ES2310167T3

ES2310167T3 - Inmovilizacion de acidos nucleicos sin modificar a sustratos con grupos fluoruro de acilo pendientes.

Info

Publication number: ES2310167T3
Application number: ES00928944T
Authority: ES
Inventors: Robert S. Matson; Raymond C. Milton
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2009-01-01
Anticipated expiration: 2020-05-10
Also published as: WO2000070088A3; WO2000070088A2; US20010039018A1; JP4608107B2; ATE401419T1; JP2002544508A; DE60039519D1; EP1208226A2; US6268141B1; EP1208226B1

Abstract

Un procedimiento de unión de ácidos nucleicos sin modificar a un soporte sólido que comprende las etapas de: (a) suministro de ácidos nucleicos sin modificar; (b) suministro de un soporte sólido con al menos una superficie que comprende funciones fluoruro de acilo pendientes; y (c) puesta en contacto de los ácidos nucleicos sin modificar con el soporte sólido permitiendo la unión de los ácidos nucleicos al soporte sólido.

Description

Inmovilización de ácidos nucleicos sin modificar a sustratos con grupos fluoruro de acilo pendientes.

Antecedentes de la invención Área de la técnica

La invención se refiere de manera general a soportes sólidos con biopolímeros inmovilizados y específicamente a soportes sólidos con biopolímeros sin modificar inmovilizados y a procedimientos de inmovilización de biopolímeros sin modificar en soportes sólidos.

Descripción de la técnica anterior

La síntesis de biopolímeros y el análisis de biopolímeros a menudo requieren la unión de biopolímeros a soportes sólidos. Por ejemplo, se han utilizado materiales orgánicos e inorgánicos para la síntesis en fase sólida de péptidos, oligonucleótidos y moléculas orgánicas pequeñas. La síntesis supone la etapa de adición de monómeros activados tales como derivados de aminoácidos o derivados de nucleótidos a una cadena oligomérica en crecimiento unida por un extremo a un soporte sólido. Al completarse la síntesis, los biopolímeros recién sintetizados se pueden escindir del soporte sólido y posteriormente se pueden utilizar en investigación bioquímica o en aplicaciones diagnósticas o, alternativamente, se pueden utilizar sin escindir los biopolímeros del soporte sólido.

Para el análisis de biopolímeros, los biopolímeros se pueden unir a un soporte sólido de diversas maneras. En técnicas de transferencia, los biopolímeros nativos primero se capturan sobre una membrana y a continuación se inmovilizan sobre la membrana mediante calor, radiación o técnicas químicas. Los biopolímeros inmovilizados entonces están disponibles para análisis posteriores, tales como los asociados a aplicaciones de transferencia Southern y técnicas analíticas de hibridación inversa.

Adicionalmente, se han inmovilizado oligonucleótidos presintetizados o naturales uniendo covalentemente oligonucleótidos activados al soporte sólido. La metodología actual para la unión covalente de ácidos nucleicos a soportes sólidos (sustratos) supone la modificación del ADN (o ARN). Por ejemplo, los oligonucleótidos normalmente se modifican en el término 5'-amino, haciendo el ADN más reactivo para la unión covalente a una superficie activada. Otros procedimientos de unión han empleado reacciones con grupos fosfatos o grupos sulfhidrales terminales con carbodiimidas superficiales u otros compuestos químicos de activación (véase Lund y col., Nucleic Acid Res. 16:10861-80, 1988, Bischoffet y col., Analyt. Biochem. 164: 336-344, 1987).

En general se entiende que los grupos reactivos presentes dentro de polinucleótidos nativos son débiles y por tanto producen una unión ineficaz. Además, cuando los polinucleótidos nativos se exponen a grupos superficiales muy reactivos, se puede producir un entrecruzamiento excesivo. Este entrecruzamiento puede evitar que el ácido nucleico unido participe completamente en la hibridación. Estas condiciones son más evidentes para fragmentos cortos de ADN u oligonucleótidos de doble cadena. Así, los oligonucleótidos a menudo se tienen que modificar, por ejemplo, derivar en un término 5'-amino, para una unión eficaz. El grupo enlazante 5'-amino permite la unión selectiva del ADN que contiene el grupo amino a portas sililados mediante la reacción con una base de Schiff con grupos aldehídos sobre la superficie del chip. La selectividad del ADN modificado en el grupo amino frente al ADN natural sin modificar es de 10:1 aproximadamente para los ADNc y de 10.100:1 aproximadamente para los 15-meros de cadena sencilla. Las moléculas de ADN de longitudes intermedias presentan relaciones de discriminación intermedias. Además, la unión del extremo 5' del ADN al chip a través del grupo amino permite la accesibilidad estérica de las moléculas unidas durante la reacción de hibridación. Por tanto, la post-modificación se percibe como obligatoria para la unión de, por ejemplo, sondas de oligonucleótidos para la creación de biochips. Esos procedimientos de post-modificación requieren etapas que consumen tiempo adicional a unos costes sustanciales.

Por tanto, es deseable desarrollar un procedimiento más eficaz para la unión de biopolímeros, particularmente biopolímeros sin modificar, a un soporte sólido. Es particularmente deseable desarrollar un procedimiento para unir directamente biopolímeros sin modificar, tales como polinucleótidos, a un soporte sólido.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que tanto los fragmentos cortos como largos de ADN de cadena sencilla o de doble cadena se pueden unir eficazmente a soportes activados con fluoruro de acilo directamente sin brazos espaciadores y sin modificar el polinucleótido.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de unión de ácidos nucleicos sin modificar a un soporte sólido. El procedimiento que comprende las etapas de:

(a): suministro de ácidos nucleicos sin modificar;

(b): suministro de un soporte sólido con al menos una superficie que comprende funciones fluoruro de acilo pendientes; y

(c): puesta en contacto de los ácidos nucleicos sin modificar con el soporte sólido en unas condiciones suficientes para permitir la unión de los ácidos nucleicos al soporte sólido.

En una forma de realización de la presente invención, el biopolímero es un polinucleótido, y el polinucleótido puede ser un oligonucleótido sintetizado, ADN amplificado, ADNc, ADN de cadena sencilla, ADN de doble cadena, ANP, ARN o ARNm. También según las formas de realización de la presente invención, el soporte sólido puede ser de materiales poliméricos, vidrios, fibras naturales cerámicas, silicios, metales y sus compuestos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de análisis de un ácido nucleico diana en una muestra. El procedimiento comprende las etapas de:

(a): suministro de un soporte sólido fabricado de un material con grupos fluoruro de acilo pendientes sobre al menos una superficie;

(b): suministro de un agente que puede formar un complejo con el ácido nucleico diana, en el que el agente comprende un segundo ácido nucleico,

(c): puesta en contacto del soporte sólido con el agente o la diana en unas condiciones que permitan la unión del agente sin modificar o de la diana sin modificar al soporte sólido, en donde el agente y el biopolímero diana están sin modificar;

(d): puesta en contacto del soporte sólido unido con el agente sin modificar con la diana, o puesta en contacto del soporte sólido con la diana unida sin modificar con el agente en unas condiciones que permitan la formación de un complejo que comprende el agente y la diana;

(e): detección y determinación de la presencia del complejo como medida de la presencia o la cantidad del ácido nucleico diana contenido en la muestra.

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Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un dispositivo que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos sin modificar y un soporte sólido. El soporte sólido tiene al menos una superficie que comprende funciones fluoruro de acilo pendientes, y los ácidos nucleicos están unidos al soporte sólido por reacción con las funciones fluoruro de acilo pendientes.

La presente invención está bien adaptada para su uso en la creación de biochips de polinucleótidos, tales como biochips genosensores y otros sistemas basados en biochips tales como biochips de expresión génica diferencial. Los biochips de polinucleótidos se pueden usar para la evaluación o identificación de actividad biológica. La presente invención también se puede usar en la creación de biochips de polinucleótidos con el propósito de secuenciar polinucleótidos. Además, la presente invención se puede usar en ensayos de hibridación e inmunoensayos.

La presente invención proporciona muchas ventajas. Permite la unión de biopolímeros sin modificar directamente a un soporte sólido. Así simplifica e incrementa adicionalmente la versatilidad de un procedimiento para la creación de biochips de biopolímeros.

Hay una tanto una ventaja económica como una ventaja técnica en esta invención. Primero, se puede evitar la producción costosa de biopolímeros modificados, tales como ADN modificado en el grupo amino. El procesamiento de post-modificación de oligonucleótidos necesita tiempo y puede incrementar sustancialmente los costes hasta dos veces. Segundo, la tarea de preparar biochips se simplifica enormemente, puesto que los procesos de post-modificación ya no son necesarios.

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Descripción de las figuras

La Figura 1a muestra los resultados de hibridación de ADNc diana marcado de actina, G3PDH, p53 y TNF con sus cebadores de fase sólida correspondientes. La Figura 1b muestra los resultados de hibridación de dianas de ADNc marcado con su ADNc sonda correspondiente inmovilizado mediante el mismo procedimiento.

La Figura 2 muestra un diseño de un biochip creado por fijación manual con una pipeta.

La Figura 3 muestra los resultados de hibridación de dianas de ADNc con biochips fijados manualmente de pares de cebadores de oligonucleótidos sin modificar.

La Figura 4 muestra los resultados de hibridación del oligonucleótido diana Fib biotinilado con sondas complementarias modificadas en el grupo amino y sin modificar del biochip.

La Figura 5 es un análisis de la imagen de las intensidades de la señal media para cada punto de la sonda en el biochip.

La Figura 6 muestra la impresión HDRT de Biomek de ADNc y marcadores de BAPA sobre películas de polipropileno activadas con fluoruro de acilo.

La Figura 7 muestra la estabilidad de biochips de ADNc basadas en polipropileno.

La Figura 8 muestra la inmovilización de proteína A.

La Figura 9 muestra la inmovilización de estreptavidina.

La Figura 10 muestra la inmovilización de anticuerpos IgG de cabra anti-biotina.

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Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de unión de ácidos nucleicos sin modificar a un soporte sólido definido en la reivindicación 1.

Como se usa en el presente documento, "polinucleótido" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en forma de fragmento separado o como componente de una construcción mayor. "Polinucleótido" como se usa en el presente documento puede ser ADN, ARN, un análogo de ADN tal como ANP (ácido nucleico de péptido), o un oligonucleótido sintetizado. El ADN puede ser un ADN de cadena sencilla o de doble cadena, o un ADN amplificado mediante la técnica de la PCR. El ARN puede ser un ARNm. La longitud de los polinucleótidos puede ser de 3 pb a 10 kb. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la longitud de los polinucleótidos puede estar en el intervalo de 50 pb a 10 kb aproximadamente, preferentemente, de 100 pb a 1,5 kb. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, la longitud de un oligonucleótido sintetizado está en el intervalo de 3 a 100 nucleótidos. De acuerdo con una forma de realización adicional de la presente invención, la longitud de un oligonucleótido sintetizado está en intervalo de 15 a 20 nucleótidos aproximadamente.

Como se usa en el presente documento, "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos, en el que el grupo \alpha-carboxilo de un aminoácido está unido al grupo \alpha-amino de otro aminoácido mediante un enlace peptídico. Una proteína puede comprender uno o múltiples polipéptidos unidos mediante enlaces disulfuro. Ejemplos de proteína incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos, antígenos, ligandos, receptores, etc.

Es un descubrimiento de la presente invención que los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden unir a un soporte sólido sin ninguna modificación. Además, biopolímeros tales como, pero no limitado a, la proteína A, anticuerpos o estreptavidina, se pueden unir a un soporte sólido sin ninguna modificación para los biopolímeros.

Para los propósitos de la presente invención, el soporte sólido puede ser cualquier material capaz de ser modificado para formar funciones fluoruro de acilo sobre al menos una superficie del soporte sólido. Ejemplos de un soporte sólido incluyen, pero no están limitados a, materiales poliméricos, vidrios, cerámicas, fibras naturales, silicios, metales y sus compuestos.

Un soporte sólido se puede fabricar de un material polimérico con al menos una superficie con funciones fluoruro de acilo pendientes como en la patente WO 97/46597.

Resumiendo, los materiales poliméricos adecuados para la fabricación de soportes sólidos pueden ser de cualquier material capaz de ser modificadas para formar funciones fluoruro de acilo sobre al menos una superficie del soporte sólido. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar materiales poliméricos con funciones carboxilo pendientes o materiales poliméricos capaces de ser modificados para soportar grupos carboxilo con reactivos adecuados para formar funciones fluoruro de acilo. En una forma de realización de la presente invención, se fabrican soportes sólidos de copolímeros de etileno-ácido acrílico, copolímeros de etileno-ácido metacrílico, o polipropileno derivado. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los materiales poliméricos capaces de ser modificados para soportar grupos carboxilo, que a su vez se pueden modificar para proporcionar funciones fluoruro de acilo superficiales, incluyen una amplia variedad de materiales, por ejemplo, el polipropileno aminado hecho reaccionar con un anhídrido cíclico, por ejemplo, anhídrido succínico, es particularmente útil para proporcionar grupos carboxilo adecuados para convertirlos a fluoruro de acilo.

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Materiales poliméricos adecuados adicionales incluyen metacrilato o acrilato de metilo saponificados para exponer un grupo carboxilo pendiente:

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Incluso otros materiales poliméricos fácilmente modificados para proporcionar un grupo carboxilo reactivo son poliacrilonitrilo hidrolizado o polimetacrilonitrilo hidrolizado:

2

Los reactivos adecuados para formar funciones fluoruro de acilo sobre al menos una superficie del soporte sólido incluyen ampliamente reactivos fluorantes reactivos a carboxilo. Un reactivo más preferido es el trifluoruro (DAST) (dietilaminoazufre) que reacciona con grupos carboxilo pendientes en la siguiente reacción:

3

Otros reactivos incluyen fluoruro cianúrico:

4

y hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformadinio:

5

En una forma de realización más preferida del soporte sólido, copolímeros de etileno-ácido acrílico o copolímeros de etileno-ácido metacrílico formados en láminas con un grosor de 0,5 mm aproximadamente se modifican sobre al menos una superficie exponiendo la superficie a una disolución al 5% aproximadamente de DAST durante un período de varias horas. Después de detener la reacción, usando lavados de diclorometano y acetonitrilo, la película está lista para uso en la inmovilización o síntesis de biopolímeros TAL como se describe a continuación. De manera ventajosa, se ha descubierto que los materiales poliméricos activados con fluoruro de acilo son sorprendentemente estables en condiciones ambientales y, cuando se almacenan en un entorno frío y seco tienen una estabilidad de almacenamiento ilimitada.

