JP6451633B2 - 固相プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット - Google Patents
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Description
本発明は、修飾核酸塩基の測定方法およびキットに関する。
核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出において、ビオチン等の物質が人工的に導入された核酸塩基を、抗体を利用したイムノアッセイで検出する技術が、これまでに多数報告されている。また、天然に存在する修飾核酸塩基（例、メチルシトシン、ヒドロキシルメチルシトシン）をイムノアッセイで検出する技術も報告されている（特許文献１、及び非特許文献１、２）。
Ｐｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６）
Ｋｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２０１２，８４，７５３３−７５３８
本発明者らは、上記のような修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系を構築するにあたり、修飾核酸塩基に対する抗体の核酸プローブに対する非特異的な結合により、検出シグナルのバックグラウンド値が高くなるという課題が存在することを見出した。したがって、高感度のイムノアッセイ系の構築のためには、バックグラウンド値を抑制する技術の開発が必要であった。
本発明者らは、鋭意検討した結果、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定において、２種のプローブ（捕捉プローブおよび固相プローブ）を併用することによりバックグランド値を抑制することなどに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび該固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕捕捉プローブまたは固相プローブの一方または双方が、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕捕捉プローブが、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔６〕の方法。
〔８〕固相プローブがポリＡまたはポリＴである、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、〔２〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、〔２〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび該固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕捕捉プローブまたは固相プローブの一方または双方が、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕捕捉プローブが、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔６〕の方法。
〔８〕固相プローブがポリＡまたはポリＴである、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、〔２〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、〔２〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
本発明の方法およびキットによれば、検出シグナルのバックグランド値の低減により、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できる。
本発明は、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有するサンプル、または当該標的核酸を含有すると疑われるサンプルである。核酸サンプルはまた、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含有する可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。このようなサンプルは、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、ＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域（例、転写調節領域）である。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、捕捉プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸が含む修飾核酸塩基の数は、１個以上（例、１〜１００個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個）であれば特に限定されない。
本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４〜６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５−カルボキシルシトシン）である。より好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
本発明で用いられる捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとハイブリダイズし得る核酸分子である。捕捉プローブは、例えば、第１の領域で標的核酸とハイブリダイズし得、かつ第２の領域で固相プローブとハイブリダイズし得る。捕捉プローブは、標的核酸に対して同種および／または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を、主鎖構造の全体として捕捉プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として捕捉プローブが有することを意味する。したがって、捕捉プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、捕捉プローブは、標的核酸に対して異種の核酸を含んでいてもよい。
捕捉プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１〜Ｃ６アルキル化のＣ１〜Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１〜６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル）、ブチル基（例、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブである。
捕捉プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、捕捉プローブの長さ）は、標的核酸および固相プローブとハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば２０個以上、好ましくは２５個以上、より好ましくは３０個以上であってもよい。捕捉プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下または５０個以下であってもよい。例えば、捕捉プローブにおいて標的核酸とハイブリダイズし得る第１の領域中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。第１の領域中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。捕捉プローブにおいて固相プローブとハイブリダイズし得る第２の領域は、同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成されていてもよく、異なる種類の２以上のヌクレオチド残基から構成されていてもよい。第２の領域が同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成され、かつ、捕捉プローブがＤＮＡプローブである場合、第２の領域は、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、グアニンまたはチミンのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＧまたはポリＴ領域であり、より好ましくは、アデニンまたはチミンの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＴ領域である。第２の領域が同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成され、かつ、捕捉プローブがＲＮＡプローブである場合、第２の領域は、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、グアニンまたはウラシルのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＧまたはポリＵ領域であり、より好ましくは、アデニンまたはウラシルの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＵ領域である。好ましくは、第２の領域は、ポリＡまたはポリＴ領域である。このような捕捉プローブは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。捕捉プローブは、遊離の形態で用いられる。
本発明において、固相プローブとは、捕捉プローブとハイブリダイズし得、かつ固相に固定可能なプローブをいう。固相プローブは、工程（１）において、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、固相プローブは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（固相プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（固相プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、固相プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。
固相プローブは、標的核酸に対して同種または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を固相プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を固相プローブが有することを意味する。したがって、固相プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の固相プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の固相プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の固相プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の固相プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、固相プローブは、標的核酸に対して異種の核酸から構成されてもよい。
固相プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブが挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、捕捉プローブに関して上述したものが挙げられる。
固相プローブを構成するヌクレオチド残基の総数（即ち、固相プローブの長さ）は、例えば、捕捉プローブとハイブリダイズし、かつ固相プローブが固定される固相からの標的核酸の距離を確保するのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。本発明では、固相からの標的核酸（即ち、本発明で検出される修飾核酸塩基）の距離を確保することで、修飾核酸塩基を高感度に検出することができる。固相プローブを構成するヌクレオチドの総数はまた、例えば１００個以下、８０個以下、７０個以下または６０個以下であってもよい。このような固相プローブは、例えば、当該分野で公知のヌクレオチド重合法により調製できる。
固相プローブは、ホモポリヌクレオチドまたはヘテロポリヌクレオチドである。
ホモポリヌクレオチドとは、同種のヌクレオチド残基のみから構成されるポリヌクレオチドをいう。ホモポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＴであり、より好ましくは、アデニンまたはチミンの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＴである。ホモポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＵであり、より好ましくは、アデニンまたはウラシルの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＵである。好ましくは、ホモポリヌクレオチドは、ポリＡまたはポリＴである。
ヘテロポリヌクレオチドとは、２以上の異種のヌクレオチド残基から構成されるポリヌクレオチドをいう。ヘテロポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成される。ヘテロポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成される。
ホモポリヌクレオチドとは、同種のヌクレオチド残基のみから構成されるポリヌクレオチドをいう。ホモポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＴであり、より好ましくは、アデニンまたはチミンの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＴである。ホモポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＵであり、より好ましくは、アデニンまたはウラシルの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＵである。好ましくは、ホモポリヌクレオチドは、ポリＡまたはポリＴである。
ヘテロポリヌクレオチドとは、２以上の異種のヌクレオチド残基から構成されるポリヌクレオチドをいう。ヘテロポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成される。ヘテロポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成される。
工程（１）において、インキュベートは、核酸サンプル中に標的核酸が含まれる場合に捕捉プローブ（遊離）、固相プローブ（遊離または後述する固相に固定）および核酸サンプル中の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応が可能である条件下で適切な溶液中で行われる。このような溶液としては、例えば、塩（例、クエン酸ナトリウム）およびその他の成分（例、界面活性剤）を含む緩衝液を用いることができる。ハイブリダイゼーション温度は、例えば１５〜９５℃（好ましくは２５〜６５℃）である。
ここで、工程（１）についての表現「核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートする」とは、標的核酸（核酸サンプルが標的核酸を含有する場合）、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが最終的に形成されるように、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブが同時または時間差の様式においてインキュベートされることが意図される。
したがって、上記表現は、具体的には、以下の態様を包含するものである：
（１−１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中で同時にインキュベートすること；
（１−２）核酸サンプルおよび捕捉プローブを先ずインキュベートし（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸および捕捉プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を固相プローブと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）；ならびに
（１−３）捕捉プローブおよび固相プローブを先ずインキュベートし（捕捉プローブおよび固相プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を核酸サンプルと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートしても、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成される目的のハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
ここで、工程（１）についての表現「核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートする」とは、標的核酸（核酸サンプルが標的核酸を含有する場合）、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが最終的に形成されるように、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブが同時または時間差の様式においてインキュベートされることが意図される。
したがって、上記表現は、具体的には、以下の態様を包含するものである：
（１−１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中で同時にインキュベートすること；
（１−２）核酸サンプルおよび捕捉プローブを先ずインキュベートし（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸および捕捉プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を固相プローブと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）；ならびに
（１−３）捕捉プローブおよび固相プローブを先ずインキュベートし（捕捉プローブおよび固相プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を核酸サンプルと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートしても、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成される目的のハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
本発明において、ハイブリッドは、標的核酸と捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造、ならびに捕捉プローブと固相プローブとの間のハイブリダイゼーションにより形成される捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造を有する、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体である。ハイブリッドの構造の例は、以下の表１−１〜１−５に記載されるとおりである。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造は、標的核酸の全体領域または一部領域で形成されていてもよい。例えば、ハイブリッドは、標的核酸の一本鎖構造を５’末端領域または３’末端領域のいずれかに有していてもよく〔例、（ａ−１）〜（ａ−５）、（ｂ−１）〜（ｂ−５）〕、または標的核酸の全体領域において二本鎖構造を形成していてもよい〔例、（ｃ−１）〜（ｃ−５）、（ｄ−１）〜（ｄ−５）、（ｅ−１）〜（ｅ−５）、（ｆ−１）〜（ｆ−５）〕。固相プローブは、５’末端領域で捕捉プローブとハイブリダイズして二本鎖構造を形成していてもよく〔例、（ａ−１）〜（ａ−２）、（ｃ−１）〜（ｃ−２）、（ｅ−１）〜（ｅ−２）、（ｂ−３）〜（ｂ−５）、（ｄ−３）〜（ｄ−５）、（ｆ−３）〜（ｆ−５）〕、または３’末端領域で捕捉プローブとハイブリダイズして二本鎖構造を形成していてもよい〔例、（ａ−３）〜（ａ−５）、（ｃ−３）〜（ｃ−５）、（ｅ−３）〜（ｅ−５）、（ｂ−１）〜（ｂ−２）、（ｄ−１）〜（ｄ−２）、（ｆ−１）〜（ｆ−２）〕。一本鎖構造は、ハイブリッドを形成した標的核酸、捕捉プローブまたは固相プローブの５’末端および／または３’末端、または補足プローブの非末端において、１個以上のヌクレオチド残基の非ハイブリダイズ領域を有することにより形成される構造である。なお、（ａ−１）〜（ｆ−５）では、標的核酸の５’末端領域および３’末端領域、捕捉プローブの５’末端領域および３’末端領域、ならびに固相プローブの５’末端領域および３’末端領域のうちの少なくとも三つの末端領域がハイブリダイズしている構造を提示した。しかし、ハイブリッドでは、このような三つの末端領域もまた必ずしもハイブリダイズする必要はなく、標的核酸の３’末端領域および捕捉プローブの５’末端領域の双方で一本鎖構造部分（即ち、非ハイブリダイズ領域）を有していてもよく、標的核酸の５’末端領域および捕捉の３’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよく、捕捉プローブの３’末端領域および固相プローブの５’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよく、捕捉プローブの５’末端領域および固相プローブの３’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよい。
ハイブリッドにおいて、標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数、ならびに捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造部分に対応する捕捉プローブおよび固相プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、二本鎖構造部分の長さ）は、それぞれ、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。このようなヌクレオチド残基の個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は低いことが好ましい。
ハイブリッドにおいて、一本鎖構造部分に対応する標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、各一本鎖構造部分の長さ）は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または５０個以上である。このような個数はまた、特に限定されないが、例えば、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下または１００個以下であってもよい。捕捉プローブおよび／または固相プローブは、このような一本鎖構造部分をハイブリッドにおいて５’末端領域または３’末端領域に形成するように設計されてもよい。
一実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように設計されてもよい。修飾核酸塩基の不対部分は、抗体による修飾核酸塩基の検出を容易にするために導入され得る。このような不対部分の形成のためには、例えば、二本鎖構造部分において、標的核酸に対して完全には相補的ではないヌクレオチド配列を有する捕捉プローブを使用すればよい。
ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの一例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して相補的なヌクレオチド残基を欠落する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に相補的な１個のヌクレオチド残基のみを欠落するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ−１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個）の隣接ヌクレオチド残基を欠落するものであってもよい〔例、表２の（Ｉ−２）〕。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の不対部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。なお、このような核酸プローブについては、例えば、特許文献１および非特許文献２を参照のこと。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの別の例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して非相補的なヌクレオチド残基を有する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ’）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に非相補的な１個のヌクレオチド残基のみを有するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ’−１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個）の隣接ヌクレオチド残基が非相補的なものであってもよい〔例、表２の（Ｉ’−２）〕。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
別の実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように設計されてもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）において、修飾核酸塩基は、５’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩ）〕、５’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩＩ）〕、３’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＶ）〕、または３’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（Ｖ）〕、あるいはこれらの２つ、３つまたは４つの組合せであってもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）が修飾核酸塩基をこのような様式で含むように、捕捉プローブが設計されてもよい。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の一本鎖構造部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。あるいは、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在し、かつ、上述したように、ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分がさらに形成されるように設計されてもよい。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
本発明の方法は、核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。この場合、本発明の方法は、核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。捕捉プローブは、固体の形態、または溶液として、核酸サンプルに添加することができる。あるいは、本発明の方法は、固相に固定された溶液中の固相プローブに、核酸サンプルおよび捕捉プローブを同時または別々に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。
修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルから上述したインキュベーション用溶液が調製される場合、溶液中の標的核酸の濃度は、本発明の方法により検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の標的核酸の濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。核酸サンプル中の標的核酸の濃度は不明であることも多いので標的核酸の厳密な濃度の設定は難しい場合もあるが、核酸サンプルの種類によっては、核酸サンプルに含有され得る標的核酸の濃度を経験的にある程度予測できることがあり、また、標的核酸の濃度が判明していることもある（例えば、標的核酸のサイズおよび／または濃度が別途測定されているものの、標的核酸中の修飾核酸塩基の有無および標的核酸中の修飾核酸塩基の含有率が不明な場合）ので、そのような場合には、上記のとおり標的核酸の濃度設定を試みてもよい。
溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
溶液中の固相プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、固相プローブを溶液に添加してもよい。
溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
溶液中の固相プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、固相プローブを溶液に添加してもよい。
好ましい実施形態では、標的核酸は、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸であってもよい。ここで、標的核酸に含まれる可能性がある修飾核酸塩基の個数は、２以上である限り特に限定されないが、例えば、２〜３０個、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個（例、２、３、４もしくは５個）である。標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の個数が複数である場合、標的核酸と異種核酸プローブとのハイブリダイゼーションに用いられる溶液中の標的核酸が極めて低い濃度（例、０．０１ｎＭ以上）であっても、修飾核酸を高感度に測定できることが確認されている（実施例６、７）。したがって、本発明の方法では、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸とハイブリダイズするように設計された異種核酸プローブを用いることができる。測定すべき標的核酸中の修飾される可能性がある核酸塩基の個数が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
修飾核酸塩基は、ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて測定される。測定に際しては、工程（１）で得られた溶液をそのまま用いてもよいが、抗体による修飾核酸塩基の測定により適した溶液において測定を行うため、別の溶液の添加および／または溶液の別の溶液への交換を行ってもよい。このような交換は、例えば、工程（１）で得られた溶液を固相に添加して、溶液中に含有され得るハイブリッドを固相に固定化し、次いで固相から溶液を除去し、必要に応じて洗浄液で洗浄した後、別の溶液（例、修飾核酸塩基に対する抗体を含有する溶液）を添加することにより行うことができる。測定に用いられる溶液は、抗原・抗体反応に適切な溶液である限り特に限定されない。
測定は、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
修飾核酸塩基に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はさらに、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイにおいて１次抗体として用いられるものであってもよく、この場合、２次抗体が併用される。
修飾核酸塩基に対する抗体は、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド（修飾核酸塩基および２’−デオキシリボースもしくはリボースから構成される構造単位）、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチド（修飾核酸塩基、２’−デオキシリボースもしくはリボースおよびホスフェートから構成される構造単位）、あるいは修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチド（例、２〜５個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド）に対する親和性を有していればよい。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、１）２’−デオキシ修飾アデノシン、２’−デオキシ修飾グアノシン、２’−デオキシ修飾シチジンおよび２’−デオキシ修飾チミジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオシドに対する抗体、２）２’−デオキシ修飾アデノシン ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾グアノシン ５’−ホスフェート、２’−デオキシ修飾シチジン ５’−ホスフェートおよび２’−デオキシ修飾チミジン ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３）修飾核酸塩基を有する上記デオキシリボヌクレオチドを含む２以上のデオキシリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、例えば、１’）修飾アデノシン、修飾グアノシン、修飾シチジンおよび修飾ウリジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドに対する抗体、２’）修飾アデノシン ５’−ホスフェート、修飾グアノシン ５’−ホスフェート、修飾シチジン ５’−ホスフェートおよび修飾ウリジン ５’−ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３’）修飾核酸塩基を有する上記リボヌクレオチドを含む２以上のリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。
修飾核酸塩基に対する抗体は、例えば、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド、修飾核酸塩基を有するヌクレオチド、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチドと、キャリアタンパク質（例、ＢＳＡ、ＫＬＨ）との複合体を、抗原として用いて調製されたものを用いることができる。例えば、このような複合体を用いて調製された修飾核酸塩基に対する種々の抗体が市販されているので、本発明の方法では、市販抗体を用いてもよい。本発明の方法では、修飾核酸塩基に対する抗体はまた、例えば、下記のとおり調製されたものを用いてもよい。
例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４−８９（１９９３））、ＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４−８９（１９９３））、ＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
修飾核酸塩基に対する抗体は、固相に固定化されて用いられてもよい。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチックおよび金属等の支持体、プレート（例、マルチウェルプレート）等の容器、ならびにデバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法で２次抗体が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識されていてもよい。
修飾核酸塩基に対する抗体による修飾核酸塩基の測定は、定性的または定量的に行われ、修飾核酸塩基の有無または量を評価することができる。なお、本発明において、修飾核酸塩基の測定とは、修飾核酸塩基自体の測定のみならず、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定もまた意図される。
例えば、修飾核酸塩基の有無の測定は、以下により行われてもよい：
（２−１）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２−３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
（２−１）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２−３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
また、修飾核酸塩基の量の測定は、例えば、バックグランド値の測定とともに行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２−３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２−４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
（２−１’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２−３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２−４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
あるいは、修飾核酸塩基の量の測定は、標品を用いて行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２−１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２−３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
（２−１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２−２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２−３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡにより行われてもよい。例えば、核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、ＥＬＩＳＡによる本発明の方法は、以下により行われてもよい：
（ｉ）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび第１の親和性物質で標識された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ）ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定されたハイブリッドと反応させて、１次抗体とハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成されたハイブリッド（換言すれば、修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること
第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の代わりに、（ｉ’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相に固定された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された固相プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された固相プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ）〜（ｖ）を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
（ｉ）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび第１の親和性物質で標識された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ）ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定されたハイブリッドと反応させて、１次抗体とハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成されたハイブリッド（換言すれば、修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること
第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の代わりに、（ｉ’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相に固定された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された固相プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された固相プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ）〜（ｖ）を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
本発明はまた、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下を含む：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
捕捉プローブ、固相プローブおよび修飾核酸塩基に対する抗体は、上述したとおりである。例えば、固相プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
捕捉プローブ、固相プローブおよび修飾核酸塩基に対する抗体は、上述したとおりである。例えば、固相プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
本発明のキットは、互いに隔離された形態または混合された形態にて各構成成分を含む。例えば、本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、例えば、捕捉プローブおよび固相プローブは、混合された形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：固相プローブの検討
固相プローブが検出シグナルのバックグランド値に与える影響を検討した。
固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は表５に示したとおりであり、北海道システムサエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
固相プローブが検出シグナルのバックグランド値に与える影響を検討した。
固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は表５に示したとおりであり、北海道システムサエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３。本抗体は、５−メチルシトシンのみならず、ＤＮＡの主鎖構造（例、デオキシリボース部分およびリン酸部分の繰り返し単位から構成される構造）の少なくとも一部を認識する抗体である）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、固相プローブ配列により検出シグナルのバックグラウンド値が大きく変化することが確認された（表６、図２）。表６の結果より、固相プローブとしては、Ａおよび／またはＴ（もしくはＵ）を含むもの（換言すれば、ＣおよびＧを含まないもの）が好ましいと考えられた。
その結果、固相プローブ配列により検出シグナルのバックグラウンド値が大きく変化することが確認された（表６、図２）。表６の結果より、固相プローブとしては、Ａおよび／またはＴ（もしくはＵ）を含むもの（換言すれば、ＣおよびＧを含まないもの）が好ましいと考えられた。
実施例２：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（１）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１３、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
固相プローブおよび捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。固定化された固相プローブ核酸を３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中に５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え（核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０．０１ｎＭであり、捕捉プローブの濃度は５０ｎＭであり、固相プローブの濃度は理論上５０ｎＭ以下（用いた全量の固相プローブが固相に固定されたと仮定した場合、５０ｎＭ）である）、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１３、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
固相プローブおよび捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。固定化された固相プローブ核酸を３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中に５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え（核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０．０１ｎＭであり、捕捉プローブの濃度は５０ｎＭであり、固相プローブの濃度は理論上５０ｎＭ以下（用いた全量の固相プローブが固相に固定されたと仮定した場合、５０ｎＭ）である）、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。
実施例３：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（２）
捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１５、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。
捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１５、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。
実施例４：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（３）
捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（配列番号１６）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１７、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。また、本実施例で用いた固相プローブおよび捕捉プローブは、実施例２及び３のものに比し、バックグランド値の抑制効率が低かった。このことは、グアニン残基の含量が少ない固相プローブがより適切であることを示す。
捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（配列番号１６）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１７、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３〜５）。また、本実施例で用いた固相プローブおよび捕捉プローブは、実施例２及び３のものに比し、バックグランド値の抑制効率が低かった。このことは、グアニン残基の含量が少ない固相プローブがより適切であることを示す。
参考例１：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（１）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、または０．００１ｐｍｏｌ）と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表７、図３〜５に示すとおりであった。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、または０．００１ｐｍｏｌ）と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表７、図３〜５に示すとおりであった。
実施例５：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（４）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、ならびに異なる捕捉プローブおよび異なる固相プローブを用いたこと以外は、実施例２と同様の方法で行った。
その結果、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように、捕捉プローブを設計した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表８、図６、７）。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、ならびに異なる捕捉プローブおよび異なる固相プローブを用いたこと以外は、実施例２と同様の方法で行った。
その結果、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように、捕捉プローブを設計した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表８、図６、７）。
参考例２：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（２）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表８、図６、７に示すとおりであった。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ−３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表８、図６、７に示すとおりであった。
実施例６：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（５）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号２０、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２１）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）中に５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２および実施例５と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表９、図８、９）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１〜１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０〜０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図９）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０〜０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号２０、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２１）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）中に５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２および実施例５と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表９、図８、９）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１〜１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０〜０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図９）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０〜０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
参考例３：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（３）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号２０、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２２、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表９、図８、９に示すとおりであった。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号２０、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２２、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、表９、図８、９に示すとおりであった。
実施例７：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（６）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２３、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２、実施例５および実施例６と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１０、図１０、１１）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１〜１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０〜０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図１１）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０〜０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２３、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２、実施例５および実施例６と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１０、図１０、１１）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１〜１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０〜０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図１１）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０〜０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
参考例４：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（４）
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２３、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２５、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、参考例３と同様の方法で行った。
結果は、表１０、図１０、１１に示すとおりであった。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２３、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２５、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、参考例３と同様の方法で行った。
結果は、表１０、図１０、１１に示すとおりであった。
実施例８：本発明の測定系における異種核酸プローブの使用
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（異種核酸プローブ：２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ＋ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号２６、５’末端側の１番目から２６番目までのヌクレオチド残基の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡであり、２７番目から４８番目までのヌクレオチド残基の主鎖はＤＮＡである）、固相プローブのヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
異種核酸プローブを用いる修飾核酸塩基の測定（実験１）は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
次いで、同種核酸プローブを用いて修飾核酸塩基の測定（実験２）を同様に行った。実験２は、実験１で使用した一部の主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである捕捉プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである（標的核酸に対する）同種核酸プローブ（５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２））を用いた以外は、実験１と同様の方法で試験した。なお、実験２は、用いた標的核酸（ＤＮＡ）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）および固相プローブ（ＤＮＡ）の種類の観点から、実施例２に類する。
実験１で測定された吸光度（異種）を、実験２で測定された吸光度（同種）で除算して、ＯＤ４５０比（異種／同種）を求めた。ここで、バックグランド値の比（異種／同種）は、実験１において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（異種））を、実験２において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（同種））で除算して求めた値に対応する。
また、実験１および実験２で測定された吸光度からＳ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）をそれぞれ算出し、次いで、Ｓ／Ｎ（異種）をＳ／Ｎ（同種）で除算して、Ｓ／Ｎ（異種／同種）を求めた。なお、Ｓ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）について、Ｓは、修飾核酸塩基を含む標的核酸（１ｐｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）の存在下で測定された吸光度を表し、Ｎは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値）を表す。結果を表１１に示す。
