WO2015025863A1 - 固相プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット - Google Patents

固相プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット Download PDF

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WO2015025863A1
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probe
solid phase
target nucleic
modified nucleobase
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PCT/JP2014/071704
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達樹 松野
麻里子 堀池
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富士レビオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for measuring modified nucleobases.
  • nucleic acids eg, DNA, RNA
  • nucleic acids eg, DNA, RNA
  • many techniques have been reported so far for detecting nucleobases into which a substance such as biotin has been artificially introduced by an immunoassay using an antibody.
  • a technique for detecting a naturally occurring modified nucleobase (eg, methylcytosine, hydroxylmethylcytosine) by immunoassay has been reported (Patent Document 1, and Non-Patent Documents 1 and 2).
  • an immunoassay system for detecting a modified nucleobase as described above, the present inventors have a problem that the background value of a detection signal increases due to non-specific binding of an antibody to a nucleic acid probe with respect to the modified nucleobase. Found that there exists. Therefore, in order to construct a highly sensitive immunoassay system, it was necessary to develop a technique for suppressing the background value.
  • the present inventors have determined that a background value can be obtained by using two types of probes (capture probe and solid phase probe) together in measurement of a modified nucleobase in a target nucleic acid using an antibody against the modified nucleobase. As a result, the present invention has been completed.
  • a method for measuring a modified nucleobase comprising: (1) incubating the nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe in solution; and (2) measuring the modified nucleobase in the solution obtained in (1) using an antibody against the modified nucleobase.
  • [2] The method of [1], wherein the nucleic acid sample contains a target nucleic acid containing a modified nucleobase, and steps (1) and (2) are performed by (1 ′) and (2 ′), respectively: (1 ′) A nucleic acid sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase, a capture probe and a solid phase probe are reacted in a solution by incubation to form a hybrid composed of the target nucleic acid, the capture probe and the solid phase probe. And (2 ′) measuring the modified nucleobase in the solution containing the hybrid using an antibody against the modified nucleobase.
  • [3] The method of [1] or [2], wherein the target nucleic acid is a target nucleic acid that may contain two or more modified nucleobases.
  • the method further comprises adding a solution containing the nucleic acid sample and the capture probe to the solid phase to which the solid phase probe is immobilized, to prepare a solution containing the nucleic acid sample, the capture probe and the solid phase probe. Any one of [1] to [3].
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the nucleic acid sample is a sample containing a target DNA containing a modified nucleobase.
  • [10] The method according to any one of [1] to [9], wherein the modified nucleobase is methylcytosine.
  • the capture probe of [2] to [10] is designed such that an unpaired portion of the modified nucleobase is formed in a double-stranded structure composed of the target nucleic acid and the capture probe in the hybrid. Either way.
  • [12] The method according to any one of [2] to [11], wherein the capture probe is designed so that the modified nucleobase is present in the single-stranded structure portion of the hybrid.
  • the measurement of the modified nucleobase using an antibody against the modified nucleobase is performed by ELISA.
  • a kit for measuring a modified nucleobase comprising: (I) a capture probe; (II) a solid phase probe; and (III) an antibody against the modified nucleobase.
  • the modified nucleobase in the target nucleic acid can be measured with high sensitivity by reducing the background value of the detection signal.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an outline of measurement of a modified nucleobase in a target nucleic acid according to the method of the present invention.
  • RN a nucleotide residue having a modified nucleobase
  • N a nucleotide residue having a nucleobase
  • R a substituent that the nucleobase has.
  • FIG. 2 is a diagram showing signal values (background values) measured in the presence of antibodies against solid phase probes 1 to 10 and modified nucleobases.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an outline of measurement of a modified nucleobase in a target nucleic acid according to the method of the present invention.
  • RN a nucleotide residue having a modified nucleobase
  • N a nucleotide residue having a nucleobase
  • R a substituent that the nucleobase has.
  • FIG. 2 is a diagram showing signal values (background values) measured in the presence of antibodies against solid phase probe
  • FIG. 3 shows a target nucleic acid (0 mol, 0.001 pmol, 0.001 pmol, 0.1 mol or 1 pmol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Examples 2 to 4; ⁇ : Reference
  • FIG. 2 is a graph showing signal values measured in the measurement under the conditions of Example 1) and an antibody (+) against a modified nucleobase (Examples 2 to 4 and Reference Example 1).