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Los soportes sólidos también se pueden preparar mediante procedimientos que comprenden las etapas de suministro de un soporte sólido fabricado de copolímero de etileno-ácido acrílico o copolímero de etileno-ácido metacrílico y la modificación de al menos una superficie del soporte sólido haciendo reaccionar la superficie con un agente activante. Los agentes activantes adecuados son reactivos capaces de reaccionar con el grupo carboxilo acrílico o metacrílico para formar grupos funcionales pendiente reactivos, por ejemplo, funciones acilo activas.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, también se puede preparar un soporte sólido mediante el recubrimiento de un soporte sólido inerte con un material polimérico que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes. Por ejemplo, grupos carboxilo del ácido poliglutámico se pueden convertir en fluoruro de acilo mediante un agente fluorante adecuado, tal como DAST. El material polimérico convertido se puede usar para recubrir una placa de microtitulación u otros soportes sólidos.

Debido a que el soporte sólido es particularmente útil en la preparación de biochips de biopolímeros para la evaluación o identificación de actividad biológica, el soporte sólido preferentemente está en forma de dispositivo con al menos una superficie plana. El tamaño del soporte sólido puede variar y depende del uso final de los biopolímeros inmovilizados. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los biochips de biopolímeros inmovilizados sobre soportes sólidos miniaturizados han estado en desarrollo durante muchos años. Estos soportes sólidos se pueden medir en unidades de mm^{2} y pueden tener numerosos biopolímeros inmovilizados diferentes, cada uno con diferentes biopolímeros unidos en una localización específica de sitio diferente sobre el soporte sólido miniaturizado. Los soportes sólidos en forma de sondas de nivel también están dentro del alcance de la presente invención. Como es sabido en la técnica, las sondas de nivel normalmente tienen forma rectangular con cada lado que mide unos pocos centímetros. Por otra parte, biopolímeros grandes tales como los biochips de polinucleótidos, utilizados para secuenciar genomas completos, pueden tener dimensiones que miden un metro o más.

Con el fin de acomodar una serie de técnicas de prueba diferentes, incluyendo equipos de prueba especializados, los soportes sólidos adecuados también se pueden moldear en cualquiera de una variedad de formas. Por ejemplo, puede ser ventajoso moldear el receptáculo de un biochip de biopolímero del mismo material polimérico utilizado para fabricar el soporte sólido. En ese sistema el receptáculo es el soporte sólido y puede tener cualquier forma, incluyendo una que se pueda manejar fácilmente mediante un sistema diagnóstico automatizado en el que los brazos robóticos mueven los biochips de biopolímero entre estaciones de reacción y estaciones de detección. Preferentemente, cuando ese receptáculo es un soporte sólido, incorpora una superficie plana o continua adecuada para unir biopolímeros.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, un soporte sólido puede estar fabricado de un material poroso o no poroso. De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, un soporte sólido puede estar en forma de hilos, láminas, películas, geles, membranas, cuentas, placas o estructuras similares. De acuerdo con una forma de realización adicional, un soporte sólido puede estar fabricado de plástico en forma de dispositivo plano con áreas aisladas discretas en forma de pocillos, cubetas, pedestales, parches hidrófobos o hidrófilos, depósitos adhesivos troquelados o troqueles de juntas laminadas que forman pocillos u otras barreras físicas para el fluido. Ejemplos de ese soporte sólido incluyen, pero no están limitados a, una microplaca o similar.

Los biopolímeros de ácidos nucleicos se unen a un soporte sólido poniendo en contacto los biopolímeros sin modificar con el soporte sólido en condiciones suficientes para permitir la unión de los biopolímeros al soporte sólido. Unas condiciones son suficientes si permiten que los biopolímeros sin modificar reaccionen con el fluoruro de acilo en un soporte sólido para unir covalentemente los biopolímeros al soporte sólido. Aunque no se quiere estar limitado por la teoría, se cree que los biopolímeros sin modificar se pueden unir a un soporte sólido por desplazamiento del grupo fluoruro contenido en el soporte sólido con un nucleófilo de un biopolímero.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, la etapa de puesta en contacto de la superficie del soporte sólido activada con fluoruro de acilo en condiciones que provocan que los polinucleótidos sin modificar reaccionen con fluoruro de acilo se consigue exponiendo la superficie del soporte sólido a polinucleótidos sin modificar en presencia de un tampón acuoso, preferentemente con un pH neutro o básico. Poniendo en contacto las funciones fluoruro de acilo con los polinucleótidos sin modificar en condiciones de pH neutro o básico da como resultado la unión de los polinucleótidos directamente a la superficie del soporte sólido. Para los propósitos de la presente invención, condiciones de pH básico son condiciones que tienen un pH superior a 8. Unas condiciones de pH básico son suficientes si permiten la unión de los polinucleótidos al soporte sólido. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, las condiciones de pH básico de la presente invención tienen un pH de 9 a 12 aproximadamente. Se debe entender que las condiciones de pH básico pueden variar, dependiendo del método usado. Alguien experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de pH básico de una reacción de unión particular en vista de la descripción de la presente invención.

Un soporte sólido se puede poner en contacto con biopolímeros sin modificar mediante procedimientos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la etapa de puesta en contacto se puede llevar a cabo mediante impresión por inyección a chorro de tinta, impresión por contacto con un dispositivo capilar sólido o abierto, impresión por canal microfluido, impresión serigráfica, y una técnica que usa dispositivos de impresión basados en fuerzas electroquímicas o electromagnéticas. Alternativamente, la etapa de puesta en contacto se puede llevar a cabo mediante fijación de los biopolímeros sin modificar al soporte sólido.

Por ejemplo, en una forma de realización el soporte sólido se expone a polinucleótidos sin modificar mediante fijación manual. Los ejemplos de fijación manual incluyen, pero no están limitados a, fijación manual con una pipeta o con una herramienta de puntas de pipeta de Biomek. En este caso, la base acuosa preferida puede ser bicarbonato-carbonato de sodio con un pH en el intervalo de 9 a 10. En otra forma de realización, el soporte sólido se expone a polinucleótidos sin modificar mediante técnicas de impresión por inyección a chorro de tinta. Se pueden utilizar técnicas de impresión por inyección a chorro de tinta térmica que utilizan impresoras de inyección a chorro disponibles comercialmente y técnicas de impresión por microinyección piezoeléctrica tal como se describe en la patente US Nº 4.877.745 para fijar polinucleótidos sin modificar a soportes sólidos. En este caso, la base acuosa puede ser una disolución salina de LiCl con un pH de 10 a 12 aproximadamente.

Se debe entender que el soporte sólido se puede exponer a los biopolímeros mediante cualquier procedimiento siempre que los biopolímeros entren en contacto con el soporte sólido. También se debe entender que otros sistemas tamponantes acuosos que no se describen específicamente en el presente documento se pueden utilizar también en la presente invención siempre que el sistema tamponante proporcione unas condiciones suficientes que permitan la unión de los biopolímeros al soporte sólido una vez que entren en contacto entre sí.

De acuerdo con formas de realización de la presente invención, puede variar la concentración de ácidos nucleicos sin modificar contenidos en disoluciones acuosas, dependiendo del tipo de molécula, el tamaño de la molécula, la estructura de la molécula y otros factores que pueden influir en la solubilidad de las moléculas. Por ejemplo, cuando los polímeros unidos son polinucleótidos, preferentemente están en el intervalo de 5 nM a 40: M. Más preferentemente, se encuentran en el intervalo de 5 nM a 5: M.

Es preferible, después de la unión de los biopolímeros a soportes sólidos, "bloquear" las funciones fluoruro de acilo sin reaccionar para evitar reacciones no deseadas. Los grupos fluoruro de acilo residuales contenidos en el soporte sólido se pueden bloquear con cualquier producto químico que pueda inactivar los grupos reactivos superficiales restantes. Por ejemplo, las funciones fluoruro de acilo se pueden hacer reaccionar con hidróxido de amonio para formar carboxiamida o con etanol para formar ésteres. No obstante, aquellos expertos en la técnica apreciarán que son posibles una gran cantidad de reacciones de bloqueo.

Como se ha mencionado anteriormente, muchas aplicaciones que usan biopolímeros inmovilizados requieren que los biopolímeros se inmovilicen en localizaciones específicas de sitio sobre una superficie de un soporte sólido. Para preparar biochips de biopolímeros ordenados, incluyendo gradillas y biochips 1 x n de biopolímeros inmovilizados con cada biopolímero localizado en localizaciones específicas de sitio, un sitio preseleccionado sobre la superficie del material polimérico activado se expone a una disolución de los biopolímeros sin modificar deseados. De acuerdo con la presente invención, esto se puede conseguir manualmente aplicando una cantidad de disolución de biopolímero sin modificar en una localización preseleccionada sobre el soporte sólido. Alternativamente, se pueden utilizar técnicas de impresión por inyección a chorro de tinta térmica que utilizan impresoras de inyección a chorro disponibles comercialmente y técnicas de impresión por microinyección piezoeléctrica tal como se describe en la patente de US Nº 4.877.745 para fijar sitios de la superficie del soporte sólido seleccionados con biopolímeros sin modificar seleccionados.

De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, al menos 1 a 1536 biopolímeros sin modificar diferentes aproximadamente se pueden unir a al menos 1 a 1536 áreas aisladas discretas aproximadamente en un soporte sólido.

La unión de biopolímeros sin modificar a soportes sólidos activados con fluoruro de acilo es muy adecuada para uso en la construcción de genosensores y otros sistemas basados en biochips tales como biochips de expresión génica diferencial. Un soporte sólido con biopolímeros sin modificar unidos de la presente invención también se puede usar como dispositivo para llevar a cabo un ensayo de unión de ligando o para llevar a cabo un ensayo de hibridación por hibridación inversa (sondas unidas) o transferencia Southern (diana unida). Ese dispositivo también se puede usar en un inmunoensayo.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para analizar un ácido nucleico diana en una muestra como se define en la reivindicación 26.

Para los propósitos de la presente invención, tanto el biopolímero diana como el agente para el biopolímero diana pueden estar unidos a un soporte sólido de la presente invención. Por ejemplo, en una transferencia Southern o en una transferencia Northern, los biopolímeros diana primero se unen a un soporte sólido. Se usan sondas, preferentemente marcadas, para poner en contacto el soporte sólido para detectar la existencia de biopolímeros diana. Por el contrario, en los ensayos de unión de ligando o en los ensayos de purificación por afinidad, las sondas preferentemente se unen primero a un soporte sólido.

Para los propósitos de la presente invención, un agente de la presente invención comprende un ácido nucleico que puede reconocer el biopolímero diana y se puede hibridar al biopolímero diana.

De acuerdo con formas de realización de la presente invención, tanto los biopolímeros diana como los agentes se pueden marcar con una molécula indicadora. Los ejemplos de moléculas indicadoras incluyen, pero no están limitados a, colorantes, compuestos quimioluminiscentes, enzimas, compuestos fluorescentes, complejos metálicos, partículas magnéticas, biotina, haptenos, transmisores de radiofrecuencia, y compuestos radioluminiscentes. Alguien experto en la técnica puede determinar fácilmente el tipo de molécula informadora a usar una vez que se determine el tipo de biopolímeros diana.

Otro aspecto de la presente invención también proporciona un dispositivo para llevar a cabo ensayos de hibridación, inmunoensayos u otros ensayos. Un dispositivo de la presente invención comprende una pluralidad de ácidos nucleicos sin modificar y un soporte sólido. El soporte sólido tiene al menos una superficie que comprende funciones fluoruro de acilo pendientes, y el biopolímero está unido al soporte sólido mediante reacción con las funciones fluoruro de acilo pendientes.

Para los propósitos de la presente invención, los biopolímeros unidos pueden ser iguales o diferentes. Si los biopolímeros son diferentes, preferentemente están localizados en áreas aisladas discretas del soporte sólido para formar biochips. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser una microplaca. Biopolímeros diferentes pueden estar unidos a pocillos diferentes de la microplaca para formar biochips. De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, al menos 1 a 1536 biopolímeros sin modificar, tales como sondas, se pueden unir a al menos 1 a 1536 pocillos de una microplaca.

El soporte sólido del dispositivo, tal como una microplaca, puede ser una superficie tratada con funciones fluoruro de acilo, y a continuación se pueden unir biopolímeros al soporte sólido mediante la reacción con las funciones fluoruro de acilo pendientes. Alternativamente, los biopolímeros se pueden impresionar sobre la superficie de un disco de plástico que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes, y a continuación el disco se inserta en el fondo del pocillo de la microplaca.

Los siguientes ejemplos 1-4 están pensados para ilustrar, pero no limitar, el alcance de la invención. Aunque esos ejemplos son típicos de los que se podrían usar, alternativamente se pueden utilizar otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. De hecho, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica pueden imaginar y producir fácilmente formas de realización adicionales, basadas en las enseñanzas del presente documento, sin experimentación innecesaria.

Ejemplo 1

Hibridación del ADNc a biochips impresos de polinucleótidos sin modificar Impresión de biochips de cebador

Se prepararon cebadores de oligonucleótidos sin modificar usados para la amplificación de actina, G3PDH, p53 y TNF-\alpha por dilución en LiCl saturado, disolución madre a pH 12 a LiCl saturado:agua (60:25 v/v) aproximadamente. La tinta para impresión resultante tenía una concentración final de oligonucleótidos 10 \muM. Usando un sistema dispensador de BioDot, los cebadores se depositaron por inyección a chorro de 12,5 nl de cada tinta sobre una pieza moldeada (Biotip) de copolímero de etileno-ácido metacrílico activado con fluoruro de acilo (EMA) para formar un biochip. El biochip de 9 x 8 consta de 9 puntos replicados para cada par de cebadores 3' y 5' para los 4 genes (9 x 2 x 4 = 72 puntos). Después de la impresión, los biochips se secaron durante toda la noche a vacío y los grupos reactivos superficiales restantes se inactivaron (bloquearon) durante 2 horas en etanol. Los biochips se enjuagaron brevemente con agua en la preparación para su uso en la hibridación.

Impresión de los biochips de las sondas de ADNc

De una forma similar, sondas de ADN de doble cadena se imprimieron sobre sustratos activados con fluoruro de acilo. El ADNc se amplificó por PCR de la 1ª cadena de ADN sin la incorporación del marcador biotina. Los productos de la PCR del ADNc (amplicones de ADNc) se purificaron usando columnas de filtración en gel por centrifugación (Xtreme, Pierce Chemical) para retirar los cebadores, dNTPs, junto con cofactores y la enzima Taq. Los amplicones se eluyeron de las columnas con agua desionizada y se prepararon para la impresión por dilución en LiCl 1 M, pH 12, para dar una tinta de LiCl:agua (1:1 v/v) a una concentración de ADNc final de 5 nM. Se usó el mismo procedimiento de fijación que se ha descrito para la impresión del cebador, excepto que en este caso el biochip consta de nueve réplicas de seis genes (9 x 6 = 54): ADNc de actina, ADNc de \beta-microglobulina, ADNc de G3PDH, ADNc de p53, ADNc de transferrina y ADNc de TNF-\alpha. El tamaño de gota dispensado fue de 16 nl aproximadamente.

