DE69031121T2

DE69031121T2 - Interferenzverhinderung mit affinitätseinfangschemas

Info

Publication number: DE69031121T2
Application number: DE69031121T
Authority: DE
Inventors: Mark Collins; David Mapleflower Ro Gillespie; David Morrissey
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1990-03-06
Publication date: 1997-11-13
Anticipated expiration: 2010-03-07
Also published as: AU5347690A; JPH04504058A; US5457025A; WO1990010717A1; JP3046838B2; CA2049042A1; EP0481999B1; ATE155821T1; EP0481999A1; DE69031121D1

Description

Grundlagen

Die Fähigkeit von Nucleinsäuren, Sequenz-spezifische Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden oder mit komplementären Nucleinsäure-Strängen zu hybridisieren, ist die Grundlage für Techniken, die allgemein als Hybridisierungstests bezeichnet werden.
In einem Hybridisierungstest wird eine Nucleinsäure mit einer ausgewählten Sequenz als eine Sonde verwendet, um eine Probe nach einer Ziel-Nucleinsäure-Sequenz, die komplementär zur Sonde ist, abzusuchen; das Binden der beiden Sequenzen wird anschließend mit Hilfe verschiedener bekannter Verfahren detektiert. Zum Beispiel macht das Markieren des von der Sonde und dem Ziel gebildeten Hybridisierungskomplexes es möglich, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren und, falls gewünscht, zu quantifizieren.
In einigen Hybridisierungstests werden geeignete Paare verwendet, die aus einer Einfangsonde und einer Substanz mit einer Affinität für die Einfangsonde bestehen, um den Hybridisierungskomplex (Ziel-Nucleinsäure- Sequenz/Sonde Komplex) zu identifizieren und/oder ihn aus der Probe zu entfernen. Zum Beispiel kann ein Poly- oder Oligonucleotid, dessen Nucleinsäure-Sequenz zu einem Bereich der Sonde komplementär ist, verwendet werden. Geeignete Paare von Affinitätskomponente - Einfangsonde können sein; Poly(dG)-Poly(dC) (Polydesoxyriboguanylat- Polydesoxyribocytidylat); Poly(dA)-Poly(dT) (Polydesoxyriboadenylat-Polydesoxyribothymidylat); und Poly(dA)- Poly(dU) (Polydesoxyriboadenylat-Polyuridylat). Ein Bestandteil dieses Affinitätspaars kann an einer festen Phase oder an einem festen Träger befestigt sein, wie beispielsweise Chromatographie-Säule, Filter, Kunststoffoberfläche, Glas etc.
Da sämtliche Stämme eines bestimmten Mikroorganismus eine genetische Komponente als Nucleinsäuren gemeinsam haben, die eine Diagnose mit Hybridisierungstests zulassen, sind derartige Hybridisierungstests wertvolle medizinische Mittel. Eine Detektion spezifischer Ziel- Nucleinsäuren ermöglicht die Diagnose von bakteriellen, mykotischen und viralen Krankheitsstadien bei Menschen, Tieren und Pflanzen. zusätzlich ist die Möglichkeit der Sondierung einer spezifischen Nucleotid-Sequenz eine wichtige Einsatzmöglichkeit bei der Identifizierung und Diagnose humangenetischer Erkrankungen.
Ein besonderer Nachteil bei Verwendung von Nucleinsäure-Hybridisierungsschemas, die auf der Verwendung eines Affinitätspaars, wie beispielsweise dA-dT, beruhen, ist jedoch die mögliche Interferenz bei einer Testdurchführung mit natürlich vorkommenden Substanzen, wie beispielsweise Moleküle, die Poly(rA) (Polyriboadenylat) oder Poly(dA) enthalten. Säugerzellen, die in unterschiedlichen Mengen praktisch in allen klinischen Proben, insbesondere Blut, vorgefunden werden, enthalten etwa ein Attomol (1 x 10&supmin;¹&sup8; mol) Poly(rA) pro Zelle (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Seite 188 (1982)). Sie enthalten ebenfalls etwa 100 ppm Poly(dA) und Poly(dT) pro Gewichtseinheit.
Falle in genügend hohen Mengen vorhanden, kann en dogenes Poly(dA) und insbesondere Poly(rA) mit dA-haltigen Sonden um die Bindung an Träger, die Poly(dT) enthalten, konkurrieren. Diese Verbindungen können auch mit beliebigen Sonden mit dA Schwanz, die an das Zielmolekül gebunden sind, in Lösung konkurrieren. Das Ergebnis ist ein vermindertes Testsignal und ein möglicherweise erhöhter Hintergrund. Das verminderte Signal resultiert aus der verringerten Bindung von Sonde/Ziel Komplexen am festen Träger. Der erhöhte Hintergrund nimmt noch weiter zu, falls die Poly(rA)- und/oder Poly(dA)-haltigen Sequenzen ein detektierbares Ausmaß an Homologie mit der markierten Sonde besitzen. Falls das Molekül, das detektiert werden soll, eine Poly(rA) mRNS ist oder anderes Poly(rA) enthält, ist die Spezifität des Hybridisierungstests reduziert, weil ein Binden dieses Moleküls über das natürlich vorkommende Poly(rA) und nicht über die hochspezifische Poly(dA)-haltige Einfangsonde an den festen Träger erfolgt. Zur spezifischen Detektion von Poly(rA)- haltigen mRNSn oder anderen polyadenylierten Sequenzen sind Verfahren notwendig, die endogenes Poly(rA) am Binden an festen Trägern, die Polydesoxyribothymidylsäure (Poly(dT)) enthalten, verhindern.
Zur Zeit ist kein Verfahren zur effektiven Verminderung der Interferenz von endogenen Poly(rA)- oder Poly(dT)-Sequenzen in Affinitätspaar-Hybridisierungstests verfügbar. Verfahren mit fein verteilten Partikeln können im Prinzip eine mögliche Signalminderung von Poly(rA) und Poly(dA) blockieren, falls genügend feste Phase eingesetzt wird, die sämtliche Zielmoleküle und sämtliche endogenen Poly(rA)- und Poly(dA)-haltigen Moleküle bindet. Collins, EP-A-0265244; Soderlund, GD-A-2169403; Stabinsky, U.S. Patent, Nr. 4.751.177. Der Einsatz einer derartigen Menge an Festphasen-Partikeln kann allerdings eine untragbare Erhöhung des normalen Werts des unspezifischen Hintergrunds verursachen. Der Einsatz von Partikeln kann auch eine Erhöhung des Hintergrunds verursachen, wenn eine kleine Menge markierter Sonde an Poly(rA)- oder Poly(dA)-haltige Moleküle bindet, die nicht das Ziel sind.
Diese Verfahren zur Interferenzverminderung von endogenen Polynucleotiden sind nur von begrenztem Nutzen, wenn Einfang und Detektion an bevorzugten Trägern für nichtisotope Affinitätspaar-Tests, wie beispielsweise an Poly(dT)-Nitrocellulose und an Poly(dT)-Polystyrol, durchgeführt werden. Diese Träger besitzen nur eine begrenzte Bindungskapazität von etwa einem Mikrogramm oder weniger Polydesoxyadenylat(dA-12), M. Collins, EP-A- 0266.244. Außerdem können diese Träger mit Poly(A)-haltiger mRNs schon gesättigt sein, die in etwa einer Million Säugerzellen vorhanden ist (beruht auf der Schätzung von etwa 1 Attomol Poly(rA)-200 pro Zelle in Maniatis et al., oben). Obwohl schon heute verfügbare Verfahren für isotope Detektion auf festen Trägern aus Magnetkügelchen, Cellulose und Glas einsetzbar sind, haben nichtisotope Affinitätsschemas auf diesen festen Trägern nicht die Empfindlichkeit gezeigt, die mit einer Detektion auf Poly(dT)-Nitrocellulose und Poly(dT)-Polystyrol vergleichbar ist. M. Collins, EP-A-0265244. Zudem gibt es keine Verfahren für die Eliminierung der Konkurrenz um die Bindung an Poly(dT) zwischen endogenem Poly(dA) und den dA enthaltenden Einfangsonden.
US-A-751.177 beschreibt Verfahren und Sets für die Durchführung von Nucleinsäure-Hybridisierungstests. Der beschriebene Sandwich-Hybridisierungstest umfaßt das in- Kontakt-Bringen der Urprobe, die die Ziel-Nucleinsäure enthält, mit dem Mediator (Einfangsonde) und der Detektorsonde. Nur nach Bildung eines Hybridisierungskomplexes aus dem Mediator, dem Ziel und den Detektorsonden in Lösung wird dann die Probe mit dem immobilisierten Homopolymer in Kontakt gebracht. In der Offenlegung wird weder gesagt noch kann daraus geschlossen werden, daß die Einfangsonde (Mediator) und das immobilisierte Homopolymer in einem früheren Stadium in Kontakt gebracht werden sollten oder daß in diesem Fall bessere Ergebnisse zu erzielen wären
Es wäre ein Verfahren zweckdienlich, mit dem Affinitätspaar-Hybridisierungstests sogar in einer Probe in Gegenwart von möglicherweise interferierenden Polymer- Nucleotiden durchgeführt werden könnten und die Interferenz von den endogenen Polynucleotiden reduziert werden könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung der Bindung, Interferenz oder Hybridisierung von in einer Probe vorhandenen endogenen Homopolynucleotiden mit komplementären Homopolynucleotiden, mit denen die Probe in Kontakt gebracht werden soll.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Interferenzverminderung von Polynucleotiden in einer Probe bei Affinitätspaar-Einfangtests, z.B. feste Phase-Affinitätspaar-Einfangtests, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
In-Kontakt-Bringen der Probe, die möglicherweise ein Ziel-Nucleotid, das eine ziel-Sequenz besitzt, enthält, mit einem komplementären Nucleotid, das eine zu der Ziel-Sequenz komplementäre Nucleotid- Sequenz besitzt; worin eine Einfangsonde das komplementäre Nucleotid und einen von einem ersten Homopolynucieotid gebildeten Schwanz umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß vor dem in-Kontakt- Bringen mit der Probe die Einfangsonde mit einem zweiten, an einem festen Träger befestigten Homopolynucleotid unter Bedingungen vereinigt wird, die eine Hybridisierung komplementärer Homopolynucleotide erlauben, wobei das zweite Homopoly nucleotid komplementär zu dem ersten Homopolynucleotid ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Hybridisierungsverminderung von in einer Probe vorhandenen endogenen Homopolynucleotid-Sequenzen mit einer Homopolynucleotid-Sequenz, die an einem festen Träger befestigt ist, mit der die Probe in Kontakt gebracht werden soll, wobei das Verfahren die Hybridisierung einer komplementären Homopolynucleotid-Sequenz an die befestigte Homopolynucleotid-Sequenz umfaßt, und dadurch die befestigte Homopolynucleotid-Sequenz für eine weitere Hybridisierung nicht verfügbar macht, wenn sie mit der Probe in Kontakt gebracht wird; und gegebenenfalls worin die komplementäre Homopolynucleotid-Sequenz eine Poly(dA)-Sequenz ist, die den Homopolynucleotid-Schwanz einer Einfangsonde umfaßt, die aus besagtem Schwanz und aus einer Polynucleotid- Sequenz besteht, die zu einer vermutlich in der Probe vorhandenen Ziel-Polynucleotid-Sequenz komplementär ist, und das befestigte Homopolynucleotid Poly(dT) ist.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Entfernen von Poly(rA) aus einem Affinitätspaar-Einfangtest bereitgestellt, in dem das Affinitätspaar an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Verfahren das in-Kontakt-Bringen des gebundenen Affinitätspaars mit einem Agens umfaßt, das Poly(rA) selektiv entfernt, und besagtes Agens ein chaotropes Salz oder ein Enzym, das ENS-Sequenzen in einem RNS/DNS-Doppelstrang verdaut, umfaßt.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein feste Phase-Affinitätspaar- Einfangtestverfahren bereitgestellt, das umfaßt:
(a) Vereinigen einer Probe, die getestet werden soll, mit einer hinreichenden Menge an Homopolynucleotiden, um mit komplementären endogenen, in der Probe vorhandenen Homopolynucleotiden unter Bedingungen zu hybridisieren, die für eine zu ereignende Hybridisierung komplementärer Nucleinsäure-Sequenzen geeignet sind, wodurch die endogenen Homopolynucleotide für weitere Hybridisierungen nicht verfügbar gemacht werden; und
(b) Vereinigen des Produkts von (a) mit einem festen Träger, an dem befestigt ist
(i) ein erstes Homopolynucleotid, das zu den endogenen Homopolynucleotiden in der Probe komplementär ist, an dieses ist hybridisiert
(ii) eine Einfangsonde, bestehend aus
