2003-11-12 | 2012-08-15 | BIO-RAD Haifa Ltd. | Method for carrying out multiple binding reactions in an array format |
| US20070207483A1 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | BUFFERS FOR DETECTION OF mRNA SEPARATED IN A MICROFLUIDIC DEVICE |
| US10741034B2 (en) | 2006-05-19 | 2020-08-11 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity |
| EP2057465A4 (en) | 2006-08-09 | 2010-04-21 | Homestead Clinical Corp | SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE |
| JP5730280B2 (ja) | 2009-03-16 | 2015-06-03 | パング バイオファーマ リミテッド | 非カノニカル生物学的活性を有するヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼスプライスバリアントを含む組成物および方法 |
| JP5848236B2 (ja) | 2009-03-31 | 2016-01-27 | エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド | 非標準的な生物活性を有するアスパルチルｔＲＮＡ合成酵素を含む組成物および方法 |
| CA2797093C (en) | 2010-04-26 | 2019-10-29 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-trna synthetase |
| CN103096911B (zh) | 2010-04-27 | 2018-05-29 | Atyr 医药公司 | 与异亮氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| JP6008837B2 (ja) | 2010-04-28 | 2016-10-19 | エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド | アラニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見 |
| US9068177B2 (en) | 2010-04-29 | 2015-06-30 | Atyr Pharma, Inc | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-tRNA synthetases |
| AU2011248490B2 (en) | 2010-04-29 | 2016-11-10 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Asparaginyl tRNA synthetases |
| CA2797393C (en) | 2010-04-29 | 2020-03-10 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases |
| CA2797277C (en) | 2010-05-03 | 2021-02-23 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of arginyl-trna synthetases |
| CA2797978C (en) | 2010-05-03 | 2019-12-03 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases |
| CN103096912A (zh) | 2010-05-03 | 2013-05-08 | Atyr医药公司 | 与苯丙氨酰-α-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| AU2011248101B2 (en) | 2010-05-04 | 2016-10-20 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-tRNA synthetase complex |
| CN103200953B (zh) | 2010-05-14 | 2017-02-15 | Atyr 医药公司 | 与苯丙氨酰‑β‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| WO2011153277A2 (en) | 2010-06-01 | 2011-12-08 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases |
| EP2593125B1 (en) | 2010-07-12 | 2017-11-01 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-trna synthetases |
| EP2608801B1 (en) | 2010-08-25 | 2019-08-21 | aTyr Pharma, Inc. | INNOVATIVE DISCOVERY OF THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, AND ANTIBODY COMPOSITIONS RELATED TO PROTEIN FRAGMENTS OF TYROSYL-tRNA SYNTHETASES |
| MX356107B (es) | 2012-02-16 | 2018-05-15 | Atyr Pharma Inc | Histidil-arnt sintetasas para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias. |
| US9266370B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-02-23 | Apdn (B.V.I) Inc. | DNA marking of previously undistinguished items for traceability |
| US9297032B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-03-29 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings |
| CA2892822C (en) | 2012-11-27 | 2023-08-08 | Pontificia Universidad Catolica De Chile | Compositions and methods for diagnosing thyroid tumors |
| US9963740B2 (en) | 2013-03-07 | 2018-05-08 | APDN (B.V.I.), Inc. | Method and device for marking articles |
| CA2926436A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Judith Murrah | Multimode image and spectral reader |
| CN106103121B (zh) | 2014-03-18 | 2019-12-06 | 亚普蒂恩(B.V.I.)公司 | 用于安全应用的加密光学标记物 |
| US10745825B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-08-18 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Encrypted optical markers for security applications |
| US10760182B2 (en) | 2014-12-16 | 2020-09-01 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Method and device for marking fibrous materials |
| CN109070130B (zh) | 2016-04-11 | 2022-03-22 | 亚普蒂恩（B V I）公司 | 用于标记纤维素产品的方法 |
| US10995371B2 (en) | 2016-10-13 | 2021-05-04 | Apdn (B.V.I.) Inc. | Composition and method of DNA marking elastomeric material |
| WO2018156352A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Apdn (B.V.I) Inc. | Nucleic acid coated submicron particles for authentication |
| WO2020076976A1 (en) | 2018-10-10 | 2020-04-16 | Readcoor, Inc. | Three-dimensional spatial molecular indexing |
| GB2580384B (en) * | 2019-01-08 | 2021-01-27 | Quantumdx Group Ltd | Oligonucleotide deposition onto polypropylene substrates |
| GB2580385B (en) * | 2019-01-08 | 2022-10-12 | Quantumdx Group Ltd | Oligonucleotide deposition onto polypropylene substrates |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0420300A (ja) * | 1990-05-11 | 1992-01-23 | Microprobe Corp | 核酸ハイブリツド形成アツセイ用固体支持体 |
| JPH0889296A (ja) * | 1994-09-30 | 1996-04-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 核酸検出方法 |
| WO1997032212A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Beckman Instruments, Inc. | System for simultaneously conducting multiple ligand binding assays |
| WO1997046597A1 (en) * | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Beckman Instruments Inc | Polymeric reagents for immobilizing biopolymers |
| WO1998053103A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Clontech Laboratories, Inc. | Nucleic acid arrays |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4144374A (en) * | 1974-12-12 | 1979-03-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Perfluorinated functionalized materials |
| US5011861A (en) * | 1988-06-28 | 1991-04-30 | Millipore Corporation | Membranes for solid phase protein sequencing |