  • FIG. 4 shows the conditions of a target nucleic acid (0 mol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Examples 2 to 4; ⁇ : Reference Example 1) and an antibody (+) against the modified nucleobase.
  • FIG. 5 is a graph showing signal-to-noise ratio (S / N) calculated in the measurement of modified nucleobases (Examples 2 to 4 and Reference Example 1).
  • S / N S was measured in measurements under conditions of target nucleic acid containing modified nucleobase (1 pmol), capture probe (+), solid phase probe (+) and antibody to modified nucleobase (+).
  • a signal value is shown, and N was measured in the measurement under conditions of a target nucleic acid (0 mol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+) and an antibody (+) against the modified nucleobase. Indicates the signal value (background value).
  • FIG. 6 shows the conditions of a target nucleic acid (0 mol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 5; ⁇ : Reference Example 2) and an antibody against the modified nucleobase (+). It is a figure which shows the signal value (background value) measured in this measurement.
  • FIG. 7 shows a target nucleic acid (0 mol, 0.01 pmol, 0.1 pmol, 1 mol or 10 pmol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 5; ⁇ : Reference Example 2) and It is a figure which shows the signal value measured in the measurement under the conditions of the antibody (+) with respect to a modified nucleobase.
  • FIG. 6 shows the conditions of a target nucleic acid (0 mol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 5; ⁇ : Reference Example 2) and an antibody against the modified nucleobase (+). It is a
  • FIG. 8 shows the conditions of a target nucleic acid containing a modified nucleobase (0 mol), a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 6; ⁇ : Reference Example 3) and an antibody against the modified nucleobase (+). It is a figure which shows the signal value (background value) measured in this measurement.
  • FIG. 9 shows a target nucleic acid (0 mol, 0.01 pmol, 0.1 pmol, 1 mol or 10 pmol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 6; ⁇ : Reference Example 3) and It is a figure which shows the signal value measured in the measurement under the conditions of the antibody (+) with respect to a modified nucleobase.
  • FIG. 9 shows a target nucleic acid (0 mol, 0.01 pmol, 0.1 pmol, 1 mol or 10 pmol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 6; ⁇ :
  • FIG. 10 shows the conditions of a target nucleic acid containing a modified nucleobase (0 mol), a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 7; ⁇ : Reference Example 4) and an antibody against the modified nucleobase (+). It is a figure which shows the signal value (background value) measured in this measurement.
  • FIG. 11 shows a target nucleic acid (0 mol, 0.01 pmol, 0.1 pmol, 1 mol or 10 pmol) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), a solid phase probe (+: Example 7; ⁇ : Reference Example 4) and It is a figure which shows the signal value measured in the measurement under the conditions of the antibody (+) with respect to a modified nucleobase.
  • the present invention provides a method for measuring modified nucleobases.
  • the method of the present invention includes: (1) incubating the nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe in solution; and (2) measuring the modified nucleobase in the solution obtained in (1) using an antibody against the modified nucleobase.
  • the nucleic acid sample is a sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase, or a sample suspected of containing the target nucleic acid.
  • the nucleic acid sample may also be a biological sample from an organism, or an environmental sample or the like. Examples of organisms from which biological samples are derived include animals such as mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds (eg, chickens), insects, and the like. , Microorganisms, plants, fungi, and fish.
  • a biological sample can also be a blood-related sample (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, milk, tissue or cell extract, or a mixture thereof, which is the blood itself or a sample derived from blood. Also good.
  • the biological sample may further be derived from a mammal suffering from a disease (eg, cancer, leukemia) or a mammal potentially having a disease.
  • the environmental sample include samples derived from soil, seawater, and fresh water that may contain nucleic acids. Such samples may be subjected to other processing before being used in the method of the present invention. Examples of such treatment include extraction of nucleic acid (eg, DNA such as genomic DNA, RNA) and fragmentation (eg, treatment with an enzyme such as a restriction enzyme).
  • the methods of the invention may further comprise extracting nucleic acid from the nucleic acid sample and / or fragmenting the nucleic acid.
  • the method of the present invention may further comprise processing the sample by centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigeration, stirring, and the like.
  • the target nucleic acid is DNA or RNA, but DNA is preferred.
  • the target nucleic acid is also a coding or non-coding region of DNA (eg, a transcriptional regulatory region).
  • the number of nucleotide residues constituting the target nucleic acid is not particularly limited as long as it can hybridize with the capture probe. For example, it is 10 or more, preferably 15 or more, more preferably 20 It may be the above.
  • the number of nucleotides constituting the target nucleic acid is not particularly limited, and may be any number that may be generated by fragmentation processing of genomic DNA, for example.
  • the number of nucleotides constituting the target nucleic acid may be 10,000 or less, 5000 or less, 2000 or less, 1000 or less, 500 or less, 200 or 100 or less.
  • the GC content of the target nucleic acid is not particularly limited, and may be, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 60% or more.
  • the GC content of the target nucleic acid may also be 90% or less, 80% or less, or 70% or less, for example.
  • the number of modified nucleobases contained in the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is 1 or more (eg, 1 to 100, 1 to 20, 1 to 10, or 1 to 5).
  • the modified nucleobase is modified with respect to a normal nucleobase selected from the group consisting of adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) and uracil (U).
  • a nucleobase having a structure includes, for example, adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) when the target nucleic acid is DNA. It is done.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid is RNA, examples thereof include adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and uracil (U).
  • the nucleobase is preferably cytosine (C).
  • Modifications include, for example, introduction of substituents into normal nucleobases, elimination of groups (eg, amino group, oxo group, methyl group) possessed by ordinary nucleobases, substituents of groups possessed by ordinary nucleobases The exchange to is mentioned.
  • the substituent is not particularly limited as long as it can be possessed by a naturally occurring nucleobase.
  • the substituent is preferably methyl, hydroxymethyl, or carboxyl, and more preferably methyl or hydroxymethyl.
  • the position of modification such as substitution is not particularly limited, but in the case of a nucleobase having a pyrimidine ring (C, T or U), for example, it is at the 2-position, 4- to 6-position, preferably at the 5-position, In the case of a nucleobase (A or G) having a purine ring, they are, for example, the 2nd, 6th and 8th positions.
  • the modified nucleobase is not particularly limited as long as it can exist in nature.
  • Administrative Instructions under the Patent Cooperation Treaty (enforced on January 1, 2009), Annex C, Appendix 2, Table 2: Examples thereof include modified nucleobases possessed by modified nucleotides described in Modified Nucleotides.
  • the modified nucleotides described in this document may be the same as the modified nucleotides described in Appendix 2, Table 2: Modified Base Table of the above guidelines. Accordingly, reference can also be made to the above guidelines for modified nucleobases.
  • the modified nucleobase is methylcytosine (eg, 5-methylcytosine), hydroxymethylcytosine (eg, 5-hydroxymethylcytosine), carboxyl cytosine (eg, 5-carboxyl cytosine). More preferably, the modified nucleobase is methylcytosine (eg, 5-methylcytosine), hydroxymethylcytosine (eg, 5-hydroxymethylcytosine).
  • a modified nucleobase is known to cause a change in the function of the nucleic acid (eg, a change in the transcriptional regulatory ability of a given gene).
  • the capture probe used in the present invention is a nucleic acid molecule that can hybridize with a target nucleic acid and a solid phase probe.
  • the capture probe can, for example, hybridize with the target nucleic acid in the first region and hybridize with the solid phase probe in the second region.
  • the capture probe can be composed of homologous and / or heterologous nucleic acids with respect to the target nucleic acid.
  • the term “same species” means that the capture probe has the same main-chain structure as the main-chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety) as a whole of the main-chain structure. .
  • the term “heterologous” means that the capture probe has a main chain structure that is different from the main chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety) as a part of or the whole main chain structure means. Therefore, the type of capture probe is determined according to the type of target nucleic acid. For example, when the target nucleic acid is DNA, a DNA probe can be used as a capture probe for homologous nucleic acids, and a nucleic acid probe other than a DNA probe can be used as a capture probe for heterologous nucleic acids.