(A) einem zweiten Homopolynucleotid- Schwanz, der zu dem ersten Homopolynucleotid komplementär ist, und
(B) einer Nucleinsäure-Sequenz, die zu einer in der Probe vermutlich vorhandenen Ziel-Nucleinsäure-Sequenz komplementär ist,
wobei der zweite Homopolynucleotid-Schwanz der Einfangsonde an (i) hybridisiert ist, und die zu dem Ziel komplementäre Nucleinsäure-Sequenz nicht hybridisiert ist und dadurch für eine Hybridisierung mit der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz verfügbar ist.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Set bereitgestellt, das umfaßt:
(a) einen festen Träger mit einem daran gebundenen Polynucleotid- Substrat;
(b) eine Einfangsonde, die eine zu einer Ziel- Nucleotid-Sequenz im wesentlichen komplementäre Nucleotid-Sequenz besitzt mit einem daran befestigten Schwanz, der komplementär zu dem Substrat ist; und
(c) ein chaotropes Agens.
Durch Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung vermindert sich die Interferenz von endogenen Polynucleotiden mit der Bindung einer Sonde (hier als Einfangsonde bezeichnet), die einen Homopolymer-Schwanz und eine zu einer Nucleinsäure-Sequenz von Interesse (eine Ziel-Nucleinsäure-Sequenz) komplementäre Nucleinsäure-Sequenz umfaßt, an einem Träger-gebundenen Polynucleotid-Substrat durch Verwendung von Zusammensetzungen und/oder ausgewählten Testbedingungen, die endogene Polynucleotide "blockieren" oder auf andere Art und Weise deren Bindung mit komplementären Homopolynucleotid- Sequenzen reduzieren. Die Interferenz wird entsprechend dem vorliegenden Verfahren entweder durch direkte Wechselwirkung mit den endogenen Polynucleotiden (z.B. indem sie gebunden werden) oder durch indirekte Beeinflussung deren Fähigkeit, mit Einfangsonden und/oder feste Träger-Affinitätsliganden (z.B. durch Änderung der Testbedingungen) zu hybridisieren.
In einer Anwendung des vorliegenden Verfahrens werden Oligo(dT)- oder Poly(dT)-Sequenzen, die an einer festen Oberfläche befestigt sind (Träger-gebundene Polynucleotide sind gelegentlich hier als Substrat bezeichnet), mit einer Einfangsonde mit dA-Schwanz vorgesättigt, die bei Detektion einer Ziel-Nucleinsäure-Sequenz in einer Probe verwendet werden soll. Folglich ist die einzige Möglichkeit, mit der eine Nucleinsäure-Sequenz an den festen Träger binden kann, über eine Hybridisierung mit der Einfangsonde. Folglich können endogene Poly(rA) und/oder Poly(dA)-Sequenzen nicht an den festen Träger binden.
In einer anderen Anwendung des vorliegenden Verfahrens ist Poly(dT) an einem festen Träger, wie beispielsweise Polystyrol, mit Hilfe von UV- oder gamma- Strahlen befestigt. Folglich ist das Binden von Poly(rA) im wesentlichen selektiv gehemmt; das Binden von endogenem Poly(dA) wird allerdings nicht beeinflußt.
In einer weiteren Anwendung des vorliegenden Verfahrens werden chaotrope Salze, wie beispielsweise Guanidinium-Thiocyanat (GuSCN), und das Einfangen an einem Poly(dT)-Polystyrol-Träger eingesetzt, um die Fähigkeit von Poly(rA) drastisch zu reduzieren, mit Einfangsonden mit Poly(dA)-Schwanz um die Bindung an Poly(dT) (das an Polystyrol-Trägeroberflächen befestigt ist) zu konkurrieren.
In einer anderen Anwendung des vorliegenden Verfahrens wird endogenes Poly(rA), nachdem die Ziel- Nucleinsäuren mit den Einf angsonden komplexieren und anschließend an das Substrat binden konnten, entfernt. Dieses Poly(rA) wird dann enzymatisch entfernt, beispielsweise durch Behandlung des Trägers (mit dem daran gebundenen Sonde/Ziel Komplex) mit RNAse H, die mit DNS hybridisierte Polyribonucleotide entfernt.
In einer anderen Anwendung des vorliegenden Verfahrens wird ein Test einer Probe unter Verwendung einer Sonde mit Poly(dA)-Schwanz in nichtchaotropen Salzen, wie beispielsweise gepuffertem Natriumchlorid, mit an einem Träger befestigten Poly(dT) durchgeführt. Als Ergebnis bindet in der Probe vorhandenes Poly(rA) kaum an auf einem Träger vorhandenes Poly(dT), trotz der Tatsache, daß die beiden Polymere mit beträchtlicher Avidität in Anwesenheit von Salzen, wie beispielsweise Natriumchlorid, normalerweise assoziieren. In einer weiteren Anwendung des vorliegenden Verfahrens werden endogene Polynucleotide, wie beispielsweise Poly(dA), an einer Bindung an Poly(dT) Stellen gehindert, die an einem festen Träger befestigt und frei geworden sind (für eine Hybridisierung verfügbar) durch den Abgang von vorimmobilisierten (vorgebundenen) Einfangsonden mit dA-Schwanz. Dies wird erreicht durch Vereinigen einer kleinen Menge an Poly(dT) mit einer zu untersuchenden Probe und einer Hybridisierung jeglicher in der Probe vorhandenen Poly(dA)-Sequenzen mit dem Poly(dT). Die Probe wird anschließend mit dem festen Träger, der Poly(dT) trägt, zusammengebracht.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls zur Detektion endogener Polynucleotid-Sequenzen in der Probe verwendet werden. In diesen Anwendungen wird mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren die Hybridisierung des endogenen Polynucleotids an die feste Phase verhindert oder vermindert. Die endogenen Polynucleotide sind folglich verfügbar, um an eine oder mehrere spezifische Sonden in Lösung zu binden.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls Testsets, die zur Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung zweckdienlich sind. Sets können ein Gefäß umfassen, das einen festen Träger, wie beispielsweise Polystyrol, und eine Affinitätskomponente, wie beispielsweise Poly(dT), die mit einer spezifischen Einfangsonde mit dA-Schwanz vorgesättigt wurde und eine chaotrope Verbindung, wie beispielsweise Guanidinium-Thiocyanat, enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1A ist eine graphische Darstellung der Bindung von Poly(rA) und Poly(dA) an Oligo(dT) als eine Funktion der GuSCN-Konzentration in der Bindungsmischung.
Abbildung iB ist eine graphische Darstellung der Stabilität von Poly(rA)-Oligo(dT) und Poly(dA)-Oligo(dT) Doppelhelices als eine Funktion der GuSCN-Konzentration im Waschpuffer.
Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung der Nucleotid-Sequenz ausgewählter Oligonucleotid-Sonden, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Sets zur Durchführung von Nucleinsäure-Hybridisierungstests und insbesondere Verfahren und Sets zur Verminderung der Interferenz von in biologischen Proben vor handenen Homopolynucleotiden oder homopolymeren Nucleinsäure-Sequenzen bei spezifischer Bindung oder Hybridisierung zwischen Einfangsonden mit Homopolymer-Schwanz und auf einem festen Träger vorhandenen komplementären Homopolymer-Sequenzen. Die Hybridisierung von endogenen Polynucleotid-Sequenzen, wie beispielsweise Poly(rA), Poly(OA), Poly(U) und Poly(dT), mit Träger-gebundenen Sequenzen wird gemäß dem vorliegenden Verfahren auf eine von verschiedenen Arten gestört; diese Verfahren können einzeln oder kombiniert verwendet werden.
Nachfolgend eine Beschreibung der verschiedenen Anwendungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei jede Anwendung in einem nachfolgenden Beispiel zusätzlich beschrieben ist. In jedem Fall wird das vorliegende Verfahren durchgeführt 1) in dem Kontext, der als ein feste Phase-Affinitätspaar-Einfangtest oder Affinitäts-Sandwichtest bezeichnet wird, (eine bekannte Technik, siehe Soderlund, U.K. Patentanmeldung GB 2169403A); und 2) um Interferenzen von endogenen Nucleinsäure-Sequenzen (z.B. Poly(rA), Poly(dA), Poly(U) Poly(dT)), die in einer Probe, die mittels Hybridisierung eines Affinitätspaares analysiert wird, vorhanden sind, wie beispielsweise eine Poly(dT)-Sequenz und eine Poly(dA)-Sequenz, deren Hybridisierung für das Testverfahren essentiell ist, zu vermindern (zu verringern, zu minimieren oder zu eliminieren).
Folglich werden in jedem Fall Nucleinsäure- Sequenzen von Interesse (Ziel-Nucleinsäuren) an einem festen Träger als ein Ergebnis zweier Hybridisierungsereignisse eingefangen: Hybridisierung der Ziel-Nucleinsäuren mit einer Einfangsonde, die aus einer zu der Ziel- Nucleinsäure-Sequenz komplementären Nucleinsäure-Sequenz und einem Homopolymer-Schwanz besteht, worin die Einfangsonde in der Lösung frei ist (das heißt, nicht immobilisiert) und anschließende Hybridisierung des Homopolymer-Schwanzes mit einem komplementären Homopolymer Substrat, das an den festen Träger befestigt ist.
Eine weitere Ausführungsform ist möglich, wo die Einfangsonde an das Substrat auf dem festen Träger hybridisiert ist und die immobilisierte Einfangsonde wird dann mit der Probe in Kontakt gebracht, und die Ziel-Nucleinsäuren werden durch Hybridisierung mit den immobilisierten Einfangsonden eingefangen. Mit "Schwanz" ist eine RNS- oder DNS-Sequenz gemeint, die entweder synthetisch oder enzymatisch an das 5' und/oder das 31 Ende und/oder an eines oder mehreren internen Nucleotiden der Einfang sonde angefügt werden kann. Der Fachmann wird erkennen, daß eine Einfangsonde mit einer überhängenden 5' Poly(rA)- oder Poly(dA)-Sequenz oder von einer oder mehreren internen Stellen (nicht an der Basenpaarung beteiligt) überhängenden Schwanz-Sequenz hergestellt werden kann, um in diesem Test genauso wie eine Sonde mit der üblicheren 3' überhängenden Schwanz-Sequenz zu fungieren. Im allgemeinen enthalten die Einfangsonden einen Poly(dA)- oder Oligo(dA)-Schwanz und eine zu der Ziel- Nucleinsäure-Sequenz, auf die eine Probe untersucht werden soll, komplementäre Nucleinsäure-Sequenz. Das Homopolynucleotid auf dem festen Träger ist im allgemeinen Poly(dT) oder Oligo(dT). Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung Poly(dA) ebenfalls Oligo(dA) umfassen.
Entsprechend soll die Bezeichnung Poly(dT) Oligo(dT) umfassen. In jedem Fall wird die Interferenz von endogenen Homopolynucleotid-Sequenzen mit der Hybridiserung des Homopolynucleotid-Schwanzes der Einfangsonde mit dem auf dem festen Träger vorhandenen komplementären Homopolynucleotid durch das vorliegende Verfahren vermindert. Das heißt, die Fähigkeit von endogenen Homopolynucleotid- Sequenzen, mit komplementären Homopolynucleotid-Sequenzen, mit denen die Probe in Kontakt gebracht wird, zu hybridisieren, ist durch das vorliegende Verfahren vermindert. Folglich ist der ausgeführte feste Phase-Test spezifischer und empfindlicher als es der Fall wäre, falls eine Interferenz durch endogene Nucleinsäure- Sequenzen vorkommen könnte.
Es gibt zwei allgemeine Ausführungsformen, die im vorliegenden Verfahren zur Verminderung der Interferenz von endogenen Nucleinsäure-Sequenzen eingesetzt werden, wobei jede der beiden unten beschrieben ist. Die erste Ausführung macht von einer ausgewählten Substanz Gebrauch, die im allgemeinen ein Polynucleotid mit einem Homopolymer-Schwanz ist. Die Schwanz-Sequenz ist zu einer auf dem festen Träger vorhandenen Hompolymer-Sequenz komplementär, an dem die Sonde mit Schwanz vorzugsweise derart vorgebunden ist, daß sie die Bindung von endogenen Homopolymeren an den festen Träger blockiert. Die zweite Ausführung beruht auf der Verwendung ausgewählter Bedingungen während des Zieleinfangs und/oder Waschens. Diese beiden Ausführungen können allein oder kombiniert, je nach Wunsch, eingesetzt werden.
In den Anwendungen des vorliegenden Verfahrens, in denen ein Polynucleotid zur Interferenzverminderung verwendet wird, ist das Polynucleotid im allgemeinen eine Einfangsonde mit Homopolymer-Schwanz. Eine hinreichende Menge an Polynucleotid wird zu der festen Phase vor dem in-Kontakt-Bringen mit der Probe gegeben, um die Bindung einer beliebigen, natürlich vorkommenden Nucleinsäure Sequenz in der Probe an die feste Phase zu mindern.