| US5288514A (en) * | 1992-09-14 | 1994-02-22 | The Regents Of The University Of California | Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support |
| US5554501A (en) * | 1992-10-29 | 1996-09-10 | Beckman Instruments, Inc. | Biopolymer synthesis using surface activated biaxially oriented polypropylene |
| US5602207A (en) * | 1993-01-11 | 1997-02-11 | The Perkin-Elmer Corporation | Support and method for immobilizing polypeptides |
| US5470307A (en) * | 1994-03-16 | 1995-11-28 | Lindall; Arnold W. | Catheter system for controllably releasing a therapeutic agent at a remote tissue site |
| US6852487B1 (en) * | 1996-02-09 | 2005-02-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| US6037124A (en) * | 1996-09-27 | 2000-03-14 | Beckman Coulter, Inc. | Carboxylated polyvinylidene fluoride solid supports for the immobilization of biomolecules and methods of use thereof |
| US5985567A (en) * | 1997-08-15 | 1999-11-16 | Beckman Coulter, Inc. | Hybridization detection by pretreating bound single-stranded probes |
| US6750344B1 (en) * | 1997-09-05 | 2004-06-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine compounds and combinatorial libraries comprising same |
-
1999
- 1999-05-12 US US09/312,095 patent/US6268141B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-05-10 ES ES00928944T patent/ES2310167T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-10 AT AT00928944T patent/ATE401419T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-10 WO PCT/US2000/012729 patent/WO2000070088A2/en active Application Filing
- 2000-05-10 DE DE60039519T patent/DE60039519D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-10 JP JP2000618493A patent/JP4608107B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-10 EP EP00928944A patent/EP1208226B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-05-31 US US09/872,052 patent/US20010039018A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0420300A (ja) * | 1990-05-11 | 1992-01-23 | Microprobe Corp | 核酸ハイブリツド形成アツセイ用固体支持体 |
| JPH0889296A (ja) * | 1994-09-30 | 1996-04-09 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 核酸検出方法 |
| WO1997032212A1 (en) * | 1996-03-01 | 1997-09-04 | Beckman Instruments, Inc. | System for simultaneously conducting multiple ligand binding assays |
| WO1997046597A1 (en) * | 1996-06-05 | 1997-12-11 | Beckman Instruments Inc | Polymeric reagents for immobilizing biopolymers |
| WO1998053103A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | Clontech Laboratories, Inc. | Nucleic acid arrays |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016521129A (ja) * | 2013-03-07 | 2016-07-21 | アプライド ディーエヌエー サイエンシズ インコーポレイテッド | Ｄｎａタガントを固定するためのアルカリ活性化 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE401419T1 (de) | 2008-08-15 |
| JP4608107B2 (ja) | 2011-01-05 |
| WO2000070088A3 (en) | 2002-03-28 |
| WO2000070088A2 (en) | 2000-11-23 |
| ES2310167T3 (es) | 2009-01-01 |
| DE60039519D1 (de) | 2008-08-28 |
| EP1208226A2 (en) | 2002-05-29 |
| EP1208226B1 (en) | 2008-07-16 |
| US6268141B1 (en) | 2001-07-31 |
| US20010039018A1 (en) | 2001-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4608107B2 (ja) | 未修飾生体高分子のフッ化アシル活性化基質への固定化 | |
| US20050123986A1 (en) | Immobilization of biopolymers to aminated substrates by direct adsorption | |
| US6929944B2 (en) | Analysis using a distributed sample | |
| US7981665B2 (en) | Supports for assaying analytes and methods of making and using thereof | |
| US20050287590A1 (en) | Multi-functional microarrays and methods | |
| US10191045B2 (en) | Sol composition for sol-gel biochip to immobilize probe on substrate without surface treatment and method and screening thereof | |
| Tonkinson et al. | Nitrocellulose: a tried and true polymer finds utility as a post-genomic substrate | |
| US6037124A (en) | Carboxylated polyvinylidene fluoride solid supports for the immobilization of biomolecules and methods of use thereof | |
| JP2002544508A5 (ja) | ||
| JP2004526420A6 (ja) | 直接的な吸着によるアミノ化基質への生体高分子の不動化 | |
| KR20010020283A (ko) | 분석 실행 장치, 그 장치의 제조 방법 및 그 장치의 제조에 멤브레인을 사용하는 방법 | |
| JP2005526259A (ja) | 導電性マイクロプレート | |
| US20110086771A1 (en) | Biochip | |
| US20040121339A1 (en) | Special film-coated substrate for bio-microarray fabrication and use thereof | |
| JP2004506922A (ja) | バイオチップマイクロアレイを構築するための固体支持体の表面活性化を得る方法 | |
| CN115124888B (zh) | 一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法和应用 | |
| US6500921B1 (en) | Schiff base reductant co-dispense process | |
| US20090171052A1 (en) | Polyelectrolyte Monolayers and Multilayers for Optical Signal Transducers | |
| US8153367B2 (en) | Amplified array analysis system | |
| US20070037174A1 (en) | Chemiluminescent generated fluorescent labeling | |
| US7368082B1 (en) | Formulation of spotting solution to achieve uniform spot size and morphology and for nondestructive quality control of assay articles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070426 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070426 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090501 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20090501 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091006 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091228 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100120 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100712 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100820 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100913 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101008 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4608107 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131015 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |