JP5020818B2 - 生物学的試料中の核酸を検出するための方法及び組成物 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）項の仮特許出願第６０／５８５，４２１号（２００４年７月１日出願）の利益を請求する。

発明の分野
本発明は、核酸アッセイの分野、特に、生物学的試料中に存在する小さなＲＮＡ又はＤＮＡ配列等の、試料中に存在する特定の標的核酸の検出に関する。

核酸の試料中の検出は、診断、治療、法医学、農業、食品科学への適用及び他の領域において有用である。核酸検出の方法としては、核酸をマトリックス中又は支持体上に捕捉して、捕捉した核酸を、色素又は挿入剤等の核酸を視覚化する手段を用いるか用いる又は検出可能プローブをその核酸へハイブリダイズさせて検出する等の、核酸の物理的な分離及び検出を用いるものがあげられる。用いる核酸を分離して検出する公知の方法は、核酸の大きさによる電気泳動分離を用いるもので、例えば、ゲルや他のクロマトグラフィーマトリックスを用いた後、分離した核酸を染色するか又はそれにプローブを付けて、前記核酸の試料中の存在を示すシグナルを産生させるものである。標的核酸を鋳型として用いて作製される産物を産生してその産物を検出すること、ＤＮＡから作製されるＲＮＡ転写物、又はＲＮＡ転写物より作製される翻訳タンパク質を検出すること等で核酸を間接的に検出する方法もある。他の間接的な方法としては、例えば、標的核酸へハイブリダイズして、酵素の基質が提供される場合、検出可能な反応を産生する酵素連結プローブ等の検出すべき核酸に関連する酵素反応により作製される産物を検出するものである。核酸検出の方法には、核酸配列を増幅して、検出される核酸をより多量に産生するものもある。増幅方法の例としては、クローニングされた配列の多数コピーを産生することや、核酸配列の多重コピーの酵素合成を用いるインビトロ増幅手順があげられる。

核酸を検出するための技術の多くは、比較的多量又は高比率の標的核酸が試料中になければならないが、他の技術では、核酸増幅を用いて核酸の量又は比率を高めて試料中の標的核酸がより少ない量でも検出する。試料中にあるいくらか又は全ての核酸を濃縮して目的の核酸の検出を促進できる。核酸の濃縮及び検出の公知の手順の多くは煩雑で、時間がかかるか、又は機器若しくは有害化学物質（例、カオトロープ、突然変異原、又は放射活性化合物）を用いなければならないため、そのような手順は、多くの試料の迅速スクリーニング、現場での診断、又は実験室外の施設での検出といった、多くの適用に望ましくない。従って、依然として、目的の核酸を検出する、比較的簡単な手順及び十分な感度及び／又は特異性をもたらす方法が必要とされている。

ある核酸では、物理的性質又は相対存在度のため、試料中での検出が妨げられる場合がある。例えば、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さいか又は短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）等の短鎖（small）ＲＮＡ（約１７〜２７ｎｔ）は、他の試料成分から分離すること、及び／又は公知の方法を用いて検出することが難しい。短鎖ＲＮＡは、生物学的試料中に比較的微量である場合が多く、そのため検出が困難となる。短鎖ＲＮＡは、遺伝子発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により変調させるか又は静止させる重要な調節分子であるので、重要な疾患予防剤又は治療剤である場合がある。従って、多数の処理や核酸増幅を必要とせずに、生物学的試料中の短鎖ＲＮＡの存在を迅速に検出して、生物学的試料におけるその存在、安定性、治療効果、又は他の特性を決定する方法が求められている。短鎖ＲＮＡにより、非標的指向性遺伝子機能が偶発的に抑制されるような状態を防ぐために、様々な生物学的試料に局在化する短鎖ＲＮＡを検出することがさらに求められている。生物学的試料中のＲＮＡ又はその効果を検出するための従来の、in situ ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＮＡを検出するノーザンブロット、タンパク質を検出するウェスタンブロット、イムノアッセイ、及び蛍光検出アッセイ（ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ００４４９１４、Liら, ＷＯ０５００４７９４、Bumcrotら）等の方法は、時間がかかり、煩雑である。

本出願は、生物学的試料中の短鎖ＲＮＡを含む、試料中の核酸の迅速検出に有用な方法及び組成物を開示して、有効な核酸検出アッセイへのニーズに対応するものである。

発明の要約
本発明の態様は、試料中に存在する核酸の存在を検出する方法であり、前記方法には：標的核酸を含む試料を提供する工程、ハイブリダイズ条件下で、内部の標的相補配列、隣接する捕捉領域、及び捕捉領域へ結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域から構成される部分的に二本鎖のヘアピン構造を形成し、ここで、標的相補領域は、実質的に一本鎖のループ部分を形成する、核酸捕捉プローブと該試料を混合する工程、捕捉プローブの標的相補配列を標的核酸中の標的配列へ特異的にハイブリダイズさせる工程、特異結合対のメンバーを共に結合させて、捕捉支持体へ付いた固定化プローブへ捕捉領域を結合させる工程により標的核酸、捕捉プローブ、及び捕捉支持体へ付いた固体化プローブから構成される捕捉ハイブリッドを形成する工程、捕捉支持体へ付いた捕捉ハイブリッドを試料成分より分離する工程、標的核酸を捕捉ハイブリッドより遊離させる工程、その後、標的核酸へ検出プローブを特異的にハイブリダイズさせて、検出ハイブリッドを形成する工程、並びに標的核酸の試料中の存在を示す、検出ハイブリッドより産生されるシグナルを検出する工程が含まれる。１つの実施態様としては、捕捉領域が捕捉プローブの３’端近くに位置して、末端領域が捕捉プローブの５’端近くに位置する。他の実施態様としては、捕捉領域が捕捉プローブの５’端近くに位置して、末端領域が捕捉プローブの３’端近くに位置する。１つの実施態様としては、固定化プローブへ捕捉領域を結合させる工程が捕捉領域及び固定化プローブの相補配列をハイブリダイズさせる。他の実施態様としては、固定化プローブへ捕捉領域を結合させる工程が、リガンドとその受容体等の、特異結合対の非核酸メンバーを共に結合させる。１つの実施態様としては、標的核酸を捕捉ハイブリッドより遊離させる工程が捕捉プローブを固定化プローブよりさらに遊離させる。１つの実施態様としては、検出工程は、捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズする標的配列と同一の標的配列に特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いる。他の実施態様としては、検出プローブが、捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズする標的配列と異なるか又は重複する標的配列に特異的にハイブリダイズする。好ましい実施態様としては、検出工程は、同種の反応で産生されるシグナルを検出する。

本発明の他の態様は、試料中に存在する標的核酸の存在を検出する方法であり、前記方法には：標的核酸を含む試料を提供する工程、核酸の第１鎖及び第２鎖から構成される少なくとも部分的に二本鎖構造である捕捉プローブと前記試料を混合する工程であって、第１鎖には、標的相補領域と捕捉領域が含まれ、そして第２鎖は、第１鎖の配列に相補的な配列を含む前記工程、捕捉プローブの標的相補配列を標的核酸中の標的配列へ特異的にハイブリダイズさせる工程、捕捉支持体へ付いた固定化プローブへ捕捉領域を結合させる工程により、標的核酸、捕捉プローブの第１鎖、及び捕捉支持体へ付いた固体化プローブから構成される捕捉ハイブリッドを形成する工程、捕捉支持体へ付いた捕捉ハイブリッドを他の試料成分から分離する工程、標的核酸を捕捉ハイブリッドから遊離させる工程、その後、標的核酸へ検出プローブを特異的にハイブリダイズさせて、検出ハイブリッドを形成する工程、並びに検出ハイブリッドより産生されるシグナルを検出する工程により、標的核酸の試料中での存在を示す工程が含まれる。１つの実施態様としては、第１鎖が３’標的相補領域へ共有結合する５’捕捉領域を含み、第２鎖が第１鎖の捕捉領域へ相補的な３’配列を含むことにより、第１鎖の捕捉領域が第２鎖の相補３’配列へハイブリダイズするときに、部分的に二本鎖構造を形成する。他の実施態様では、第１鎖が３’捕捉領域へ共有結合する５’標的相補領域を含み、第２鎖が第１鎖の３’捕捉領域へ相補的な５’配列を含むことにより、第１鎖の捕捉領域が第２鎖の相補５’配列へハイブリダイズするときに、部分的に二本鎖構造を形成する。

本発明の他の態様は、ハイブリダイズ条件下で少なくとも部分的に二本鎖構造を形成して、標的相補配列と、特異結合対のメンバーを用いることにより固定化プローブへ結合する捕捉領域が含まれる、核酸捕捉プローブである。１つの実施態様としては、部分的に二本鎖構造が、内部の標的相補配列と、隣接する捕捉領域と、捕捉領域に結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成する末端領域が含まれる連続した線状配列から構成されるヘアピン構造であり、標的相補領域は、実質的にヘアピン構造の一本鎖のループ部分を形成する。捕捉領域がこの連続した線状配列の５’領域でもよく、末端領域がその３’領域であるか、あるいは捕捉領域が、ヘアピン構造を形成する連続した線状配列の５’領域でもよく、末端領域がその３’領域であるのが好ましい。他の捕捉プローブの実施態様としては、その構造は、標的相補領域と捕捉領域が含まれる第１鎖と、第１鎖と第２鎖の相補配列のハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に二本鎖構造をつくるように、第１鎖の配列に相補的な配列を含む他の第２鎖から構成される。第１鎖は、５’標的相補領域と３’捕捉領域を有してもよく、あるいは３’標的相補領域と５’捕捉領域を有してもよく、他の第２鎖の相補配列は、第１鎖の標的相補領域又は捕捉領域のいずれに相補的でもよいことが好ましい。好ましい実施態様としては、第２鎖の相補配列が第１鎖の捕捉領域に相補的である。他の実施態様としては、部分的に二本鎖のヘアピン構造を形成する捕捉プローブと、ヘアピン構造の捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズする配列を含む標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブが含まれるキットがある。キットの１つの実施態様としては、検出プローブが、捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズするのと同じ標的核酸配列へ特異的にハイブリダイズする。他の態様としては、キットには、捕捉支持体へ付いた固定化プローブがさらに含まれ、ここで固定化プローブには、捕捉プローブへ特異的に結合する特異結合対のメンバーが含まれる。１つのキットとしては、特異結合対メンバーが、ハイブリダイズ条件下で、捕捉プローブを固定化プローブへハイブリダイズさせる相補配列である。他のキットの実施態様としては、標的相補領域と捕捉領域を含む第１鎖と、第１鎖の配列に相補的な配列を含む他の第２鎖から構成される捕捉プローブと、捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズする配列を含む標的核酸へ特異的にハイブリダイズする検出プローブがあげられる。

発明の詳細な説明
本発明は、試料中に存在する目的の標的核酸の検出に有用である。本方法は、標的核酸を他の試料成分より単離及び／又は濃縮して標的核酸を検出するために、比較的少なくて容易に実施される工程を用いる。本方法には、１以上の捕捉プローブを用いて、捕捉支持体へ連結する捕捉ハイブリッドを形成させて標的核酸を捕捉し、これらを共に他の試料成分から分離する捕捉工程が含まれる。その後、捕捉ハイブリッド中の標的核酸を捕捉支持体より遊離させて、検出プローブを用いて、検出可能シグナルを産生する検出ハイブリッドを形成させて標的核酸を検出する。捕捉ハイブリッド及び検出ハイブリッドの成分を連結させるにはどの特異結合対を用いてもよいが、好ましい態様としては、核酸ハイブリダイゼーションを用いて捕捉及び検出のハイブリッドを形成させる。好ましい態様としては、非結合検出プローブが、検出ハイブリッド中の結合検出プローブより生じるシグナルの検出に干渉しない同種の反応アッセイで検出工程を実施する。これにより、検出ハイブリッドからのシグナルの検出前に非付着性の検出プローブを混合物より除去する必要がなくなり、本システムが簡易的及び効率的になる。

上記方法は、尿に排出されるか、又は細胞又は組織の抽出物に存在する等の試料中に希薄な濃度で存在する可能性がある小さな標的核酸を検出するのに特に有用である。上記方法はまた、捕捉及び検出の工程を各試料につき単一の反応チャンバで実施できるため、自動化ハイスループットシステムのように、好ましくは同時に、又は迅速に連続して多くの試料をアッセイするのに有用である。

本発明の様々な態様をよりよく理解するために、本発明の記載に用いられるいくつかの用語について以下により詳しく記載する。
「核酸」は、骨格構造により連結した、少なくとも２つ、そして好ましくは１０以上の塩基から構成されるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはその類似体）又はポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ若しくはその類似体）を意味する。ＤＮＡでは、通常の塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）であり、一方、ＲＮＡでは、通常の塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びウラシル（Ｕ、Ｔに置き換わる）であるが、核酸には、塩基類似体（例、イノシン）と非塩基位置（即ち、１以上の位置でヌクレオチドを欠くホスホジエステル骨格、米国特許第５，５８５，４８１号）が含まれる。核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡのポリヌクレオチド又はポリマーとオリゴヌクレオチド又はオリゴマーが含まれ、それらは、一本鎖（ｓｓ）、二本鎖（ｄｓ）、又は三本鎖でもよい。オリゴマーは、一般に、１０００以下のヌクレオチドを含み、そしてしばしば２〜約１００のヌクレオチドを含む核酸を意味し、一方、ポリマーは、一般に、１０００以上のヌクレオチドを含む核酸を意味し、当該技術分野で周知の、プラスミド、コスミド、遺伝子、染色体、ゲノム等のような数千のヌクレオチドを含む核酸構造を含む。さらに、この用語に含まれるのは、「ロックト（locked）核酸」（ＬＮＡ）、ＲＮＡ模倣性の糖コンホメーションにロックされた二環系フラノース単位とともに１以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含み、相補性ｓｓＲＮＡ、又は相補性ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を高めた核酸類似体である（Vester B. and Wengel J., 2004, Biochemistry. 43(42): 13233-41）。

核酸「骨格」は、当該技術分野で公知の（Eschenmoser, 1999, Science 284: 2118-2124）、例えば、糖−ホスホジエステル結合、２’−Ｏ−メチル結合、ＤＮＡ中のグアニジンリンカー（「ＤＮＧ」）、Ｓ−メチルチオ尿素リンカー、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ポリアミド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等のアミド骨格修飾物、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸エステル核酸結合、ピラノシルオリゴヌクレオチド結合、ビシクロ及びトリシクロ核酸結合、ホルムアセタール及び３’−チオホルムアセタール結合、モルホリノ結合、又は他の天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合の修飾物、又は単一骨格中のこのような結合の組合せ等の基又は結合を意味する（Majlessi et al., 1998, Nucl. Acid Res. 26(9): 2224-2229; Dempcy et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097-6101; Browne et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7051-7055; Arya & Bruice, 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 6619-6620; Reynolds et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(22): 4584-4591; Gryaznov & Chen, 1994, Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144; Chaturvedi et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(12): 2318-2323; Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg. & Med. Chem. 4: 5-23; Hydig-Hielsen et al., ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／３２３０５：Mesmaeker et al., Syn. Lett., Nov. 1997: 1287-1290; Peyman et al., 1996, Angew. Chem.. Int. Ed. Engl. 35(22): 2636-2638; Aerschot et al., 1995, Angew. Chem.. Int. Ed. Engl. 34(12):1338-1339; Koshkin et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 13252-13253; Steffens & Leumann, 1997, J. Am. Chem. Soc. 119: 11548-11549; Jones et al., 1993, J. Org. Chem. 58:2983-2991; Summerton & Weller, 1997, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 7: 187-195; Stirchak et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(15): 6129-6141）。核酸骨格には、同一核酸中に結合混合物（例、糖−ホスホジエステル及び２‘−Ｏ−メチル結合）が含まれても、全て１種の結合（例、オリゴマー中の全ての２’−Ｏ−メチル、又は全てのアミド修飾の結合）でもよい。

「標的」又は「標的配列」又は「標的核酸」は、例えば、標準的な相補塩基対合を用いることにより他の核酸が結合する（、核酸又は核酸の一部に存在するヌクレオチド塩基の配列をいう。標的配列は、遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に含まれる特異配列等のより大きな核酸の比較的小さな部分でもよい。当業者は、標的核酸が、部分的に二本鎖のヘアピン構造又は部分的に二本鎖の二重鎖構造等の、一本鎖、二本鎖、三本鎖、又はこれらの混合物の様々な形態）で存在できることを理解し、さらに、標的配列がその構造のいかなる鎖（＋又は−）でも存在しうることを理解するであろう。簡潔には、標的核酸は、一本鎖の全部又は部分的として記載でき、このことは、標的の意味を１つ又は特定の核酸鎖に限定することを意味するものではない。当該技術分野では、核酸をその融解温度（Ｔｍ）より高温で加熱すること、及び／又は化学変性剤を用いること等の標準的方法を用いることにより多重鎖核酸をその一本鎖成分へ容易に変換することが周知である。

「相補的な」核酸、又はその「相補性」は、核酸の１つの鎖中のヌクレオチド配列が、官能基の配向のため、対の核酸鎖上の他の配列へ水素結合することを意味する。相補的な塩基は、典型的には、ＤＮＡではＡとＴ、ＣとＧであり、ＲＮＡではＣとＧ、そしてＵとＡである。「実質的に相補的な」は、一方の鎖の配列が対の鎖の配列に対して全部は、及び／又は完全には相補的でないが、２つの鎖上の塩基間では十分な結合がおこり、一連のハイブリダイゼーション条件（例、塩濃度及び温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。そのような条件は、その配列と、当業者に公知の標準的な数理計算を用いてハイブリダイズする鎖のＴｍを予測することによるか、又は定型的な方法を用いてＴｍを経験的に決定して予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖間で形成されたハイブリダイゼーション複合体の集合の５０％が変性する温度を意味する。Ｔｍ未満の温度ではハイブリダイゼーション複合体の形成が優勢であるのに対して、Ｔｍより高い温度ではハイブリダイゼーション複合体における鎖の融解又は分離が優勢である。Ｔｍは、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中に既知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸については、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて推定できるが、核酸の構造特性を考慮する他のＴｍ計算法も当該技術分野で公知である。

「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が相補的な鎖相互作用と水素結合により第二の核酸鎖へ結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する、累積的な環境をいう。そのような条件としては、核酸を含む水溶液又は有機溶液の化学成分とその濃度（例、塩類、キレート剤、ホルムアミド）、及びその混合物の温度があげられる。インキュベーション時間の長さや反応チャンバの寸法のような他の周知の因子も、本環境の一因となる場合がある（例、Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版、1.90-1.91, 9.47-9.51, 11.47-11.57 頁（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989））。

「標識」は、検出可能であるか又は、例えば、検出可能シグナルを産生する反応を触媒して検出可能な応答又はシグナルを直接的又は間接的に産生する分子部分を意味する。標識としては、発光部分（蛍光性、生物発光性、又は化学発光性の化合物等）、放射性同位体、特定結合対のメンバー（例、ビオチン及びアビジン）、酵素又は酵素基質、反応基、又は色素や検出可能な色素をもたらす粒子等の発色団があげられる。

「検出プローブ」は、標的配列へ特異的に結合するオリゴマー又はポリマーであり、その結合により、直接的又は間接的に、標的配列の存在を示す検出可能シグナルがもたらされる。検出プローブは、検出可能シグナルを産生するために標識化する必要はなく、例えば、プローブをその標的配列へ結合させて生じる電気インパルスが検出可能シグナルになり得る。「標識化プローブ」は、標識を含むか又はそれへ直接的又は間接的に結合したプローブである。標識化プローブを作製し、及び／又は用いる方法は当該技術分野で周知である（例、Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」第２版、第１０章；米国特許第６，３６１，９４５号、Becker et al.;５，６５８，７３７号、Nelson et al.;５，６５６，２０７号、Woodhead et al.;５，５４７，８４２号、Hogan et al.;５，２８３，１７４号、Arnold et al.;４，５８１，３３３号、Kourilsky et al.;５，７３１，１４８号、Becker et al）。例えば、検出プローブには、非ヌクレオチドリンカーとそのリンカーへ付いた化学発光標識を含めてよい（米国特許第５，１８５，４３９、５，５８５，４８１、及び５，６３９，６０４号、Arnold et al.）。

「均一検出可能標識」は、標識が標的へ結合しているか又は非結合であるかに依存して、均一な方法でその存在を検出できる標識をいう。均一検出可能標識は、検出工程の前に、標識の非結合型を混合物より物理的に分離せずに「均一反応」において検出できる。均一反応は、溶液中でも、マイクロアレイ、バイオチップ、又は遺伝子チップ等の支持体上でも起こり得ることが理解されるであろう。好ましい均一検出可能標識とその検出条件は公知である（米国特許第５，２８３，１７４号、Arnold et al.；５，６５６，２０７号、Woodhead et al.；５，６５８，７３７号、Nelson et al.）。

「固定化プローブ」は、標的核酸を含む捕捉ハイブリッドを捕捉支持体へ結合させる手段を提供する。好ましい固定化プローブは、標的核酸へ直接的又は間接的に結合して、結合した標的核酸を他の試料成分等の非結合材料から分離することを促す、支持体に結合した核酸オリゴマー又はポリマーである。好ましい実施態様としては、標的核酸を固定化プローブへ捕捉プローブを介して間接的に結合させる。捕捉支持体としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、及び磁気吸引材料より作製されるマトリックス又は粒子等のいかなる多様な材料をも用いられる。単分散性の磁気球体は、それらが相対的に均一な大きさであり、好ましくは自動化システムにおいて、磁力を反応容器へあてて溶液から容易に回収されるため、捕捉支持体の好ましい態様である。固定化プローブは、いかなる多様な共有結合、キレート化、又はイオン相互作用のいずれかをも用いて捕捉支持体へ直接連結させてもよく、支持体へ結合する１以上のリンカーを介して間接的に連結させてもよい。

「捕捉プローブ」は、好ましくは相補配列のハイブリダイゼーションにより、標的核酸と固定化プローブを結合する手段を提供する。捕捉プローブとしては、標的相補的な配列の領域と、捕捉プローブ、又は捕捉プローブが含まれるハイブリダイゼーション複合体を固定化プローブへ付けるための手段が含まれる。そのような付着手段は、固定化プローブの配列に相補的である配列の領域でも、他の特異結合対のメンバー（例、ビオチン及びアビジン又はストレプタビジン）でもよい。好ましい実施態様としては、上記のように（Weisburg et alの米国特許第６，１１０，６７８号）、捕捉プローブとして、捕捉プローブの標的相補領域へ共有結合して、適切な条件下で、固定化プローブの相補的なホモポリマー（例、ポリＴ又はポリＡ）へハイブリダイズする核酸ホモポリマー（例、それぞれポリＡ又はポリＴ）があげられる。

「試料」又は「生物学的試料」は、目的の標的核酸が存在し得るあらゆる組成物又は混合物をいい、植物又は動物の材料、廃棄物質、法医学分析用の材料、環境試料等が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料としては、例えば、末梢血、骨髄、血漿、血清、リンパ節が含まれる生検組織、呼吸系組織又は滲出液、胃腸組織、尿、糞、精液、又は他の体液等の、標的核酸を含む可能性がある、生きた又は死んだ生物由来のあらゆる組織、細胞、抽出物があげられる。

「分離すること」又は「単離すること」又は「精製すること」は、１以上の成分を試料等の複雑な混合物から除去することをいう。試料成分としては、標的及び非標的の核酸と、塩類、酸、塩基、界面活性剤、タンパク質、炭水化物、脂質、及び他の有機又は無機材料等の他の材料があげられる。好ましくは、分離する、単離する、又は精製する工程は、標的核酸の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約９５％を他の試料成分から取り出す。分離する、単離する、又は精製する工程は、場合によっては、非標的の試料成分を除去する追加の洗浄工程を含んでもよい。

捕捉ハイブリッドの「遊離」は、捕捉プローブから標的核酸を、及び／又は固定化プローブから捕捉プローブを分離するように、捕捉ハイブリッドの１以上の成分を互いに分離することをいう。標的核酸鎖の遊離により、捕捉ハイブリッドの他の成分から標的が分離されて、その標的は、検出プローブへ結合できる。捕捉ハイブリッドの他の成分は結合したままでよく、例えば、捕捉プローブ鎖は、標的検出に影響を及ぼさずに捕捉支持体上の固定化プローブへ結合したままでもよい。１以上の捕捉ハイブリッド成分は、成分の解離を促進するために１以上の条件を変化すること（例えば、Ｔｍより高温で加熱すること、塩濃度を変えること、変性剤又は競合結合部分を混合物へ加えること）により、又は鎖置換等の他の周知の方法を用いて遊離させることができる。

「から本質的になる」は、本発明の基本的かつ新規の特性を実質的には変えない他の成分、組成物、又は方法工程を本発明の組成物、キット、又は方法に含めてよいことを意味するために用いる。そのような特性としては、試料中の標的核酸へ特異的に結合又はハイブリダイズするオリゴマーの標的相補領域の能力、他の試料成分より分離される捕捉ハイブリッドの能力、及び、標的核酸へハイブリダイズして、標的の試料中の存在を示す検出可能シグナルを提供する検出プローブの能力があげられる。上記特性には、図１〜３に例示される特定の配列に依存しない、本明細書に記載される捕捉プローブの構造特性が含まれる。当業者は、捕捉ハイブリッド及び検出ハイブリッドを創出するために多様な条件を使用し得ること、さらに、本発明の方法工程を達成するために多様なデバイス又はシステムを使用し得ることを理解するであろう。本明細書に記載した実施態様に例示される、本発明の方法の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼすいかなる成分、組成物、又は方法工程をも、この用語には含まれない。

捕捉プローブの例としては、標的核酸に相補的な少なくとも１０のヌクレオチドの配列を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はその類似体のオリゴマーである。好ましい実施態様としては、結合を高めるための２’−Ｏ−メチル結合や他の修飾構造を有する約２０のヌクレオチドの標的相補領域を含むオリゴマーがあげられる。捕捉プローブの実施態様としては、捕捉プローブの３’及び／又は５’領域でホモポリマー配列へ共有結合する約１５〜２５のヌクレオチドの標的相補配列を有するオリゴマーがあげられる。１の実施態様としては、捕捉プローブの標的相補領域の一端へ共有結合する約１５〜３０のヌクレオチドのポリｄＡ配列があげられる。

ある捕捉プローブの実施態様としては、５’Ｘ_ｎａ’ｂ’ｃ’Ｙ_ｎ３’と図式化し得る、５’領域、中間標的相補領域、及び３’領域を含むオリゴマーが含まれ、Ｘ_ｎは、ｎ個の残基を含む配列Ｘを示し、ａ’ｂ’ｃ’は、標的相補配列を示し、そしてＹ_ｎは、ｎ個の残基を含む配列Ｙを示し、Ｘ_ｎ及びＹ_ｎの領域は、捕捉プローブ全体がループ等の標的相補配列があるヘアピン構造を形成するように二本鎖構造を形成できる。ある実施態様としては、ハイブリダイズ条件下で、ホモポリマー配列の分子内ハイブリダイゼーションにより部分的に二本鎖のヘアピン構造を形成するように、線状の捕捉プローブの標的相補領域に隣接する５’Ｘ_ｎ及び３’Ｙ_ｎ領域に相補的なホモポリマー配列が含まれる。図２に例示するように、ヘアピン捕捉プローブの例としては、標的相補領域に隣接した５’ポリｄＴ領域と３’ポリｄＡ領域が含まれ、本ポリｄＴ及びポリｄＡ領域が互いに結合する場合に標的相補領域はヘアピン構造のループを形成する。本実施態様では、標的相補領域はヘアピン構造では実質的に一本鎖のままである。当業者であれば、５’及び３’領域に位置するいかなる相補配列も、ヘアピン捕捉プローブ構造を形成するオリゴマー中の標的相補領域に隣接するために用いうることを理解するであろう。

他の捕捉プローブの実施態様としては、個々の一本鎖の各々が少なくとも部分的に対の一本鎖に部分的にへ相補的である２つのオリゴマー鎖から構成される部分的に又は完全な二本鎖構造があげられる。そのような実施態様は、以下のように図式化できる：
（第１鎖） ５’Ｘ_ｎａ’ｂ’ｃ’３’
（第２鎖） ３’Ｙ_ｎａ ｂ ｃ ５’
ここで、Ｘ_ｎは、ｎ個の残基を含む配列Ｘを示し、ａ’ｂ’ｃ’は、標的相補配列を示し、ａｂｃは、標的相補配列に相補的な任意の配列を示し、そしてＹ_ｎは、ｎ個の残基を含む配列Ｙを示し、ここでＸ_ｎ及びＹ_ｎの領域は、二本鎖構造を形成できる。例えば、第１一本鎖は、３’標的相補領域へ共有結合する５’ポリｄＴ部分をＸ_ｎに含み、第２一本鎖は、第１鎖の一部に相補的な他の５’配列領域へ共有結合する３’ポリｄＡ部分をＹ_ｎに含み、ここで二本鎖構造は、少なくともこのハイブリダイズするポリｄＴ／ポリｄＡ領域から構成される。このような捕捉プローブを図３に例示する。

捕捉プローブの他の実施態様としては、３’又は５’標的相補領域と固定化プローブに結合する連続領域から構成される一本鎖オリゴマーがあり、以下のように図式化できる：
５’Ｘ_ｎａ’ｂ’ｃ’３’又は５’ａ’ｂ’ｃ’Ｘ_ｎ３’
［ここで、Ｘ_ｎは、ｎ個の残基を含む配列Ｘを示し、ａ’ｂ’ｃ’は、標的相補配列を示す］。１つのそのような態様を図１に例示する。

検出プローブの好ましい実施態様の例としては、例えば、結合又は非結合のプローブ上の標識の差異的加水分解を用いる等の同種の反応において検出される付着標識がある、約５〜５０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドがあげられる。検出プローブの好ましい実施態様としては、アッセイに用いる捕捉プローブの標的相補配列と同鎖であるヌクレオチド配列があるものがあげられる。検出プローブの他の好ましい態様としては、捕捉プローブの標的相補配列と同一ヌクレオチド配列があげられる。好ましい検出プローブは、例えばアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物等の付着する化学発光マーカーがある（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６３９，６０４号、５，５８５，４８１号、及び５，６５６，７４４号）。好ましい実施態様としては、非ヌクレオチドリンカーを用いてＡ及びＴ塩基対の領域に近いプローブの中央領域へアクリジニウムエステル標識を付けて（米国特許第５，５８５，４８１号及び５，６５６，７４４号、Arnold et al.）、ＡＥの両側のヌクレオチド塩基のアミンを制限して挿入部位を提供する。あるいは、標的核酸がもたらす隣接するアミンの効果を制限するために、標的核酸上の検出プローブに隣接してハイブリダイズする第二のオリゴマーと共に用いる検出プローブの３’又は５’末端にＡＥ標識を付けてもよい。他の実施態様としては、ミスマッチ部位近傍の二重鎖の領域が十分に脱安定化して、関連の非標的配列へハイブリダイズしたプローブ上のＡＥを加水分解の分解に対して感受性なため、関連する非標的ポリヌクレオチド配列とのミスマッチの部位又はその近くにＡＥ標識を付けて、１つのヌクレオチドだけが異なる場合に関連配列と標的配列を識別できるようにする。

本発明の方法は、標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸を試料より単離する工程を、検出可能シグナルを産生する検出プローブを用いて標的核酸を検出する工程と組み合わせる。本発明の組成物は、構造的捕捉プローブ、捕捉支持体上の固定化プローブ、及び本明細書に記載の検出プローブを含み、これらは、本方法を実施するための他の試薬と共にキットに含めてよい。図面は、本発明のいくつかの態様を概略的に例示する。

図１は、一本鎖の捕捉プローブを用いて試料から標的核酸を捕捉して、検出ハイブリッドを形成して標的核酸の検出により検出可能シグナルを産生する方法の態様を例示する。捕捉プローブ（ポリＡａ’ｂ’ｃ’の配列として示す）と標的核酸（ａｂｃｄの配列として示す）を溶液中で混合する。当業者であれば、標準的な方法を用いて二本鎖の標的核酸を処理し、この鎖を化学的又は物理的に解離させて、一本鎖を捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに適用できることを理解するであろう。捕捉プローブとしては、標的相補領域（配列ａ’ｂ’ｃ’）と、固定化プローブ（捕捉支持体へ付いたポリＴとして示す）と結合する他の部分（ポリＡ）があげられる。当業者であれば、捕捉プローブの特異結合対メンバーが、特異結合対の他のメンバーか又はそれを含む固定化プローブに結合する限り、他の核酸配列も含む特異結合対のいかなるメンバーも、例示のポリＡ領域に置き換えられることを理解するであろう。

捕捉プローブは、そのプローブの標的相補領域を標的核酸にハイブリダイズして、捕捉支持体へ付いた固定化プローブへハイブリダイズするか、さもなければ結合して、捕捉ハイブリッドを形成する。捕捉支持体へ付いたポリＴオリゴマーとして示される固定化プローブは、捕捉プローブのポリＡ部分に相補的である。捕捉ハイブリッドは、固定化プローブ、捕捉プローブ、及び標的核酸が同時に結合して形成させても、連続した工程で形成してもよい。例えば、捕捉ハイブリッドの連続形成は、最初に、捕捉プローブと標的核酸で構成される複合体を形成した後、この複合体が、捕捉プローブの一部が固定化プローブへ結合して固体支持体へ付いてもよい。連続形成の他の例としては、最初に捕捉プローブを固定化プローブへ付けて、標的相補領域で標的核酸を捕捉プローブへ結合させる方法がある。捕捉ハイブリッドの形成後、例えば、遠心分離、濾過、磁気捕捉支持体の磁気吸引等の様々な公知の方法のいずれかを用いて捕捉支持体を物理的に分離して、捕捉ハイブリッドを他の試料成分から単離する。捕捉ハイブリッドのいかなる部分にも非特異的に付着する他の試料成分からの標的核酸の単離をさらに促進するため、捕捉ハイブリッドを１回以上洗浄して、他の試料成分を希釈して除去できる。洗浄は、適当な水溶液（例、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）と適当な条件（例、成分のＴｍより高温）で捕捉ハイブリッドを個々の成分へ解離させてから、捕捉ハイブリッドを再形成させるような条件を再調整して達成できる。処理の簡素化と工程の最少化のために、洗浄は、捕捉ハイブリッドを維持する条件を用いて、捕捉支持体へ付いたインタクトな捕捉ハイブリッドを溶液中でリンスするのが好ましい。

次に、標的を捕捉ハイブリッドから遊離させる。例えば、捕捉ハイブリッドを個々の成分に遊離して、標的核酸を溶液中へ放出して、検出プローブと検出可能複合体を形成できるようにする。例示のように、捕捉プローブオリゴマーと検出プローブオリゴマーは同一センス鎖であるため、捕捉プローブオリゴマーを溶液中へ遊離させても検出プローブとハイブリダイズしない。検出プローブ（ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示す）は、標的核酸（配列ａｂｃｄとして示す）とハイブリダイズするのに適した条件で提供されるため、検出ハイブリッドを形成する。遊離した捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリダイゼーションで検出プローブと競合する可能性があるため、当業者は、検出プローブを過剰に、又は検出プローブの長さ及び／又は構造修飾（例、骨格）により標的核酸に（捕捉プローブに比べて）より親和性が高いものを提供するべきであることを理解する。例示のように、検出プローブの標的相補配列は、捕捉プローブの標的相補配列より長い。標的核酸は検出プローブとほぼ同じ長さで例示されているが、当業者であれば、検出プローブは標的核酸より短く、捕捉プローブにより認識される標的領域とは異なる標的領域へ結合できることを認識するであろう。検出工程では、場合によっては、１以上の他のオリゴマーを標的核酸へ結合させて、検出プローブへ結合すること、及び／又は検出可能シグナルを産生することを促進する。そのような他のオリゴマーとしては、ヘルパー、非標的配列と交差反応するための競合的プローブ、又はシグナル産生に用いる他の成分（例、酵素、基質、触媒、又はエネルギー放出体）を検出プローブの近傍にするオリゴマー等があげられる（米国特許第５，０３０，５５７号、Hogan et al.;５，４３４，０４７号、Arnold；及び５，９２８，８６２号、Morrison）。検出工程は、当該技術分野で周知の方法を用いて、検出ハイブリッドからの検出可能シグナル（★として示す）の産生に適する条件を用いる。検出ハイブリッドからのシグナルの検出は、試料中に標的核酸が存在することを示す。

図２は、図１に例示したものに類似の工程を用いるが、部分的に二本鎖であり、標的相補領域が含まれる一本鎖ループ領域を含むヘアピン構造を形成する捕捉プローブを用いる他の態様を例示する。捕捉プローブには、ヘアピンの二本鎖部分を形成する相補的な５’及び３’配列（ポリＴ及びポリＡとして示す）が含まれ、して、ループを形成する標的相補領域（ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示す）に隣接する。本実施態様では、ヘアピン捕捉プローブの５’及び３’端を分離して（例えば、Ｔｍより高温で加熱して水素結合を解離させる）、標的核酸（配列ｄｃｂａとして示す）とのハイブリダイゼーションの前に、線状一本鎖捕捉プローブとする。試料中の二本鎖標的も、捕捉プローブと標的鎖のハイブリダイゼーションの前に、捕捉プローブを線状にして標的核酸鎖を解離させる単回の融解工程で融解してよい。あるいは、融解工程を行わず、標的と標的相補領域のハイブリダイゼーションをしてもよく（例えば、鎖置換又は鎖侵入により）、それにより捕捉プローブの５’及び３’端を分離する。標的にハイブリダイズしない過剰の捕捉プローブは、分子内ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造を再形成して、固定化プローブ等の混合物中の他の成分へ捕捉プローブが結合することを効率よく妨げる。

本実施態様において、捕捉ハイブリッドは、捕捉プローブの標的相補領域へハイブリダイズした標的核酸と、相補的固定化プローブへハイブリダイズした捕捉プローブの一端から構成される。例示のように、捕捉プローブの３’ポリＡ領域は、捕捉支持体へ付いたポリＴの固定化プローブへハイブリダイズする。その後、捕捉支持体へ付いた捕捉ハイブリッドから溶液相を分離して、場合によっては洗浄工程を用いて、標的に非結合の過剰なヘアピン捕捉プローブを含む試料成分をさらに除去できる。本方法は、図１で上記のように、標的を捕捉ハイブリッドより遊離させるか又は捕捉ハイブリッドをその成分に分離した後、標的核酸に特異的にハイブリダイズした検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示す）から構成される検出ハイブリッドを形成して進行する。例示のように、捕捉ハイブリッドから遊離した捕捉プローブは、ヘアピン構造を再形成するものの、固定化プローブへはハイブリダイズしないであろう。なぜなら、それは検出プローブと同一センス鎖であり、好ましい分子内ハイブリダイゼーション又は検出プローブのためである。このことは、それにより捕捉プローブと検出プローブの標的への結合の競合が妨げられるか又は最少化されるため、本実施態様の利点である。検出プローブと標的から構成される検出ハイブリッドは、検出可能シグナル（★として示す）を産生して、標的の試料中に標的が存在することを示す。

図３は、２つの鎖（一方の鎖上の３’ポリＡ領域と他方の鎖上の５’ポリＴ領域として示す）上の相補配列と少なくとも１つの標的相補領域（ポリＴ含有鎖上のａ’ｂ’ｃ’として示す）を含む完全又は部分的に二本鎖の捕捉プローブを用いて標的核酸を捕捉する方法の実施態様を例示する。本実施態様では、捕捉プローブの一方の鎖だけが標的核酸（配列ａｂｃｄｅとして示す）にハイブリダイズする。標的配列へ結合する捕捉プローブ鎖はまた、固定化プローブ（捕捉支持体上のポリＡ鎖として示す）に結合する特異結合パートナーのメンバーをも含むことは重要である。捕捉プローブの標的相補領域への標的結合に起因する鎖置換により、捕捉プローブ鎖が分離できるにもかかわらず、この部分的な二本鎖の捕捉プローブは、通常、捕捉ハイブリッドを形成する前に解離する。図３は、２つの鎖が互いに相補的である部分を含み（一方の鎖上のポリＡと他方の鎖上のポリＴとして示す）、かつ、一方の鎖が標的相補配列を含むのに対して、他方の鎖は標的相補配列に相補的な配列を含む、完全二本鎖の実施態様を例示する。当業者であれば、捕捉プローブが部分的に二本鎖でもよいことを理解するであろう（例えば、ポリＡ鎖を図３に示すポリＡ−ａｂｃ鎖で置き換える）。完全二本鎖及び部分的に二本鎖の捕捉プローブでは、同じアッセイ工程を用い、場合によっては、標準的な方法を用いる捕捉プローブ鎖の分離から始めて、一方の捕捉プローブ鎖の標的相補部分が標的核酸にハイブリダイゼーションできるようにする。２つの捕捉プローブ鎖は、再ハイブリダイズして（例えば、ポリＡのポリＴへの結合により）、捕捉プローブ鎖の標的相補配列が標的核酸に結合することを干渉できるため、当業者であれば、捕捉プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションを最適化するため修飾しながら合成できることを理解するであろう。

本実施態様において、捕捉ハイブリッドは、一方の捕捉プローブ鎖の標的相補領域へハイブリダイズする標的核酸から構成され、同じ捕捉プローブ鎖の他の部分（ポリＴとして示す）は、捕捉支持体に付いた固定化プローブ（ポリＡとして示す）に結合する。上記のように、支持体へ付いた捕捉ハイブリッドを他の試料成分から分離し、場合によっては洗浄し、試料成分と捕捉ハイブリッドに結合していない捕捉プローブ鎖を除去する。標的配列に結合しない捕捉プローブ鎖は、部分的な又は完全な二本鎖構造を再形成して、結合していない単鎖と共に洗い流すことができる。その後、標的核酸を捕捉ハイブリッドから遊離するか、又は捕捉ハイブリッドをその成分に分離して、遊離した標的を溶液中で検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’として示す）に結合させ、検出ハイブリッドを形成して、検出されるシグナル（★として示す）を産生し、標的核酸の試料中の存在を示す。図３に例示するように、捕捉ハイブリッドから遊離した捕捉プローブ鎖は溶液中に残存するが、検出プローブと同一センス鎖であるため検出プローブに結合しない。当業者は、検出プローブと遊離される捕捉プローブ鎖が標的に結合する場合の競合を最小化するため、検出プローブには、標的核酸の結合に有利な構造（例えば、配列長さの増加、及び／又は骨格修飾）が含まれるべきであることを理解するであろう。

本明細書に記載の方法を用いる典型的なアッセイとしては、目的の核酸を含む試料を提供することがあげられる。そのような試料は、本アッセイに直接用いても、生物体液の溶解溶液での単純希釈から当該技術分野で周知の複雑な多様な方法（例えば、Su et al., J. Mol. Diagn. 2004, 6: 101-107; Sambrook, J. et al., 1989「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」第２版、7.37-7.57頁；及び米国特許第５，３７４，５２２号、５，３８６，０２４号、５，７８６，２０８号、５，８３７，４５２号、及び６，５５１，７７８号）のいずれかを用いて調製できる。典型的には、標的核酸を含む試料を加熱して試料中の酵素を不活性化し、試料中の核酸を一本鎖にする（例えば、９０〜１００℃で２〜１０分、その後０〜５℃に急冷）。捕捉ハイブリッドを形成するために、本試料を適当なハイブリダイゼーション条件で捕捉プローブ（例、上記の形態のいずれか）と、捕捉支持体へ付いた固定化プローブともにインキュベートする。効率的な方法としては、これらの成分をハイブリダイゼーション混合物中で共に混合し、第１条件を用いて、捕捉プローブ鎖の標的相補領域と標的核酸の間のハイブリダイゼーションを促進し、その後第２条件で、本捕捉プローブ：標的複合体の固定化プローブへの結合を促進する。例えば、第１条件では、捕捉プローブの標的相補配列と標的配列のＴｍ未満で、捕捉プローブと固定化プローブを結合する配列のハイブリダイゼーションのＴｍよりは高温で本混合物をインキュベートした後、固定化プローブ配列に結合する捕捉プローブのＴｍ未満の第２温度でインキュベートする（米国特許第６，１１０，６７８号）。核酸ハイブリダイゼーションが必要ない特異結合対のメンバー（例、ビオチンとアビジン又はストレプタビジン）を用いて捕捉支持体へ捕捉ハイブリッドを付ける実施態様では、選択する結合対メンバーに適した条件を用いる。捕捉ハイブリッドの形成後、濾過、遠心分離、重力、磁力等を用いてフィルター、膜、又は粒子を溶液相より取り出す等の、支持体に適する周知の方法を用いて、捕捉支持体へ付いた捕捉ハイブリッドを他の試料成分から物理的に分離する。捕捉ハイブリッドの付いた捕捉支持体を他の試料成分から分離する場合、捕捉された標的核酸をさらに精製するために、場合によっては、洗浄工程を含めてもよく、好ましくは、捕捉ハイブリッドを捕捉支持体へ付けたまま実施する。その後、標的核酸、又は捕捉ハイブリッドの全ての成分を溶液中へ放出して、標的を検出工程のために遊離させる。標的又は捕捉ハイブリッド成分の遊離は、温度又は混合物の化学組成を変化させて、捕捉ハイブリッドを１以上の核酸成分に解離することを促進する等のいかなる方法でも実施できる。典型的には、例えば、低イオン強度の水溶液中９０〜１００℃５分間、その後０〜５℃に急冷する、単一加熱工程を実施して標的と捕捉プローブ鎖を溶解する。捕捉ハイブリッドの他の成分（例、捕捉プローブ）を遊離させることもできるが、標的核酸だけは検出プローブに結合できるようにすべきである。遊離した標的核酸を含む溶液相を混合物の他の成分（例、捕捉支持体、及び／又は非結合の捕捉プローブ）から分離できるが、捕捉プローブ鎖は検出プローブと同鎖であり、検出プローブの標的への結合には干渉しないため必須ではない。図２に例示するように、ある実施態様では、分子内ハイブリダイゼーションにより捕捉プローブのヘアピン形を再形成して、捕捉プローブをさらに隔離する。検出工程は、遊離した標的核酸を含む溶液相に検出プローブを直接加えて、検出プローブ及び標的の配列を結合するのに適したハイブリダイゼーション条件（例えば、可溶相へ塩類を加えて好適なイオン強度の溶液にして、２５〜６０℃でインキュベートすること）で、本混合物をインキュベートして可溶相で実施できる。検出プローブが標的核酸へ結合して検出ハイブリッドを形成した後、本ハイブリッドからのシグナルを検出して、標的の試験試料中の存在を示す。定型的な手順を用いて非結合の検出プローブをシグナル検出前に除去してよい。好ましい実施態様としては、シグナル検出前に非結合プローブを結合プローブから分離しなくてもいいように、検出ハイブリッドからのシグナルを同種反応物中で検出する（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、５，６３９，６０４号、５，９４８，８９９号、５，６５８，７３７号、５，７５６，７０９号、５，８２７，６５６号、及び５，８４０，８７３号に記載のように）。検出ハイブリッド中の選択標識からのシグナルを産生して検出するのに適した条件は、当業者に周知である。

本発明はまた、本明細書に記載の標的核酸を検出する方法を実施するための成分を含むキットを含む。好ましいキットは、標的核酸に特異的な少なくとも１つの検出プローブと、標的核酸を含む捕捉ハイブリッドを形成するための手段を含む。例示のキットには、標的相補領域を含む一本鎖の捕捉プローブと固定化プローブへ結合する手段が、標的に特異的な検出プローブと共に含まれる。他の例示キットとしては、ハイブリダイゼーション条件下でヘアピン構造を形成する２つの相補領域が隣接する標的相補領域を含む捕捉プローブであって、相補領域の一方が捕捉プローブを固定化プローブへ結合する手段を果たすものが、標的特異的検出プローブと共にあげられる。他の例示キットには、一方の鎖に標的相補領域を含む完全に又は部分的に二本鎖の捕捉プローブと固定化プローブに結合する手段が、標的特異的な検出プローブと共に含まれる。例示のキットは、捕捉支持体に付いた１以上の固定化プローブをさらに含んでもよく、固定化プローブは、捕捉プローブの一部と相補的なヌクレオチド配列を含むか又は捕捉プローブ上の他の結合対メンバー（例、ビオチン）と結合する特異結合対のメンバー（例、アビジン）を含み、キット中の捕捉プローブの一部に結合できる。好ましいキットにおいて、捕捉支持体は、磁化粒子、好ましくは常磁性ビーズであり、キット中の捕捉プローブのホモポリマー部分に相補的なホモポリマーオリゴマー（例、ポリＡ、ポリＴ、ポリＣ、又はポリＧ）がそれに付く。キットの実施態様はまた、捕捉ハイブリッド及び／又は検出ハイブリッドの形成に用いる、塩類、緩衝剤、キレート剤、及び他の無機又は有機化合物等の化学化合物を含みうる。キットの実施態様は、標的核酸を捕捉ハイブリッドから遊離するのに用いる、塩類、緩衝剤、キレート剤、変性剤、及び他の無機又は有機化合物等の化学化合物を含むことができる。キット態様は、検出工程で用いる、酵素、基質、混合物のｐＨを調整する酸又は塩基、塩類、緩衝剤、キレート剤、及び検出可能シグナルを検出ハイブリッドより産生するのに用いる他の無機又は有機化合物等の化学化合物を含みうる。キットの実施態様はまた、組織又は細胞材料を破壊する溶解剤や核酸を完全に保存する薬剤の個々の成分又は混合物を含む、本発明の方法で用いる試料を調製するための化学品を含みうる。そのような組成物としては、酵素、界面活性剤、カオトロープ剤、キレート剤、塩類、緩衝剤、及び他の無機又は有機化合物があげられる。キットには、上記の捕捉プローブ、検出プローブ、及び固定化プローブの成分のあらゆる組合せが含まれ、これらは、混合物として、又は個別の容器で、互いに組み合わせて包装される。当業者にとっては、本発明に多くの異なるキット構成物が含まれることは明らかであろう。

本発明の態様及び実施態様を以下の実施例で例示する。核酸合成、ハイブリダイゼーション、及び標識検出の方法及び試薬は実質的に本明細書で記載のように用いたが、当業者であれば、同等の結果を達成するのに、他の定型的な方法や標準試薬を用いうることを理解するであろう。オリゴヌクレオチドは、標準のホスホロアミダイト化学（Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol., 154: 287）を用いて合成し、定型的なクロマトグラフィー法（例、ＨＰＬＣ）を用いて精製して、典型的には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で室温〜−８０℃に保存した。実施例に例示する標的捕捉工程では、捕捉支持体として磁気粒子を用いて、これに磁場を加えて溶液相からアッセイ容器外へ分離したが、当業者であれば、他の分離手段を用いうることを理解するであろう。可溶性成分を含む上清を除去し、粒子に結合したハイブリダイゼーション複合体を洗浄した（捕捉されたハイブリッドを磁気粒子へ結合する結合を維持するのに十分なイオン強度の洗浄溶液を用いて、洗浄温度、通常は約２５℃で１〜３回）。一般に、洗浄は、粒子を洗浄溶液に懸濁させること、粒子を分離すること、及び上清を除去すること、そして各洗浄の工程を繰り返すことを室温で実施する。検出工程では、遊離した標的核酸と検出プローブを適切な塩類及び緩衝剤を含む水溶液中で、検出プローブ配列とその標的配列について予測されるＴｍ未満の温度で通常３０〜６０分間インキュベートした。ＡＥ標識の検出プローブを用いた場合、標的と結合したＡＥ標識プローブと比較した、非結合プローブ上のＡＥ標識の差異的加水分解を用いる同種検出工程を実施した（米国特許第５，２８３，１７４号に詳しく記載されている）。例えば、非結合プローブ上のＡＥ標識の加水分解を促進する選択試薬（例、塩基性溶液）を加えて加水分解を行った後、結合プローブに付いたＡＥからの化学発光を触媒する検出試薬（例、Ｈ_２Ｏ_２）を加えて、化学発光シグナル（相対発光量、又はＲＬＵとして参照する）をルミノメーター（例、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ＨＣ＋，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）で検出した。

以下の実施例は、上記のアッセイに用いるいくつかの好ましい態様と試薬を記載する。当業者であれば、本方法工程を実施するのに、本明細書に記載のものに代えて他の試薬及び条件を用いうることを理解するであろう。例えば、シグナルを産生して検出するための試薬及び条件は、選択する検出プローブ標識に基づき、当業者が選択できる。当業者であれば、本発明の方法が、相補配列にハイブリダイズすることができる、選択したいかなる標的核酸配列を用いても実施し得ること、即ち、本方法がいかなる特別なプローブや標的配列にも依存しないことを理解できるであろう。当業者であれば、標的配列を選択し、本明細書に記載の捕捉プローブ形態のうちいずれかの適当な標的相補配列と標的特異的な検出プローブを、定型的な方法を用いて設計及び合成できるだろう。即ち、特定のアッセイは、標的配列と、本明細書に記載の構造特性が含まれる捕捉及び検出プローブに含まれる適当な標的相補配列の選択に依存し、そのような選択は、標準的な手順を用いて当業者が実施でき、その後、本明細書に記載の方法を用いて、設計した成分を定型的に試験して、選択した標的の検出を最適化する。

異なる標識化プローブの検出
検出プローブを設計するために、ヒトヘルペスウイルス５型（サイトメガロウイルス）株のゲノム配列（Dunn et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(24): 14223-14228；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＣ１４６９９９、ＡＣ１４６８５１、及びＡＹ３１５１９７）に共通し、蛍光タンパク質遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ３０３１６６、ＡＹ３０３１６７、及びＡＹ２３７１５７）の部分に相補的な配列から２３ｎｔの標的配列を選択した。標的配列に完全に相補的な２３ｎｔのオリゴマーを、ＧＣ含量５２％の２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドとしてインビトロ合成した。上記詳細な方法（米国特許第５，１８５，４３９号、５，２８３，１７４号、及び５，６５６，７４４号）を用いて、本プローブの３つの形を異なる位置（２３merの塩基８及び９、１２及び１３、並びに１３及び１４の間）にリンカーで標識して、ＡＥ標識をリンカーに付けた。本標識化プローブ（各反応０．１ピコモル）を、１５μｌのハイブリダイゼーション試薬（１９０ｍＭスクシネート，１７％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ），１００ｍＭ ＬｉＯＨ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，及び３ｍＭ ＥＧＴＡ，ｐＨ５．１）を含む３０μｌの反応混合物中で、相補的な合成ｓｓＲＮＡ標的配列（各反応１０ピコモル）に６０℃１時間、個別にハイブリダイズさせた。その後、本ハイブリダイゼーション混合物をハイブリダイゼーション試薬で５００μｌに希釈して、検出工程を実施するために２０μｌのアリコートを取り出して、各検出反応混合物へ８０μｌのハイブリダイゼーション試薬の後、２００μｌの選択試薬（６００ｍＭホウ酸，１８２．５ｍＭ ＮａＯＨ，１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００），ｐＨ８．５）を加えて、５０℃で変動期間中、加水分解を実施した。その後、２００μｌの検出試薬（１ｍＭ硝酸、及び３２ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２）を加えることに続いて２００μｌの１．５Ｍ ＮａＯＨを加えた後、シグナルの産生及び検出を実施し、ルミノメーターを用いて化学発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した（２秒間）。ｓｓＲＮＡ標的のない個別プローブを含むアリコートで同じ検出反応法を実施して、非結合プローブ上のＡＥ標識の加水分解を測定した。これらの結果より、相補性の標的鎖が存在するか又は非存在である場合に、各プローブ組成物の検出可能標識の半分が加水分解する時間（Ｔ_１／２）を決定した。標的のない３つのプローブ（非結合プローブ）は全てのＴ_１／２が０．６９分〜１．０５分であるのに対し、標的が存在する場合（即ち、結合プローブ）のＴ_１／２は２５．８分〜１２５分であり、検出プローブが標的へ結合して、同種の反応混合物中の過剰なバックグラウンドシグナルにおいて検出可能なシグナルを産生することを示した。プローブが標的とハイブリダイズする場合は、異なるＴ_１／２特性を呈した：１２位と１３位の間で標識したプローブは最短のＴ_１／２（２５．８分）で、１３位と１４位の間で標識したプローブは最長のＴ_１／２（１２５分）で、８位と９位の間で標識したプローブは中間のＴ_１／２（６９分）であった。これらの結果から、３つのプローブがいずれも相補的なＲＮＡ標的へ結合することができること、非結合プローブ中の標識を差異的加水分解特性で結合プローブ中の標識から識別できること、及びオリゴマー上の標識位置が標識加水分解の速度に影響を及ぼすため、定型的な試験を用いて、アッセイに最適なプローブを選択して設計できることが示される。

一本鎖及び二本鎖の標的の検出感度
実施例１と同一の標的及び検出プローブ配列を用いるが、ｓｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの形態の場合のＲＮＡ標的の検出を比較して標的検出の感度を決定した。ｓｓＲＮＡ標的オリゴマーと、１３と１４の位置の間にＡＥで標識した検出プローブオリゴマーを実施例１のように用いた。本アッセイでは、反応物は全て、ハイブリダイゼーション反応（１００μｌのハイブリダイゼーション混合物を６０℃１時間インキュベートした）につき、０〜５フェムトモルのｓｓＲＮＡ標的にハイブリダイズする０．１ピコモルのＡＥ標識化プローブを含む。ハイブリダイゼーション後、２００μｌの選択試薬を加えて５０℃で１０分間インキュベートして非結合プローブ上のＡＥ標識を加水分解した後、結合プローブの化学発光シグナルを実質的に実施例１に記載のように検出した。表１、カラム１及び２に示す結果は、試験した標的量の範囲で線形の検出可能シグナルが測定されたことを示す。反応物中ｓｓＲＮＡ標的が０．００５フェムトモルより少ない場合、標的核酸がアッセイに存在しない場合に得られるバックグラウンドシグナルより検出可能シグナルは高かった。「正味ＲＬＵ」データ（カラム２）は、各試験試料につき検出されたＲＬＵからバックグラウンドＲＬＵ（標的が存在しない場合の５６０ＲＬＵ）を差し引いて計算した。

ｄｓＲＮＡ標的を用いて実施した試験では、上記のｓｓＲＮＡ標的オリゴマーに相補的なＲＮＡ鎖を合成し、この２つの相補ＲＮＡ鎖を共にハイブリダイズさせて標的を作製した。ｄｓＲＮＡ標的は、上記のように２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドとして合成し、１３位と１４位の間にＡＥで標識したのと同じプローブを用いて、実質的に上記のように試験した。本検出プローブは、ｄｓＲＮＡ標的の鎖の１つに相補的であった。ＡＥ標識化プローブとのハイブリダイゼーションの前に、溶液（１０ｍＭコハク酸Ｌｉ，及び０．０１％ ＬＬＳ，ｐＨ５．０）中で９０℃５〜７分間加熱後、氷で急冷してｄｓＲＮＡ標的を変性させた。試験１では、５０ピコモルの標的ｄｓＲＮＡを変性させてから希釈し、異なる量の標的を各々の１００μｌハイブリダイゼーション反応物に用いた。試験２では、適正量の標的ｄｓＲＮＡを別々の管へ５０μｌアリコートで分配して、上記のように加熱変性させてから、標識化プローブを含む５０μｌのハイブリダイゼーション試薬を各管に加えて、ハイブリダイゼーション反応混合物を作製した。ハイブリダイゼーション及び検出の反応は、実質的にｓｓＲＮＡ標的反応を上記のように実施して、ｄｓＲＮＡ標的の結果を表１、カラム３〜５に示す。標的が存在しない場合に検出されたバックグラウンドシグナル（試験１では９４２ＲＬＵ、試験２では９３２ＲＬＵ）を、ｄｓＲＮＡ標的が存在する場合に検出されるシグナルから差し引いて、「正味ＲＬＵ」（試験１ではカラム４、そして試験２ではカラム５）を得た。正味ＲＬＵの測定値は、本アッセイが、試験した標的量の範囲で実質的に線形の応答である検出可能シグナルとなることを示した。０．０１フェムトモル（試験１）〜０．０５フェムトモル（試験２）程度の少ない標的ＲＮＡが反応物に存在する場合にも陽性のシグナルが検出されて、本検出工程の感度を示した。

標的ＲＮＡの捕捉及び検出
本アッセイでは、ハイブリダイゼーション条件下でヘアピン構造を形成できる捕捉プローブを用いて標的核酸を試料から捕捉し、本標的核酸の標識化検出プローブとのハイブリダイゼーション及び結合した検出プローブからのシグナル検出を行った。本実験に用いた捕捉プローブは全てヘアピン構造の形成できる構造特性（５’領域ホモポリマー配列、５’領域配列に完全又は部分的に相補的な３’領域配列、及び５’及び３’領域配列に隣接する標的相補配列）を含んでいた。この５’及び３’領域配列はヘアピン構造の「ステム」部分を形成し、標的相補配列はヘアピン構造の「ループ」部分を形成する。

３形のヘアピン捕捉プローブを合成し、定型的な方法を用いてアッセイし、ヘアピン捕捉プローブのステムのＴｍを決定した。３つのプローブ全ての相補的な５’及び３’領域配列をデオキシリボヌクレオチド結合で合成した。ヘアピンプローブの各標的相補配列は、実施例１の２３ｎｔ標的相補配列のように、プローブ１及び２は２’−Ｏ−メチル結合で、プローブ３はデオキシリボヌクレオチド結合で合成した。プローブ１及び３で、５’領域は（ｄＴ）_１２配列、３’領域は（ｄＡ）_１２配列であり；プローブ２で、５’領域配列は（ｄＴ）_５Ａ（ｄＴ）_６であった。これは（ｄＡ）_１２の３’領域配列に部分的に相補的である。概略としては、生じた捕捉プローブ配列を以下の線型で示す：

［ここで、Ｎ_２３は、標的相補配列を表す］。上記の線状配列は５’領域の３’領域への分子内ハイブリダイゼーションで部分的な二本鎖ヘアピン構造を形成し、標的相補配列（Ｎ_２３）はこのヘアピン構造のループ部分となることが容易に理解できる。上記ヘアピンプローブの二本鎖ステム部分のＴｍは、約４６℃〜約５７℃の範囲であった（プローブ２で４６．３℃、プローブ３で５５．７℃、及びプローブ１で５６．７℃）。

上記のヘアピン捕捉プローブを用いた捕捉と標的の検出は、各反応につき０．０５〜５フェムトモルの標的量を用い、実施例２に記載のｄｓＲＮＡ標的及びＡＥ標識化プローブを用いて実施した。臨床試料類似の試料を提供するために、２００μｌの試料輸送溶液（１１０ｍＭ ＬＬＳ，１５ｍＭ第一リン酸ナトリウム，１５ｍＭ第二リン酸ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，ｐＨ６．７）に存在するｄｓＲＮＡ標的を２００μｌの尿と混合し、最終試料容量を４００μｌとした。本混合物を加熱してｄｓＲＮＡ標的を変性させ（９０℃で５分間、その後氷冷）、ｓｓＲＮＡ標的鎖を捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに供した。個別に試験したこの各ヘアピン捕捉プローブについて、変性したＲＮＡ標的試料を、０．３ピコモルのヘアピン捕捉プローブと、ｄＴ_１４の固定化プローブオリゴマーが共有結合する捕捉支持体である５０μｇの磁気粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ−ＭＡＧ^ＴＭ ＭＧ−ＣＭ粒子、Seradyn社、インディアナポリス、IN）を含む１００μｌの標的捕捉試薬（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，３１０ｍＭ ＬｉＯＨ，１．８８Ｍ ＬｉＣｌ，１００ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ６．４）と混合した。本混合物を６５℃（各々の捕捉プローブのＴｍより高温）で６０分間、その後室温で３０分間インキュベートして、上記の粒子に付く捕捉ハイブリッドを形成した。その後、捕捉ハイブリッドの付いた粒子を液体試料成分から磁気的に分離して取り出した。捕捉ハイブリッドの付いた粒子を室温で２回、５００μｌの試料輸送溶液で洗浄した後、捕捉ハイブリッドの付いた粒子を溶液から分離して取り出した。本捕捉ハイブリッドの付いた洗浄後の粒子を１００μｌの水と混合して加熱（９０℃で５分間）し、捕捉ハイブリッドの核酸成分を遊離させた（標的と捕捉プローブオリゴマーは溶液へ遊離し、固定化プローブは捕捉支持体粒子へ共有結合したままであった）。その後、標的の検出のため、実施例２に記載のように、本溶液を１００μｌのハイブリダイゼーション試薬中でＡＥ標識化検出プローブと混合し、本混合物をハイブリダイゼーション条件（５５℃で６０分間）下でインキュベートして検出プローブを標的鎖へ結合させた。上記の条件下で遊離した捕捉ハイブリッドは、分子内ハイブリダイゼーションで部分的に二本鎖のヘアピン構造を再形成し、標的鎖へのハイブリダイゼーションで検出プローブと競合する捕捉プローブの競合阻害を最小化できる。本検出プローブとヘアピン捕捉プローブの標的相補配列は同じセンス鎖であるため、互いにハイブリダイズすることはない。結合した検出プローブからのシグナルの検出は、実質的に実施例１に記載のように実施した。標的なしの対照反応物を同様に処理すると、反応のバックグラウンドシグナルは全て、５３５〜７１５ＲＬＵの範囲にあった。上記のアッセイの実験結果を表２、カラム２に正味ＲＬＵ（検出ＲＬＵ−バックグラウンドＲＬＵ）として示す。各アッセイの検出されたシグナルのバックグラウンドＲＬＵに対する比を表２、カラム３に示す。

上記アッセイの結果は、ヘアピン捕捉プローブを用いる標的核酸の捕捉とｄｓＲＮＡ標的の一方の鎖に相補的な検出プローブを用いる検出を組み合わせて、試料に存在する標的について試験した標的の全ての量を有効に検出したことを示す。

異なる形態の捕捉プローブを比較するアッセイ
上記のアッセイは、実施例３の記載に類似の方法を用いて、標的配列の捕捉及び検出の相対効率を比較し、標的捕捉工程は、ヘアピン構造又は線状構造のいずれか一方の捕捉プローブを用いて実施した。言及しない限り、本試験に用いた試薬は、上記の実施例１〜３に開示のものと同じであった。全てのアッセイで、実施例２に記載のように、２００μｌの試料輸送溶液と混合した２００μｌの尿に１フェムトモルのｓｓＲＮＡ標的を含む試験試料を用いた。標的捕捉工程で、実施例３に記載の部分的に二本鎖のヘアピン捕捉プローブ（配列番号１）又は以下の構造：
５’ＸＮ_２３ＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’（配列番号３）
［これは、実質的にヘアピン捕捉プローブと同じ標的相補配列（Ｎ_２３）であるが、他の５’ヌクレオチド（Ｘ）を１つ含む］の線状の一本鎖捕捉プローブのいずれか異なる量（０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０、及び２０ピコモル）を含む１００μｌの標的捕捉試薬と各４００μｌの試験試料を混合した。捕捉プローブのヘアピン形と線状形の両方で、標的相補領域を２’−Ｏ−メチル結合で合成した。ヘアピン捕捉プローブでは、相補的な５’−ポリｄＴ及び３’−ポリｄＡ領域が標的相補領域に隣接する一方、線状形では、標的相補領域が３’（ｄＴ）_３（ｄＡ）_３０配列に共有結合した。本反応混合物を６５℃で６０分間、その後室温で３０分間インキュベートし、捕捉ハイブリッドの形成と、固定化プローブを介した捕捉支持体への付着をできるようにした。磁場をかけて、捕捉ハイブリッドの付いた支持体を溶液試料成分より分離し、実施例３に実質的に記載したように、（各々０．５ｍｌの試料輸送溶液を用いて）２回洗浄した。最終洗浄溶液を除去し、捕捉ハイブリッドの付いた捕捉支持体をアッセイにつき１００μｌの水と混合して、９０℃で５分間インキュベートし、氷で急冷して捕捉ハイブリッドを核酸成分に遊離した後、標的鎖を検出プローブとハイブリダイズさせた。その後、各試験試料を、１００μｌのハイブリダイゼーション試薬中で実施例２の０．１ピコモルのＡＥ標識化検出プローブと混合し、５５℃で６０分間インキュベートして、検出プローブが標的鎖へハイブリダイズできるようにした。標的鎖へ結合した検出プローブからの化学発光シグナルの検出は、実質的に実施例３に記載のように実施した（２００μｌの選択試薬を加え、５５℃で１０分間インキュベートし、２００μｌの検出試薬と混合して、ルミノメーターで化学発光を（５秒間）測定する）。本結果を表３にカラム２及び３の正味ＲＬＵとして示し、線状形又はヘアピン形の捕捉プローブを用いて捕捉工程を実施して得られた検出の相対百分率をカラム４及び５に示す。正味ＲＬＵは、陽性の試料で検出されたＲＬＵからバックグラウンドＲＬＵを差し引いて計算した（バックグラウンドは、ヘアピンプローブ試験で７６５ＲＬＵ、線状プローブ試験で７４９ＲＬＵであった）。検出の相対百分率は、検出した最高正味ＲＬＵ（０．１ピコモルのヘアピン捕捉プローブの結果）を１００％と設定して、他の試験で検出された値よりも低い正味ＲＬＵを最高正味ＲＬＵ（２１，７７８）で割って計算した。

上記の結果は、同一標的配列に特異的な捕捉プローブの線状形及びヘアピン形を用いて実施したアッセイで、実施した全てのアッセイについて検出可能なシグナルが得られたことを示す。検出の相対百分率は、捕捉プローブがヘアピン形の場合、線状形と比較して常に高かった。検出の相対百分率の違いは、この２つの形から得られた結果を試験した最高量の捕捉プローブ（各反応につき２０ピコモル）で比較した場合の約１０倍強から、２つの形から得られた結果を試験した最低量の捕捉プローブ（各反応につき０．１ピコモル）で比較した場合の約２．７倍に及んだ。ヘアピン及び線状の捕捉プローブ形を使用したアッセイ間のこの相違は、線状捕捉プローブを用いる場合により競合的な阻害が原因である可能性がある。これは、アッセイの検出段階で、遊離した線状形が標的配列へのハイブリダイゼーションで検出プローブと競合し得るのに対し、同条件下で、ヘアピン形は、ヘアピン構造を再形成して、捕捉プローブの標的相補領域と検出プローブの標的への結合の競合を制限し得るからである。

部分的に二本鎖の捕捉プローブを用いるアッセイ
本実施例は、完全又は部分的に二本鎖の捕捉プローブを用いる態様について記載する。本態様の捕捉プローブは、その一方の鎖に標的核酸の一部に結合する標的相補領域が含まれる、２つの完全又は部分的に相補的な鎖から構成される。本捕捉プローブの１つの形は、合成し、共にハイブリダイズして、以下に示す少なくとも相補的な３’ポリＡ及び５’ポリＴ配列でのハイブリダイゼーションで結合する、部分的に二本鎖の捕捉プローブになる第一の捕捉プローブ鎖（配列番号４）及び第二の捕捉プローブ鎖（配列番号５）から構成される。