Natürlich vorkommende oder "endogene" Nucleinsäuren, die in der Lage sind, mit feste Phase-Affinitätspaar-Einfangtests zu interferieren, sind polymere Ribound Desoxyribonucleotide, wie beispielsweise Polydesoxy ribo- (Poly dA) und Polyribo- (Poly rA) Säuren. Eine Interferenz anderer Polynucleotide, wie beispielsweise Poly(dT) oder Poly(U), kann ebenfalls mit Hilfe des Verfahrens dieser Erfindung eliminiert werden. Diese Polynucleotide werden in biologischen Proben vorgefunden, die reich an Säugerzellen sind, wie beispielsweise Blut. Mit "Polynucleotid" ist ein RNS- oder DNS-Molekül gemeint, das üblicherweise 10 oder mehr Nucleotide lang ist. Die optimale Länge muß für jede Anwendung empirisch bestimmt werden. Für rRNS-Ziele und das Einfangschema, wie hier offengelegt, ist die optimale Länge der Einfang- Polynucleotidsonde etwa 25-35 Nucleotide. Andere Anwendungen erfordern unterschiedliche Längen.
Es gibt in der Praxis keine obere Grenze für die Menge an endogenem Homopolynucleotid, das am Interferieren mit Nucleinsäure-Hybridisierungstests durch die vorliegende Erfindung gehindert werden kann. Dies ist besonders zweckdienlich für biologische Proben, die große Mengen an Säugerzellen enthalten, wie beispielsweise Blut.
In einer Anwendung dieser Erfindung kann der Polynucleotid-Schwanz einer Einfangsonde (z.B. eine Sonde mit Poly(dA)-Schwanz) an komplementäre Nucleinsäure-Sequenzen (z.B. Poly(dT)), die an einer festen Phase befestigt sind, vor der Vereinigung des festen Substrats mit einer zu testenden Probe (die normalerweise endogene, interferierende Polynucleotide enthält) hybridisieren. In dieser Anwendung wird die mit Homopolynucleotid-Schwanz versehene Einfangsonde an die feste Phase "vorhybridisiert" (d. h. an das auf dem festen Träger vorhandene komplementäre Homopolynucleotid vor Verwendung in einem Test hybridisiert), üblicherweise in hinreichenden Mengen, um das auf dem Träger vorhandene Poly(dT) zu sättigen. Diese Komponenten werden unter Bedingungen inkubiert, die für eine Hybridisierung zwischen komplementären Nucleinsäuren (d. h. den Nucleinsäuren des Homopolymer-Schwanzes der Einfangsonde und dem an der festen Phase befestigten Homopolymer) hinreichend sind. Der Zweck dieser "Vorhybridisierung" ist, Substrate auf der festen Phase für eine Hybridisierung mit endogenem, in der Probe vorhandenem Poly(rA) oder Poly(dA) nicht verfügbar zu machen. Die feste Phase (die jetzt die Einfangsonde trägt) wird von der Lösung, die die Einfangsonden mit Schwanz enthält, abgetrennt.
Die Verwendung immobilisierter Einfangsonden wird in WO-A-9010716, veröffentlicht am 20.09.90 (entspricht der gleichzeitig anhängigen U.S. Patentanmeldung, Nr. 07/321.728, eingereicht am 10.03.1989, mit Titel "Immobilized Oligonucleotide Probes an Uses Therefor" von Collins und Morrissey), diskutiert. In dieser und anderen Anwendungen der Erfindung wird die Trennung der festen Phase von anderen Komponenten des Tests durch Waschen, magnetische Trennung, Zentrifugation oder Filtrationsverfahren erreicht. Der feste Phase/Einfangsonde Komplex wird anschließend mit einer Probe, die auf das Vorhandensein von Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen untersucht werden soll, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für eine zu ereignende Hybridisierung komplementärer Nucleinsäuren geeignet sind. Dies führt zur Bildung eines Produkts aus feste Phase/Einfangsonde/Ziel-Nucleinsäure-Sequenz. Dieses Produkt wird mit Hilfe bekannter Techniken detektiert. Diese Anwendung wird detaillierter in Beispiel 2 beschrieben.
Alternativ macht eine Vorhybridisierung von Sonden mit dT-Schwanz an Poly(dA) oder Poly(rA) auf festen Trägern es möglich, die Wechselwirkung von Sonden mit Poly(dT)-Schwanz mit endogenen Poly(rA)- und Poly(dA)- Sequenzen zu mindern.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde das Ziel, Campylobacter rRNS, auf Poly(dT)-Polystyrol mit Hilfe der vorimmobilisierten Campylobacter-spezifischen Einfangsonde #732 mit dA-Schwanz in Anwesenheit und Abwesenheit von zugegebenem Poly(dA) eingefangen. Salmonella rRNS wurde mit einer generischen Ribosonde markiert und an eine Salmonella-spezifische Oligonucleotid-Sonde mit dA- Schwanz in Lösung hybridisiert, um zu bestimmen, ob dieses markierte Poly(dA)-haltige Molekül das Testsignal vermindern oder das Testrauschen erhöhen würde.
Die in Beispiel 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Poly(dA)-haltigen Moleküle die Bildung des Testsignals nicht abschwächten, wenn der Zieleinfang mit Hilfe von Poly(dT)-Polystyrol, das ein vorhybridisiertes Campylobacter-spezifisches Polynucleotid mit dA-Schwanz enthält, erfolgte. Es wurde weiter gezeigt, daß dieses Ergebnis darauf zurückzuführen ist, daß das Poly(dA)-haltige Molekül die Campylobacter Sonde mit dA-Schwanz von dem Poly(dT) nicht wirksam verdrängte. Der heutige Stand der Technik erlaubt einem nicht vorauszusagen, ob das exogen zugegebene Poly(dA) die zuvor gebundene Sonde mit Schwanz tatsächlich nicht verdrängen würde. Im Gleichgewicht würde bestimmt ein beträchtliches Ausmaß an Verdrängung stattfinden, weil die Gleichgewichtskonstante für die Verdrängung einer kürzeren vorgebundenen Sonde mit dA-Schwanz durch eine exogen zugegebene Sonde mit längeren dA-Schwanz geringfügig größer als eins angenommen werden würde. Offensichtlich wird das Gleichgewicht unter diesen Inkubationsbedingungen nicht erreicht.
Die Tatsache, daß die Campylobacter-Sonde in Anwesenheit und Abwesenheit von exogenem Poly(dA) gleich gut gebunden blieb, zeigt, daß diese Technik des Vor- Bindens der Einfangsonde mit dA-Schwanz an Poly(dT)- Träger zur Verhinderung eines jeglichen möglichen Signalverlusts zweckdienlich ist, der von endogenem Poly(dA) und Poly(dT) während des Einfangs von Ziel- Nucleinsäuren, wie beispielsweise Campylobacter rRNS, mit Oligonucleotid-Sonden mit dA-Schwanz verursacht wird.
Es ist ebenfalls möglich, das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur selektiven Interferenzverminderung von endogenen Polyadenylat-Nucleotiden, wie beispielsweise Poly(rA), einzusetzen. Insbesondere kann die Interferenz von in biologischen Proben vorhandenem Poly(rA) durch Ausführung des Einfangtests unter Bedingungen, die das Binden von endogenem Poly(rA) an Homopolynucleotide oder Substrate auf der festen Phasen selektiv verhindern, eliminiert werden.
Mit "Substrat" ist eine Substanzschicht gemeint, die auf einen festen Träger kovalent oder nichtkovalent aufgetragen ist. Das Substrat verstärkt die Bindung der nächsten Substanzschicht erheblich. Es können viele Substratschichten an der ersten festen Phase gebunden sein. Beispielsweise kann Poly(dT) an Polystyrol gebunden sein. Polymere Nucleotide mit (dA)-Schwanz, die eine Vielzahl an anderen Affinitätsliganden tragen, können an dem Poly(dT)-Substrat gebunden sein. Weitere Substanzen können an den anderen Affinitätsliganden an jedem der ersten Oligomere mit Schwanz etc. gebunden sein, und somit eine riesige dreidimensionale Struktur aus Einfangsonden aufbauen, die in der Lage ist, ein Ziel rasch und effizient einzufangen.
Die selektive Hemmung der Poly(rA)-Bindung an das Substrat auf einer festen Phase in einem Affinitätstest dieser Erfindung beruht auf mehreren Entdeckungen, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Es ist entdeckt worden, daß sowohl Poly(rA) als auch Poly(dA) in Gegenwart bestimmter Salze unterschiedlich an Poly(dT) bindet. Insbesondere ist entdeckt worden, daß Poly(rA) nicht mit einer Einfangsonde mit Poly(dA)-Schwanz um eine Hybridisierung an einen Poly(dT)- festen Träger konkurriert, weder wenn die Einfangsonde in Lösung zugegeben ist, noch wenn die Einfangsonde an einem Poly(dT)-tragenden festen Träger vorhybridisiert ist. Dies liegt teilweise an der Inkubation dieser Komponenten in Gegenwart chaotroper Verbindungen. In diesem Zusammenhang ist eine chaotrope Verbindung eine Verbindung, die Moleküle primär durch Zerstörung der das Molekül umgebenden Hydrathülle denaturiert. Hamaguchi, K. und Geiduchek, E.P: J. Am. Chem. Soc., 84 1329-1338 (1962). Eine besonders bevorzugte chaotrope Verbindung, die für das Verfahren dieser Erfindung zweckdienlich ist, ist das chaotrope Salz Guanidinium-Thiocyanat (GuSCN). Andere bevorzugte chaotrope Salze sind die monovalenten Salze großer Säureionen, wie beispielsweise Trichloracetat (TCA), Trifluoracetat (TFA) und Thiocyanat (SCN). Folglich ist eine unerwartete Entdeckung, daß die Verwendung chaotroper Salze, insbesondere GuSCN, ein Konkurrieren zwischen Poly(rA) und Einfangsonden mit Poly(dA)-Schwanz um die Bindung an dT-haltige feste Träger verhindern kann.
Ein weiteres unerwartetes Ergebnis ist, daß Poly(rA) sehr schwach an ein an Polystyrol (z.B. Poly(dT)-Polystyrol) befestigtes Substrat hybridisiert. Der Mechanismus dieser Bindungshemmung ist nicht klar. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß Poly(rA) an Polystyrol mit einem Poly(dT)-Substrat, sogar in Natriumchlorid (NaCl)-haltigen Puffern, nicht hybridisiert und daß dieses unerwartete Ergebnis dazu verwendet werden kann, um eine Interferenz endogener polyadenylierter Moleküle in feste Phase-Affinitätspaar-Einfangsondentests zu verhindern. Poly(dT)-Polystyrol kann ebenfalls zusammen mit einer chaotropen Verbindung, wie beispielsweise GuSCN, verwendet werden, um die Fähigkeit von Poly(rA) weiter herabzusetzen, mit Einfangsonden mit Poly(dA)-Schwanz um die Bindung an Poly(dT) zu konkurrieren.
Die Verwendung geeigneter Konzentrationen von chaotropen Verbindungen, wie beispielsweise GuSCN, kombiniert mit geeigneten Temperaturen während der Affinitätseinfangtests ist ebenso zweckdienlich mit einer Einfangsonde, die einen Polydesoxythymidylat (Poly(dT)) Schwanz besitzt, und einer festen Phase, an der Poly(dA) befestigt ist. Dies ist so, weil endogenes Poly(rA) nicht in der Lage ist, an den Poly(dT) Schwanz der Einfangsonde zu binden, und folglich bleibt der Poly(dT)-Schwanz frei für die Bindung an Poly(dA) auf dem festen Träger.
Für das vorligenden Verfahren sind drei Variable wichtig: die Konzentration des chaotropen Salzes (z.B. GuSCN), Temperatur und die Länge der Sonden. Zum Beispiel kann die Temperatur zwischen ca. 0ºC und ca. 100ºC variieren. Die Konzentration von GuSCN (oder einem anderen chaotropen Salz) kann zwischen ca. 0,25 M bis ca. 4 M liegen. Die Sondenlänge kann von ca. 10 bis zu ca. 3000 Nucleotiden betragen. Wenn die Länge der Sonden erhöht ist, sollte die Temperatur, bei der Poly(rA) an einer Bindung gehemmt werden kann, oder die Konzentration des chaotropen Salzes oder beides erhöht werden. Ein bevorzugter Temperaturbereich für das vorliegende Verfahren liegt zwischen ca. 4ºC bis ca. 65ºC; mit 37ºC als besonders zweckdienlicher Temperatur. Zum Beispiel ist eine GuSCN-Konzentration von etwa 2,5 bis 3,5 M bei etwa 37ºC für die Interferenzhemmung von Poly(rA) bei der Poly(dT)- Poly(dA) Paarbildung zweckdienlich; und eine Konzentration von etwa 1,0-1,5 M GuSCN bei etwa 37ºC für die Interferenzhemmung bei der Oligo(dT)&sub1;&sub4; - Poly(dA) Paarbildung zweckdienlich. Viele Kombinationen von Temperatur, Chaotrop-Konzentration und Sondenlänge sind allerdings möglich, und die beste Kombination kann empirisch einfach bestimmt werden.