その結果、バックグランド値の比（異種／同種）より明らかであるように、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、バックグランド値を抑制した（表１１）。また、標的核酸の量がより少ないとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以下、特に０．０１ｐｍｏｌ以下）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度がより低いとき（例えば１ｎＭ以下、特に０．１ｎＭ以下）、ＯＤ４５０比（異種／同種）の低下が認められた（表１１）。さらに、標的核酸の量がより多いとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以上、特に１ｐｍｏｌ以上）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度が高いとき（例えば１ｎＭ以上、特に１０ｎＭ以上）、Ｓ／Ｎ比（異種／同種）の向上が認められた（表１１）。
標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１、［Ｃ］は５−メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（異種核酸プローブ：２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ＋ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号２６、５’末端側の１番目から２６番目までのヌクレオチド残基の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡであり、２７番目から４８番目までのヌクレオチド残基の主鎖はＤＮＡである）、固相プローブのヌクレオチド配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
異種核酸プローブを用いる修飾核酸塩基の測定（実験１）は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
次いで、同種核酸プローブを用いて修飾核酸塩基の測定（実験２）を同様に行った。実験２は、実験１で使用した一部の主鎖が２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡである捕捉プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである（標的核酸に対する）同種核酸プローブ（５’−ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１２））を用いた以外は、実験１と同様の方法で試験した。なお、実験２は、用いた標的核酸（ＤＮＡ）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）および固相プローブ（ＤＮＡ）の種類の観点から、実施例２に類する。
実験１で測定された吸光度（異種）を、実験２で測定された吸光度（同種）で除算して、ＯＤ４５０比（異種／同種）を求めた。ここで、バックグランド値の比（異種／同種）は、実験１において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（異種））を、実験２において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（同種））で除算して求めた値に対応する。
また、実験１および実験２で測定された吸光度からＳ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）をそれぞれ算出し、次いで、Ｓ／Ｎ（異種）をＳ／Ｎ（同種）で除算して、Ｓ／Ｎ（異種／同種）を求めた。なお、Ｓ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）について、Ｓは、修飾核酸塩基を含む標的核酸（１ｐｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）の存在下で測定された吸光度を表し、Ｎは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値）を表す。結果を表１１に示す。
その結果、バックグランド値の比（異種／同種）より明らかであるように、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、バックグランド値を抑制した（表１１）。また、標的核酸の量がより少ないとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以下、特に０．０１ｐｍｏｌ以下）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度がより低いとき（例えば１ｎＭ以下、特に０．１ｎＭ以下）、ＯＤ４５０比（異種／同種）の低下が認められた（表１１）。さらに、標的核酸の量がより多いとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以上、特に１ｐｍｏｌ以上）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度が高いとき（例えば１ｎＭ以上、特に１０ｎＭ以上）、Ｓ／Ｎ比（異種／同種）の向上が認められた（表１１）。
上記結果を説明すると以下のとおりである。
１）標的核酸が存在しないか、または標的核酸の濃度が少ない場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、検出シグナルの値をより抑制した。使用した標的核酸の量の範囲では、検出シグナル値の抑制に関し、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に優れた効果を奏した。
２）使用した標的核酸の量が少ない場合、異種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値は、同種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値と同等であった。一方、使用した標的核酸の量が多い場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、Ｓ／Ｎ値をより向上させた。つまり、Ｓ／Ｎ値に関して、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に同等以上の効果を奏した。
以上より、本発明の方法における異種核酸プローブの使用は有益であることが示された。
１）標的核酸が存在しないか、または標的核酸の濃度が少ない場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、検出シグナルの値をより抑制した。使用した標的核酸の量の範囲では、検出シグナル値の抑制に関し、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に優れた効果を奏した。
２）使用した標的核酸の量が少ない場合、異種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値は、同種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値と同等であった。一方、使用した標的核酸の量が多い場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、Ｓ／Ｎ値をより向上させた。つまり、Ｓ／Ｎ値に関して、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に同等以上の効果を奏した。
以上より、本発明の方法における異種核酸プローブの使用は有益であることが示された。
本発明の方法およびキットは、修飾核酸塩基の測定に有用である。
Claims (14)
- 以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体を用いて標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。 - 核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、請求項１記載の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。 - 標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項１または２記載の方法。
- 核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび該固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
- 前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
- 捕捉プローブまたは固相プローブの一方または双方が、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
- 捕捉プローブが、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、請求項６記載の方法。
- 固相プローブがポリＡまたはポリＴである、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
- ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、請求項２〜１０のいずれか一項記載の方法。
- ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、請求項２〜１１のいずれか一項記載の方法。
- 修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
- 以下を含む、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体。
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