ES2832609T3 - Métodos para la amplificación y detección de polinucleótidos a base de helicasas - Google Patents

Abstract

Un metodo para detectar la presencia o ausencia de un polinucleotido diana en una muestra, que comprende: a. proporcionar un soporte solido recubierto que comprende un sustrato de silicio, una capa cationica y una pluralidad de sondas especificas de la diana escindibles unidas al soporte solido recubierto; b. aplicar la muestra al soporte solido recubierto; c. escindir quimicamente las sondas hibridadas y las sondas no hibridadas del soporte solido recubierto y eluir las sondas escindidas para crear un eluyente; d. aplicar el eluyente y un medio de reaccion a un segundo soporte solido recubierto e. someter el eluyente a un proceso de amplificacion isotermica dependiente de helicasa capaz de amplificar un polinucleotido diana e hibridar simultaneamente los polinucleotidos dianas amplificados con las sondas en el segundo soporte solido recubierto y f. detectar la presencia o ausencia de polinucleotidos dianas unidos a las sondas.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la amplificación y detección de polinucleótidos a base de helicasas

Antecedentes

La incidencia de bacterias resistentes a los antibióticos ha aumentado dramáticamente durante la última década. Si no se diagnostican y tratan de manera adecuada, estos patógenos humanos pueden causar una variedad de enfermedades potencialmente mortales que incluyen septicemia y síndrome de choque tóxico. El tratamiento temprano de estas infecciones se ha asociado con mejores resultados en los pacientes. Los resultados de estudios clínicos demuestran que la reducción del tiempo hasta el diagnóstico reduce la duración de la estancia del paciente y la morbilidad y mortalidad, lo que genera ahorros importantes de costos para el hospital. Los métodos microbiológicos estándar en la práctica actual requieren de 24 a 72 horas para identificar el patógeno causante de una infección. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de pruebas rápidas y fáciles de realizar para identificar patógenos resistentes a los antibióticos.

El documento US-A-2003/105320 describe un método de detección de ácidos nucleicos en el que se prepara una placa de microtitulación que contiene sondas de baliza molecular. Se amplifica el ARN de la muestra. La señal provocada por el ARN unido se detecta mediante una señal fluorescente. Las sondas de baliza biotiniladas se unen a placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina que pueden estar hechas de vidrio. Además, se describe la posibilidad de inmovilizar las balizas moleculares sobre un soporte sólido que sea compatible con un proceso de amplificación, por ejemplo, diferentes reacciones de amplificación isotérmica.

Gill y otros, Diagnostic microbiology and infectious diseases, volumen 59 (3), 2007, páginas 243-249 describe una amplificación de ADN isotérmica dependiente de helicasa para la detección de a Dn de ureC de H. pylori. Los amplicones de ADN se detectan mediante un proceso enzimático después de haberse unido a una sonda biotinilada que se inmoviliza en una placa de microtitulación revestida con estreptavidina.

Resumen

La presente invención proporciona métodos, como se define en las reivindicaciones, para amplificar y detectar polinucleótidos dianas en estado de solución en un solo dispositivo. En un aspecto, un método para detectar un polinucleótido diana en una muestra incluye aplicar la muestra y un medio de reacción a un soporte sólido recubierto, compuesto por un sustrato sólido, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. Los polinucleótidos dianas de la muestra se amplifican luego mediante un proceso de amplificación isotérmica dependiente de helicasa. Alternativamente, los polinucleótidos dianas primero se hibridan con las sondas, se eluyen del soporte y luego se amplifican dentro del mismo dispositivo o se aplican a un segundo soporte sólido recubierto para la amplificación mediante un proceso de amplificación isotérmico. El proceso de amplificación se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la amplificación /hibridación acoplada en condiciones de bajo contenido de sal. Adicionalmente, puede incluirse una etapa de hibridación con alto contenido de sal opcional para mejorar la hibridación y aumentar la sensibilidad de detección.

Pueden usarse cebadores biotinilados en la reacción de amplificación para facilitar la detección de polinucleótidos dianas unidos capturados por las sondas sobre el soporte sólido recubierto. A manera de ejemplo, los conjugados de anti-biotina /peroxidasa de rábano picante pueden unirse a los productos de amplificación biotinilados inmovilizados sobre la superficie del soporte sólido recubierto. La conversión catalizada por enzima de un sustrato cromogénico, tal como tetrametilbencidina, puede resultar en la producción de materia precipitable en la superficie del soporte sólido recubierto creando una señal detectada visible a simple vista en condiciones de luz visible.

En otro aspecto de la divulgación, un método para detectar polinucleótidos dianas en una muestra incluye aplicar la muestra y un medio de reacción a un soporte sólido recubierto compuesto de sustrato de silicio, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas a la capa catiónica. Los polinucleótidos dianas de la muestra se amplifican luego mediante un proceso de amplificación isotérmica dependiente de helicasa. El proceso de amplificación se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la amplificación /hibridación acoplada en condiciones de bajo contenido de sal. Adicionalmente, se incluye un paso de hibridación con alto contenido de sal para aumentar la sensibilidad. Mediante el uso de reactivos de detección apropiados, los polinucleótidos dianas capturadas por las sondas pueden detectarse visualmente como se describe a continuación.

La invención se basa en el descubrimiento inesperado de que un soporte sólido configurado catiónicamente que contiene sondas de captura específicas de la diana inmovilizadas puede reducir los efectos negativos del desenrollamiento catalizado por helicasa y la liberación de dúplex unidos a la superficie del soporte sólido recubierto durante un proceso de amplificación /hibridación isotérmica acoplada.

El soporte sólido recubierto incluye un sustrato de silicio y una capa catiónica unida al mismo. El soporte de silicio recubierto no comprende una capa de recubrimiento (tal como una capa antirreflectante) capaz de mediar en la detección visible a simple vista de polinucleótidos dianas por interferencia destructiva. Las sondas específicas de la diana unidas a la capa catiónica se hibridan luego con los polinucleótidos dianas de la muestra, que luego se detectan usando los reactivos de detección apropiados.

Se describe un biosensor de silicio recubierto para la detección visual directa de polinucleótidos dianas depositadas sobre un soporte de silicio recubierto compuesto por un sustrato de silicio, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte de silicio recubierto. El soporte de silicio recubierto puede configurarse para admitir la detección visual de polinucleótidos dianas en la muestra mediante un proceso que no se basa en principios de interferencias destructivas, sino en una combinación de dispersión de luz y colorimetría. En particular, el solicitante ha descubierto inesperadamente un tipo de soporte de silicio que puede facilitar la detección visual rápida de polinucleótidos dianas unidos en condiciones de luz visible sin el uso de una capa antirreflectante que facilite convencionalmente la detección de analitos, incluidos los ácidos nucleicos, basándose en los principios de interferencia destructiva.

La presente invención usa un sistema de amplificación dependiente de helicasa (HDA) /hibridación acoplado, llevado a cabo en condiciones isotérmicas bajas en sal. Las reacciones de amplificación se realizan con los cebadores de amplificación en fase de solución en presencia de la sonda que contiene el soporte de silicio o microchip en condiciones que proporcionan una cinética de reacción de amplificación /hibridación en fase de solución. Los productos de amplificación se desnaturalizan continuamente por la helicasa. A medida que aumenta su(s) concentración(es), los polinucleótidos desnaturalizados pueden hibridar con cebadores de oligonucleótidos, volver a hibridar con cadenas complementarias o hibridar con sondas inmovilizadas en la superficie de un soporte sólido, como un microchip. Al final de la reacción, el soporte o chip puede lavarse y detectarse la presencia del polinucleótido diana. Cuando se usa junto con un soporte a base de silicio o un microchip de acuerdo con la presente invención, el sistema de amplificación /hibridación acoplado es capaz de soportar la detección visual directa de polinucleótidos dianas en condiciones de luz visible.

A partir de una muestra de sangre de 10 mL o un hisopo nasal que contenga tan solo 10 copias de la secuencia diana, pueden amplificarse rápidamente altas concentraciones de material (se producen de 105 a 1010 copias de ADN de acuerdo con el enfoque). De manera ventajosa, todas las etapas de generación de señales pueden realizarse rápidamente en condiciones isotérmicas bajas en sal, generando señales altamente sensibles visibles a simple vista. Dependiendo de la cantidad de polinucleótidos dianas en la muestra, todo el proceso desde la extracción hasta la detección puede completarse en 1 hora, requiriendo solo 10 minutos de tiempo práctico a bajo costo usando un soporte sólido recubierto simple sin instrumentación costosa o sofisticada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la desnaturalización y la hibridación mediada por helicasa de polinucleótidos dianas de simple cadena, de alícuotas de productos amplificados con HDA diluidos 1 /5000 en tampón de hibridación 1X (alto contenido de sal) o tampón de HDA 1X (bajo contenido de sal).

La Figura 2 representa una unión más estable de polinucleótidos dianas amplificados, al soporte sólido recubierto, en condiciones de bajo contenido de salinidad (IsoAmp II 1X) que en condiciones de alta salinidad (Hyb 1X).

La Figura 3 representa tiempos de duplicación representativos (Figura 3A) y tasas de duplicación (Figura 3B) para amplicones de HDA producidos usando conjuntos de cebadores seleccionados (J, L, Q y P) dirigidos al gen mecA específico para la resistencia a la meticilina en Staphylococcus.

La Figura 4 representa un cálculo del tiempo previsto hasta el resultado (TTR) en chips de silicio basado en el límite inferior de detección (LLOD) y los tiempos de duplicación del amplicón.

La Figura 5 representa un análisis de respuesta a la dosis para calcular el límite inferior de detección (LLOD) del ADN de MRSA amplificado por HDA e hibridado con chips recubiertos de silicio.

La Figura 6 representa un análisis de tiempo hasta el resultado (TTR) del ADN de MRSA amplificado por HDA e hibridado con chips recubiertos de silicio.

La Figura 7 representa un análisis de detección directa de HDA on-chip en un chip biosensor de capa fina (Onchip).

La Figura 8 representa la detección de amplicones de HDA de un cultivo de sangre aislado en (de izquierda a derecha): un chip envejecido (Envejecido), un chip no bloqueado (No bloqueado), un chip bloqueado de acetato de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) (bloque NHS-Ac) y un chip bloqueado de anhídrido acético (bloque AcAn). La Figura 9 representa secuencias de oligonucleótidos y /o modificaciones estructurales usadas en los cebadores o sondas descritos en los ejemplos siguientes.

Descripción detallada

A fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones.

Las unidades, prefijos y símbolos pueden indicarse en su forma SI aceptada. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'. Los intervalos numéricos citados en la presente incluyen los números que definen el intervalo e incluyen y apoyan cada número entero dentro del intervalo definido. Los aminoácidos pueden denominarse en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura IUPAC-IUBMB. Asimismo, puede hacerse referencia a los nucleótidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. A menos que se indique lo contrario, los términos "un" o "una" deben interpretarse en el sentido de "al menos uno de". Los títulos de las secciones que se usan en la presente son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito. En el caso de cualquier discrepancia de aminoácidos o secuencia nucleica dentro de la aplicación, las figuras tienen prioridad.

Como se usa en la presente, la frase "soporte sólido recubierto" se refiere a una configuración de ensayo que incluye un sustrato sólido; una o más capas de recubrimiento y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. Las capas de recubrimiento ejemplares incluyen, pero no se limitan a, capas catiónicas, capas de silano, capas de siloxano, capas antirreflectantes, materiales que mejoran la densidad de la sonda, capas de unión y similares.

Como se usa en la presente, el término "superficie" generalmente se refiere a un dominio geométrico covalentemente contiguo o una región de un dominio geométrico directamente contactable por medio circundante y que tiene grupos funcionales que soportan interacciones químicas entre polinucleótidos, sondas específicas de la diana y/o estructuras químicas modificadas de la superficie a través de interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones de London, interacciones hidrofóbicas o combinaciones de las mismas. Puede usarse una superficie zwitteriónica para soportar la adsorción biomolecular. Puede fabricarse una superficie del soporte sólido recubierto sobre el soporte sólido o puede ser una propiedad intrínseca del soporte sólido. Un ejemplo no limitante de fabricación de superficies es la aminosilanización en la que los grupos funcionales catiónicos se unen covalentemente al soporte sólido.

El término "sustrato sólido" se refiere a cualquier material que tenga intrínsecamente una superficie o cualquier material que pueda modificarse para crear una superficie que pueda configurarse para la inmovilización de sondas de ácido nucleico. El sustrato sólido proporciona una superficie que puede transferirse de una solución a otra para la detección de polinucleótidos dianas e incluye, pero no se limita a, portaobjetos, láminas, tiras, varillas, membranas, películas, filtros, perlas, nanopartículas, partículas magnéticas, pocillos de microtitulación, tubos, cadenas o cualquier superficie que pueda configurarse para la inmovilización de sondas de ácido nucleico. Un sustrato sólido puede formarse a partir de silicio, vidrio, fibra de vidrio, plásticos, como policarbonato, poliestireno o cloruro de polivinilo, carbohidratos complejos, como agarosa y Sepharose™, resinas poliméricas, incluidas las formadas a partir de acrílico, como poliacrilamida, filtros de nitrocelulosa u otras membranas, cerámica, perlas de látex, metales, tales como oro, compuestos orgánicos e inorgánicos o combinaciones de los mismos.

La frase "capa catiónica" se refiere a una capa catiónica en el soporte sólido recubierto, comprendiendo la capa catiónica una pluralidad de grupos funcionales catiónicos a los que se unen sondas específicas de la diana o agentes secundarios a los que pueden unirse sondas específicas de la diana.

El término "capa antirreflectante" se refiere a un recubrimiento de capa fina que es antirreflectante a longitudes de onda específicas de luz para crear cambios de color de superficie característicos que resultan de interferencias destructivas. Más particularmente, cuando la luz reflejada de la interfaz de capa fina de superficie está desfasada con la luz reflejada de la interfaz de capa fina de aire, las longitudes de onda específicas de luz se eliminan de la luz reflectante por interferencia destructiva para crear cambios de color de superficie de capa fina característicos.

El término "grupo funcional" se refiere al átomo(s) responsable de las reacciones características de un compuesto. Por ejemplo, el grupo funcional de los alcoholes es --OH, el grupo funcional de los aldehídos es --CHO, el grupo funcional de los ácidos carboxílicos es --COOH. Un grupo funcional dado se comporta aproximadamente de la misma manera en todas las moléculas de las que forma parte. Una sola molécula puede tener una pluralidad de grupos funcionales. Los grupos funcionales pueden mediar, por ejemplo, en una interacción no covalente entre una superficie y un polinucleótido. Los grupos funcionales ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a biotina, N-hidroxisuccinimida, vinilsulfona, quelatos de iones metálicos (por ejemplo, Ni2+-NTA), grupo de unión a glutatión, amino, aldehído, epoxi, mercapto, maleimida, heparina, metoxi, sulfonato, silano, azida, acrilato, aldehído, isocianato, fosfonato y epoxi.

El término "ácido nucleico" se refiere a un polidesoxirribonucleótido (ADN o un análogo del mismo) o polirribonucleótido (ARN o un análogo del mismo) formado por al menos dos, y preferentemente diez o más bases unidas por una cadena principal. En el ADN, las bases comunes son adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C), mientras que en el ARN, las bases comunes son A, G, C y uracilo (U, en lugar de T), aunque los ácidos nucleicos pueden incluir análogos de bases (por ejemplo, inosina) y posiciones abásicas (es decir, una cadena principal de fosfodiéster que carece de un nucleótido en una o más posiciones, patente de EE.UU No. 5,585,481). Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen polinucleótidos u oligonucleótidos de ADN y ARN de simple cadena (ss), de doble cadena (ds) o de triple cadena.

El término "polinucleótido" se refiere a ácidos nucleicos que contienen más de 10 nucleótidos.

Como se usa en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico de simple cadena que contiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 nucleótidos.

El término "cadena principal de ácido nucleico" se refiere a grupos o enlaces de ácidos nucleicos, que incluyen pero no se limitan a, enlaces azúcar-fosfodiéster, enlaces 2'-O-metilo, enlaces guanidina en el ADN ("DNG"), enlaces S-metiltiourea, enlaces metilfosfonato, enlaces de fosforamidato, modificaciones de la estructura de amida como en los ácidos nucleicos de poliamida o péptido (PNA), enlaces de fosforotioato, enlaces de ácido nucleico de éster fosfónico, enlaces de oligonucleótido de piranosilo, enlaces de ácido biciclo y triciclo-nucleico, enlaces de formacetal y 3'-tioformacetal, enlaces morfolino, u otras modificaciones del enlace internucleósido fosfodiéster natural, o combinaciones de dichos enlaces en una única cadena principal. Una cadena principal de ácido nucleico puede incluir una mezcla de enlaces en el mismo ácido nucleico (por ejemplo, enlaces azúcar-fosfodiéster y 2'-O-metilo) o puede tener todos de un tipo de enlaces (por ejemplo, todos los enlaces 2'-O-metilo o todos los enlaces de modificación de amida).

El término "muestra" se refiere a cualquier fuente de muestra biológica que contenga o se sospeche que posiblemente contenga un polinucleótido diana o una secuencia del polinucleótido diana. La muestra de prueba puede derivarse de cualquier fuente biológica, como, por ejemplo, sangre, lavado alveolar bronquial, saliva, frotis de garganta, líquido del cristalino ocular, líquido cefalorraquídeo, sudor, esputos, orina, leche, líquido ascítico, mucosas, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico, tejidos, caldos de fermentación, cultivos celulares, mezclas de reacción química y similares. La muestra de prueba puede usarse (i) como obtenida directamente de una fuente de muestra o (ii) después de un tratamiento previo para modificar el carácter de la muestra. Por lo tanto, la muestra de prueba puede tratarse previamente antes de su uso, por ejemplo, preparar plasma a partir de sangre, romper células, preparar líquidos a partir de materiales sólidos, diluir fluidos viscosos, filtrar líquidos, destilar líquidos, concentrar líquidos, inactivar componentes interferentes, añadir reactivos, purificar ácidos nucleicos y similares.

Los términos "polinucleótido diana", "secuencia diana" y "ácido nucleico diana" se usan indistintamente y se refieren a un ácido nucleico en una muestra de prueba que tiene una secuencia de bases nucleotídicas a las que se une otra secuencia, como una sonda específica de la diana a través de emparejamiento de bases complementarias estándar. El polinucleótido diana se dirige a una secuencia de ácido nucleico que puede detectarse, amplificarse o tanto amplificarse como detectarse. El polinucleótido diana se proporciona generalmente en un estado de solución, que luego se hibrida con una sonda específica de la diana. Los polinucleótidos dianas pueden ser de simple o doble cadena y pueden comprender ADN, ARN, así como combinaciones o derivados de los mismos. La secuencia diana puede ser una parte relativamente pequeña de un ácido nucleico más grande, como una subsecuencia específica contenida en un ADN genómico o ARN mensajero (ARNm). Los expertos en la técnica apreciarán que un ácido nucleico diana puede existir en diferentes formas, es decir, como simple cadena, doble cadena, triple cadena, o mezclas de los mismos, como en una estructura de horquilla parcialmente de doble cadena o como una estructura dúplex parcialmente de doble cadena, y además apreciará que una secuencia diana puede estar presente en cualquier cadena (+ o -) de la estructura. Por simplicidad, un ácido nucleico diana puede describirse como todo o parte de una sola cadena, pero esto no pretende limitar el significado de una diana a una o una cadena del ácido nucleico particular. Se conoce bien en la técnica que un ácido nucleico multicatenario se convierte fácilmente en sus componentes de simple cadena usando métodos estándar, tales como calentando un ácido nucleico por encima de su temperatura de fusión (Tm) y/o usando desnaturalizantes químicos.

El término "sonda específica de la diana" se refiere a un polinucleótido unido a una superficie que se une específicamente a una secuencia del polinucleótido diana y cuya unión es capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable para indicar la presencia de la secuencia del polinucleótido diana. Preferentemente, la sonda específica de la diana es un oligonucleótido de simple cadena que tiene una longitud entre aproximadamente 12 nucleótidos y aproximadamente 60 nucleótidos. La sonda específica de la diana puede unirse a un marcador en el paso de detección posterior a la hibridación. Las sondas específicas de la diana marcadas pueden incluir enlazadores y/o marcadores de los mismos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5,185,439, 5,283,174, 5,585,481 y 5,639,60).

El término "bloqueado" se refiere a un grupo funcional en (en un polinucleótido, polipéptido o agente no polimérico) que se modifica o derivatiza químicamente para hacer que el grupo funcional sea químicamente inerte o para reducir o eliminar el reconocimiento enzimático como resultado de la modificación o derivatización. A manera de ejemplo, el extremo de una sonda específica de la diana puede "bloquearse" (por ejemplo, por un "grupo de bloqueo") mediante la reacción o la inclusión de un grupo químico y/o elemento estructural que hace que la sonda sea menos adecuada para el reconocimiento (o reacción) por una enzima, tal como helicasa o ADN polimerasa, evitando así o reduciendo sustancialmente, por ejemplo, que la enzima se una al extremo bloqueado o cerca del mismo, o catalizando una reacción enzimática en el extremo bloqueado o cerca del mismo. Puede crearse una "sonda bloqueada" o "sonda de oligonucleótido bloqueada" modificando estructuralmente un oligonucleótido existente o prediseñando una modificación adecuada o elemento estructural en el diseño original de, por ejemplo, una sonda del oligonucleótido obtenible comercialmente. Los grupos amino libres en las capas catiónicas pueden "bloquearse" de manera similar para proporcionar un nivel deseable de densidad de carga/ reactividad en una superficie del soporte sólido recubierto.

El término "sonda modificada", "sonda específica de la diana modificada" y "oligonucleótido modificado" se refiere a un ácido nucleico de simple cadena que tiene una estructura no convencional, que incluye al menos un elemento estructural del ácido nucleico que no se encuentra en el ADN genómico humano. Generalmente, esto se refiere a una variante intencionada de los residuos de adenina, timina, guanina, citosina o uracilo de ribo y desoxirribonucleótidos clásicos unidos por enlaces fosfodiéster. El elemento estructural no natural puede añadirse a un oligonucleótido convencional o puede incluirse en el diseño del oligonucleótido durante su síntesis. Cuando se usa en este contexto en la presente, el término generalmente significará: (1) una variante de los nucleótidos clásicos que genera a una mayor eficiencia de unión cuando una sonda específica de la diana se hibrida con un polinucleótido diana en comparación con una sonda específica de la diana idéntica que contiene los nucleótidos clásicos; y/o (2) una variante de los nucleótidos clásicos que produce un sustrato con características estructurales que confieren una reducción o eliminación en el reconocimiento por una enzima de amplificación isotérmica de la sonda específica de la diana unida al polinucleótido diana, o que confiere una reducción o eliminación en desnaturalización enzimática de la sonda unida al polinucleótido diana (en comparación con una sonda específica de la diana por lo demás idéntica que contiene los nucleótidos clásicos).

El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico de simple cadena capaz de unirse a una región de simple cadena en un polinucleótido diana para facilitar la replicación dependiente de la polimerasa y/o la amplificación del polinucleótido diana.

El término "polímero" se refiere a una cadena de moléculas que consta de unidades estructurales y unidades repetidas conectadas por un enlace químico covalente.

El término "silano" o "reactivo de silanización" se refiere a un compuesto o reactivo que contiene un átomo de silicio con o sin una cadena polimérica de subunidades repetidas. Los ejemplos de silanos incluyen, pero no se limitan a, organosilanos, aminosilanos, vinilsilanos, epoxisilanos, metacrilsilanos, sulfursilanos, alquilsilanos, polialquilsilanos, (alquil)alcoxisilanos, aminoalquilsilanos, (aminoalquil)alcoxisilanos (tales como (3-aminoproxi)trietoxisilanos) y similares.

El término "siloxano" se refiere a un compuesto polimérico que contiene una unidad molecular silicio-oxígeno-silicio (Si-O-Si).

Aplicado a polinucleótidos, el término "amplificación" se refiere a cualquier procedimiento in vitro conocido para producir múltiples copias de un fragmento del polinucleótido diana (es decir, "amplicones") de forma lineal o exponencial con ciclos de temperatura (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR) o sin ciclos de temperatura (por ejemplo, amplificación isotérmica).

El término "amplificación isotérmica" se refiere a un proceso de amplificación que no requiere ciclos de temperatura entre las etapas de polimerización y desnaturalización del ácido nucleico. Por consiguiente, las etapas de polimerización y amplificación en un proceso de amplificación isotérmica pueden llevarse a cabo en condiciones de temperatura sustancialmente constantes. Las temperaturas isotérmicas para las reacciones de amplificación isotérmica están generalmente por debajo de la temperatura de fusión (Tm, la temperatura a la cual la mitad de las moléculas potencialmente de doble cadenas en una mezcla se encuentran en un estado desnaturalizado de una sola cadena) del producto de reacción predominante, generalmente 90 °C o menor, y normalmente entre aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 75 °C.

Aunque la reacción de polimerización puede ocurrir en condiciones isotérmicas, un proceso isotérmico puede incluir opcionalmente una etapa de desnaturalización por calor de preamplificación para generar un ácido nucleico diana de simple cadena que se usará en la etapa de amplificación isotérmica.

El término "enzima de amplificación isotérmica" se refiere a una enzima asociada con un proceso de amplificación, que incluye, pero no se limita a polimerasas, enzimas de desnaturalización enzimática, como helicasas, y enzimas accesorias de desnaturalización, incluidas proteínas de unión de simple cadenas y similares. Una enzima de amplificación isotérmica puede ser de naturaleza termofílica o mesofílica.

Los términos "amplificación dependiente de helicasa" y "HDA" se usan indistintamente para describir un proceso de reacción in vitro para amplificar ácidos nucleicos que usa una preparación de helicasa para desenrollar un ácido nucleico de doble cadena para generar moldes para la hibridación del cebador y la posterior extensión del cebador mediante una o más enzimas polimerasas. El HDA usa dos cebadores de oligonucleótidos, un primer cebador que hibrida con una secuencia complementaria en la cadena sentido de una secuencia del polinucleótido diana y un segundo cebador que hibrida con una secuencia complementaria en la cadena antisentido de una secuencia polinucleótido diana, por lo que los dos cebadores definen los límites exteriores del polinucleótido diana amplificado. La reacción de HDA constituye un método general para la amplificación de ácidos nucleicos dependiente de helicasa.

Los términos "hibridación" e "hibridar" se usan indistintamente para referirse a la unión de un cebador o sonda específica de la diana a una región de simple cadena del polinucleótido diana en condiciones en las que el cebador o la sonda se unen específicamente a su secuencia complementaria en el polinucleótido diana, pero no a otras regiones de polinucleótido. La especificidad de la hibridación puede verse influida por la longitud del cebador del oligonucleótido, la temperatura a la que se realiza la reacción de hibridación, la fuerza iónica y el pH.

Los términos "complementario" o "complementariedad de" se usan en el contexto de los ácidos nucleicos para significar que una secuencia de nucleótidos en una cadena del ácido nucleico es capaz de unirse a otra secuencia en una cadena del ácido nucleico opuesta debido a la orientación de los grupos funcionales. Las bases complementarias típicamente son, en el ADN, A con T y C con G, y, en el ARN, C con G y U con A. "Sustancialmente complementaria" significa que una secuencia en una cadena no es completa y/o perfectamente complementaria a una secuencia en una cadena opuesta, pero que se produce un enlace suficiente entre las bases de las dos cadenas para formar un complejo híbrido estable en un conjunto de condiciones de hibridación (por ejemplo, concentración de sal y temperatura). Tales condiciones pueden predecirse usando las secuencias y cálculos matemáticos estándar conocidos por los expertos en la técnica para predecir la Tm de las cadenas hibridadas, o mediante la determinación empírica de Tm usando métodos de rutina. La Tm se refiere a la temperatura a la que una población de complejos de hibridación formados entre dos cadenas de ácido nucleico se desnaturaliza al 50 %. A una temperatura por debajo de la Tm se favorece la formación de un complejo de hibridación, mientras que a una temperatura por encima de la Tm se favorece la fusión o separación de las cadenas en el complejo de hibridación. La Tm puede estimarse para un ácido nucleico que tiene un contenido de G C conocido en una solución acuosa de NaCl 1 M usando, por ejemplo, Tm = 81,5 0,41 (% G C), aunque se conocen otros cálculos de Tm en la técnica que tiene en cuenta otras características estructurales de los ácidos nucleicos.

La frase "condiciones adecuadas para la hibridación" se refiere a las condiciones ambientales acumulativas suficientes para facilitar la unión específica de una primera cadena de ácido nucleico a una segunda cadena de ácido nucleico mediante interacciones de cadenas complementarias y enlaces de hidrógeno para dar como resultado un híbrido o complejo de hibridación estable. Tales condiciones incluyen los componentes químicos y sus concentraciones (por ejemplo, sales, agentes quelantes, formamida) de una solución acuosa u orgánica que contiene los ácidos nucleicos y la temperatura de la mezcla. Como saben los expertos en la técnica, otros factores bien conocidos, tales como la duración del tiempo de incubación o las dimensiones de la cámara de reacción, pueden contribuir al medio ambiente.

Los términos "alto contenido de sal" o "condiciones de alto contenido de sal" se usan en la presente con referencia a las condiciones de hibridación que tienen una concentración de catión monovalente mayor de aproximadamente 0,5 M.

Los términos "bajo contenido de sal" o "condiciones de bajo contenido de sal" se usan aquí con referencia a condiciones de hibridación en las que la concentración de catión monovalente está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM, preferentemente entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 75 mM.

Los términos "fundir", "desenrollar" o "desnaturalizar" se refieren a la separación total o parcial de dos cadenas complementarias de un dúplex de ácido nucleico.

El término "helicasa" se refiere a una enzima necesaria para desenrollar o desnaturalizar enzimáticamente un ácido nucleico solo o en combinación con al menos una proteína accesoria de helicasa.

El término "proteína accesoria de helicasa" se refiere a una proteína adicional que puede ser necesaria para la actividad de la helicasa o para estimular la actividad de la helicasa. Las proteínas accesorias de la helicasa incluyen proteínas de unión a ADN (SSB) de una sola cadena, que pueden ser necesarias para desenrollar los ácidos nucleicos cuando se usan helicasas mesófilas. La E. coli MutL es una proteína accesoria ejemplar para potenciar la actividad de fusión de la helicasa UvrD.

El término "preparación de helicasa" se refiere a una mezcla de helicasa(s) y/o proteínas accesorias de helicasa necesarias y suficientes para desenrollar o desnaturalizar enzimáticamente un ácido nucleico. Cuando se usa una helicasa termoestable en una preparación de helicasa, la presencia de una proteína de unión de simple cadena puede ser opcional. Una preparación de helicasa, cuando se combina con una ADN polimerasa, un molde de ácido nucleico, desoxinucleótidos trifosfatos y cebadores, generalmente es capaz de lograr una amplificación isotérmica de ácidos nucleicos in vitro.

Los términos "unido" y "enlazado" se usan indistintamente para referirse a cualquier conexión química entre dos componentes o compuestos, incluidas las conexiones químicas tanto directas como indirectas. La conexión puede ser de naturaleza covalente o no covalente. Los ejemplos de uniones no covalentes incluyen, pero no se limitan a, interacciones electrostáticas, interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van Der Waals, interacciones dipolo-dipolo e interacciones hidrofóbicas.

El término "marcador" se refiere a un resto molecular, compuesto o conjugado que se une directa o indirectamente a una sonda o polinucleótido diana específico para la detección (por ejemplo, un polinucleótido amplificado), el marcador contiene una característica física o química capaz de provocar una señal detectable y/o medible indicativa de la formación de dúplex entre una sonda específica de la diana y un polinucleótido diana complementario, que incluye, pero no se limita a, señales catalizadas por enzimas y similares. El marcaje directo puede ocurrir a través de enlaces o interacciones que unen el marcador al polinucleótido (por ejemplo, enlaces covalentes o interacciones no covalentes), mientras que el marcaje indirecto puede ocurrir mediante el uso de un "enlazador" o resto de puente, como un oligonucleótido o anticuerpo, que, además, puede marcarse directa o indirectamente. Los marcadores ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, cromóforos; tintes, partículas o compuestos ópticamente detectables, incluidos compuestos colorimétricos, luminiscentes, fluorescentes, bioluminiscentes, quimioluminiscentes y fosforescentes; anticuerpos; compuestos hapténicos o antigénicos usados en combinación con un anticuerpo adecuadamente marcado; ligandos específicos o miembros de pares de unión que contienen un sitio de reconocimiento de ligando, tal como biotina o avidina; enzimas cofactores o sustratos enzimáticos; secuencias de nucleótidos complementarias; enzimas cofactores o sustratos enzimáticos; radioisótopos; y similares. Pueden incluirse además restos de puente para amplificar una señal detectable. Además, el marcador puede incluir una variedad de grupos reactivos diferentes o funcionalidades químicas adecuadas para la unión a una variedad de agentes biomoléculas.

Se entenderá que los marcadores directamente detectables pueden requerir componentes adicionales tales como, por ejemplo, sustratos, reactivos de activación, luz y similares para permitir la detección del marcador. Cuando se usan marcadores detectables indirectamente, se usan típicamente en combinación con un "conjugado". Un conjugado es típicamente un miembro de unión específico que se une o acopla a un marcador directamente detectable. Las químicas de acoplamiento para sintetizar un conjugado son bien conocidas en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, cualquier medio químico y/o medio físico que no destruya la propiedad de unión específica del miembro de unión específico o la propiedad detectable del marcador.

El término "señal" se refiere a una propiedad o característica de un marcador detectable que permite que se detecte y/o distinga visual o instrumentalmente. Las señales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, señales cromogénicas, señales fluorescentes, señales quimioluminiscentes, señales radiactivas y similares.

La frase "límite inferior de detección" (o "LLOD") se refiere a la concentración más baja de la diana que puede detectarse visualmente en un ensayo usando un equipo de laboratorio convencional.

La presente invención proporciona métodos para amplificar y detectar polinucleótidos dianas en estado de solución. El método emplea amplificación /hibridación /detección acopladas de polinucleótidos diana(s) en una muestra que incluye aplicar la muestra y un medio de reacción a un soporte sólido recubierto compuesto del soporte sólido, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. Los polinucleótidos dianas de la muestra se amplifican mediante un proceso de amplificación isotérmica dependiente de helicasa y se hibridan simultáneamente con las sondas específicas de la diana en condiciones de bajo contenido de sal.

Se describen soportes sólidos recubiertos y su uso en métodos para la detección rápida por amplificación en el punto de atención, de polinucleótidos dianas unidos a los soportes sólidos recubiertos. El solicitante ha descubierto inesperadamente un método para amplificar y detectar rápidamente un polinucleótido diana en un proceso de detección /hibridación /amplificación isotérmica acoplada. El solicitante ha determinado que un soporte sólido configurado catiónicamente que contiene sondas de captura específicas de la diana inmovilizadas puede reducir los efectos negativos de desenrollar y liberar los dúplex unidos a la superficie del soporte sólido recubierto durante un proceso de hibridación /amplificación isotérmica dependiente de helicasa acoplado, que de otra manera podría reducir la detección de dúplex capturados, particularmente en condiciones de bajo contenido de sal. Los efectos negativos de desenrollar y liberar los dúplex durante el proceso de amplificación /hibridación isotérmica acoplada también pueden reducirse usando sondas de captura específicas de la diana modificadas o incorporadas con un elemento estructural para reducir o eliminar el reconocimiento por una enzima de amplificación isotérmica (como una helicasa) cuando se une a un polinucleótido diana.

Además, el sistema acoplado de amplificación /hibridación /detección de la presente invención puede practicarse sin requerir pasos separados o adicionales dirigidos a la desnaturalización o hibridación de materiales de amplicón con sondas de captura de ADN de simple cadena inmovilizadas en la superficie.

Los soportes recubiertos que contienen la sonda proporcionan una cinética de reacción de hibridación /amplificación isotérmica más óptima. La reacción de amplificación isotérmica se realiza en fase de solución sobre el soporte sólido recubierto que contiene la sonda usando la helicasa, los productos accesorios y los cebadores específicos de la diana adecuados. A medida que aumentan la concentración(es) de polinucleótidos dianas amplificados, los polinucleótidos dianas se alinean con cebadores de oligonucleótidos, se realinean con cadenas complementarias o se alienan con sondas inmovilizadas en la superficie de un soporte sólido, como un microchip. Las sondas específicas de la diana pueden modificarse adicionalmente o incorporarse con un elemento estructural para reducir o eliminar el reconocimiento por una enzima de amplificación isotérmica (tal como una helicasa) cuando se unen a un polinucleótido diana. Los productos de amplificación se desnaturalizan continuamente por la helicasa en una reacción de amplificación dependiente de helicasa en condiciones que apoyan la hibridación de productos de reacción de simple cadena a un soporte sólido recubierto en forma de chip biosensor. Al final de las reacciones de amplificación /hibridación, el soporte o chip puede lavarse y detectarse la presencia del polinucleótido diana.

I. Componentes materiales de la presente invención

1. Muestras y procesamiento de muestras

Una muestra para usar en el presente método incluye cualquier fuente de ácido nucleico que contenga o potencialmente contenga un polinucleótido diana para la detección. Como tal, la muestra puede incluir una preparación de polinucleótidos o un extracto de cualquier fuente que contenga ácido nucleico, incluidas células animales, células microbianas, tales como bacterias y hongos, virus o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden extraerse de cualquier material fuente de polinucleótidos usando metodologías de extracción convencionales conocidas por los expertos en la técnica, incluidas muestras clínicas de sangre (por ejemplo, 10 pl) o hisopados nasales. Un extracto de ácido nucleico puede diluirse en un tampón de reacción para la amplificación directa. En otras modalidades, la muestra puede incluir productos de reacción de un proceso de amplificación de ácido nucleico isotérmico o un proceso de amplificación de ácido nucleico convencional, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

2. Soporte sólido recubierto

Se describe un soporte sólido recubierto para la detección de un polinucleótido diana que incluye un sustrato sólido, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. También se describe un soporte sólido recubierto para la detección de polinucleótidos dianas que incluye una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto.

Se describe además un soporte sólido recubierto para la detección de un polinucleótido diana que incluye un biosensor basado en silicio para la detección visual de un polinucleótido diana en una muestra. El biosensor a base de silicio incluye un soporte de silicio recubierto compuesto por un sustrato de silicio, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte de silicio recubierto, por lo que el soporte de silicio recubierto está configurado para soportar la detección visual de polinucleótidos dianas en la muestra y no comprende una capa de recubrimiento capaz de mediar en la detección visual de polinucleótidos dianas por interferencia destructiva. En un aspecto particular, el soporte de silicio recubierto no comprende una capa antirreflectante usada en biosensores de capa fina.

2.1 Sustrato sólido

Un sustrato de silicio sólido puede ser cualquier material que tenga intrínsecamente una superficie o cualquier material que pueda modificarse para crear una superficie a la que se pueda unir un ácido nucleico de simple cadena, de forma covalente o no covalente. Un soporte sólido puede tener la forma de un portaobjetos, microchip, micromatriz, placa de microtitulación, varilla de medición, lámina, filtro de membrana, película, perla o cualquier otra forma de soporte adecuada conocida en la técnica.

El sustrato sólido puede ser poroso o no poroso. Los sustratos no porosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, materiales comúnmente usados para la construcción de micromatrices de ácidos nucleicos, tales como obleas de silicio.

En una modalidad, el sustrato sólido tiene forma de oblea o chip de silicio. En una modalidad particular, una oblea de silicio para usar en la presente invención incluye una superficie de "lado rugoso" sin pulir usada para la aplicación de capas catiónicas y/o sondas. Puede proporcionarse una superficie de silicio de lado rugoso mediante el uso de una oblea de silicio que tenga un lado pulido y un lado rugoso, sin pulir. En una modalidad, la superficie del lado rugoso sin pulir puede tener una rugosidad caracterizada por un intervalo de pico a valle de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 5 pM, o de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 2 pM. La rugosidad de la superficie puede estar gobernada o modulada por el tiempo de exposición a un baño cáustico (por ejemplo, NaOH concentrado, 90 °C). En una modalidad particular, la superficie rugosa de silicio sin pulir se somete al baño cáustico durante aproximadamente 15 segundos.

Los solicitantes han descubierto inesperadamente que la superficie lateral rugosa de una oblea de silicio puede emplearse sin pulir más para proporcionar un medio de detección visual sin necesidad de pulir más o recubrimientos de capa fina para la detección visual basada en interferencias destructivas. Si bien no se desea limitarse a la teoría, se cree que la superficie de silicio del lado rugoso para su uso en la presente invención puede soportar la detección visual de polinucleótidos dianas mediante un proceso que no se basa en principios de interferencias destructivas, sino más bien en una combinación de dispersión de luz y colorimetría.

En modalidades alternativas, puede usarse un soporte sólido (o biosensor) recubierto de una capa fina en el que se recubre un lado pulido de una oblea de silicio con una capa antirreflectante para proporcionar un medio para la detección visual de polinucleótidos dianas mediante interferencia destructiva. La capa antirreflectante puede formarse como un recubrimiento de nitruro de silicio como se describió previamente (Jenison y otros, Expert Rev. Molec. Diagn., 2006). Puede formarse una capa de unión adicional compuesta de polidimetilsiloxano con estructura en T para facilitar la conjugación con las sondas específicas de la diana. Biosensores de capa fina ejemplares, que incluyen capas de unión para usar en un biosensor de capa fina para usar en los métodos de la presente invención, se describen en la patente de EE.UU No. 5,955,377 y la solicitud de patente de EE.UU. No. 2008/003693.

Se describe que los sustratos sólidos pueden moldearse en cualquiera de una variedad de figuras y formas. Ejemplos de tales figuras y formas incluyen, pero no se limitan a, láminas, películas, portaobjetos, geles, espumas, filamentos, hilos, membranas, perlas, placas y similares. Los sustratos pueden fabricarse en forma de un dispositivo plano que tiene áreas aisladas discretas en forma de pozos, canales, pedestales, parches hidrófobos o hidrófilos, depósitos adhesivos troquelados u otras barreras físicas al flujo de fluido. Los ejemplos de tales sustratos incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos, microplacas, láminas, películas, varillas de medición y similares. Debido a que los dispositivos son particularmente útiles en la preparación de matrices de polinucleótidos para la detección de polinucleótidos dianas, se fabrica preferentemente una capa catiónica en un dispositivo que tiene al menos una superficie plana gruesa, como un portaobjetos.

El tamaño del soporte sólido recubierto puede variar, dependiendo del uso final de los polinucleótidos dianas inmovilizados. Los expertos en la técnica apreciarán que las matrices de polinucleótidos inmovilizados sobre sustratos sólidos miniaturizados se han desarrollado durante muchos años. Estos sustratos sólidos pueden medirse en términos de área de superficie plana mm2 y pueden tener numerosos polinucleótidos dianas inmovilizados diferentes, cada uno unido a una ubicación específica de sitio diferente sobre el soporte sólido miniaturizado. También se describen sustratos sólidos en forma de portaobjetos o varillas. Como se conoce en la técnica, las varillas de medición son típicamente de forma rectangular y cada lado mide unos pocos centímetros.

En una modalidad particular, los sustratos sólidos pueden incluir un material que mejora la densidad de la sonda en forma de una perla o gránulo que contiene una superficie catiónica revestida. Las perlas pueden proporcionar un medio para aumentar la densidad de la sonda en el soporte sólido recubierto. Una perla puede constituir un sustrato sólido o puede constituir adicionalmente un material mejorador de la densidad de la sonda para la unión a otros sustratos sólidos o recubrimiento de sustratos sólidos. Las perlas pueden proporcionar una variedad de químicas superficiales o funcionalidades (por ejemplo, amina, carboxilo, hidroxi, etc.) adecuadas para convertir la perla en catiónica mediante, por ejemplo, aminación o mediante enlace directo o indirecto a un polímero catiónico.

Las composiciones de perlas adecuadas incluyen las que se usan en la síntesis de péptidos, ácidos nucleicos y restos orgánicos, e incluyen, por ejemplo, plásticos, como poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, cerámica, vidrio, materiales poliméricos, como dextranos reticulados, celulosa, nailon y látex, materiales paramagnéticos, dióxido de titanio, látex. Las perlas pueden abarcar cualquier tipo de esfera sólida o hueca, bola, rodamiento, cilindro u otra configuración sólida, que puede ser de naturaleza porosa o no porosa. El uso de perlas porosas puede aumentar el área de superficie de la perla disponible para la detección de ácidos nucleicos. Los tamaños de las perlas generalmente oscilan entre aproximadamente 100 nm a aproximadamente 5 mm, preferentemente entre aproximadamente 0,2 |_im y aproximadamente 200 |_im, más preferentemente entre aproximadamente 0,5 |_im y aproximadamente 5 |_im. Los métodos para unir sondas específicas de la diana a superficies de perlas se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5,514,785, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia.

Una superficie o capa sobre el soporte sólido puede bloquearse o envejecerse para reducir la pasivación superficial (o unión no específica) de los componentes de la reacción para interferir con la amplificación y/o detección de polinucleótidos unidos a las sondas. Por ejemplo, las aminas superficiales de fácil acceso pueden bloquearse mediante tratamiento con acetato de NHS o anhídrido acético. Además, los soportes sólidos, incluidos los sustratos de silicio, pueden envejecerse (por ejemplo, 3 a 12 meses) para reducir la pasivación superficial de los componentes de reacción de los mismos.

2.2 Capa catiónica.

Los solicitantes han descubierto inesperadamente que puede usarse una capa catiónica junto con sondas inmovilizadas sobre un soporte sólido recubierto para reducir la liberación y/o aumentar la detección de secuencias diana capturadas en la superficie del soporte recubierto, reduciendo así los efectos potencialmente negativos del desenrollado catalizado por helicasa y la liberación de dúplex unidos de la superficie de soporte recubierto. Además, contrariamente a las expectativas convencionales, los solicitantes han descubierto además que el uso de un recubrimiento de capa catiónica puede estabilizar la unión y la detección resultante de dúplex de polinucleótidos unidos en la superficie del soporte sólido recubierto en condiciones de bajo contenido de sal en mayor medida que en condiciones de alto contenido de sal típicamente usadas para facilitar la hibridación.

La capa catiónica puede configurarse de manera que una proporción de los grupos funcionales catiónicos en la capa catiónica retengan su funcionalidad catiónica después de la unión a sondas específicas de la diana o agentes secundarios que promueven la unión a las sondas específicas de la diana. En un aspecto, entre aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 10 % de los grupos funcionales catiónicos se retienen en el soporte sólido recubierto después de la unión de sondas específicas de la diana al mismo. En otro aspecto, entre aproximadamente el 0,5 y aproximadamente el 3 % de los grupos funcionales catiónicos se retienen en el soporte sólido recubierto después de la unión de sondas específicas de la diana al mismo.

En una modalidad, la capa catiónica se forma a partir de un polímero catiónico. Los polímeros catiónicos ejemplares incluyen polilisina, poli(lys-phe), poli(lys-tyr), poli(lys-trp), poli(arg-trp) y poli(arg-pro-tyr). Preferentemente, el polímero catiónico cubre sustancialmente al menos una parte del soporte sólido.

La formación y/o incorporación de capas catiónicas sobre superficies de silicio puede facilitarse especialmente usando metodologías y compuestos basados en la química del silano bien conocidos por los expertos en la técnica, incluido el uso de polímeros modificados con silano, polisilanos, silazanos, polisilazanos, resinas T y polisilicatos de polialcosiloxano.

En una modalidad, la capa catiónica puede formarse a partir de sustancias poliméricas o no poliméricas derivatizadas para formar una capa catiónica. En una modalidad, la capa catiónica puede crearse introduciendo grupos amina en la superficie del soporte sólido. Los grupos amina pueden introducirse mediante silanos catiónicos, siloxanos catiónicos o derivados catiónicos de los mismos, o pueden añadirse mediante un polímero catiónico, por ejemplo, sobre una capa de recubrimiento compuesta de varios silanos, siloxanos o derivados de los mismos. A manera de ejemplo, una capa de recubrimiento puede estar compuesta por recubrimientos no aminados, incluidos recubrimientos hidrófobos de polipéptidos, silanos o siloxanos. A continuación, pueden crearse capas aminadas sobre el mismo mediante el uso de varios policationes, tales como poli (lys-phe). Este enfoque puede servir para aumentar la densidad de las aminas y crear recubrimientos multicapas estables.

Los silanos ejemplares incluyen aminopropiltrimetoxisilano, glicidoxipropiltrimetoxisilano y aminopropiltrietoxisilano. Los ejemplos de siloxanos incluyen organopolilsiloxanos con función amino y alcoxilatos de siloxano con función amino. La patente de EE.UU No. 6,013,789 describe métodos para introducir grupos amina en una superficie de polipropileno.

Puede derivatizarse químicamente un polímero catiónico, un material que mejora la densidad de la sonda catiónica o una superficie aminada del soporte recubierto para facilitar el enlace con un soporte sólido o con una sonda de captura específica de la diana. Por ejemplo, los grupos amino pueden modificarse con aldehído, con hidrazida, o con sulfhidrilo para facilitar la conjugación química con una sonda de captura adecuadamente modificada. Puede usarse cualquier agente de reticulación adecuado para unir o conjugar químicamente grupos funcionales, particularmente grupos amino en la capa catiónica al soporte sólido y/o las sondas de captura específicas de la diana, incluidos, entre otros, ésteres de NHS heterobifuncionales como SFB, SHNH, SIAB y NhS.

Un soporte sólido puede modificarse químicamente para formar una capa catiónica sobre el mismo. En particular, los soportes sólidos pueden modificarse introduciendo una funcionalidad seleccionada de un grupo que consiste en: amino, carboxilo, tiol y sus derivados. Los grupos amino pueden introducirse en la superficie de un soporte sólido mediante cualquier método convencional conocido por los expertos en la técnica, incluyendo el uso de descarga de plasma en un gas que contiene amoniaco o amina orgánica. El "plasma" es con la máxima preferencia un gas ionizado, que obtiene suficiente energía de ionización de un campo electromagnético. Preferentemente, la energía de ionización se aplica mediante una descarga de plasma de radiofrecuencia, una descarga de plasma de frecuencia de microondas o una descarga de corona. La amina puede derivarse de un gas amoniaco y el estado de energía elevado se logra mediante la descarga de plasma por radiofrecuencia.

2.3. Capas de recubrimiento adicionales.

Pueden añadirse capas o recubrimientos adicionales sobre la capa catiónica, el soporte sólido o entre la capa catiónica y el soporte sólido. La(s) capa(s) adicional(es) pueden añadirse además de una capa catiónica. A manera de ejemplo, el o los recubrimientos adicionales pueden añadirse directamente a un soporte sólido. La capa catiónica puede crearse luego sobre la capa de recubrimiento adicional. Los recubrimientos adicionales pueden incluir polipéptidos, polisacáridos y/o recubrimientos de compuestos basados en química de silano, que incluyen polímeros modificados con silano, polisilanos, silazanos, polisilazanos, resinas T y polisilicatos de polialcosiloxano.

Las capas de recubrimiento adicionales que pueden incluirse en el soporte sólido recubierto de la presente invención incluyen capas antirreflectantes de capa fina, capas de unión y materiales que mejoran la densidad de la sonda. Por ejemplo, un soporte sólido recubierto puede incluir además una capa antirreflectante de capa fina sobre el soporte sólido. Una capa antirreflectante de capa fina es antirreflectante para longitudes de onda de luz específicas para crear cambios de color característicos de la superficie como resultado de interferencias destructivas. Más particularmente, cuando la luz reflejada de la interfaz de capa fina de superficie está desfasada con la luz reflejada de la interfaz de capa fina de aire, las longitudes de onda específicas de luz se eliminan de la luz reflectante por interferencia destructiva para crear cambios de color de superficie de capa fina característicos. En una modalidad, la capa antirreflectante de nitruro de silicio se deposita mediante deposición química potenciada por plasma. Las capas antirreflectantes pueden depositarse sobre una variedad de soportes diferentes. Los métodos y soportes para depositar capas antirreflectantes de capa fina se describen en la solicitud de patente de EE.UU. No. 2008/03693.

Puede incorporarse una capa de unión a un soporte sólido recubierto como una capa que sirve como puente químico que conecta las sondas específicas de la diana a cualquier capa. Preferentemente, la capa de unión se adhiere físicamente o se une químicamente de otra manera a una superficie de una capa de soporte o de recubrimiento para minimizar la interferencia con los procesos bioquímicos que ocurren sobre los soportes recubiertos (por ejemplo, amplificación, hibridación, detección) y para proporcionar suficiente durabilidad frente a pasos de procesamiento posteriores.

En una modalidad, la capa de unión constituye un recubrimiento de agentes de acoplamiento adecuados o reactivos de reticulación depositados sobre una capa de recubrimiento o una superficie de soporte sólida. La elección de un agente de acoplamiento o reactivo de reticulación adecuado dependerá de la naturaleza de los grupos químicos reactivos y/o de la longitud de la cadena del agente, lo que minimizaría o evitaría la interferencia intraunitaria dentro o entre polímeros. Véase "Reagents For Organic Synthesis", L. Fiezer, M. Fiezer, Volumen 1-8, Wiley & Son; "Cross Linking Reagents" (Edición 1980), Pierce Biochemical Reagent Catalog, Compañía Pierce Chemical, Rockford III. y referencias en el mismo, o "Advanced Organic Chemistry" J. March, McGraw Hill (1968).

Los materiales que mejoran la densidad de la sonda pueden incorporarse en los soportes sólidos recubiertos como una capa de unión que proporciona superficies químicas adicionales o alternativas para aumentar la densidad de la sonda en la superficie de la capa catiónica o el soporte sólido. Como tales, los materiales de mejora de la densidad de la sonda están diseñados para unirse directa o indirectamente (por ejemplo, mediante agentes de reticulación, etc.) a las sondas específicas de la diana. Ejemplos de materiales que mejoran la densidad de la sonda incluyen partículas de látex, partículas de sílice, dextrano, sulfato de dextrano, dendrímeros, ácido acrílico, sulfato de dextrano, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, polivinil sulfato, alcohol polivinílico, ácido poliacrílico, copolímero de ácido poli(acrilamida) acrílico, incluidos los derivados químicos y poliméricos de los mismos.

Al unir grupos funcionales en cualquier componente estructural, los grupos funcionales que no han reaccionado pueden bloquearse modificando químicamente o derivatizando el grupo funcional para hacerlo químicamente inerte. A manera de ejemplo, un extremo de una sonda específica de la diana puede "bloquearse" (por ejemplo, por un "grupo de bloqueo" o "compuesto de protección") mediante la reacción con otro grupo químico que hace que un extremo de la sonda sea un sustrato inadecuado para una enzima, como la helicasa o la ADN polimerasa, evitando así o reduciendo sustancialmente que la enzima se una al término bloqueado o cerca del mismo, o catalizando una reacción enzimática en el término bloqueado o cerca de él. Los grupos amino libres en las capas catiónicas pueden bloquearse de manera similar para mejorar el rendimiento del dispositivo mediante la optimización de la densidad /reactividad de carga superficial.

Los agentes de bloqueo ejemplares incluyen, por ejemplo, compuestos reactivos con amina capaces de convertir grupos amina libres en amidas o imidas. A manera de ejemplo, el agente de bloqueo puede ser un reactivo acetilante. Los compuestos reactivos con amina pueden incluir compuestos de una o más de las siguientes clases químicas: ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS), imidoésteres, haluros de arilo, haluros de acilo, isocianatos, isotiocianatos, ésteres de nitrofenilo, carbonilos, carboxilatos y anhídridos de ácido. Los compuestos reactivos con amina particulares pueden incluir, por ejemplo, uno cualquiera o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en acetato de NHS, suberato de disuccinimidilo (DSS), succinimidil-3-(tri-N-butilestanil) benzoato, metil N-succinimidiladipato (MSA), mono(latosilamido) mono(succinimidil) suberato, anhídrido acético, cloruros de arilo, cloruros de acilo, 2,4-dinitrofluorobenceno (DFNB), haluros de sulfonilo, aldehídos, químicas de activación basadas en 1 -etil-3 (3-dimetilaminopropil)-carbodimida (EDC)), anhídrido maleico, anhídrido succínico, cloruros de acetilo, cloruros de benzoílo, cloruros de propionilo, cloruros de butirilo y cloruros de peniletanoílo.

Los agentes de bloqueo adecuados también pueden seleccionarse entre agentes no acetilantes, tales como diazoacetatos, imidoésteres, carbodimidas, maleimidas, a-haloacetilo, haluros de arilo, compuestos de dicarbonilo, sulfhidrilos e hidrazidas. A manera de ejemplo, los compuestos no acetilantes específicos pueden seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, N-etilmaleimida, ácido N-p-maieimidopropiónico, ácido N-£-maleimidocaprioico, ácido yodoacético, N-[yodoetil] (trifluoroacetamida), 3,4-difluoronitrobenceno (DFNB), haluro de sulfonilo, cloruro de (4-cloro-7-sulfobenzo-furazan) de amonio (cloruro de SBF), glioxal, fenglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) seguido de químicas de sulfhidrilo, ácido (2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBSA) y 2-mercaptoetanol. El agente de bloqueo puede incluir o modificarse para incluir un marcador detectable.

3. Sondas de captura específicas de la diana.

Las sondas de captura específicas de la diana pueden emplear una variedad de polinucleótidos u oligonucleótidos diferentes para la detección de diana(s) de polinucleótidos. Las sondas de captura específicas de la diana contienen secuencias complementarias a las secuencias en los polinucleótidos diana(s) que incluyen un primer extremo unido al soporte sólido recubierto y un segundo extremo no unido.

Las sondas de captura específicas de la diana se configuran generalmente como un polinucleótido de simple cadena unido al soporte sólido recubierto, preferentemente un oligonucleótido de entre aproximadamente 12 y 60 nucleótidos de longitud, con mayor preferencia de 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

Las sondas específicas de la diana pueden emplear estructuras de oligonucleótidos convencionales. Alternativamente, la sonda específica de la diana incluye un oligonucleótido modificado (que contiene una estructura de ácido nucleico no convencional) capaz de formar una estructura dúplex, por lo que el oligonucleótido modificado incluye una característica estructural que confiere una reducción o eliminación en el reconocimiento del oligonucleótido por una enzima de amplificación isotérmica cuando se une al polinucleótido diana. En una modalidad particular, una sonda específica de la diana incluye un oligonucleótido modificado que incorpora una característica estructural que confiere una reducción o eliminación de la desnaturalización enzimática cuando se une al polinucleótido diana.

Las estructuras de ácido nucleico no convencionales para su uso en el método de la presente invención incluyen oligonucleótidos con adiciones o sustituciones químicas o de cadena principal no convencionales, que incluyen, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos con cadenas principales de morfolino, metilfosfonatos, tapones de estilbeno o pirenilo estabilizadores dúplex, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfotriésteres y similares. A manera de ejemplo, los oligonucleótidos modificados pueden incorporar o sustituir uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo; modificaciones internucleotídicas que incorporan, por ejemplo, enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) o enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.); modificaciones que incorporan intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.) o alquilantes y/o enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.)) (EE.UU. 2007/0166741).

En una modalidad, la(s) sonda(s) específica de la diana se modifican internamente para incluir al menos una carga neutra en su estructura. Por ejemplo, la sonda de captura puede incluir una cadena principal de metilfosfonato o ácido nucleico peptídico (PNA) complementario a la secuencia específica de la diana. Se ha descubierto que estas modificaciones previenen o reducen el desenrollamiento mediado por helicasa. El uso de sondas no cargadas puede aumentar aún más la velocidad de hibridación con polinucleótidos dianas en una muestra, aliviando la repulsión de las cadenas de ácido nucleico con carga negativa en la hibridación clásica (Nielsen y otros, 1999, Curr. Issues Mol. Biol., 1: 89-104).

Los oligonucleótidos de PNA son análogos de ácidos nucleicos no cargados para los cuales el esqueleto del fosfodiéster se ha reemplazado por una poliamida, lo que hace que los PNA sean un polímero de unidades de 2-aminoetil-glicina unidas entre sí por un enlace amida. Los PNA se sintetizan usando la misma química de Boc o Fmoc que se usan en la síntesis de péptidos estándar. Las bases (adenina, guanina, citosina y timina) están unidas a la columna vertebral mediante un enlace metilencarboxilo. Por tanto, los PNA son acíclicos, aquirales y neutrales. Otras propiedades de los PNA son una mayor especificidad y temperatura de fusión en comparación con los ácidos nucleicos, capacidad para formar triples hélices, estabilidad a pH ácido, no reconocimiento por enzimas celulares como nucleasas, polimerasas, etc. (Rey y otros, 2000, FASEB J., 14: 1041-1060; Nielsen y otros, 1999, Curr. Issues Mol. Biol., 1: 89-104).

Los oligonucleótidos que contienen metilfosfonato son análogos de ADN neutros que contienen un grupo metilo en lugar de uno de los fosforil oxígenos no enlazantes. Los oligonucleótidos con enlaces de metilfosfonato fueron de los primeros en inhibir la síntesis de proteínas a través del bloqueo antisentido de la traducción. Sin embargo, el proceso sintético produce moléculas quirales que deben separarse para producir monómeros quiralmente puros para la producción personalizada de oligonucleótidos (Reynolds y otros, 1996, Nucleic Acids Res., 24: 4584-4591).

En una modalidad, las sondas de oligonucleótidos específicas de la diana usan un esqueleto de azúcares modificados unidos por enlaces fosfodiéster internucleotídicos. Los azúcares modificados pueden incluir análogos de furanosa, que incluyen, entre otros, 2-desoxirribofuranósidos, a-D-arabinofuranósidos, a-2'-desoxirribofuranósidos y 2',3'-didesoxi-3'-aminoribofuranósidos. En modalidades alternativas, los grupos 2-desoxi-p-D-ribofuranosa pueden reemplazarse con otros azúcares, por ejemplo, p-D-ribofuranosa. Además, la p-D-ribofuranosa puede estar presente en donde el 2-OH del resto de ribosa está alquilado con un grupo alquilo Ci-6 (2-(O--alquil Ci-6) ribosa) o con un grupo alquenilo C^2-6 (2-(O--alquenil C²-⁶) ribosa), o se sustituye por un grupo fluoro (2-fluororribosa).

Los azúcares formadores de oligómeros relacionados incluyen los que se usan en los "ácidos nucleicos bloqueados" (LNA), que son ácidos nucleicos bicíclicos en los que un ribonucleósido (que incluye, por ejemplo, un anillo de furanosa) se une entre los átomos de 2'-oxígeno y 4'-carbono con una unidad de metileno. Los LNA fueron descritos por primera vez por Wengel y colaboradores como una clase de análogos de oligonucleótidos restringidos conformacionalmente (Koshkin y otros, Tetrahedron, 54: 3607-3630 (1998); Singh y otros, Chem. Comm., 4: 455-456 (1998). Los nucleótidos de LNA ejemplares incluyen unidades monoméricas bicíclicas modificadas con un puente de metileno 2'-O-4'-C, tales como las descritas en la patente de EE.UU. No.6,268,490.

Pueden prepararse oligonucleótidos que contienen a-D-arabinofuranósidos como se describe en la patente de EE.UU. No. 5,177,196. Los oligonucleótidos que contienen 2',3'-didesoxi-3'-aminorribofuranósidos se describen en Chen y otros. Nucleic Acids Res. 23:2661-2668 (1995). Synthetic procedures for locked nucleic acids (Singh y otros, Chem. Comm., 455-456 (1998); Wengel J., Acc. Chem. Res., 32:301-310 (1998)) y también se han descrito oligonucleótidos que contienen 2'-halógeno-2'-desoxirribofuranósidos (Palissa y otros, Z. Chem. 27: 216 (1987)).

Las tapas de estilbeno o pirenilo estabilizantes dúplex incluyen tapas de trimetoxiestilbeno y pirenilmetilpirrolindol (Glen Research, Sterling, VA).

También pueden usarse otros restos de azúcar compatibles con la hibridación del oligonucleótido, y se conocen por los expertos en la técnica, que incluyen, entre otros, a-D-arabinofuranósidos, a-2'-desoxirribofuranósidos o 2',3'-didesoxi-3'-aminorribofuranósidos. Pueden prepararse oligonucleótidos que contienen a-D-arabinofuranósidos como se describe en la patente de EE.UU. No. 5,177,196. Los oligonucleótidos que contienen lados 2',3'-didesoxi-3'-aminoribofurano se describen en Chen y otros. Nucleic Acids Res. 23: 2661- 2668 (1995).

Los oligonucleótidos químicamente modificados también pueden incluir, solos o en cualquier combinación, modificaciones de azúcar en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5 (por ejemplo, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N- [2-(1 H-indol-3il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[1-(3-tri-metilamonio)propil]carboxiamida)-cloruro de 2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina y 5-(N- [1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2'-desoxiuridina), modificaciones de purina de 8 posiciones, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo- o 5-yodo-uracilo, metilaciones, combinaciones inusuales de apareamiento de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares.

La cadena principal de fosfato en la(s) sonda(s) específica de la diana puede emplear oligonucleótidos que contienen enlaces fosforotioato o fosforamidatos (Chen y otros, Nucl. Acids Res., 23: 2662-2668 (1995)). También pueden usarse combinaciones de tales enlaces oligonucleotídicos.

En otra modalidad, el extremo de la sonda 5' o 3' en la sonda específica de la diana puede bloquearse para reducir o eliminar el reconocimiento por una helicasa. En una modalidad, al menos uno de los extremos de la sonda 5' o 3' se modifica o bloquea mediante taponamiento o mediante la incorporación de un modificador terminal o un modificador espaciador adecuado como se describe más adelante (Glen Research, Sterling, VA). A manera de ejemplo, un extremo de la sonda 3'-OH no unido puede modificarse o bloquearse para evitar la incorporación de la sonda en un producto de extensión del cebador por una polimerasa durante la amplificación. Esto puede lograrse mediante: (i) eliminar el 3'-OH; (ii) incorporar un nucleótido que carece de 3'-OH, tal como didesoxinucleótido; (iii) incorporar cordicepina (3'-desoxiadenosina) y otras bases 3' sin un resto 3'-OH; (iv) incorporar un espaciador que carece de un 3'-OH, tal como un espaciador de propilo C3; (v) incorporar un grupo amina o fosfato; o (vi) cualquier otra modificación química que haga inerte la sonda como cebador para la extensión del cebador, como conocen los expertos en la técnica. La incorporación de un marcador de biotina en el hidroxilo 3' del último nucleótido puede tener un doble fin al actuar también como un marcador para la detección o captura posterior del ácido nucleico unido al marcador.

En un aspecto adicional, la sonda puede modificarse o diseñarse con otras funcionalidades aumentando la utilidad del sistema de amplificación /detección. En una modalidad particular, la sonda incluye o se une químicamente a un enlazador escindible que facilita la liberación de dúplex híbridos del soporte sólido recubierto para la amplificación y/o detección adicionales. El diseño y uso de conectares escindibles en sondas de oligonucleótidos se describe en la patente de EE.UU. 5,380,833, 6,060,246, 6,027,879, y 7,291,471 y la solicitud de patente de EE.UU. No.

2005/0106576. Los modificadores de oligonucleótidos fotoescindibles, incluidos los modificadores de espaciadores fotoescindibles, están disponibles comercialmente (Glen Research, Sterling, VA).

En un aspecto adicional, la sonda puede incluir o estar unida químicamente a un modificador terminal o modificador espaciador en el extremo 5', el extremo 3' o ambos. Puede incorporarse un modificador terminal o un modificador espaciador para aumentar la distancia entre las secuencias diana de la sonda de captura y la superficie del soporte sólido recubierto y/o para reducir o eliminar el reconocimiento de una enzima de amplificación isotérmica o la desnaturalización enzimática por una enzima de amplificación isotérmica cuando se une a un polinucleótido diana. Ejemplos de modificadores terminales y modificadores espaciadores incluyen, por ejemplo, una variedad de modificadores 5'-amino, modificadores 3-amino y modificadores químicamente derivatizados de los mismos disponibles comercialmente; fosforamidatos espaciadores para insertar brazos espaciadores de longitud variable; espaciadores para introducir sitios abásicos dentro de un oligonucleótido; y modificadores de espaciadores fotoescindibles (Glen Research, Sterling, VA).

Las sondas de captura específicas de la diana pueden unirse directa o indirectamente a cualquier componente del soporte sólido recubierto, incluido el soporte sólido, la capa catiónica, un material que mejora la densidad de la sonda o una superficie de soporte sólido adecuadamente modificada. La sonda puede unirse covalente o no covalentemente por su extremo 5' o 3' al soporte sólido recubierto. La sonda puede unirse covalentemente a través de grupos funcionales catiónicos directamente o mediante grupos funcionales incorporados a la misma con el fin de facilitar esta unión. Para facilitar la unión a cualquier parte del soporte sólido recubierto, las sondas pueden modificarse o diseñarse para incluir en sus extremos terminales 5' o 3' una variedad de grupos funcionales para mejorar la conjugación con otros elementos basados en polímeros o ácidos nucleicos. Los grupos funcionales ejemplares incluyen grupos amino, hidrazida, aldehído y sulfhidrilo.

Una pluralidad de sondas específicas de la diana iguales o diferentes pueden unirse directa o indirectamente a la capa catiónica o un soporte sólido modificado con catión. Cualquiera de los extremos de la molécula de ADN (extremo 5' o 3') en la sonda de captura específica de la diana puede unirse al soporte sólido o a la capa catiónica. Además, como se describió anteriormente, los extremos de la sonda de captura no unidos pueden bloquearse para reducir el reconocimiento de la helicasa o las extensiones del cebador a partir de ellos.

En una modalidad, la sonda de captura se une a un polímero policatiónico en la capa catiónica. En otra modalidad, la sonda de captura se une a un silano catiónico, siloxano catiónico o derivado catiónico en la capa catiónica. En una modalidad preferida, la sonda de captura se une a un polímero catiónico (tal como phe-lys) derivatizado con una funcionalidad de aldehído.

Un soporte sólido recubierto puede incluir un tipo de sonda específica de la diana de una sola especificidad o una pluralidad de sondas específicas de la diana diferentes con especificidades múltiples para detectar una pluralidad de secuencias dianas diferentes de un organismo, una pluralidad de organismos diferentes o combinaciones de los mismos. La(s) sonda(s) puede unirse a un área discreta en el soporte sólido como un punto o a una pluralidad de áreas discretas en forma de una matriz.

II. Métodos para amplificar y detectar polinucleótidos dianas

1. Sistema de detección de amplificación /hibridación

Los soportes sólidos recubiertos están configurados para permitir la amplificación, hibridación y detección isotérmicas en un solo dispositivo de detección. Un proceso de amplificación isotérmica es particularmente adecuado para su uso en tal dispositivo, ya que no requiere altas temperaturas de desnaturalización por calor para la amplificación del ADN que pueden ser incompatibles con los materiales usados en un dispositivo acoplado de amplificación /hibridación /detección.

Se describe un método para amplificación /hibridación /detección de polinucleótidos diana(s) en una muestra que incluye aplicar la muestra y un medio de reacción a un soporte sólido recubierto compuesto por un sustrato sólido, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. En el método de la invención, la amplificación /hibridación /detección incluye un soporte sólido recubierto compuesto por un sustrato sólido y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. Los polinucleótidos dianas de la muestra se amplifican luego mediante un proceso de amplificación isotérmica y al mismo tiempo se hibridan con las sondas específicas de la diana. Tras la amplificación de los ácidos nucleicos en la muestra durante un período de tiempo suficiente para la detección, los polinucleótidos dianas pueden hibridarse con las sondas específicas de la diana que se unen al soporte sólido recubierto.

El sistema acoplado de amplificación /hibridación /detección incluye un proceso de amplificación isotérmico que usa la helicasa, capaz de desenrollar los productos de amplificación sintetizados. Los productos de amplificación de una sola cadena desenrollados pueden hibridarse con cebadores de amplificación, volver a hibridar con cadenas complementarias o hibridar con sondas inmovilizadas en la superficie de un soporte sólido recubierto. Los polinucleótidos pueden amplificarse e hibridarse con el soporte sólido recubierto en condiciones de bajo contenido de sal o someterse a una etapa opcional de hibridación de alto contenido de sal (para mejorar la sensibilidad), seguida de lavados con bajo contenido de sal y detección de los complejos unidos.

En un aspecto, los polinucleótidos dianas en la muestra se purifican inicialmente por hibridación sobre un soporte sólido recubierto y luego se transfieren a un segundo soporte sólido recubierto para el proceso de amplificación /hibridación /detección acoplado. En este caso, los polinucleótidos dianas unidos a sondas específicas de la diana escindibles se eluyen de un primer soporte sólido recubierto y luego se aplican a un segundo soporte sólido recubierto para amplificación por HDA. Después de lavados convencionales para eliminar polinucleótidos unidos de forma no específica y otros polinucleótidos o componentes de reacción, se escinden las sondas específicas de la diana escindibles unidas al soporte recubierto, por lo que las sondas escindidas, incluidas las hibridadas con los polinucleótidos dianas, se someten a amplificación isotérmica sobre un segundo soporte sólido recubierto. Los productos de amplificación hibridados con el segundo soporte sólido recubierto pueden detectarse directamente en condiciones de bajo contenido de sal o, opcionalmente, someterse a un paso corto de hibridación de alto contenido de sal (por ejemplo, 15 a 30 minutos) (para mejorar la sensibilidad), seguido de lavados con bajo contenido de sal y detección de complejos. Alternativamente, los complejos unidos pueden someterse a ciclos adicionales de elución, amplificación y/o hibridación antes de la detección.

2. Sistema de hibridación /detección

Se describe un método que incluye la aplicación de una muestra y un medio de reacción a un soporte sólido recubierto compuesto por un soporte sólido y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. El soporte sólido recubierto puede incluir además una capa catiónica como se describe anteriormente. Se proporcionan las condiciones y reactivos adecuados para desnaturalizar polinucleótidos dianas en la muestra mediante un proceso enzimático, seguido de la hibridación de los polinucleótidos dianas desnaturalizados enzimáticamente en la muestra con las sondas específicas de la diana. En un paso final, se detecta la presencia o ausencia de polinucleótidos dianas unidos a las sondas.

Se describe además que el sistema de hibridación /detección incluye aplicar una muestra y un medio de reacción a un soporte de silicio recubierto compuesto por un soporte sólido, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana unidas al soporte sólido recubierto. El soporte de silicio recubierto no comprende una capa de recubrimiento capaz de mediar en la detección visual de polinucleótidos dianas por interferencia destructiva. En una modalidad particular, el lado rugoso de un soporte de silicio se recubre con la capa catiónica y la pluralidad de sondas específicas de la diana. Se proporcionan condiciones y reactivos adecuados para hibridar polinucleótidos dianas en la muestra con las sondas específicas de la diana. Por ejemplo, los polinucleótidos dianas pueden desnaturalizarse enzimáticamente antes de la etapa de hibridación como se describe anteriormente. En un paso final, se detecta la presencia o ausencia de polinucleótidos dianas unidos a las sondas. En una modalidad particular, las etapas de hibridación y detección pueden llevarse a cabo en condiciones de bajo contenido de sal como se describe anteriormente. Como se describió anteriormente, cuando se usa junto con una capa catiónica, las etapas de hibridación y detección pueden llevarse a cabo en condiciones de bajo contenido de sal, y pueden incluir opcionalmente también una etapa de hibridación en alto contenido de sal de 15 a 30 minutos.

3. Amplificación isotérmica de polinucleótidos dianas

La amplificación de polinucleótidos dianas requiere necesariamente una helicasa adecuada. En una modalidad, todas las etapas de desnaturalización y amplificación se llevan a cabo enzimáticamente en condiciones de temperatura isotérmica. En otra modalidad, la muestra del polinucleótido se desnaturaliza inicialmente mediante desnaturalización térmica antes de la etapa de hibridación del cebador, y luego se desnaturaliza enzimáticamente durante las etapas posteriores de amplificación /hibridación. Alternativamente, o además, la muestra del polinucleótido puede amplificarse en fase de solución primero y luego desnaturalizarse por calor antes de la hibridación y detección de los productos de amplificación en el soporte sólido recubierto.

La amplificación dependiente de helicasa (HDA) ejemplar se describe en la patente de EE.UU. No. 7,282,328.

Un proceso de HDA requiere una preparación de la polimerasa para la síntesis de productos de amplificación y una preparación de la helicasa para facilitar la desnaturalización enzimática y la hibridación de cebadores de amplificación con los polinucleótidos dianas amplificados. Una preparación de la helicasa adecuada incluye al menos un tipo de helicasa sola o en combinación con un producto accesorio de helicasa, como las proteínas de unión de simple cadenas (SSB). Preferentemente, la helicasa es una helicasa termoestable, que es capaz de mediar la HDA en ausencia de productos accesorios adicionales.

El término "helicasa" se refiere a cualquier enzima capaz de desenrollar o desnaturalizar enzimáticamente un ácido nucleico solo o en combinación con una proteína accesoria helicasa. Las helicasas pueden desenrollar ácidos nucleicos de doble cadenas en las direcciones '5 o 3'. Las helicasas se encuentran en todos los organismos y se usan en procesos enzimáticos que involucran ácidos nucleicos, incluida la replicación, recombinación, reparación, transcripción, traducción y empalme de ARN. En las presentes modalidades de la invención puede usarse cualquier helicasa que se transloque a lo largo del ADN o ARN en una dirección 5' a 3' o en la dirección opuesta 3' a 5'. Esto incluye helicasas obtenidas de procariotas, virus, arqueas y eucariotas o formas recombinantes de enzimas naturales, así como análogos o derivados que tienen la actividad especificada. Ejemplos de helicasa de ADN de origen natural incluyen helicasa I, II, III y IV de E. coli, helicasa UvrD, helicasa Rep, helicasa RecQ, helicasa PcrA, helicasa RecBCD, helicasa DnaB, PriA, PcrA, helicasa T4 Gp41, helicasa T4 Dda, helicasas T7 Gp4, antígeno T grande de SV40, helicasas de herpesvirus, incluyendo la helicasa HSV-1, levadura RAD, helicasa Sgs1 de levadura, helicasas dependientes de DEAH_ATP, helicasa RecQ, helicasas UvrD termoestables de T. tengcongensis y T. thermophilus, helicasa DnaB termoestable de T aquaticus, MCM helicasa, así como análogos, homólogos, helicasas termoestables, variantes de helicasa modificadas genéticamente de los anteriores, o cualquiera de las helicasas descritas en la patente de EE.UU. No. 7,282,328.

En determinadas circunstancias, las helicasas (especialmente las helicasas mesófilas) requieren o exhiben una actividad mejorada en presencia de proteínas de unión de simple cadena (SSB), un cofactor de helicasa conocido por estabilizar los ácidos nucleicos de simple cadenas. En estas circunstancias, la elección de SSB generalmente no se limita a una proteína específica. Los ejemplos de proteínas de unión de simple cadena incluyen la proteína T4 del gen 32, E. coli SSB, T7 gp2.5 SSB, fago phi29 SSB (Kornberg y Baker, supra (1992)) y formas truncadas de las mencionadas anteriormente. Las composiciones y métodos para la HDA se describen en la patente de EE.UU. No.

7,282,328.

Puede usarse una variedad de polimerasas diferentes para amplificar polinucleótidos dianas. El uso de estas polimerasas puede seleccionarse basándose en la procesividad y la actividad de desplazamiento de la cadena.

Después de la fusión y la hibridación con un cebador, el ácido nucleico se somete a una etapa de polimerización. Se selecciona una ADN polimerasa si el ácido nucleico a amplificar es ADN. Cuando la diana inicial es ARN, se usa primero una transcriptasa inversa para copiar la diana de ARN en una molécula de ADNc y luego el ADNc se amplifica adicionalmente en HDA mediante una ADN polimerasa seleccionada. La ADN polimerasa actúa sobre el ácido nucleico diana para extender los cebadores hibridados con las plantillas de ácido nucleico en presencia de cuatro dNTP para formar productos de extensión de cebadores complementarios a la secuencia de nucleótidos en la plantilla de ácido nucleico.

En una modalidad, la ADN polimerasa se selecciona de un grupo de polimerasas que carecen de actividad exonucleasa 5' a 3' y que además pueden carecer de actividad exonucleasa 3'-5 '. Los ejemplos de ADN polimerasas incluyen un fragmento de Klenow deficiente en exonucleasa de la ADN polimerasa I de E. coli (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), una ADN polimerasa T7 deficiente en exonucleasa (Sequenase; USB, (Cleveland, Ohio)), un fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), un fragmento grande de la ADN polimerasa Bst (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), ADN polimerasa KlenTaq (AB Peptides, (St Louis, MO)), ADN polimerasa T5 (Patente de EE.UU No. 5,716,819), y ADN polimerasa Pol III (Patente de EE.^u U No. 6,555,349).

Las ADN polimerasas que poseen actividad de desplazamiento de cadena, tales como el fragmento Klenow deficiente en exonucleasa de la ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento grande de la ADN polimerasa Bst y la Sequenasa, se prefieren para la amplificación dependiente de helicasa. La polimerasa T7 es una polimerasa de alta fidelidad que tiene una tasa de error de 3,5 x 105 que es significativamente menor que la polimerasa Taq (Keohavong y Thilly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9253 9257 (1989)). Sin embargo, la polimerasa T7 no es termoestable y, por lo tanto, no es óptima para su uso en sistemas de amplificación que requieren termociclado o que se mejoran a temperaturas más altas. La T7 Sequenasa es una polimerasa preferida para la amplificación de ADN mediante procesos HDA isotérmicos.

4. Hibridación de polinucleótidos dianas

Las condiciones adecuadas para promover la formación de complejos de hibridación entre la sonda específica de la diana y su cadena complementaria en el polinucleótido diana para producir un complejo de hibridación se conocen bien en la técnica. Como saben los expertos en la técnica, la especificidad de la hibridación puede verse influida por la longitud y la composición del cebador del oligonucleótido, la temperatura a la que se realiza la reacción de hibridación, la fuerza iónica y el pH. Las condiciones adecuadas pueden determinarse empíricamente. Las condiciones de hibridación pueden incluir los componentes químicos y sus concentraciones (por ejemplo, sales, agentes quelantes, formamida) de una solución acuosa u orgánica que contiene los ácidos nucleicos y la temperatura de la mezcla. Otros factores bien conocidos, tales como la duración del tiempo de incubación y la naturaleza física y las dimensiones del soporte sólido, pueden contribuir a un entorno apropiado para la hibridación y también pueden modificarse como conocen los expertos en la técnica. Los complejos unidos pueden lavarse para eliminar polinucleótidos no hibridados y otros componentes de reacción antes de la amplificación o detección adicional de polinucleótidos dianas.

5. Detección de polinucleótidos dianas

Los polinucleótidos dianas unidos a sondas complementarias específicas de la diana sobre soportes sólidos recubiertos en los sistemas de amplificación /detección acoplada o hibridación /detección descritos anteriormente pueden detectarse usando cualquier metodología de detección adecuada conocida por los expertos en la técnica. La detección puede proporcionarse mediante características tales como cambio de color, luminiscencia, fluorescencia o radiactividad. Normalmente, la detección de polinucleótidos dianas se facilita mediante el complejo con un marcador o reportero adecuado. Un marcador adecuado puede incluir cualquier resto o grupo molecular que tenga una característica física o química capaz de producir una respuesta o señal que sea directa o indirectamente detectable y/o medible, por ejemplo, catalizando una reacción que produzca una señal ópticamente detectable. El marcador puede incorporarse a los materiales de partida antes o durante la finalización de cualquiera de las etapas de amplificación, hibridación y/o detección.

Los ejemplos de marcadores incluyen, pero no se limitan a, tintes cromogénicos o sustratos que facilitan la detección colorimétrica; restos luminiscentes, incluidos compuestos fluorescentes, bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes; compuestos hapténicos o antigénicos usados en combinación con un anticuerpo adecuadamente marcado; miembros de un par de unión específico que contienen un sitio de reconocimiento de ligando (por ejemplo, biotina y avidina); enzimas; sustratos de enzimas, radioisótopos; complejos metálicos; partículas magnéticas; transmisores de radiofrecuencia y similares. Además, el marcador puede incluir una variedad de grupos reactivos diferentes o funcionalidades químicas adecuadas para la unión a una variedad de agentes biomoléculas.

En una modalidad, el marcador incluye una reacción de catálisis enzimática de sustratos para producir productos coloreados, fluorescentes, luminiscentes, densos en electrones o radiactivos. Más particularmente, el marcador puede unirse a polinucleótidos dianas unidos para formar un complejo marcador de polinucleótidos precipitable cromogénico de un tamaño y composición tales que la luz dispersada del complejo al iluminarse con luz blanca puede ser detectada por el ojo humano, preferentemente sin aumento.

Los marcadores de enzimas ejemplares incluyen peroxidasas, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina o ácida, galactosidasa, glucosa oxidasa, NAD-Pasa, luciferasa, carboxipeptidasa y similares. En algunas modalidades, la detección visual directa puede mejorarse usando una enzima que cataliza la formación de productos precipitables que contienen cromóforos que producen un cambio de color visible. Los precipitados coloreados pueden controlarse, por ejemplo, mediante espectrofotometría, escaneo de superficie plana, microscopía o a simple vista. Ejemplos de enzimas que catalizan la formación de productos precipitables que contienen cromóforos incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa.

Los marcadores enzimáticos pueden suministrarse en forma de conjugados enzima/miembro de unión o conjugados anticuerpo-enzima. Ejemplos de conjugados de enzima incluyen conjugados de estreptavidina /HRP y anticuerpo anti-biotina /HRP. Los sustratos cromogénicos ejemplares para HRP incluyen 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB), 3,3'-diaminobencidina (DAB) y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC). La TMB es un sustrato no precipitante que actúa como donante de electrones para la conversión de peróxido de hidrógeno en agua. La TMP se convierte enzimáticamente en un complejo coloreado detectable visualmente por HRP. Los sustratos cromogénicos ejemplares para la fosfatasa alcalina incluyen BCIP /NBT, Fast Red y AP-Orange. Las enzimas unidas a avidina y los sustratos cromogénicos están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Pierce Chemical Company (Rockville, III.) y Sigma (St. Louis, MO). El marcaje enzimático y la detección se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 4,789,630.

Los miembros del par de unión que contienen un sitio de reconocimiento de ligando, como biotina y avidina, pueden incorporarse en cualquiera de los cebadores de amplificación o en las sondas específicas de la diana.

Los métodos de detección fluorométrica se basan en la emisión de fotones o excitones de menor energía o diferente longitud de onda de ciertas moléculas después de la excitación a una longitud de onda adecuada que se encuentra en la luz ultravioleta, por ejemplo. Existe una variedad de moléculas fluorescentes conocidas por los expertos en la técnica que pueden servir como reporteros que pueden detectarse y cuantificarse, después de la excitación a una longitud de onda adecuada, con varios aparatos tales como fluorómetros, escáneres de fluorescencia confocal, microscopios, etc. La detección de polinucleótidos dianas pueden facilitarse incorporando marcadores o colorantes fluorescentes en los cebadores de amplificación como conocen los expertos en la técnica.

La detección quimioluminiscente se basa en enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante, que pueden convertir un sustrato con emisión concomitante de luz que puede detectarse mediante autorradiografía (fase sólida) o luminometría (fase líquida).

La detección electroquímica se realiza generalmente en la superficie de los electrodos, por lo que las reacciones de óxido-reducción de las moléculas indicadoras producen electrones que pueden controlarse usando un aparato adecuado, como un potenciostato.

En otra modalidad, pueden usarse polímeros catiónicos para la detección basada en electrostática de polinucleótidos dianas unidos a sondas de captura en los soportes sólidos recubiertos de la presente invención. Las metodologías de detección de ácido nucleico basadas en polímeros catiónicos se basan típicamente en interacciones electrostáticas entre polímeros cargados positivamente y ácidos nucleicos cargados negativamente (solicitud de patente pendiente PCT /CA02 /00485; Ho y otros, 2002, Angew. Chem. Int. Ed., 41:1548-1551; Ho y otros, 2002, Polymer Preprints, 43:133-134; Nilsson y otros, 2003, Nat. Mater. 2: 419-424). Estos enfoques aprovechan una modificación de las propiedades ópticas o electroquímicas de los biosensores poliméricos tras la unión electrostática a una molécula de ácido nucleico cargada negativamente de simple cadena o de doble cadena. Estas interacciones macromoleculares se asocian con cambios conformacionales y de solubilidad que contribuyen a la generación de señales (Ho y otros, 2002, Angew. Chem. Int. Ed., 41:1548-1551). Estas tecnologías de detección basadas en polímeros no requieren ningún marcaje químico de la sonda o de la diana y pueden discriminar entre la hibridación específica y no específica de ácidos nucleicos que se diferencian por un solo ácido nucleotídico.

Los polímeros "reporteros" catiónicos ejemplares incluyen varios derivados de politiofeno, que incluyen derivados de politiofeno de ion híbrido fluorescente solubles en agua (Nilsson y otros, 2003, Nat. Mater. 2: 419-424) y conjugados de polifluoreno fenileno solubles en agua (Gaylord y otros, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 10954-10957), y poli(3,4-etilendioxitiofeno) (Krishnamoorthy y otros, 2004, Chem. Commun., 2004: 820 - 821). Las metodologías y reactivos de detección basados en polímeros catiónicos se describen adicionalmente en la solicitud de patente de EE.UU. Publ. Nos. 2004/0171001 y 2007/0178470.

La detección de marcadores de polinucleótidos puede facilitarse mediante el uso de un "marcador de amplificación", que es una molécula que puede amplificar el número de marcadores detectables que pueden unirse a un polinucleótido diana(s). Un marcador de amplificación puede comprender, por ejemplo, un polímero que se une específicamente a un polinucleótido diana y tiene una pluralidad de sitios de unión a los que pueden unirse marcadores para generar múltiples señales detectables en relación con uno o más polinucleótidos diana unidos. A manera de ejemplo, el marcador de amplificación puede ser un polímero que tenga una pluralidad de grupos amina que faciliten la unión covalente a una pluralidad de moléculas de biotina. Las moléculas de biotina pueden usarse para generar una señal detectable. Debido a que cada molécula de biotina genera una señal independiente, hay múltiples señales generadas en relación con un polinucleótido diana unido a la que se une el polímero, amplificando así la señal correspondiente a la misma.

III. Estuches para la amplificación y/o detección de polinucleótidos dianas

Se describe un estuche para la amplificación isotérmica que incluye un soporte sólido recubierto descrito anteriormente y una o más enzimas colectivamente suficientes para un proceso de amplificación isotérmica. En una modalidad particular, el soporte sólido recubierto incluye una capa catiónica. En otra modalidad, el soporte sólido recubierto se une a al menos una sonda específica de la diana formada a partir de un oligonucleótido modificado o incorporado con un elemento estructural que reduce o elimina el reconocimiento por una enzima de amplificación isotérmica cuando se une a un polinucleótido diana como se describió anteriormente.

Cuando se suministra como un estuche, cualquiera de los componentes o reactivos diversos puede envasarse en recipientes separados y mezclarse antes de su uso con los soportes sólidos de la presente invención. Dicho embalaje separado de los componentes permite un almacenamiento a largo plazo. Así, por ejemplo, un estuche puede suministrar enzimas de amplificación anhidras y/o sustratos de enzimas y tampones para reconstituir las enzimas y/o sustratos de enzimas. Se contempla cualquier tampón diseñado para mantener un pH adecuado en las condiciones de reacción de la presente invención. Las preparaciones anhidras pueden liofilizarse, en las que el agua se elimina al vacío, se liofiliza, se cristaliza o se prepara usando cualquier otro método para eliminar el agua para preservar la actividad de los reactivos anhidros. Pueden añadirse excipientes a estas preparaciones para estabilizar estos reactivos, tales como albúminas séricas o Prionex. En otras modalidades, los reactivos pueden suspenderse en una composición acuosa que comprende, por ejemplo, glicerol u otros disolventes en los que las enzimas y /u otros reactivos son estables.

El estuche puede incluir además reactivos de lisis celular (incluidos detergentes no iónicos (tales como de la serie Triton), detergentes catiónicos, detergentes aniónicos, detergentes de ion híbrido y similares); uno o más medios de reacción para la hibridación de polinucleótidos dianas con las sondas y para la eliminación de componentes de reacción unidos inespecíficamente; tampones de neutralización; tampones de lavado y cualquiera de los reactivos o soluciones de detección descritos anteriormente para la detección de polinucleótidos dianas unidos a las sondas. Los estuches pueden incluir reactivos en recipientes separados para facilitar la ejecución de una prueba específica, como la lisis celular o la amplificación en fase de solución. Pueden suministrarse polinucleótidos y pares de cebadores usados como controles internos o controles positivos con respecto a la hibridación y/o amplificación. El estuche puede suministrar un componente de recolección de muestras, como una membrana, un filtro o un hisopo. Los reactivos incluidos en los estuches pueden suministrarse en envases de cualquier tipo de manera que se conserve la vida de los diferentes componentes y no se adsorben o alteren por los materiales del envase. Por ejemplo, las ampollas de vidrio selladas pueden contener enzimas liofilizadas o tampones que se han envasado en un gas neutro que no reacciona, como nitrógeno. Las ampollas pueden consistir en cualquier material adecuado, como vidrio, polímeros orgánicos, como policarbonato, poliestireno, etc., cerámica, metal o cualquier otro material empleado típicamente para contener reactivos. Otros ejemplos de recipientes adecuados incluyen botellas simples que pueden fabricarse a partir de sustancias similares como ampollas y sobres, que pueden consistir en interiores forrados con papel metálico, como aluminio o una aleación. Otros recipientes incluyen tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas o similares. Los contenedores pueden tener un puerto de acceso estéril, como una botella con un tapón que puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica. Otros recipientes pueden tener dos compartimentos que están separados por una membrana fácilmente removible que al ser removida permite mezclar los componentes. Las membranas removibles pueden ser de vidrio, plástico, caucho, etc.

Los estuches pueden suministrarse además con un conjunto de instrucciones para usar el contenido de un estuche determinado. Las instrucciones pueden estar impresas en papel u otro sustrato y/o pueden suministrarse como un medio de lectura electrónica, como un disquete, CD-ROM, DVD-ROM, disco Zip, cinta de video, cinta de audio, etc. Las instrucciones detalladas pueden no estar asociadas físicamente con el estuche; en cambio, un usuario puede dirigirse a un sitio web de Internet especificado por el fabricante o distribuidor del estuche, o suministrado como correo electrónico. Las instrucciones pueden instruir al usuario del estuche en cualquier aspecto de los métodos, pasos del método o metodologías descritos anteriormente relacionados con la práctica de la presente invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar en la comprensión de la invención y no se interpretan como limitaciones de la misma.

Ejemplo 1

Preparación del soporte recubierto específico de la diana.

Los biosensores de silicio de "lado rugoso" empleaban una oblea de silicio que tenía un lado pulido y un lado sin pulir, por lo que la superficie del lado "rugoso" sin pulir se usaba para recubrimientos y pruebas. Los biosensores de capa fina (Inverness Medical-Biostar; Jenison y otros., Expert Rev. Molec. Diagn., 2006) emplearon obleas de silicio recubiertas en un lado pulido con ~ 475 angstroms de nitruro de silicio, seguido de un recubrimiento con ~ 135 angstroms de aminoalquil polidimetil isiloxano con estructura en T (United Chemical Technologies) como capa de unión. Las superficies se revistieron con 5 pg /ml de poli (lys-phe) (Sigma) en 1X PBS pH 6, NaCl 2 M durante la noche a temperatura ambiente con rotación. Las superficies se lavaron con agua y luego se recubrieron con SFB 10 pM (succinimidil formil benzoato (Solulink) en borato 0,1 M a pH 8,5) para convertir los grupos amino libres en aldehidos libres para crear enlaces hidrazona estables con sondas de captura modificadas con hidrazida. Después del recubrimiento con SFB, las obleas se lavaron extensamente con agua, se secaron con una corriente de nitrógeno y se almacenaron en una caja seca purgada con nitrógeno. Las sondas de captura de ADN, modificadas en el extremo 5' con enlaces de hidrazida, se diluyeron a 50, 150 y 500 nM en tampón Spotting (fosfato 100 mM a pH 8, glicerol al 10 %). Se esparció 1 pl de cada dilución sobre una superficie modificada con SFB. La sonda se incubó en un ambiente húmedo durante 2 a 16 horas. A continuación, las superficies se lavaron con agua y se trataron con SDS al 0,1 % a > 37 °C durante 2 a 16 horas para eliminar la sonda de captura adsorbida de forma suelta. Las superficies se lavaron de nuevo con agua, se secaron y se almacenaron en una caja seca purgada con nitrógeno protegida de la luz.

Ejemplo 2

Cebadores y sondas

Las secuencias de oligonucleótidos de cebadores y sondas se diseñaron usando el software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) con secuencias de entrada descargadas del repositorio de secuencias genéticas de GenBank. Las secuencias usadas en estos estudios se muestran en la Figura 9. Los cebadores inversos se modificaron en sus extremos 5' con biotinTEG (5"-BT) (Glen Research, Sterling VA) para facilitar la detección de secuencias amplificadas. Las sondas de captura específicas de la diana (CP) se modificaron en sus extremos 5' con un enlazador 5'-I (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) y un espaciador iS18 (Glen Research, Sterling VA) para facilitar la inmovilización a los grupos de aldehido de la superficie con espaciado optimizado para la hibridación del ADN. Los tamaños del amplicón en los Ejemplos siguientes fueron 82, 84 o 116 pares de bases para los amplicones L, J y Q mecA, respectivamente, y 95 pares de bases para el amplicón ApoB . Ejemplo 3

Protocolo de HDA en superficie

Para la HDA en superficie, las superficies se aseguraron en pocillos de placa de micropocillos usando cinta de doble cara. Se preparó una mezcla maestra usando reactivos del estuche ^h D^a Universal II (BioHelix Corp., Beverly, MA) añadiendo lo siguiente (concentración 1X): tampón de hibridación 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCI 10 mM), NaCl 40 mM, MgSO⁴4 mM, dNTP 400 pM, dATP 3 mM, 0,1 pm cada par de cebadores, mezcla de enzima helicasa 1X y agua estéril hasta el volumen. La mezcla maestra se dividió en alícuotas (74 pl) sobre la superficie de cada pocillo. Se añadió ADN genómico de MRSA purificado o extraído (1 pl) a cada reacción y la superficie de la placa se cubrió con cinta de sellado (Roche) y se incubó a 65 °C (placa caliente o incubadora) durante un período de tiempo apropiado, generalmente 45 minutos. Después de la amplificación, se eliminó el sobrenadante y la(s) superficie(s) se lavaron con el lavado A (0,1X SSC, 0,1 % SDS) seguido del lavado B (0,1X SSC). A continuación, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón anti-biotina conjugado con HRP diluido 1 /1000 en tampón de hibridación 1X (5X SSC, 0,1 % SDS, 0,5 % StabilCoat (Surmodics)) a la(s) superficie(s) de soporte recubierto y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después, la(s) superficie(s) se lavaron con el lavado B y se incubaron con 125 pl de TMB a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, la(s) superficie(s) se lavaron con agua y metanol y se dejaron secar.

Ejemplo 4

La hibridación de dianas de ADN de doble cadena con sondas específicas de la diana inmovilizadas en la superficie se hace posible usando la helicasa para desenrollar la diana de doble cadena.

Para demostrar que la helicasa puede desnaturalizar suficientemente los moldes de ADN de doble cadena para crear regiones de simple cadenas disponibles para la hibridación con sondas específicas de la diana, se amplificaron polinucleótidos dianas mecA de ADN de Staphylococcus aureus resistente a meticilina en un tubo de microtitulación (25 pL) durante 60 minutos usando el conjunto de cebadores mecA L como se describe en el Ejemplo 3. Los productos (o amplicones) amplificados con HDA se diluyeron 1/500 en agua y se hibridaron con un chip biosensor de capa fina (Inverness Medical-Biostar, Inc.) adherido al fondo de una placa de microtitulación que contenía 90 pL de tampón de hibridación 1X o tampón IsoAmp II 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, NaCl 40 mM, MgSO444 mM). Para un control negativo (Chip A), se añadieron 10 pl de agua a un chip que contenía tampón de hibridación 1X. Para un control de desnaturalización por calor (chip B), se calentó una alícuota del amplicón de 10 pl a 95 °C durante 5 minutos y luego se añadió a una superficie de chip que contenía tampón de hibridación 1X. Para un control sin desnaturalización (Chip C), se añadieron 10 pL del amplicón diluido directamente a un chip que contenía tampón HDA 1X junto con 5 pL de tampón diluyente de helicasa (KCI 10 mM, Tris-HCI 1 mM, D^t T 0,1 mM, 0,01 EDTA mM, TX-100 al 0,01 %, glicerol al 5 % pH 7,4 de concentración final). Para la muestra diana desnaturalizada con helicasa (Chip D), se añadieron 5 pL de helicasa (150 ng en tampón diluyente de helicasa) a los 10 pL del amplicón diluido y se colocaron en un chip que contenía tampón HDA 1X. Todas las superficies se incubaron 15 minutos a 53 °C y luego se lavaron con el lavado A seguido del lavado B. A cada chip, se añadieron 125 pL del conjugado anticuerpo anti-biotina /HRP diluido 1 /1000 en tampón de hibridación 1X y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los chips se lavaron con el lavado B y luego se añadieron 125 ml de TMB. Los chips se incubaron otros 5 minutos, se lavaron con agua y metanol y se dejaron secar.

Como se muestra en la Figura 1, la hibridación del ADN diana requiere la desnaturalización del mismo, como se esperaba. En particular, la adición de helicasa a la diana produjo una señal positiva, aunque no tan fuerte como el control de desnaturalización por calor. Esto sugiere que la helicasa puede no ser tan eficaz como el calor para desnaturalizar la muestra. Sin embargo, cabe señalar que la helicasa no se incubó a su temperatura óptima (65 °C) para este estudio. Además, la sensibilidad de la detección del objetivo se reduce de 2 a 4 veces en tampón 1X HDA en comparación con el tampón de hibridación 1X a 53 °C (datos no mostrados). No obstante, este estudio ilustra que la helicasa es suficiente para desenrollar dianas de doble cadena para la hibridación con sondas inmovilizadas en la superficie.

Ejemplo 5

La disociación y detección de polinucleótidos dianas hibridadas de la superficie catiónica se ve afectada inesperadamente por la fuerza iónica.

Las secuencias del gen mecA en Staphylococcus aureus resistente a meticilina se amplificaron en un tubo de microtitulación (25 pl) durante 60 minutos usando el conjunto de cebadores mecA L como se describe en el Ejemplo 3. Los amplicones de una reacción de HDA se diluyeron 1 /5000 en tampón de hibridación 1X y se hibridaron en un chip biosensor de capa fina durante 15 minutos a 53 °C. Las superficies se lavaron con el lavado A y el lavado B. Luego se añadieron 100 pl de tampón IsoAmp II 1X o tampón de hibridación 1X y se incubaron a diversas temperaturas. Las reacciones se detuvieron en varios momentos lavando con el lavado A seguido del lavado B. A cada chip, se añadieron 125 pL del conjugado anticuerpo anti-biotina /HRP diluido 1 /1000 en tampón de hibridación 1X y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los chips se lavaron con el lavado B y luego se añadieron 125 pl de TMB. Los chips se incubaron otros 5 minutos, se lavaron con agua y metanol y se dejaron secar.

Como se muestra en la Figura 2, a 58,5 °C el ADN diana unido a la superficie se disoció rápidamente de la superficie del chip (ti^/2 ~ 30 minutos) en presencia del tampón de hibridación 1X con alto contenido de sal (que contenía un catión monovalente 825 mM). Por el contrario, todavía quedaba una fracción significativa de la diana en presencia de tampón IsoAmplI 1X (que contenía un catión monovalente 54 mM), incluso después de 4 horas a 58,5 °C. Experimentos adicionales realizados en un intervalo de temperaturas (53 °C a 64 °C) confirmaron que la disociación del ADN objetivo de la superficie fue más rápida a temperaturas más altas en tampón de hibridación 1X, como se esperaba para los dúplex de ADN (ti^/2 ~ 240 minutos a 53 °C y <<30 minutos a 64 °C, datos no mostrados). Las tasas de disociación de la superficie del soporte recubierto (como se refleja por la señal detectable), aunque no se determinan cuantitativamente aquí, parecen ser similares a los valores publicados en la literatura. Por el contrario, la disociación del ADN diana de la superficie fue mucho más lenta en el tampón IsoAmp II de menor fuerza iónica en condiciones iguales (ti^/2 >> 360 minutos a 53 °C y >> 240 minutos a 58,5 °C, datos no mostrados).

La expectativa convencional sería que los dúplex de ADN se disociaran más rápidamente en tampones de fuerza iónica más baja que exhiban menos estabilización de carga. Por lo tanto, los datos anteriores sugieren que la superficie con un carácter catiónico juega un papel en la disociación del ADN diana de la superficie. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que, en condiciones de alto contenido de sal, los cationes de la superficie están protegidos de interactuar con (y estabilizar) los polinucleótidos dianas hibridados. Por consiguiente, los polinucleótidos dianas pueden disociarse más libremente de la superficie. En condiciones de reacción de HDA con bajo contenido de sal, los cationes pueden conservar su capacidad de interacción electrostática con la cadena principal del ADN del polinucleótido diana, ralentizando o previniendo su disociación de la superficie aunque la diana ya no esté hibridada con la sonda inmovilizada en la superficie.

Ejemplo 6

Duplicación del tiempo para los cebadores MRSA en solución.

Se realizaron una serie de reacciones HDA usando una variedad de ADN de entrada de MRSA genómico (ATCC) (100-1.000.000 de copias) en una mezcla de reacción que contenía tampón de hibridación 1X (Tris-HCI 20 mM, pH 8,8, KCI 10 mM) (BioHelix), NaCl 40 mM, MgSO44 mM, dNTP de 400 pm, ATP 3 mM, 0,1 pm de cada cebador, mezcla de enzima helicasa 1X (BioHelix), EvaGreen 0,2X (Biotium, Inc.). Las muestras se colocaron en una placa óptica Roche LightCycler 480, se cubrieron con cinta de sellado y se colocaron en el Roche LightCycler 480. Las placas se incubaron a 65 °C y los datos se recogieron cada 60 segundos. EvaGreen es un colorante específico de doble cadena que confiere aumentos en la fluorescencia en función de la amplificación. El análisis de la curva de fusión se realizó después de la amplificación para verificar que se produjo un amplicón de longitud completa de la Tm esperada. La fidelidad de la amplificación se confirmó además mediante la hibridación con sondas específicas de la diana inmovilizadas en chips de silicio como se describió anteriormente. La incorporación de colorante se evaluó representando el tiempo hasta la señal detectable (CP) frente al número de copias del ADN genómico de entrada. La pendiente de las curvas produce tiempos de duplicación (tiempo para que el par de cebadores cree una copia) característicos de cada juego de cebadores. Este análisis proporciona una aproximación razonable de la cantidad esperada de amplicón presente en un momento dado. Dado que es probable que haya una pequeña fase de retraso que superar en las primeras etapas de la reacción HAD, las velocidades de duplicación reales pueden ser algo más rápidas que los tiempos de duplicación promedios aquí determinados.

Las Figuras 3A y 3B ilustran datos de amplificación representativos para conjuntos de cebadores dirigidos al gen mecA en la resistencia a meticilina en Staphylococcus. Se encontró que los pares de cebadores probados exhibían tiempos de duplicación en solución que variaban de aproximadamente 1 a 3 minutos. Aquellos con los tiempos de duplicación más cortos (y que se encontró que eran específicos para la amplificación de la diana) se eligieron para el desarrollo del ensayo adicional.

Ejemplo 7

Determinación del efecto del chip sobre la eficiencia de amplificación HDA.

Las reacciones de HDA se prepararon en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml o en un chip con 2000 copias de ADN humano purificado (Promega) como entrada para la amplificación. Se dejó que las reacciones prosiguieran durante varios períodos de tiempo y se detuvieron. Las reacciones de ambos conjuntos de muestras se aplicaron a un gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio.

Ambos conjuntos de reacciones muestran bandas claramente visibles del tamaño correcto en el gel después de 30 minutos de tiempo de amplificación. No parece haber ningún efecto adverso sobre la eficiencia de amplificación del chip. Los amplicones en el chip se revelan como una sola banda en el gel y las bandas en puntos de tiempo iguales son más intensas.

Ejemplo 8

Cálculo de TTR teóricos basado en los LLOD del chip teórico y tiempos de duplicación calculados.

Los tiempos de duplicación del cebador calculados en solución (por ejemplo, 1,1 minutos para el conjunto de cebadores "L") se usaron para calcular un tiempo teórico hasta el resultado (TTR) para un chip que no interfiere con la amplificación /detección en función de los LLOD del chip medidos a 10 a 30 pM del ADN de entrada (amplicón) a una temperatura de HDA (65 °C) y condiciones de tampón. En la Figura 4 a continuación se muestra un gráfico de la cantidad de amplicón presente en función del tiempo de amplificación. Un cuadro en negrita incluye entre paréntesis el límite de sensibilidad para un conjunto de sondas específicas de la diana dado y una línea discontinua muestra la cantidad que es 10 veces superior al LLOD (límite inferior de detección). Una línea vertical aproxima el tiempo hasta la señal detectable para 10 copias de la diana como entrada en la reacción de HDA. Los resultados muestran que, a partir de tan solo 10 copias de ADN de entrada, pueden obtenerse niveles detectables de amplicón en ~ 30 minutos, produciendo además un nivel 10 veces mayor del umbral de detección en 38 minutos.

Ejemplo 9

Detección de productos de amplificación HDA en chips de silicio (LLOD).

Para determinar el límite inferior de detección (LLOD) correspondiente a la amplificación /detección de HDA en chip de ADN de MRSA, se realizó un análisis de respuesta a la dosis de la amplificación de ADN de MRSA usando el protocolo descrito en el Ejemplo 3. Las secuencias en el gen mecA de ADN genómico de Staphylococcus aureus resistente a meticilina purificado (ATCC, cepa No. 11632) se amplificaron usando el conjunto de cebadores "L" descrito en el Ejemplo 2 y representado en la Figura 9. Se probó la respuesta a la dosis para el ADN de entrada genómico que oscilaba entre 0 y 10000 copias. Las reacciones de amplificación se incubaron durante 45 minutos a 64 °C en chips de silicio "rugosos" que contenían una sonda de captura específica de mecA inmovilizada en la superficie (mecA1703 CP, la Figura 9). Los datos representativos de la Figura 5 incluyen los controles negativos NTC A y NTC B. Los resultados muestran que el LLOD es de 10 copias del ADN diana en el chip. El resultado de LLOD se reprodujo en experimentos que amplificaban el gen ApoB humano y el gen cfb de Streptococcus agalactiae.

Ejemplo 10

Detección de productos de amplificación HDA en chips de silicio (TTR).

Para determinar el tiempo necesario para amplificar el ADN genómico de MRSA a niveles detectables (tiempo hasta el resultado, TTR), se realizaron reacciones de HDA usando cebadores específicos de mecA en presencia de cantidades variables (0 a 1000 copias de la secuencia) de ADN genómico purificado de Staphylococcus aureus resistente a meticilina aplicado al chip de silicio de "lado rugoso" recubierto con la sonda de captura 1703 específica de mecA como se describe en el Ejemplo 3. Las señales del chip se midieron en varios momentos lavando el chip para detener la reacción antes de la adición de los reactivos de detección. Los datos representativos se muestran en la Figura 6. Con 100 copias de la secuencia de ADN diana de MRSA, el chip produjo una señal detectable después de 30 minutos; 10 copias de entrada arrojaron un valor detectable después de 45 minutos. Estos resultados son generalmente consistentes con el modelo teórico del Ejemplo 8 que predice la detectabilidad de 100 copias a los 27 a 30 minutos y 10 copias a los 30 a 33 minutos. (Para evaluar con mayor precisión el rendimiento de HDA para 10 copias en relación con el modelo teórico, es posible que se requieran más puntos de tiempo alrededor de 30 minutos). Estos datos sugieren que la amplificación HDA en chip puede funcionar cerca de sus límites predichos en condiciones en las que el chip no afecta negativamente a la eficiencia de amplificación. Estos datos también sugieren que HDA no parece mostrar una fase de retraso prolongada al inicio de la amplificación, lo que ralentiza el tiempo hasta un resultado detectable. Sin embargo, en la medida en que pueda haber tal fase de retraso, los cebadores generarían tiempos de duplicación más rápidos que los previstos.

Ejemplo 11

Detección de productos de amplificación HDA en chips biosensores de capa fina.

Para probar la amplificación /detección en chip de HDA en otro medio de detección visual, usamos un chip biosensor de capa fina que contiene sondas mecA inmovilizadas (1703) para la detección visual directa de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos 3 y 10. Los tiempos de detección en el chip fueron similares a los del chip de silicio de lado rugoso usado en el Ejemplo 10. Como se muestra en la Figura 7, la amplificación de 100 copias de ADN genómico produjo señales detectables a los 30 minutos, consistente con los resultados observados con los chips del lado rugoso. Por tanto, los soportes de silicio recubiertos pueden proporcionar una plataforma flexible para la amplificación y detección de HDA en chip.

Ejemplo 12

Detección de secuencias del gen mecA a partir de hemocultivos aislados mediante detección de HDA en chip en relación con diversos tratamientos de superficie.

Se extrajo sangre (~ 10 mL) y se colocó en una botella de hemocultivo BACTEC. A continuación, se sembró la botella con ~ 1,000,000 UFC de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (cepa ATCC No. 11632) en placa sobre agar sangre y se cultivó a 37 °C durante la noche. La botella de hemocultivo se incubó en un instrumento BACTEC hasta que sonó la alarma, lo que indica que la botella era positiva para el crecimiento bacteriano. Las placas de dilución revelaron la presencia de aproximadamente 108 a 109 organismos por mL en el momento en que sonó la alarma. Se extrajeron alícuotas (10 |_il) de una botella de cultivo de sangre de MRSA BACTEC y se añadieron a 3 |_il de NaOH 1 M para lisar los eritrocitos. A continuación, se añadieron 87 |_il de una mezcla de extracción (Tris 10 mM pH 7, 50 unidades de acromopeptidasa (ACP, Sigma)) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de hervir la muestra tratada para inactivar el ACP. A partir de la muestra lisada, 1 |_il se sometió luego a una reacción de HDA on-chip en chips biosensores de capa fina durante 40 minutos esencialmente como se describe en el Ejemplo 3. Los controles negativos incluyeron lisis de 10 |_il de hemocultivo libre de bacterias. Se usaron cuatro chips biosensores de capa fina diferentes: (1) un chip que envejeció 6 meses después de la fijación de la sonda que no se trató posteriormente para bloquear los grupos reactivos restantes (envejecido); (2) un chip recién hecho no tratado posteriormente para bloquear los grupos reactivos restantes (Desbloqueado); (3) un chip recién hecho del mismo lote, tratado con 100 |_im de acetato de NHS (Pierce) para bloquear las aminas de superficie de fácil acceso (bloque NHS-Ac); y (4) un chip recién hecho del mismo lote, tratado con anhídrido acético de 100 |_im (Aldrich) para bloquear las aminas superficiales de fácil acceso (bloque AcAn).

Los resultados representativos se muestran en la Figura 8. Se observó una señal claramente detectable en todos los chips. Los controles negativos carecían de señal, lo que indica que la matriz no interfiere con la amplificación /detección, excepto en el caso del chip recién preparado sin bloquear, que mostró evidencia de pasivación superficial, o unión no específica, por componentes en el extracto de hemocultivo, que incluye células bacterianas extraídas con acromopeptidasa, componentes sanguíneos y/o medios de cultivo. Estos datos muestran que el rendimiento sobre una superficie catiónica recubierta puede mejorarse mediante el envejecimiento u otros tratamientos que sirvan para bloquear al menos una proporción de las aminas libres.

Parece que las superficies pueden volverse más hidrófobas con el tiempo con recubrimientos de poli-(lys, phe) sobre biosensores de silicona o de capa fina, medidos por un ángulo de contacto aumentado en un goniómetro (datos no mostrados). Esto sugiere que se produce una difusión significativa con el tiempo, cambiando la accesibilidad de las aminas. Si bien esto no parece perjudicar la capacidad de inmovilizar las sondas de captura, es beneficioso controlar las interacciones no específicas que involucran componentes en muestras de hemocultivo, por ejemplo. Como

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para detectar la presencia o ausencia de un polinucleótido diana en una muestra, que comprende:

   a. proporcionar un soporte sólido recubierto que comprende un sustrato de silicio, una capa catiónica y una pluralidad de sondas específicas de la diana escindibles unidas al soporte sólido recubierto;

   b. aplicar la muestra al soporte sólido recubierto;

   c. escindir químicamente las sondas hibridadas y las sondas no hibridadas del soporte sólido recubierto y eluir las sondas escindidas para crear un eluyente;

   d. aplicar el eluyente y un medio de reacción a un segundo soporte sólido recubierto

   e. someter el eluyente a un proceso de amplificación isotérmica dependiente de helicasa capaz de amplificar un polinucleótido diana e hibridar simultáneamente los polinucleótidos dianas amplificados con las sondas en el segundo soporte sólido recubierto y

   f. detectar la presencia o ausencia de polinucleótidos dianas unidos a las sondas.
2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las etapas de amplificación e hibridación se realizan a una concentración del catión monovalente entre aproximadamente 10 mM y 100 mM.
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde las etapas de amplificación e hibridación se realizan a una concentración del catión monovalente entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 75 mM.
4. 4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la etapa de detección comprende unir un conjugado de anticuerpo anti-biotina/peroxidasa de rábano picante a un marcador de biotina y añadir un sustrato de tetrametilbencidina.
5. 5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la capa catiónica comprende al menos un polímero policatiónico, opcionalmente seleccionado de uno o más del grupo que consiste en polilisina, poli(lys-phe), poli(lys-tyr), poli(lys-trp), poli(arg-trp) y poli(arg-pro-tyr).
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el polímero policatiónico se une al soporte sólido.
7. 7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la capa catiónica comprende un compuesto seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un silano catiónico, un siloxano catiónico o un derivado catiónico del mismo, tal como uno o más del grupo que consiste en aminopropiltrimetoxisilano, aminopropiltrietoxisilano, organopolilsiloxanos aminofuncionales y alcoxilatos de siloxano aminofuncionales.
8. 8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el sustrato sólido se bloquea o envejece para reducir la pasivación superficial de los componentes de reacción que interfieren con la detección de los polinucleótidos dianas unidos a las sondas.
9. 9. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la pluralidad de sondas específicas de la diana se une al soporte sólido mediante una capa de unión que comprende un recubrimiento de agentes de acoplamiento depositados sobre la superficie del soporte sólido.