In einer weiteren Anwendung des Verfahrens dieser Erfindung zur Verhinderung einer Interferenz von endogenen Polynucleotiden bei Affinitätseinfangtests werden chaotrope Salze und andere geeignete Verbindungen verwendet, um endogene Polynucleotide selektiv zu entfernen, die mit einem an einem festen Träger gebundenen komplementären Homopolymer hybridisieren.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, ist ein alternatives Verfahren zur Verhinderung einer Poly(rA)-Interferenz in Affinitätspaar-Einfangtests entwickelt worden. Dieses Verfahren beruht auf dem Waschen der am festen Träger gebundenen Polynucleotide mit einem geeigneten Puffer oder einer anderen Flüssigkeit, die ein Reagenz enthält, das in der Lage ist, gebundene Polynucleotide selektiv zu entfernen (abzuwaschen). In dieser Anwendung wird, obwohl sowohl Poly(rA) als auch Poly(dA) an den festen Träger binden, ein Puffer, der ein Reagenz, wie beispielsweise GuSCN, enthält, verwendet, um Poly(rA) aber nicht Poly(dA) selektiv von dem (dT)-Substrat (das heißt, (dT)- haltigen Trägern) zu waschen.
Andere Reagenzien, wie beispielsweise RNAse H, die die RNS-Sequenzen in einem RNS/DNS-Hybrid selektiv verdaut (Berkower, etal., 1973. J. Biol. Chem., 248:5914; Vournakis, J.H. etal., 1975. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:2959) können verwendet werden, um die Poly (rA)-haltigen Sequenzen von einem Poly(dT)-haltigen Träger selektiv abzuwaschen. Diese Reagenzien können entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren unter Verwendung von RNAse H und GuSCN ist RNAse H in einem Waschschritt zu verwenden und dann GuSCN zu verwenden, um Poly(rA)- Sequenzen in einem weiteren Waschschritt zu entfernen. Die Verwendung zweier Verfahren, die auf unterschiedlichen und unabhängigen Mechanismen basieren, wird bevorzugt, da die Effizienz normalerweise wesentlich größer ist, als es der Fall wäre, wenn eine einfache Wiederholung des gleichen Verfahrens oder die Verwendung von Verfahren, die mit den gleichen Mechanismen arbeiten, eingesetzt werden würden. Der Fachmann wird ferner erkennen, daß eine Kombination aus selektiver Bindung von Poly(dA) an einen Poly(dT)-haltigen Träger und selektiver Elution des Großteils an jeglichem verbliebenen Poly(rA) von dem Träger während des Waschens ebenfalls effektiv angewendet werden kann.
Es ist ebenfalls möglich, das vorliegende Verfahren zu verwenden, um endogene Polynucleotid-Sequenzen (z.B. Poly(dA)) an einer Bindung an Polynucleotid-Stellen (z.B. Poly(dT)) zu hindern, die an einem festen Träger befestigt sind und durch den Abgang einer kleinen Menge an vorimmobilisierter Einfangsonde mit Homopolymer-Schwanz (z.B. (dA)-Schwanz) für eine Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz (unbesetzt) wieder verfügbar sind. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wird die Probe vor dem in- Kontakt-Bringen mit einem festen Träger, der ein Polynucleotid (Z.B. Poly(dT)) trägt, mit einer kleinen Menge des gleichen Polynucleotids (hier Poly(dT)), das auch an dem festen Träger befestigt ist, vereinigt und unter Bedingungen gehalten, die für eine zu ereignende Hybridisierung komplementärer Nucleinsäure-Sequenzen geeignet sind. Die Menge an verwendetem Polynucleotid sollte die Menge übersteigen, die für eine Bindung der endogenen Polynucleotid-Sequenzen hinreichend ist; die genaue Menge muß für einen bestimmten Probentyp ermittelt werden. Anschließend wird die Probe mit dem Poly(dT) tragenden festen Träger in Kontakt gebracht und die Einfangsonde daran befestigt.
Die vorliegenden Verfahren zur Verhinderung der Interferenz mit Polynucleotiden in Nucleinsäure- Hybridisierungstests kann vorteilhafterweise als ein Mittel zur Detektion des endogenen Polynucleotids verwendet werden. Das heißt, die hier beschriebenen Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um eine zusätzliche Spezifität bei Hybridisierungsreaktionen zu gewinnen, worin die Ziele Polymere aus A, T, oder U enthalten. Durch Blockierung der Bindung des endogenen Polynucleotids an das Subtrat auf dem festen Träger muß das Ziel, wenn vorhanden, an den festen Träger über den Polymer-Schwanz an der spezifischen Einfangsonde (an der das Ziel spezifisch hybridisiert sein muß) binden. Insbesondere berücksichtigt das hier bereitgestellte Verfahren die spezifische Detektion eines polyadenylierten Ziels durch die Blockierung der Bindung des Ziels an eine (dT)-haltige feste Phase über die eigene polyadenylierte Sequenz und zwingt es, an den festen Träger über ein spezifisches Einfang-Nucleotid mit Schwanz zu binden, an das das Ziel spezifisch hybridisieren muß.
Durch Markieren des Ziels (z.B. eines endogenen Polynucleotids) mit einer spezifisch markierten (Reporter) Sonde liefert die vorliegende Erfindung zusätzlich ein Verfahren zur Detektion des Polymersequenzen enthaltenden Ziels, was von der spezifischen Hybridisierung der beiden Sonden an das Ziel abhängt. Diese Verfahren sind im allgemeinen zweckdienlich mit Polymersequenzen enthaltenden Zielen und insbesondere mit "chimären" polyadenylierten mRNSn zweckdienlich. Eine chimäre RNS ist eine einzelne ununterbrochene Kette von Ribonucleinsäure-Nucleotiden, die aus Sequenzen besteht, die normalerweise oder gewöhnlicherweise in zwei oder mehreren getrennten und distinkten RNS-Molekülen vorgefunden oder können in bestimmten Fällen vorgefunden werden; alternativ bezieht sich eine chimäre mRNS auf eine einzelne ununterbrochene Kette aus Ribonucleinsäure- Nucleotiden, deren DNS codierende Sequenzen vor der Transkription durch (ein) Rekombinationsereignis(sen) zwischen zwei oder mehreren verschiedenen DNS codierenden Sequenzen vor der Transkription gebildet werden. Um in diesem Fall die chimäre Natur von derartigen mRNS nachzuweisen, ist die Beobachtung entscheidend, ob zwei nor malerweise distinkte Polynucleotid-Sequenzen in einem Molekül zusammen verknüpft worden sind. Ein spezifisches Binden einer Einfangsonde an eine Sequenz und ein spezifisches Binden einer Reportersonde an die andere Sequenz reicht aus, um nachzuweisen, ob die beiden Sequenzen zu einer verknüpft worden sind.
Zum Beispiel umfaßt ein Verfahren zur Detektion einer polyadenylierten Nucleinsäure in einer biologischen Probe die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der polyadenylierten Nucleinsäure und komplementären Sequenzen auf einer Einfangsonde, die an einem (dT)- Substrat auf einem festen Träger befestigt ist. Die polyadenylierte Ziel-Nucleinsäure kann am Binden an dem Poly(dT)-haltigen festen Träger mit Hilfe der zuvor beschriebenen Verfahren gehindert werden. Das heißt, Einfangsonden können an die feste Phase vorhybridisiert werden, bevor die feste Phase mit der das Ziel enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann ein beliebiges Poly(rA)-haltiges Ziel in Anwesenheit eines chaotropen Salzes inkubiert werden, um das Binden des Ziels an die feste Phase, wie zuvor beschrieben, zu verhindern.
Jedes der zuvor beschriebenen Verfahren zur Hemmung der Bindung endogener Polynucleotide kann ebenfalls verwendet werden, um Polynucleotide unter Verwendung von Reporter- und Einfangsonden zu detektieren. Zum Beispiel wird ein Hybridisierungskomplex aus der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz, einer Einfangsonde und einer markierten Sonde gebildet. Sowohl die Einfangsonde als auch die markierte Sonde sind in der Lage, an die Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren. Falls die Ziel-Nucleinsäure beispielsweise einen Poly(rA)-Bereich enthält, kann dessen direktes Binden an das dT Substrat auf der festen Phase mit Hilfe der Verfahren dieser Erfindung blockiert werden. Das an seine Reportersonde gebundene Poly(rA) Ziel-Polynucleotid darf an den festen Träger ausschließlich über komplementäre Sequenzen auf der Einfangsonde binden.
Sets, die zu verwendende Materialien in den vorliegenden Verfahren zur Verminderung der Polynucleotid- Interferenz bei Affinitätspaartests enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Derartige Sets können zum Beispiel Gefäße oder andere Behältnisse umfassen, die eine Einfangsonde mit einem Homopolymer-Schwanz, eine feste Phase, an der ein zu dem Schwanz der Einfangsonde komplementäres Polynucleotid befestigt ist, ein chaotropes Salz und gegebenenfalls Reagenzien, die zur Verhinderung der Hybridisierung komplementärer Sequenzen und/oder zum selektiven Entfernen (Auswaschen) hybridisierter Sequenzen verwendet werden, enthalten. Zum Beispiel kann ein Set, das zur Verhinderung der Interferenz von Poly(rA) entwickelt wurde, enthalten:
a. Ein Gefäß, das ein chaotropes Salz, wie beispielsweise GuSCN, enthält;
b. Ein Gefäß, das eine oder mehrere Einfangsonden mit (dA)-Schwanz enthält, wobei die Sonden für die Ziele spezifisch sind; und
c. Ein Behältnis, das einen speziellen festen Träger (z.B. Tauchstäbchen oder Mikrotitervertiefungen) umfaßt, an dem Poly(dT) derart befestigt ist, um das Binden von Poly(rA) zu hemmen.
Alternativ kann ein Set das Gefäß von (a) und ein zweites Gefäß enthalten, das einen festen Träger, der Poly(dT) als das Substrat und eine vorhybridisierte ausgewählte Einfangsonde trägt, enthält. Endogenes Poly(rA), das an das Substrat bindet, kann mit einem Enzym, das spezifisch für die RNS eines RNS-DNS-Doppelstrangs ist, wie beispielsweise RNAse H, nach dem Binden des Ziels an die Sonde und anschließendem Binden des Sonde/Ziel Komplexes an den Träger entfernt werden. Die Sets können so entwickelt sein, daß das Vorhandensein einer beliebigen Species innerhalb einer Gattung für eine bestimmte Erkrankung detektiert werden kann. Zum Beispiel kann ein Set mit einer für Salmonella, Shigella oder Campylobacter spezifischen Sonde entwickelt werden. Alternativ kann ein Set zum Testen auf gastromtestinale Erkrankungen entwickelt werden, das für alle drei dieser Bakterienarten spezifische Sonden enthält.
Das Set kann gegebenenfalls eines oder mehreres des Folgenden enthalten: eine markierte Sonde zum Detektieren und Quantifizieren der Ziel-Nucleinsäuren, ein Mittel zum Detektieren der markierten Sonde, Waschpuffer (z.B. zur Verminderung des unspezifischen Bindens), einen oder mehrere Elutionspuffer oder Klonierungsreagenzien und/oder eine oder mehrere positive Kontrollproben und eine oder mehrere negative Kontrollproben. Eine Amplifizierung der Ziel-Sequenzen kann zum Beispiel mit der von Mullis, im U.S. Patent 4.683.202 beschriebenen Technik, durchgeführt werden. Die Klonierung des isolierten Ziels kann mit Verfahren, die von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1982) beschrieben sind, durchgeführt werden. Die markierte Sonde kann zum Beispiel mit Fluorophoren, Liganden (wie beispielsweise Biotin oder Antigenen), Chemielumineszenz- Verbindungen oder Radioisotopen markiert sein. Die Mittel zur Detektion der markierten Sonde hängen vom verwendeten Markierungstyp ab; zum Beispiel kann eine Radionuclid- Markierung autoradiographisch oder mit dem Szintillationszähler detektiert werden.
Diese Erfindung wird nun vollständiger mit Bezug auf die spezifischen Beispiele beschrieben, die in keiner Weise als einschränkend zu verstehen sind.

Beispiel 1: Verfahren zur Herstellung von Sonden und festen Trägern

Dieses Beispiel erläutert die üblichen Materialien und Verfahren, die zur Herstellung der Komponenten dieser Erfindung verwendet werden.

A. Anhängen des Schwanzes an die Einfangsonden

Oligonucleotid-Sonden wurden über Nacht bei 37ºC in 0,1 M Kaliumkakodylat (pH 7,0), 4 mM MgCl&sub2;, 1,2-Mercaptoethanol, 0,1 mg/ml acetyliertem Rinderserumalbumin (BSA), dATP Oligonucleotid mit einem molaren Verhältnis von 30:1 bis 100:1 und 1000 Einheiten TdT pro ml (Supertechs) mit einem Schwanz versehen. Eine geringe Menge Tritium markiertes dATP wurde zugegeben, um die Schwanzlänge und das Binden der Sonde an das Polystyrol zu kontrollieren.

B. Herstellung von markierten Sonden

Markierte Ribosonden: Ein 3W 720 bp Fragment der E. coli 165 rRNS wurde in den PGEM4 Vektor (Promega Biotec) geklont. Es wurde mit 5P6 Polymerase mit Hilfe bio-11-UTP (Enzo) gemäß Herstelleranleitung (Promega Biotec) transkribiert. Die Ribosonde wurde dann durch zweimalige Ethanol-Präzipitation gereinigt.
Alternativ wurde ein 5' 567 bp Fragment der E. coli 16S rRNS in den pGEM4 Vektor kloniert. Es wurde mit T7 Polymerase mit Hilfe bio-11-UTP (Enzo) gemäß Herstelleranleitung transkribiert. Die Ribosonde wurde dann durch zweimalige Ethanol - Präzipitation gereinigt.
Diese Sonden sind in der Lage, über kurze Homologiebereiche an jede eubakterielle 168 rRNS, für die eine Sequenzinformation verfügbar ist, zu hybridisieren. Sie haben gezeigt, daß sie an E. coli, Shigella, Salmonella, Campylobacter, Listeria, Neisseria gonorrhea und Chlamydia trachomatis hybridisieren.

c. Beschichten von Polystyrol mit Poly(dT)

Das folgende Verfahren ist spezifisch auf Mikrotitervertiefungen zugeschnitten, kann aber mit wenigen Modifikationen für das Binden von dT-Polymeren an gamma bestrahlte Tauchstäbchen (Hygeia, In., Newton MA) und Polystyrol-Röhrchen verwendet werden.
Ein Volumen von 0,3 ml von 3 OD/ml Poly(dT) in 1,5 M NaCl, 0,3 M Tris pH 8,0, 0,5 M MgCl&sub2; pro Mikrotitervertiefung (Dynatech Immulon 2) wurde gut verschlossen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die dT-Mischung wurde dann aus den vertiefungen entfernt, die bei 37ºC 30 Minuten getrocknet wurden. Die getrockneten Vertiefungen wurden dann 650 µW/cm² UV (254 nm) 2 Minuten exponiert, dreimal mit 1 M NaCl, 100 mM Tris pH 9,3, 2 mM MgCl&sub2;, 0,1 % Tween-20 gewaschen und an Luft getrocknet. Die Vertiefungen wurden mit 2,5 M Guanidinium-Thiocyanat (GuSCN), 2,5 % acetyliertem BSA, 10 µg/ml E. coli ssDNS, 10 mg/ml tRNS 1 Stunde bei 37ºC blockiert und dreimal wie oben gewaschen. Die Vertiefungen wurden getrocknet, gut verschlossen und bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch aufbewahrt. Es gab keinen Verlust an Bindungskapazität nach einer dreimonatigen Aufbewahrung bei diesem Verfahren.
Um die Bindungskapazität der Poly(dT) beschichteten vertiefungen zu bestimmen, wurde 0,3 ml ³²P 5' endmarkiertes dA12 (5 µg/ml) pro Vertiefung zugegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit dem obigen Puffer gewaschen und dann im Szintillationszähler gezählt. Eine Bindungskapazität von größer als oder gleich 250 ng/Vertiefung wurde als akzeptabel festgelegt.