Hibridación

Biotips con biochips de ADNc unidos se desnaturalizaron durante 15 minutos en 200 \mul de desnaturalizante (NaCl 0,15 M, NaOH 0,5 M), a continuación se enjuagaron en tampón de astringencia (2X SSC, SDS al 0,01%, pH 7,0) justo antes de la hibridación. En el caso de los Biotips de biochips de cebador, no se usó etapa de desnaturalización. Los productos de la PCR marcados con biotina de actina, G3PDH, p53 y TNF-\alpha procedentes de una primera cadena de una dotación de ADNc (hígado) se prepararon para la hibridación a los biochips de cebador o a los biochips de ADNc de la forma siguiente: 10 \mul de disolución de PCR se diluyeron con 10 \mul de agua y se añadieron 50 \mul de desnaturalizante. La disolución se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de la adición de 150 \mul de tampón de neutralización (Tris 0,3 M, pH 7,5, 2,4X SSC, SDS al 0,02%). Después de mezclar, la disolución se puso en los pocillos de una placa de cultivo de células de polipropileno de 24 pocillos y se sumergió el Biotip. Se dejó que la hibridación transcurriese durante 60 minutos a 25ºC para los biochips de ADNc o a 60ºC durante 60 minutos para los biochips de cebador con agitación en una cámara humidificada. A continuación los Biotips se retiraron de la disolución de hibridación y se pusieron en otro pocillo que contiene 2X SSC, SDS al 0,01% para un enjuagado de astringencia (a la misma temperatura usada para la hibridación) durante 10 minutos. Tras un enjuague final en el tampón de astringencia anterior, el Biotip se transfirió para retirar la disolución en exceso y se puso en conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar exhaustivamente en tampón de astringencia, el Biotip se transfirió de nuevo, y a continuación se puso en reactivo ELF (sustrato fluorescente para la fosfatasa alcalina, Molecular Probes, Inc.) para revelar la señal. La señal se dejó revelando durante 30 minutos. Después de un breve enjuagado en agua, la señal del biochip se leyó usando un sistema de cámara CCD.

Resultados

Como se muestra en la Figura 1a, el ADNc diana marcado de actina y G3PDH se hibrida específicamente a sus correspondientes cebadores de fase sólida, mientras que el ADNc de p53 presenta hibridación cruzada con los cebadores de G3PDH. El TNF-\alpha también presenta hibridación cruzada con los cebadores 3' de la actina y de la p53. Estos resultados son similares a aquellos que usan dianas de ADNc marcadas hibridadas a ADNc sonda inmovilizado mediante el mismo proceso (Figura 1b).

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Ejemplo 2

Hibridación de dianas de ADNc a biochips fijados manualmente de pares de cebadores de oligonucleótidos sin modificar Fijación manual de biochips de cebadores

Se prepararon cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de los genes de actina, p53 y TNF-\alpha a las siguientes concentraciones para la fijación en tampón de bicarbonato sódico 0,5 M, pH 9:

Cebador: \muM (concentración final)

Actina 3': 5,01

Actina 5': 5,00

p53 3': 3,73

p53 5': 3,83

TNF 3': 3,80

TNF 5': 3,70

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Se puso una gota de aproximadamente 1 \mul de cada uno de estos sobre un soporte de plástico activado con fluoruro de acilo (EMA) usando una pipeta manual que crea un biochip similar al diseño mostrado a continuación en la
Figura 2.

Después de la fijación, los biochips se incubaron a 25ºC durante 1 hora en una cámara humidificada. A continuación se retiraron de la cámara y se dejaron secar al aire durante 25 minutos a temperatura ambiente, seguido por el secado adicional a 30ºC durante 10 minutos. A continuación los soportes de plástico se sumergieron el etanol durante 60 minutos para bloquear los grupos superficiales reactivos residuales, seguido de una inmersión final de 10 minutos en agua desionizada.

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Hibridación

Los productos de la PCR marcados con biotina de actina, p53 y TNF-\alpha procedentes de una primera cadena de una dotación de ADNc (hígado) se prepararon para la hibridación se prepararon para la hibridación a los biochips de cebador de la forma siguiente: 10 \mul de disolución de PCR se diluyeron con 10 \mul de agua y se añadieron 30 \mul de desnaturalizante. La disolución se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de la adición de 150 \mul de tampón de neutralización. Después de mezclar, la disolución se puso en un pocillo de una placa de cultivo de células de polipropileno de 24 pocillos y se sumergió el Biotip. Se dejó que la hibridación transcurriese durante 60 minutos a 60ºC con agitación en una cámara humidificada. A continuación el Biotip se retiró de la disolución de hibridación y se puso en otro pocillo conteniendo 2X SSC, SDS al 0,01% para un enjuagado de astringencia a 60ºC durante 10 minutos. Tras un enjuague final en el tampón de astringencia anterior, el Biotip se transfirió para retirar la disolución en exceso y se puso en conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar exhaustivamente en tampón de astringencia, el Biotip se transfirió de nuevo, y a continuación se puso en reactivo ELF para revelar la señal. La señal se dejó revelando durante 30 minutos. Después de un breve enjuagado en agua, la señal del biochip se leyó usando un sistema de cámara CCD.

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Resultados

La Figura 3 muestra los resultados de la hibridación. Las dianas de ADNc marcadas con biotina se hibridan específicamente a sus sondas de cebador inmovilizadas complementarias. Las dianas de actina y p53 presentan poca hibridación cruzada a sondas de cebadores no complementarias unidas a la superficie. No obstante, la diana de TNF presenta una hibridación cruzada significativa, especialmente a los cebadores 3'.

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Ejemplo 3

Hibridación de dianas de oligonucleótidos marcadas con biotina a cebadores impresos de sondas de oligonucleótidos modificados con grupos amino (referencia) y sin modificar Impresión de biochips de sondas Fib

Se prepararon sondas de oligonucleótidos modificadas en 5'-amino (Fib-a) y sin modificar (Fib) por dilución en LiCl saturado, pH 12, para dar una tinta de impresión LiCl saturado:agua (60:25 v/v) a concentraciones finales de 10 \muM a 40 \muM para Fib; y 10 \muM para Fib-a. Usando un sistema dispensador de BloDot, nueve puntos replicados de cada disolución sonda se depositaron mediante inyección por chorro de tinta 16 nl de cada tinta sobre una pieza moldeada (Biotip) de EMA activado con fluoruro de acilo para formar un biochip. Después de la impresión, los biochips se secaron durante toda la noche a vacío y los grupos reactivos superficiales restantes se inactivaron (bloquearon) durante dos horas en etanol. Los biochips se enjuagaron brevemente con agua en la preparación para su uso en la hibridación.