配列番号４のオリゴマーは、ヒトＢ１９パルボウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ３８６３３０）に含まれる配列に相補的な５’ポリＴ領域と３’配列を含み；配列番号５のオリゴマーは、５’ポリ−（ＴＣ）領域と３’ポリ−Ａ領域を含む。他の形において、捕捉プローブは、完全に二本鎖であり、以下に示す相補鎖（配列番号６）にハイブリダイズする第一の捕捉プローブ鎖（配列番号４）から構成される。

別々のアッセイにおいて、捕捉プローブの各形の約３．５ピコモルを、パルボウイルスＢ１９ゲノムＤＮＡ（変性させて、場合によっては、約１００〜１０００ｎｔ長の断片に剪断するか又は酵素により消化する）を含む０．５ｍｌ血漿試料と、ポリ（Ａ）オリゴマーの付いた捕捉支持体粒子を固定化プローブとして含む等量の標的捕捉試薬と混合する。即ち、固定化ポリ（Ａ）オリゴマーは、配列番号４の捕捉プローブオリゴマーの５’ポリ−ｄＴ部分に相補的である。本混合物をインキュベートして（６０〜６５℃、２０〜６０分）、捕捉プローブをその成分オリゴマー（配列番号４及び配列番号５、又は配列番号４及び配列番号６）に解離させ、配列番号４の標的特異部分をパルボウイルスＢ１９標的ＤＮＡ中の相補配列にハイブリダイズさせる。その後、本混合物をより低温（２５〜３０℃、１４〜３０分）でインキュベートし、捕捉プローブの相補的なホモポリマー配列と固定化プローブをハイブリダイズさせて、パルボウイルスＢ１９ＤＮＡ中の相補配列にハイブリダイズした配列番号５の捕捉プローブ鎖が含まれる捕捉ハイブリッドで、標的Ｂ１９ ＤＮＡを磁気粒子へ付ける。磁力をかけて、捕捉ハイブリッドが付いた粒子を試料成分から容器外に分離し、ハイブリダイズしなかった捕捉プローブ鎖が含まれる液体試料成分を除去する。洗浄工程を用いて、捕捉ハイブリッドの付いた粒子を、捕捉支持体に付いた捕捉ハイブリッドを維持するのに十分なイオン強度の水溶液に懸濁してから、磁力を用いて本粒子を水溶液より分離して、非結合の捕捉プローブオリゴマーと他の試料成分を含む洗浄溶液を除去する。捕捉したＢ１９ ＤＮＡの検出には、捕捉ハイブリッドの付いた粒子を、蛍光標識（例、フルオレセイン）で標識した配列番号７の検出プローブオリゴマー（各反応につき０．１〜０．５ピコモル）を含むハイブリダイゼーション試薬と混合して、検出プローブのＴｍ未満であるがポリＡ−ポリＴ二重鎖の融解温度より高温（例、５５℃、２０〜６０分）で本混合物をインキュベートして、捕捉したＢ１９ ＤＮＡ中の相補配列へ検出プローブをハイブリダイズさせ、Ｂ１９標的核酸を溶液相へ遊離させる。その後、本混合物をより低温（例、２５〜３０℃、１０〜３０分）でインキュベートすると、Ｂ１９標的ＤＮＡ、検出プローブ、及びポリｄＴ含有捕捉プローブ鎖から構成されるハイブリダイゼーション複合体が粒子上のポリ（Ａ）固定化プローブへ付くことができる。ハイブリダイズした検出プローブを含む複合体の付いた粒子を上記のように溶液相から分離して、非結合の検出プローブを含む溶液相を除去する。複合体の付いた粒子は、実質的に上記のように、粒子上のハイブリダイゼーション複合体を維持して残留する非結合の検出プローブを除去する条件下で場合によっては洗浄する。最後に、本粒子をある容量の液体（例、０．５ｍｌの水）と混合し、標準的なフルオロメトリー手順を用いて、本混合物の蛍光を測定する。Ｂ１９粒子もＤＮＡも含まない血漿等の陰性対照の試料を上記と同一に処理し、本陰性対照試料から測定される蛍光は、本アッセイのバックグラウンドシグナルを示す。捕捉プローブの部分的二本鎖及び完全二本鎖の両方の形で、上記のアッセイは、パルボウイルスＢ１９核酸を含む試験試料について、陰性対照試料が産生するバックグラウンドシグナルより有意に高い検出可能な陽性シグナルを産生する。陽性のシグナルは、パルボウイルスＢ１９標的核酸の試料中の存在を示す。
配列表

図１は、標的核酸（配列ａｂｃｄとして示す）を、一本鎖の捕捉プローブと混合して、捕捉プローブの標的相補領域（配列ａ’ｂ’ｃ’として示す）へハイブリダイズする標的核酸と、捕捉プローブの他の部分（ポリＡとして示す）へハイブリダイズする固定化プローブ（捕捉支持体へ付いたポリＴとして示す）から構成される捕捉ハイブリッドを形成し、その後に標的核酸の遊離と、標的核酸へハイブリダイズする検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示す）から構成される検出ハイブリッドが形成し、検出ハイブリッドが、検出可能シグナル（★により示す）を産生して、標的の存在を示す、標的核酸の捕捉及び検出を示す態様を示す。 図２は、標的核酸（配列ｄｃｂａとして示す）を、標的相補領域（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’として示す）に隣接するその５’及び３’端（ポリＴ及びポリＡ領域として示す）に相補配列を有するヘアピン捕捉プローブと混合して、開いた捕捉プローブの標的相補領域へハイブリダイズする標的核酸と、相補的な固定化プローブ（捕捉支持体へ付いたポリＴとして示す）へハイブリダイズする捕捉プローブの部分（ポリＡ領域）から構成される捕捉ハイブリッドを形成し、その後、標的を溶液中へ遊離させて、標的核酸へハイブリダイズする検出プローブ（配列ｄ’ｃ’ｂ’ａ’により示す）から構成される検出ハイブリッドを形成して検出可能シグナル（★により示す）を産生して、標的の存在を示す、標的核酸の捕捉及び検出を示す態様を例示する。 図３は、標的核酸（配列ａｂｃｄｅとして示す）を、相補配列を２つの鎖（ポリＡ及びポリＴ配列として示す）と１つの標的相補領域（ポリＴ含有鎖上の配列ａ’ｂ’ｃ’として示す）を含む完全な又は部分的な二本鎖の捕捉プローブと混合して、捕捉プローブ鎖の標的相補領域へハイブリダイズする標的核酸と、相補的な固定化プローブ（捕捉支持体へ付いたポリＴとして示す）へハイブリダイズする捕捉プローブ鎖の他の部分（ポリＴ）から構成される捕捉ハイブリッドを形成し、その後標的核酸を溶液中へ遊離させて、標的核酸へハイブリダイズする検出プローブ（配列ａ’ｂ’ｃ’ｄ’ｅ’により示す）から構成される検出ハイブリッドを形成して検出可能シグナル（★により示す）を産生して、標的の存在を示す、標的核酸の捕捉及び検出を示す態様を例示する。

Claims (11)

1. 試料中の標的核酸の存在を検出する方法であって：
   ハイブリダイズ条件下で、捕捉（capture）領域に隣接する内部の標的相補配列及び末端領域から構成される部分的な二本鎖のヘアピン構造を形成する核酸捕捉プローブを提供する工程であって、前記末端領域は前記捕捉領域と結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、前記標的相補配列は実質的にヘアピン構造の一本鎖ループ部分を形成する；
   標的核酸を含む試料を前記捕捉プローブと混合する工程；
   捕捉プローブの標的相補配列を標的核酸中の標的配列へ特異的にハイブリダイズさせる工程；
   捕捉領域を捕捉支持体に付いた固定化プローブに結合させる工程であって、ここで固定化プローブへの捕捉領域の結合が捕捉領域および固定化プローブの相補配列のハイブリダイズによるものであり、それにより、標的核酸、捕捉プローブ及び捕捉支持体に付いた固定化プローブから構成される捕捉ハイブリッドを形成する工程；
   捕捉支持体に付いた捕捉ハイブリッドを試料中の他の成分から分離する工程；
   標的核酸を捕捉ハイブリッドから遊離させる工程；
   その後、検出プローブを標的核酸へ特異的にハイブリダイズさせて、検出ハイブリッドを形成する工程；並びに
   試料中の標的核酸の存在を示す、検出ハイブリッドから産生されるシグナルを検出する工程；
   を含む、前記方法。
2. 捕捉領域が捕捉プローブの３’端の近くに位置し、末端領域が捕捉プローブの５’端近くに位置する、請求項１記載の方法。
3. 捕捉領域が捕捉プローブの５’端の近くに位置し、末端領域が捕捉プローブの３’端近くに位置する、請求項１記載の方法。
4. 標的核酸を捕捉ハイブリッドから遊離させる工程により、さらに捕捉プローブが固定化プローブから遊離する、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
5. 検出プローブが、捕捉プローブの標的相補配列とハイブリダイズする標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
6. 検出プローブが、捕捉プローブの標的相補配列とハイブリダイズする標的核酸中の標的配列と異なるか又は部分的に重複する標的核酸中の第２の標的配列へ特異的にハイブリダイズする、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
7. シグナルが均一（homogenous）反応で産生される、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１記載の方法に用いる組成物であって、ここで該組成物は、ハイブリダイズ条件下で、捕捉領域に隣接する内部の標的相補配列と末端領域から構成される部分的な二本鎖のヘアピン構造を形成する核酸捕捉プローブを含み、ここで末端領域は捕捉領域へ結合してヘアピン構造の二本鎖ステム部分を形成し、そしてここで標的相補領域は実質的に一本鎖のヘアピン構造のループ部分を形成する、組成物。
9. 捕捉プローブの標的相補配列にハイブリダイズする配列を含む標的核酸に特異的にハイブリダイズする検出プローブをさらに含む、請求項８記載の組成物。
10. 検出プローブが、捕捉プローブの標的相補配列へハイブリダイズする配列に特異的にハイブリダイズする、請求項９記載の組成物。
11. 捕捉支持体に付いた固定化プローブをさらに含む、請求項８〜１０いずれか１項に記載の組成物。

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