Beispiel 2: Vorhybridisierung von Einfangsonden mit Polynucleotid-Schwanz an die feste Phase

A. Bindung von Oligonucleotid-Sonden mit dA-Schwanz an Poly(dT)-beschichtete Mikrotitervertiefungen vor dem Zieleinfang

Eine Bindungsmischung aus 2,5 M GuSCN, 200 mM Tris pH 7,4, 40 mM EDTA, 2,5 % acetyliertem BSA und 2,5 µg/ml der Sonde mit dA-Schwanz wurden zu vorblockierten Mikrotitervertiefungen mit und ohne (negative Kontrolle) dT3000 Beschichtung gegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC eine Stunde inkubiert und dann aus den Vertiefungen entfemt. Die Mischung wurde aufbewahrt. Die Vertiefungen wurden dreimal mit dem Standardwaschpuffer gewaschen. Sowohl die gewählten Vertiefungen als auch die verwendete Bindungsmischung wurden im Szintillationszähler gezählt. Zur Bestimmung der an die Vertiefungen gebundenen Sonde mit Schwanz wurde die folgende Formel verwendet, in der C als Kapazität in Mikrogramm definiert ist:
C = cpm zugegeben - cpm entfernt/spezifisiche Aktivität der Sonde (cpm/µg)/= cpm gebunden/spezifische Aktivität (cpm/µg)
Die zwei zur Kapazitätsberechnung verwendeten Verfahren stimmten hervorragend überein. Kontrollvertiefungen, die nicht mit Polydesoxythymidylat beschichtet waren, banden im Durchschnitt (N=5) 1 ng der Sonde mit Schwanz. Poly(dT) Vertiefungen binden abhängig von der Schwanzlänge typischerweise 300-500 ng der Sonde mit Schwanz.

B. Verwendung von vorgebundenen Einfangsonden in einem nicht-radioaktiven Test.

Einfangsonden können entweder an Polystyrol-Mikrotitervertiefungen, Polystyrol-Röhrchen oder Polystyrol- Tauchstäbchen, eigentlich mit allen Trägern, die sich gleich gut zum Testen klinischer Proben eignen, immobilisiert werden. Das nachfolgende Verfahren ist auf die Verwendung von Polystyrol-Mikrotitervertiefungen besonders zugeschnitten. Mit Abänderungen beim Volumen kann es allerdings leicht auf Tauchstäbchen und Röhrchen adaptiert werden.
Drei Volumina des 1,3 X Arbeitspuffers (3,25 M GuSCN SCN, 0,4 M Tris pH 7,51 0,08 M EDTA, 13 % Dextransulfat, 1 % Sarkosyl) wurden zu den Proben gegeben. Nach 30 Sekunden Verwirbeln wurden 300 µl der Probe zu jeder Mikrotitervertiefung gegeben und das Einfangen des endogenen Polynucleotids durfte L Minuten bei 37ºC stattfinden, wobei L die Schwanzlänge der Einfangsonde ist. Die optimale Schwanzlänge ist mit 30-50 Nucleotiden und die optimale Einfangzeit bei ca. 30-50 Minuten gefunden worden. Die Proben wurden dann aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen mit 2,4 M TEA Cl 15 Minuten bei 37ºC gewaschen. Im Anschluß erfolgten drei Waschungen mit 1 M NaCl, 0,1 M Tris pH 9,3, 2 mM MgCl&sub2;, 0,1 % Tween-20. Ein Volumen von 300 µl einer biotinylierten generischen Ribosondenmischung wurde zu jeder Vertiefung gegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Diese Mischung enthielt 0,5-1,0 µg/ml Ribosonde, 2,5 M GuSCN, 0,2 M Tris pH 7,5, 0,01 M EDTA und 10 % Dextransulfat. Die Ribosonden-Mischung wurde dann aus den Vertiefungen entfemt, die dreimal mit dem obigen NaCl- Puffer gewaschen wurden. Ein Streptavidin/alkalische Phosphatase Konjugat, 1:500 verdünnt, wurde zu den Vertiefungen (300 µl/Vertiefung) gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß erfolgte dreibis fünfmaliges Waschen mit dem NaCl-Waschpuffer und dann die Zugabe des Enzymsubstrats PNPP (1 mg/ml) in 1 X Diethanolamin-Puffer (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD). Wenn der Hintergrund in der negativen Kontrolle anfing zu erscheinen, wurde die optische Dichte bei 405 nm gemessen.

C. Verwendung von in Lösung freien Einfangsonden in einem nicht-radioaktiven Test

Die Einfangsonde mit dA-Schwanz und die biotinylierte generische Ribosonde wurden beide mit 0,5 µg/ml zu den Zellextrakten in 10 % Dextransulfat-haltigem 2,5 M GuSCN Puffer gegeben. Die resultierende Lösung wurde eine Stunde bei 37ºC in Poly(dT)-Vertiefungen (oder Tauchstäbchen) inkubiert. Die festen Träger wurden mit dem NaCl-Waschpuffer gewaschen. Ein Streptavidin/alkalische Phosphatase Konjugat (BRL) wurde auf 1:500 in 1 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM Magnesiumchlorid (MgCl&sub2;), 0,1 mg/ml einzelsträngige E. coli DNS und 0,5 % acetyliertem BSA verdünnt und in den Vertiefungen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 1 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl (pH 9,3), 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Tween-20R gewaschen. Die Farbe wurde mit 1 mg/ml pNPP in 1 X Diethanolamin (Kierkegaard und Perry), bis der Hintergrund sichtbar wurde, entwickelt. Die Farbe wurde bei einer OD bei 405 nm mit einem Mikrotiter platten-Lesegerät (Titertek oder Dynatech) gemessen.
Daten aus zwei repräsentativen Experimenten werden gezeigt, in denen die Ergebnisse, die entweder mit der vorimmobilisierten Einfangsonde oder mit der in Lösung freien Einf angsonde gewonnen wurden, verglichen werden. Die Campylobacter spezifische Einfangsonde #732 (dA65) (Abbildung 2) wurde verwendet, um Campylobacter Extrakte (5 X 10&sup6; Zellen/ml) in Anwesenheit oder Abwesenheit eines endogenen Polynucleotids zu untersuchen. Poly(dT) beschichtete Polystyrol-Tauchstäbchen wurden als das Substrat und beziehungsweise fester Träger für das Einfangen der Zielmoleküle verwendet.
Zwei Situationen wurden in Betracht gezogen: kein Kompetitor vorhanden (nur 5 X 10&sup6; Campylobacter/ml) und Poly(rA) Kompetitor mit 10 µg/ml vorhanden. Dies ist die Menge an Poly(rA), die in 1 X 10&sup8; Säugerzellen/ml vorhanden wäre, was das praktische Limit für Säugerzellen in einer Probe ist, da aufgrund der Viskosität die Fähigkeit von in GuSCN gelösten Proben, mit Hilfe einer Pipette transferriert zu werden, eingeschränkt ist. Abgesehen von der Verdrängung der Probe mit Schwanz durch das Poly(rA) könnte vorausgesagt werden, daß in Gegenwart eines Kompetitors der Test mit vorimmobilisierter Sonde wenig oder keinen Signalverlust zeigen würde, während die Ausführung mit der in Lösung freien Sonde einen wesentlichen Signalverlust zeigen würde. Überraschenderweise konkurrierte Poly(rA) jedoch nicht mit dem Komplex aus Sonde mit Schwanz und Ziel um die Bindung an das Poly(dT)-Polystyrol, selbst wenn die Sonde mit Schwanz frei in Lösung zugegeben wurde. Die Daten die dies begründen, werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Vergleich von Kompetitor-Effekten in Testausführungen mit freier oder immobilisierter Sonde
Das Fehlen einer Konkurrenz zwischen Poly(rA) und der Sonde mit dA-Schwanz wurde durch die folgenden Experimente erklärt. Aliquote des 5' endmarkierten Poly(rA)-400 und Poly(dA)-50 wurden in den angegebenen Salziösungen zu den mit Poly(dT)-4000 beschichteten Mikrotitervertiefungen gegeben und 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Alle Lösungen enthielten ebenfalls 0,1 M Tris- Hai (pH 7,5), 0,01 EDTA, 0,5 % Sarkosyl, 0,2 % BSA und 0,04 % Bronopol. Die Platten wurden mit den angegebenen Puffern einmal gewaschen und in einem Beckmann L1801 Liquid Scintillation Counter gezählt. Die CPM von dem 5 M GuSCN sind als Hintergrundwert von allen Zahlenwerten außer denjenigen der Kügelchen abgezogen worden. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen daß: (1) Poly(dA) gut, aber Poly(rA) sehr schwach an Poly(dT) in 2,5 M-3,0 M GuSCN bei 37ºC bindet und (2) Poly(dT)-Polystyrol bindet Poly(rA) sogar unter Bedingungen schwach, die normalerweise zu der Assoziation dieses Affinitätspaares führen (z.B. in 0,5 M NaCl) Tabelle 2: Die Bindung von Poly(rA) an Poly(dT) Polystyrol
Es wurden 8 ng Poly(rA) zugegeben, ein Betrag, der weitaus weniger als die Kapazität der Mikrotitervertiefungen (ca. 350 ng) ausmacht, aber nur wenige hundert Picogramm Poly(rA) banden an die Platten in der Kontrolle mit 0,5 M NaCl Puffer. Dieses Ergebnis wurde weitere zweimal überprüft mit genau dem gleichen Ergebnis. Die Bindung von Poly(dT) an Polystyrol muß irgendwie ebenfalls die Bindung von Poly(rA) an Poly(dT) hemmen, da die Kontrollen zeigten, daß in dem gleichen 0,5 M NaCl Puffer beinahe sämtliches Poly(rA) an die (dT)-Magnetkügelchen band. Das Nicht-Binden von Poly(rA) an Poly(dT)-Polystyrol in einem Puffer, in dem die zwei Polymere normalerweise ohne weiteres assozueren, ist neu und unerwartet. Dies kann als Grundlage für Einfangschemas verwendet werden, bei denen Affinitätspaare (z.B. dA-dT) in Proben eingesetzt werden, die signifikante Mengen menschlicher oder anderer Zellen mit einer großen Anzahl an polyadenylierten Molekülen enthalten.
Die Verwendung von Reagenzien, wie beispielsweise ungefähr 2,5-3,0 M GuSCN, das mit einem Einfangen an Poly(dT)-Polystryol bei 37ºC verbunden ist, vermindert drastisch die Fähigkeit von Poly(rA), mit Sonden mit Poly(dA)-Schwanz (möglicherweise an das Ziel gebunden) um die Bindung an Poly(dT) zu konkurrieren, so daß kein Signalverlust beobachtet wurde (Tabelle 1). Der Fachmann wird erkennen, daß andere Kombinationen von Temperaturen, Chaotrop-Konzentrationen und Hybridlänge verwendet werden können, um eine derartige selektive Bindung von Poly(dA) an Poly(dT) zu erreichen.
Die Verwendung von GuSCN um Poly(dA)- aber nicht Poly(rA)-Polymere an dT-Träger zu binden, wurde ferner mit Hilfe von Poly(dT) magnetischen Trägern untersucht. Siehe Collins, EP-A-0265244. Poly(rA)-400 und Poly(dA)-50 wurden 5' endmarkiert und Aliquote wurden 5 min. bei 37ºC mit Magnetkügelchen entweder in 0,5 M NaC1 (Kontrolle) oder in 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M, 1,0 M, 1,25 M und 1,5 M GuSCN inkubiert. Alle Puffer enthielten 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 M EDTA, 0,2 % Sarkosyl, 0,2 % BSA Fraktion V, 0,04 % Bronopol. Die Kügelchen wurden zweimal mit dem angegebenen Puffer bei 37ºC gewaschen und gezählt. Die Ergebnisse werden in Abbildung 1A gezeigt.
Wie in Abbildung 1A gezeigt, bindet Poly(rA)-400 gut an Magnetkügelchen in 0,5 M NaCl, aber nur sehr schwach (1 %) in 1,0 M GuSCN oder höheren GuSCN-Konzentrationen. Poly(dA) bindet etwa ebensogut (100 %) an Magnetkügelchen in 1,0 M GuSCN wie in 0,5 M NaCl, aber verliert allmählich die Fähigkeit, in höheren GuSCN-Kon zentrationen zu binden. Folglich kann beim Einfangen von Polynucleotiden an die Ziele in einer Lösung, die über 1 M GuSCN bei 37ºC enthält, endogenes Poly(rA) wirksam an einer Bindung an die (dT)&sub1;&sub4; Kügelchen blockiert werden. Folglich wird Poly(rA) nicht mit den Sonden mit dA- Schwanz, die möglicherweise an Ziele gebunden sind, um die Bindungsstellen in etwa 1,0 M GuSCN konkurrieren, aber kann in 0,5 M NaCl konkurrieren. Die Verwendung von annähernd 1,0 M GuSCN zur selektiven Bindung von Poly(dA) an Oligo(dT)&sub1;&sub4; Kügelchen ist unerwartet.
Um zu sehen, ob die Poly(rA)-(dT) Helix in 1,0 M GuSCN einfach instabil ist oder ob die Formierungsrate dieser Helix ganz außergewöhnlich langsam ist, wurde Poly(rA) an (dT)-haltige Kügelchen in dem 0,5 m NaCl Puffer gebunden und zweimal mit den verschiedenen GuSCN- Puffern bei 37ºC gewaschen. Die Ergebnisse werden in Abbildung 1B gezeigt.
Die Daten sind im wesentlichen nicht von den Daten in Abbildung 1A zu unterscheiden: Bei 0,5 M GuSCN blieb nur 32 % des Poly(rA) an den Kügelchen gebunden und bei 1,0 M GuSCN blieb weniger als 1 % dea Poly(rA) an den Kügelchen gebunden. Das Waschen mit 1,0 M GuSCN entfernte offensichtlich kein (weniger als 5 %) gebundenes Poly(dA). Folglich ist, wie beschrieben, ein Waschen der Kügelchen in annähernd 1,0 m GuSCN hinreichend, um Poly(rA)-haltige Sequenzen selektiv zu entfernen, während praktisch alle Poly(dA)-haltigen Sequenzen gebunden bleiben. Die Daten zeigen, daß die Poly(rA)-Oligo(dT) Helix in 1,0 M GuSCN einfach instabil ist. Vielleicht kann das Poly(rA) eine intramolekulare Sekundärstruktur in 1,0 M GuSCN, an der hunderte von "Basenpaaren" beteiligt sind, mit einer wesentlich höheren Stabilität bilden als die kurz basengepaarte Konkurrenzstruktur Oligo(dT) Oligo(rA). Nach Bildung dieser möglichen Sekundärstruktur würde das Poly(rA) durch die Rückfaltung sich selbst von den (dT)-haltigen Magnetkügelchen verdrängen.
Andere Kombinationen von Chaotrop-Konzentration, Temperaturen und Hybridlänge können verwendet werden, um diese selektive Hybridisierung von Poly(dA) an Poly(dT) zu erreichen.