Sonda Fib:	5'-CGGCTGGACACGCTTCTGTAG-3'

Sonda Fib-a:	5'-NH2-CGGCTGGACACGCTTCTGTAG-3'

Diana Fib:	5'-Biotina-CTACAGAAGCGTGTCCAGCCG-3'

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Hibridación

Se preparó diana Fib (100 nM, concentración final) mezclando 20 \mul de una disolución madre 1 \muM con 30 \mul de desnaturalizante. La diana se mantuvo en condiciones desnaturalizantes durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de la adición de 150 \mul de tampón de neutralización. El Biotip se sumergió en la disolución mantenido en un pocillo de una placa de microtitulación de polipropileno de 24 pocillos que a su vez se puso en una cámara humidificada durante 60 minutos a 25ºC. Después de enjuagar durante 10 minutos en tampón de astringencia 2X SSC, SDS al 0,01%, pH 7,0, el Biotip se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en una disolución de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina preparada en tampón de astringencia. El Biotip se enjuagó 2 veces con tampón de astringencia para retirar el conjugado sin unir, y continuación se sumergió en reactivo ELF para revelar la señal durante 30 minutos. Después de un breve enjuague en agua, la señal del biochip Biotip se leyó usando un sistema de cámara CCD.

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Resultados

La Figura 4 muestra que el oligonucleótido diana Fib biotinilado se hibrida a las sondas complementarias del biochip tanto modificadas en el grupo amino como sin modificar.

El análisis de la imagen de las intensidades de la señal media para cada punto de la sonda dentro del biochip se realizó para tres biochips Biotip separados. La Figura 5 muestra que las hibridaciones de la sonda modificada en el grupo amino y de la sonda sin modificar fueron aproximadamente del mismo nivel cuando se considera el intervalo de valores estimados de la desviación estándar.

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Ejemplo 4

Preparación y características de ADNc en biochips sobre películas de polipropileno activadas con fluoruro de acilo Activación de las películas de polipropileno

Se aminó la superficie de una película de polipropileno mediante plasma por radiofrecuencia (patente US Nº 5.554.501) y las funciones amina se convirtieron en grupos carboxilo por reacción con anhídrido succínico. La activación del fluoruro de acilo se consiguió usando el reactivo DAST como se ha descrito previamente en la solicitud de patente US pendiente de tramitación número de serie 08/797.222. La película de polipropileno activada con fluoruro de acilo se almacenó en seco con argón a -20ºC hasta que se necesitó.

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Impresión de los biochips de ADNc

ADNc sin modificar de la amplificación por PCR de la primera cadena de ADNc (tumor hepático) se purificó mediante columna de filtración en gel por centrifugación (Xtreme, Pierce Chemical) para retirar los cebadores, dNTPs, los cofactores y la enzima Taq. El ADNc purificado se eluyó de las columnas con agua, y a continuación se diluyó en tampón bicarbonato sódico 0,5 M a pH 9 para el acoplamiento. Se usó un sistema robótico Biomek 2000^{TM} equipado con un sistema HDRT de 384-pin para impresionar las disoluciones de ADNc sobre el sustrato. También se impresionó un grupo de marcadores BAPA, 5-(biotinamido)pentilamina (Pierce Chemical), en ambos extremos de la película, flanqueando así los ADNc unidos. La BAPA, que une el conjugado de estreptavidina-enzima independientemente de la hibridación, sirve como control interno para la robustez del ensayo. Después de la impresión, las películas se secaron a 35ºC durante 15 minutos y a continuación se sumergieron en etanol durante dos horas para bloquear los grupos reactivos superficiales residuales. Las películas se enjuagaron brevemente en agua desionizada y se dejaron secar al aire. La película de 8 cm x 12 cm se seccionó en 12 piezas con cada tira que contiene dos copias de un replicado 3 x 3 de cada ADNc junto con seis copias de replicados 3 x 3 del marcador BAPA. Las tiras de la película del biochip de ADNc resultantes se almacenaron en seco a -20ºC o a temperatura ambiente antes de la hibridación.

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Hibridación

Para la hibridación, cada tira de la película se desnaturalizó durante 15 minutos en 150 \mul de desnaturalizante dispensado sobre un portaobjetos de vidrio de microscopio. Después de la etapa de desnaturalización, las tiras de la película se retiraron del portaobjetos y se enjuagaron brevemente en tampón de astringencia para eliminar el desnaturalizante residual. Se preparó una mezcla de productos de la PCR marcados con biotina de actina, G3PDH y TNF-\alpha procedentes de una primera cadena de una dotación de ADNc (tumor hepático) para su hibridación en un tubo de polipropileno de 15 ml de la manera siguiente: se mezclaron 15 \mul de cada disolución de ADNc y a continuación se diluyeron con 180 \mul de agua. Se añadieron 337,5 \mul de desnaturalizante. Se dejó que la desnaturalización transcurriese durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 1687,5 \mul de tampón de neutralización al tubo. Una alícuota de 150 \mul se transfirió sobre portaobjetos de vidrio de microscopio y a continuación los biochips de la película se pusieron sobre la disolución con la parte del ADN hacia abajo. Se dejó que la hibridación transcurriese durante 60 minutos a 60ºC con agitación en una cámara humidificada. A continuación las tiras de la película se retiraron de la disolución de hibridación, se transfirieron a tubos de cultivo de polipropileno con tapón de rosca de 50 ml y las películas primero se enjuagaron brevemente, y a continuación se sumergieron en 40 ml de tampón 2X SSC, SDS al 0,01% precalentado a 60ºC para un enjuague de astringencia a 60ºC durante 10 minutos. Tras un enjuague final en el tampón de astringencia anterior, las películas se transfirieron para retirar la disolución en exceso y se pusieron sobre portaobjetos de vidrio de microscopio que contienen una disolución de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar exhaustivamente en tampón de astringencia, las películas se transfirieron de nuevo, y a continuación se pusieron en reactivo ELF para revelar la señal. La señal se dejó revelando durante 30 minutos. Después de un breve enjuagado en agua, la señal del biochip se leyó usando un sistema de cámara CCD.

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Resultados

Un biochip de ADNc y marcadores BAPA se imprimieron con éxito sobre películas de polipropileno activadas con fluoruro de acilo como se determina por hibridación de una mezcla de los ADNc correspondientes (Figura 6). La Figura 6 muestra las impresiones HDRT de Biomek de ADNc y marcadores BAPA sobre películas de polipropileno activadas con fluoruro de acilo (hibridación el día 7 para 3 tiras de película separadas). El almacenamiento de los biochips de la película, a temperatura ambiente o a -20ºC, no afectó negativamente a la hibridación durante un período aproximado de tres meses (Figura 7). La Figura 7 muestra la estabilidad de biochips de ADNc basados en polipropileno. Las intensidades de la señal se normalizaron a las intensidades del marcador BAPA para tener en cuenta las diferencias en las condiciones de ensayo durante el periodo prolongado. Todas las sondas de ADNc mantuvieron la eficacia de hibridación a cualquier temperatura de almacenamiento. La señal del TNF fue consistentemente inferior que las señales del marcador BAPA, mientras que las señales de hibridación del ADNc restante permanecieron aproximadamente a la misma intensidad que los marcadores BAPA.

Ejemplo 5

Inmovilizaciones de proteína Proteínas, tampones y otros reactivos

1.: Fosfatasa alcalina biotinilada: Pierce Immunopure® (lote 95120774)

2.: IgG de conejo anti-cabra (H+L): Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif. (lote 2112098)

3.: IgG de cabra anti-biotina: Sigma Chemical Co. (lote 116H8842), anticuerpo aislado por afinidad, reconstituido a 1 mg/ml en PBS.