Beispiel 3: Hemmung von interferierenden Poly(dA)-haltigen Molekülen mit Hilfe von vorhybridisierten Einfangsonden

A. Material und Methoden

Das Protokoll für diese Experimente war wie folgt: Zu Poly(dT)-Polystyrol-Vertiefungen, die mit einer ³²P- markierten Campylobacter spezifischen Sonde mit Schwanz (Schwanzlänge 65; siehe Beispiel 2) vorhybridisiert waren, wurden gegeben:
A. Keine Sonde, 4 X 10&sup6; Campylobacter/ml.
B. Salmonella-spezifische Sonde mit Schwanz (0,5 µg/ml), 4 X 10&sup6; Campylobacter/ml.
C. Keine Sonde, 1 X 10&sup6; Salmonella/ml.
D. Salmonella-spezifische Sonde mit Schwanz (0,5 µg/ml), 1 X 10&sup6; Salmonella/ml.
Die Vertiefungen wurden bei 37ºC 40 Minuten mit 0,5 µg/ml der 5' biotinylierten Ribosonde inkubiert, die sowohl Salmonella als auch Campylobacter rRNS markierte. Dann wurden alle Überstände gezählt, um die Menge an Camylobacter-spezifischer Sonde mit Schwanz, die von dem Träger in A bis D eluierte, zu bestimmen. An dieser Stelle wurde die Farbe entwickelt, um die Signalstärke in allen Proben zu messen.
Wie aus Tabelle 3 zu ersehen ist, war die Retention der Campylobacter Sonde mit Schwanz in den Proben A bis D ausgezeichnet und wurde nicht durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der Salmonella Sonde mit Poly(dA)-Schwanz in der Lösung beeinflußt. Die Gesamtmenge an exogen zugefügtem Poly(dA) war 1,6 µg/ml. Dies ist die Menge an Poly(dA), die in 3 X 10&sup9; Säugerzellen/ml enthalten ist. Die praktische Grenze für die Verwendung von Säugerzellen in einem Test ist nur 1 X 10&sup8;/ml aufgrund der eingeschränkten der Pipetierfähigkeit wegen der Viskosität. Tabelle 3: Retention der an Poly(dT)-Polystyrol vorhybridisierten Campylobacter Sonde in Anwesenheit und Abwesenheit von zugegebener Salmonella Sonde mit Schwanz:
Die angeführten Ergebnisse zeigen den Durchschnitt dreier Ansätze. In allen Fällen wurden mehr als 93 % der an die Vertiefungen vorhybridisierten Sonde zurückbehalten. Dies zeigt, daß keine wirksame Verdrängung der Campylobacter Sonde (Schwanzlänge 65) durch Zugabe von 0,5 µg/ml Salmonella Sonde 676 (Schwanzlänge 110) (Abbildung 2) und 40 minütiger Inkubation in 2,5 M GuSCN bei 37º stattfand.
Tabelle 4 zeigt, daß das durch das Einfangen von 4 X 10&sup6; Campylobacter erhaltene Signal (Farbe) das gleiche ist, egal ob Poly(dA) zugefügt wurde oder nicht. Der Hintergrund (kein Campylobacter) war in beiden Fällen gering. Tabelle 4: Effekt von exogen zugegebenem Poly(dA) auf die Detektion von Campylobacter Ziel-RNS:
Die in A und B gebildete Farbe (Tabelle 4) war nach Neutralisierung des Hintergrunds (C und D) sehr ähnlich. Dies zeigt, daß die Anwesenheit der exogen zugefügten Salmonella Sonde mit Schwanz keinen gegenteiligen Effekt auf das Signal hatte und nur ein leichtes Ansteigen des Hintergrunds bewirkte. Dieser leichte Anstieg des Hintergrunds liegt vermutlich an einer kleinen Menge an markierter Salmonella rRNS, die über die Salmonella Sonde mit Schwanz an Poly(dT) bindet, das durch den Abgang von 6-7 % der vorgebundenen Campylobacter Sonde, gezeigt in Tabelle 3, frei blieb. Dieser Anstieg des Hintergrunds ist eine artifizielle Obergrenze, da die markierte Sonde zu einer polyadenylierten Sequenz hoch komplementär ist, in diesem Fall kann eine nicht-Ziel rRNS, die aufgrund einer Einfangsonde polyadenyliert ist, an den festen Träger binden. Höchstwahrscheinlich würden bei der normalen Verwendung die endogen polyadenylierten Species eine geringe oder keine Homologie zu einer markierten Nucleotidsonde, die spezifisch für das Analyt von Interesse ist, besitzen. Folglich würde der Hintergrund sehr klein sein, der sich aus einer kleinen Menge dieser polyadenylierten Species ergibt, die an die feste Phase bindet, da in den meisten Fällen das polyadenylierte Material unmarkiert wäre.
Das Verfahren der Vorhybridisierung einer Einfangsonde mit Schwanz an komplementäre Nucleotide (das heißt Substrate) auf einem festen Träger verhindert die Interferenz beim Einfangen von Nucleinsäuren, die detektiert werden sollen, nicht nur von endogenem Poly(dA) sondern ebenfalls von Poly(rA), Poly(U) und Poly(dT) wie auch von den entsprechenden Oligomer-Sequenzen. Die Sonden könnten mit Poly(dA), Poly(rA), Poly(U) oder Poly(dT) Schwanz oder einer beliebigen der entsprechenden Oligomer Sequenzen versehen sein.

Beispiel 4: Gleichzeitige Verwendung von vorhybridisierter Einfangsonde und Polynucleotid in Lösung, um endogene Polynucleotide zu hemmen.

Dies Beispiel erläutert ein Verfahren, mit dem endogenes Poly(dA) an einer Bindung an Poly(dT)-Stellen, die durch den Abgang einer kleinen Menge an vorhybridisierter Sonde mit dA-Schwanz frei geworden sind, gehindert werden kann. In diesem Beispiel wird eine Menge an Poly(dT) zu der Probe in Lösung gegeben und darf an endogenes Poly(dA) in Gegenwart der vorhybridisierten festen Phase hybridisieren.

Material und Methoden

Das Protokoll dieses Experiments entspricht Beispiel 3:
Zu Poly(dT)-Polystyrol-Vertiefungen, die mit einer ³²P-markierten Campylobacter-spezifischen Sonde mit Schwanz (Schwanz-Länge 65) vorhybridisiert waren, wurden zugegeben:
A. Keine Sonde, 4 x 10&sup6; Campylobacter/ml.
B. Listeria-spezifische Sonde mit Schwanz (0,5 µg/ml), 4 x 106 Campylobacter/ml.
C. Keine Sonde, 1 x 10&sup6; Listeria/ml.
D. Listerig-spezifische Sonde mit Schwanz (0,5 µg/ml), 1 x 10&sup6; Listeria/ml.
Einem Satz der Proben A bis D wurde kein Poly(dT)- 3000 zugegeben und einem anderen Satz wurden insgesamt 2 µg Poly(dT)-3000 pro Probe zugegeben.
Die Vertiefungen wurden bei 37ºC 40 Minuten mit 0,5 µg/ml 5' biotinylierter Ribosonde inkubiert, die sowohl Listeria als auch Campylobacter rRNS markierte. An dieser Stelle wurde die Farbe gebildet, um die Signalstärke in allen Proben zu messen. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse gezeigt. Tabelle 5: Zugabe von Poly(dT) zur Blockierung der Interferenz von Poly(dA)-haltigen Molekülen mit Einfang-Schemas die an Poly(dT)- Polystyrol vorhybridisierte Sonden mit Schwanz verwenden
Die angeführten Ergebnisse sind der Durchschnitt zweier Meßreihen. Es ist zu beachten, daß die Anwesenheit von Poly(dT) beim Einfangen keinen Einfluß auf das gebildete Signal besitzt. Dies wird erwartet, vorausgesetzt daß das Poly(dT) in Lösung die Sonde mit Schwanz von dem vorhybridisierten Poly(dT) nicht verdrängt. Ebenfalls ist zu beachten, daß der Hintergrund in Probe D ca. um das Achtfache von 0,031 auf 0,004 durch die Anwesenheit von Poly(dT) in der Probe vermindert war. Offensichtlich band das zugefügte Poly(dT) an das zugefügte Poly(dA) und hinderte es an einer Bindung an das in kleinen Menge freie, immoblilisierte Poly(dT) (das durch den Abgang einiger vorhybridiserter Campylobacter Sonde mit Schwanz frei wurde). Folglich ist die Kombination aus Zugabe von etwas Poly(dT) zu der Probe und die Verwendung einer vorhybridisierten Einfangsonde mit Schwanz ein Verfahren, das zur Verhinderung eines jeglichen möglichen Anstiegs des Testhintergrunds, der von endogenen Poly(dA)-haltigen Molekülen stammt, sehr effektiv ist.
Es ist ebenfalls möglich, daß eine Menge an freiem Poly(dA), das nicht mit einer Einfangsonde assoziiert ist, zu dem festen Träger vor der Zugabe der Probe gegeben werden kann, so daß jegliche freie Poly(dT)-Sequenzen auf dem festen Träger, die von der vorgebundenen Einfangsonde mit Schwanz freigelassen wurden, durch das Polynucleotid vorblockiert werden und nicht für eine Bindung endogener Poly(dA)-haltiger Moleküle verfügbar sind. Damit würde das gleiche Ziel, nämlich die Verhinderung eines jeglichen möglichen Anstiegs des Testhintergrunds erreicht werden.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt viele Entsprechungen oder kann diese mit Hilfe üblicher Experimente zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen. Diese Entsprechungen werden von den folgenden Ansprüchen umfaßt.

Claims

1. Ein Verfahren zur Interferenzverminderung von Polynucleotiden in einer Probe bei Affinitätspaar- Einfangtests, z.B. feste Phase-Affinitätspaar- Einfangtests, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

In-Kontakt-Bringen der Probe, die möglicherweise ein Ziel-Nucleotid, das eine Ziel-Sequenz besitzt, enthält, mit einem komplementären Nucleotid, das eine zu der Ziel-Sequenz komplementäre Nucleotid-Sequenz besitzt; worin eine Einfangsonde das komplementäre Nucleotid und einen von einem ersten Homopolynucleotid gebildeten Schwanz umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß vor dem in-Kontakt-Bringen mit der Probe die Einfangsonde mit einem zweiten, an einen festen Träger befestigten Homopolynucleotid unter Bedingungen vereinigt wird, die eine Hybridisierung komplementärer Homopolynucleotide erlauben, wobei das zweite Homopolynucleotid komplementär zu dem ersten Homopolynucleotid ist.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das eine Hybridisierung vermindert entweder zwischen

(a) dem ersten Homopolynucleotid und endogenen polynucleotiden in der Probe oder

(b) dem zweiten Homopolynucleotid und endogenen Polynucleotiden in der Probe.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das erste Homopolynucleotid ein Poly(dA) ist und das zweite Homopolynucleotid Poly(dT) ist.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, das ferner die Schritte umfaßt:

Befestigen des festen Trägers an das zweite Homopolynucleotid vor dem Vereinigen der beiden Homopolynucleotide; und

ein chaotropes Salz ist mit inbegriffen, wenn die Probe mit der Einf angsonde in Kontakt gebracht wird.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der feste Träger aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus: Polystyrol, Agarose-Kügelchen und magnetischen Partikeln.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, worin das chaotrope Salz Guanidiniumthiocyanat ist.

7. Das Verfahren gemäß Ansprüchen 4, 5 oder 6, worin der Schritt des in-Kontakt-Bringens der Probe mit der Einfangsonde bei einer Temperatur und mit einer Guanidiniumthiocyanat-Konzentration durchgeführt wird, die Poly(rA) an der Bindung an Poly(dT) hemmt, aber Poly(dA) und Poly(dT) erlaubt, zu hybridisieren oder hybridisiert zu bleiben.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Guanidiniumthiocyanat-Konzentration von etwa 2,5 bis 3,5 M ist und die Temperatur etwa 37ºC ist.

9. Ein Verfahren zur Hybridisierungsverminderung von in einer Probe vorhandenen endogenen Homopolynucleotid- Sequenzen mit einer Homopolynucleotid-Sequenz, die an einen festen Träger gebunden ist, mit der die Probe in Kontakt gebracht werden soll, wobei das Verfahren die Hybridisierung einer komplementären Homopolynucleotid-Sequenz an die befestigte Homopolynucleotid-Sequenz umfaßt, und dadurch die befestigte Homopolynucleotid-Sequenz für eine weitere Hybridisierung nicht verfügbar macht, wenn sie mit der Probe in Kontakt gebracht wird; und gegebenenfalls worin die komplementäre Homopolynucleotid-Sequenz eine Poly(dA) Sequenz ist, die den Homopolynucleotid- Schwanz einer Einfangsonde umfaßt, die aus besagtem Schwanz und aus einer Polynucleotid Sequenz besteht, die zu einer vermutlich in der Probe vorhandenen Ziel-Polynucleotid-Sequenz komplementär ist, und das befestigte Homopolynucleotid Poly(dT) ist.

10. Ein Verfahren zur Hybridisierungsverminderung von endogenen Poly(rA) Sequenzen in einer Probe mit auf einem festen Träger vorhandenen Poly(dT) Sequenzen, mit dem die Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das Verfahren das Befestigen der Poly(dT) Sequenzen an den festen Träger mit Hilfe von UV Bestrahlung oder gamma Bestrahlung vor dem Kontakt des festen Trägers mit der Probe umfaßt, und gegebenenfalls der feste Träger Polystyrol ist.

11. Ein Verfahren zum Entfernen von Poly(rA) aus einem Affinitätspaar-Einfangtest, in dem das Affinitätspaar an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Verfahren das in-Kontakt-Bringen des gebundenen Affinitätspaars mit einem Agens umfaßt, das Poly(rA) selektiv entfernt, und besagtes Agens ein chaotropes Salz oder ein Enzym, das RNS Sequenzen in einem RNS/DNS Doppelstrang verdaut, umfaßt.

12. Ein Verfahren nach Anspruch 11, worin

(a) das chaatrope Salz Guanidiniumthiocyanat ist; oder

(b) das Enzym RNAse H ist.

13. Ein feste Phase-Affinitätspaar-Einfangtestverfahren, das umfaßt:

(a) Vereinigen einer Probe, die getestet werden soll, mit einer hinreichenden Menge an Homopolynucleotiden, um mit komplementären endogenen, in der Probe vorhandenen Homopolynucleotiden unter Bedingungen zu hybridisieren, die für eine zu ereignende Hybridisierung komplementärer Nucleinsäure-Sequenzen geeignet sind, wodurch die endogenen Homopolynucleotide fur weitere Hybridisierungen nicht verfügbar gemacht werden; und

(b) Vereinigen des Produkts von (a) mit einem festen Träger, an dem befestigt ist

(i) ein erstes Homopolynucleotid, das zu den endogenen Homopolynucleotiden in der Probe komplementär ist, an dieses ist hybridisiert

(ii) eine Einfangsonde, bestehend aus

(A) einem zweiten Homopolynucleotid-Schwanz, der zu dem ersten Homopolynucleotid komplementär ist, und

(B) einer Nucleinsäure-Sequenz, die zu einer in der Probe vermutlich vorhandenen Ziel-Nucleinsäure-Sequenz komplementär ist,

wobei der zweite Homopolynucleotid-Schwanz der Einfangsonde an (i) hybridisiert ist, und die zu dem Ziel komplementäre Nucleinsäure-Sequenz nicht hybridisiert ist und dadurch für eine Hybridisierung mit der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz verfügbar ist.

14. Ein Set, das umfaßt:

(a) einen festen Träger mit einem daran gebundenen Polynucleotid-Substrat;

(b) eine Einfangsonde, die eine zu einer Ziel- Nucleotid-Sequenz im wesentlichen komplementäre Nucleotid-Sequenz besitzt mit einem daran befestigten Schwanz, der komplementär zu dem Substrat ist; und

(c) ein chaotropes Agens.

15. Ein Set nach Anspruch 14, worin

(a) der feste Träger aus der Gruppe gewählt ist, die aus Agarose-Kügeichen, magnetischen Partikeln und Polystyrol besteht

16. Ein Set nach Anspruch 15, worin der feste Träger ein(e) Polystyrol Tauchstäbchen, Mikrovertiefung oder Röhrchen umfaßt.

5. 17. Ein Set nach Anspruch 14, worin das Polynucleotid- Substrat aus Poly(dT) besteht und der Schwanz aus Poly(dA) besteht.

18. Ein Set nach Anspruch 14, worin das Polynucleotid Substrat aus Poly(dA) besteht und der Schwanz aus Poly(dT) besteht.

19. Ein Set nach Anspruch 14, worin das chaotrope Agens Guanidiniumthiocyanat umfaßt.

20. Ein Set nach Anspruch 14, das ferner umfaßt:

(a) eine markierte Sonde;

(b) ein Mittel zur Detektion besagter markierter Sonde;

(c) einen oder mehrere Elutionspuffer; und

(d) ein Amplifizierungsreagenz oder Klonierungsreagenzien.