4.: Proteína A: Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif. (lote 21212416); reconstituida 5 mg en 2 ml de agua desionizada (2,5 mg/ml).

5.: Estreptavidina (de, S. avidinii): Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif. (lote 70536128); reconstituida 5 mg en 1 ml de agua desionizada (5 mg/ml).

6.: Caseína: Hammersten (lote BDH44020)

7.: Tampón de acoplamiento: carbonato sódico 1 M, pH 9 ó 10 diluido a 0,8 M con una disolución de proteína

8.: Reactivo ELF® (kit de detección de fosfatasa endógena ELF®-97): Molecular Probes, Eugene, Oreg. (lote 6771)

9.: Tampón con elevado contenido salino: Tris 1,0 M, NaCl 1,5 M, pH 7,5 (tampón de neutralización de Digene); Digene Diagnostics, Beltsville, Md. (lote 0094MX95)

10.: Tampón de inactivación/bloqueo: caseína 1 mg/ml, carbonato 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,5

11.: TBS: Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5

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Procedimientos Inmovilización de proteínas sobre Biotips

Se diluyeron las proteínas (proteína A, estreptavidina, IgG de conejo anti-cabra) en tampón carbonato 1 M, pH 9 ó 10, a una concentración de 0,5-1,0 mg/ml. La disolución de proteína se aplicó a la superficie de los Biotips de plástico activados con fluoruro de acilo en gotas de 0,5 \mul. Las puntas se incubaron en una cámara con una humedad elevada a 25ºC durante 1 h. A continuación se extrajeron de la cámara y se dejaron secar completamente al aire (\sim15 minutos) antes de colocarlas en la disolución de inactivación/bloqueo. Las puntas se inactivaron poniéndolas en una disolución de 1,0 ml en una placa de 24 pocillos y se pasaron vigorosamente por el vortex durante un mínimo de 30 minutos. Después de inactivarlas, las puntas se enjuagaron con agua desionizada durante 10 minutos con agitación y se secaron al aire.

Detección de la fosfatasa alcalina con el reactivo ELF

Para cada punta, se prepararon 50 \mul de reactivo ELF según el procedimiento de Molecular Probes (es decir, 19 partes de Reactivo B más 1 parte de Reactivo A) y se aplicó a la superficie de las puntas. Las puntas con el reactivo ELF se incubaron durante 30 minutos en una caja parcialmente llena de agua para mantener la humedad. Después de eso, las puntas se enjuagaron tres veces con agua desionizada. Las puntas se fotografiaron bajo luz UV a una excitación de 365 nm con un filtro de lente de 520 nm. Normalmente el tiempo de exposición para la cámara CCD fue de 10 segundos.

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Resultados experimentales Inmovilización de proteína A sobre Biotips

Revelado y detección de la señal:

Se incubó IgG de conejo anti-cabra, 1:100 en TBS durante 1 h, seguido por IgG de cabra anti-biotina en TBS durante 1 h, y a continuación el conjugado de biotina-AP en 2X SSC, SDS al 0,01% durante 1 h. La imagen se reveló con ELF. Se demostró que la proteína A inmovilizada es funcional en la captura del anticuerpo de conejo en el inmunoensayo de sándwich anterior.

Inmovilización de estreptavidina sobre Biotips

Se preparó a 1 mg/ml en carbonato 0,8 M, pH 9. Se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se inactivó durante 45 minutos en un Vortexer con diferentes agentes de bloqueo (a 1 mg/ml).

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Revelado y detección de la señal:

Se incubó fosfatasa alcalina biotinilada diluida 1:100 en tampón 2X SSC, SDS al 0,01% durante 1 h. Se incubó con el reactivo ELF durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se demostró que la estreptavidina inmovilizada es funcional para la captura específica de una enzima biotinilada en una variedad de condiciones de bloqueo dirigida a reducir la unión no específica (Figura 9).

Inmovilización de anticuerpo sobre Biotips

IgG de cabra anti-biotina inmovilizada sobre Biotips de la manera siguiente:

1.: 1,0 mg/ml en PBS, pH 7,2 incubado durante 30 min

2.: 1,0 mg/ml en PBS, pH 7,2 incubado durante 60 min

3.: 0,5 mg/ml en carbonato 0,8 M, pH 10 incubado durante 30 min

4.: 0,5 mg/ml en carbonato 0,8 M, pH 10 incubado durante 60 min

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Revelado y detección de la señal:

Incubación con el conjugado fosfatasa alcalina-biotina diluido 1:100 en un tampón con un elevado contenido salino durante el mismo tiempo que la incubación del anticuerpo. Revelado con el reactivo ELF durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo, IgG de cabra anti-biotina, se inmovilizó con éxito a pH 7,2 y pH 10, como se demuestra por la captura específica de la enzima informadora marcada con biotina (fosfatasa alcalina) (Figura 10).

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Documentos indicados en la descripción

En la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.

Documentos de patente indicados en la descripción

\bullet WO 9746597 A [0021]: \bullet US 5554501 A [0064]

\bullet US 4877745 A [0036] [0040]

Literatura de las patentes no citadas en la descripción

\bulletLUND et al. Nucleic Acid Res., 1988, vol. 16, 164,10861-80[0004]

\bulletBISCHOFFET. Analyt. Biochem., 1987,vol. 33-344 [0004]

Claims

1. Un procedimiento de unión de ácidos nucleicos sin modificar a un soporte sólido que comprende las etapas de:

(a): suministro de ácidos nucleicos sin modificar;

(c): puesta en contacto de los ácidos nucleicos sin modificar con el soporte sólido permitiendo la unión de los ácidos nucleicos al soporte sólido.

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2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que los ácidos nucleicos son polinucleótidos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por oligonucleótidos sintetizados, ADN amplificado, ADNc, ADN de cadena sencilla, ADN de doble cadena, ARN, o ARNm.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la longitud del polinucleótido está en el intervalo de 3 pb a 10 kb aproximadamente.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la longitud del polinucleótido está en el intervalo de 100 pb a 1,5 kb aproximadamente.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la longitud del oligonucleótido está en el intervalo de 3 a 100 nucleótidos aproximadamente.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la longitud del oligonucleótido está en el intervalo de 15 a 20 nucleótidos aproximadamente.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo constituido por materiales poliméricos, vidrios, cerámicas, fibras naturales, silicios, metales y sus compuestos.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido es un material polimérico seleccionado del grupo constituido por ácido etilenacrílico, ácido etilenmetacrílico, PVDF carboxilado, polipropileno carboxilado o polietileno carboxilado, y sus copolímeros.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende adicionalmente una etapa de recubrimiento de un soporte sólido inerte con un material polimérico que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes o capaz de soportar funciones fluoruro de acilo pendientes.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido está constituido de un material poroso o no poroso.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el soporte sólido se encuentra en forma de hilos, láminas, películas, geles, membranas, cuentas, placas y estructuras similares.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el soporte sólido está fabricado de plástico en forma de dispositivo plano con áreas aisladas discretas en forma de pocillos, cubetas, pedestales, parches hidrófobos o hidrófilos, depósitos adhesivos troquelados u otras barreras físicas para el fluido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el soporte sólido es una microplaca.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el plástico es una superficie de polipropileno tratada con funciones fluoruro de acilo.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de puesta en contacto se lleva a cabo mediante una técnica seleccionada del grupo constituido por impresión por inyección a chorro de tinta, impresión por contacto con un dispositivo capilar sólido o abierto, impresión por canal microfluido, impresión serigráfica, y una técnica que utiliza dispositivos de impresión basados en fuerzas electroquímicas o electromagnéticas.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la etapa de puesta en contacto se lleva a cabo mediante fijación de los ácidos nucleicos sin modificar al soporte sólido.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento se lleva a cabo en condiciones de pH básico.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las condiciones de pH básico se mantienen en un medio de impresión a un pH de 8 a 12 aproximadamente.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el medio de impresión contiene una sal.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la sal es LiCl.

22. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el medio de impresión comprende un tampón bicarbonato-carbonato sódico.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que las condiciones de pH básico tienen un pH de 9-12.

24. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que los polinucleótidos están fijados sobre el soporte sólido en unas condiciones de pH de 9-10.

25. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que los polinucleótidos se imprimen por inyección a chorro sobre el soporte sólido en unas condiciones de pH de 10-12.

26. Un procedimiento de análisis de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de:

(c): puesta en contacto del soporte sólido con el agente o el ácido nucleico diana permitiendo la unión entre el soporte sólido y el agente o el ácido nucleico diana sólido, en el que el agente y el ácido nucleico diana están sin modificar;

(d): puesta en contacto del soporte sólido con el agente unido sin modificar con el ácido nucleico diana, o puesta en contacto del soporte sólido con el ácido nucleico diana unido sin modificar con el agente permitiendo la formación de un complejo que comprende el agente y el ácido nucleico diana; y

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27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que en la etapa (c) el agente está unido a la superficie del soporte sólido, y en la etapa (d) el soporte sólido con el agente unido sin modificar está en contacto con el ácido nucleico diana permitiendo la formación de un complejo que comprende el agente y el ácido nucleico diana.

28. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que en la etapa (c) el ácido nucleico diana está unido a la superficie del soporte sólido, y en la etapa (d) el soporte sólido con el ácido nucleico diana unido sin modificar está en contacto con el agente permitiendo la formación de un complejo que comprende el agente y el ácido nucleico
diana.

29. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el ácido nucleico diana es un polinucleótido, y el agente comprende una sonda de polinucleótido que es complementaria del polinucleótido diana.

30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el complejo comprende el polinucleótido y la sonda del polinucleótido, y el complejo se forma por hibridación de la sonda del polinucleótido al polinucleótido diana.

31. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que en la etapa (c) el agente o el ácido nucleico diana está covalentemente unido a la superficie del soporte sólido.

32. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el complejo comprende adicionalmente una molécula informadora seleccionada del grupo constituido por colorantes, compuestos quimioluminiscentes, enzimas, compuestos fluorescentes, complejos metálicos, partículas magnéticas, biotina, haptenos, transmisores de radiofrecuencia, y compuestos radioluminiscentes.

33. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo constituido por materiales poliméricos, vidrios, cerámicas, fibras naturales, silicios, metales y sus compuestos.

34. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el soporte sólido es un material polimérico seleccionado del grupo constituido por ácido etilenacílico, ácido etilenmetacrílico, PVDF carboxilado, polipropileno carboxilado o polietileno carboxilado, y sus copolímeros.

35. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que la etapa (a) comprende adicionalmente una etapa de recubrimiento de un soporte sólido inerte con un material polimérico que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes o capaz de soportar funciones fluoruro de acilo pendientes.

36. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el soporte sólido se encuentra en forma de hilos, láminas, películas, geles, membranas, cuentas, placas y estructuras similares.

37. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el soporte sólido está fabricado de plástico en forma de dispositivo plano con áreas aisladas discretas en forma de pocillos, cubetas, pedestales, parches hidrófobos o hidrófilos, depósitos adhesivos troquelados u otras barreras físicas para el fluido.

38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que el soporte sólido es una microplaca.

39. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que el plástico es una superficie de polipropileno tratado con funciones fluoruro de acilo.

40. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que el agente o el ácido nucleico diana está impreso sobre la superficie de un disco de plástico que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes, y el disco se inserta en el fondo de un pocillo de una microplaca para formar el soporte sólido unido con el agente sin modificar o el ácido nucleico diana sin modificar.

41. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que agentes o ácidos nucleicos diana sin modificar iguales o diferentes están unidos a diferentes áreas aisladas discretas en el dispositivo plano para formar un biochip.

42. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que al menos 1 a 1536 agentes o ácidos nucleicos sin modificar aproximadamente están unidos a al menos 1 a 1536 áreas aisladas discretas aproximadamente en el dispositivo plano.

43. El procedimiento de la reivindicación 42, en el que el dispositivo plano es una microplaca, y las áreas aisladas discretas son pocillos de la microplaca.

44. Un dispositivo que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos sin modificar y un soporte sólido, en el que el soporte sólido tiene al menos una superficie que comprende funciones fluoruro de acilo pendientes, en el que los ácidos nucleicos están unidos al soporte sólido mediante un procedimiento en el que los ácidos nucleicos se hacen reaccionar con el soporte sólido que contiene funciones fluoruro de acilo pendientes.

45. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que los ácidos nucleicos son polinucleótidos.

46. El dispositivo de la reivindicación 45, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por oligonucleótidos sintetizados, ADN amplificado, ADNc, ADN de cadena sencilla, ADN de doble cadena, ARN, o ARNm.

47. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que los ácidos nucleicos pueden ser iguales o diferentes.

48. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo constituido por materiales poliméricos, vidrios, cerámicas, fibras naturales, silicios, metales y sus compuestos.

49. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que el soporte sólido es un material polimérico seleccionado del grupo constituido por ácido etilenacrílico, ácido etilenmetacrílico, PVDF carboxilado, polipropileno carboxilado o polietileno carboxilado, y sus copolímeros.

50. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que el soporte sólido se encuentra en forma de hilos, láminas, películas, geles, membranas, cuentas, placas y estructuras similares.

51. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que el soporte sólido está fabricado de plástico en forma de dispositivo plano con áreas aisladas discretas en forma de pocillos, cubetas, pedestales, parches hidrófobos o hidrófilos, depósitos adhesivos troquelados u otras barreras físicas para el fluido.

52. El dispositivo de la reivindicación 51, en el que el soporte sólido es una microplaca.

53. El dispositivo de la reivindicación 51, en el que el plástico es una superficie tratada con funciones fluoruro de acilo.

54. El dispositivo de la reivindicación 53, en el que el plástico se selecciona del grupo constituido por polipropileno, poliestireno, polisulfona, polietileno y sus copolímeros.

55. El dispositivo de la reivindicación 51, en el que los ácidos nucleicos están unidos a diferentes áreas aisladas discretas para formar un biochip, y en el que los ácidos nucleicos pueden ser iguales o diferentes.

56. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que el dispositivo se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): suministro de una pluralidad de ácidos nucleicos sin modificar;

(c): puesta en contacto de la pluralidad de ácidos nucleicos sin modificar con el soporte sólido permitiendo la unión de cada uno de los ácidos nucleicos al soporte sólido en una localización discreta sobre el soporte sólido.

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57. El dispositivo de la reivindicación 56, en el que el soporte sólido tiene una pluralidad de localizaciones aisladas discretas, y los ácidos nucleicos están unidos al soporte sólido en las respectivas localizaciones aisladas discretas.

58. El dispositivo de la reivindicación 44, en el que los ácidos nucleicos son iguales o diferentes.