  • the target nucleic acid is a natural RNA
  • a normal RNA probe composed of the same type of RNA as the natural RNA can be used as the same type of nucleic acid capture probe, and a normal RNA probe as a heterologous nucleic acid capture probe.
  • Other nucleic acid probes can be used.
  • the capture probe may contain a nucleic acid heterologous to the target nucleic acid.
  • the capture probe examples include a DNA probe, an RNA probe, a peptide nucleic acid (PNA) probe, a lock nucleic acid (also referred to as LNA, bridged nucleic acid (BNA)) probe, a phosphorothioate (S) nucleic acid probe, and such 2 probes.
  • PNA peptide nucleic acid
  • BNA bridged nucleic acid
  • S phosphorothioate
  • a chimeric nucleic acid probe in which the above nucleic acid probes are linked and / or mixed the chimeric nucleic acid probe necessarily includes a nucleic acid heterologous to the target nucleic acid).
  • RNA probe examples include a normal RNA probe composed of a natural ribonucleotide having a hydroxyl group at the 2 ′ position, and a modified RNA probe composed of a ribonucleotide modified with a hydroxyl group at the 2 ′ position.
  • a ribonuclease resistant RNA probe may be used as the modified RNA probe.
  • modified RNA probes include 2′-O-alkylated RNA probes. The 2′-O-alkylated RNA probe is preferably a 2′-O—C 1 -C 6 alkylated RNA probe.
  • the C 1 -C 6 alkylated C 1 -C 6 alkyl group is a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methyl, ethyl, propyl group (eg, n -Propyl, iso-propyl), butyl group (eg, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl), pentyl group, hexyl group and the like.
  • the 2′-O—C 1 -C 6 alkylated RNA probe is preferably a 2′-O-methylated RNA probe.
  • the number of nucleotide residues constituting the capture probe (that is, the length of the capture probe) is not particularly limited as long as it is long enough to hybridize with the target nucleic acid and the solid phase probe. , Preferably 25 or more, more preferably 30 or more.
  • the number of nucleotides constituting the capture probe may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 60 or less, or 50 or less.
  • the GC content in the first region that can hybridize with the target nucleic acid in the capture probe is not particularly limited, but for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, Or 60% or more may be sufficient.
  • the GC content in the first region may also be, for example, 90% or less, 80% or less, or 70% or less.
  • the second region that can hybridize with the solid phase probe in the capture probe may be composed of only the same type of nucleotide residues, or may be composed of two or more different types of nucleotide residues.
  • the second region is composed only of nucleotide residues of the same type and the capture probe is a DNA probe
  • the second region is preferably only one of adenine, guanine or thymine as a nucleobase A poly A, poly G or poly T region composed only of nucleotide residues containing, more preferably a poly A or poly T region composed only of nucleotide residues containing only one of adenine or thymine .
  • the second region is composed only of nucleotide residues of the same type and the capture probe is an RNA probe
  • the second region is preferably only one of adenine, guanine or uracil as a nucleobase.
  • a poly A, poly G or poly U region composed only of nucleotide residues containing, more preferably a poly A or poly U region composed only of nucleotide residues containing only one of adenine or uracil .
  • the second region is a poly A or poly T region.
  • Such a capture probe can be prepared, for example, by a probe synthesis method known in the art. The capture probe is used in free form.
  • a solid phase probe refers to a probe that can hybridize with a capture probe and can be immobilized on a solid phase.
  • the solid phase probe is used in a free form or a form immobilized on a solid phase (described later).
  • the solid phase probe may be labeled with a substance or group that allows immobilization to the solid phase. Labeling is performed, for example, at either the 5 'end or the 3' end. Examples of the group or substance that enables immobilization to a solid phase include a group or substance that enables covalent binding to a solid phase, and an affinity substance.
  • Examples of the group or substance capable of covalently binding to a solid phase include, for example, a thiol group or a substance having a thiol group (such a thiol group introduced into a solid phase probe is a maleimide group on a solid phase). And an amino group or a substance having an amino group (such an amino group introduced into a solid phase probe can bind to maleic anhydride on a solid phase).
  • Examples of the affinity substance include streptavidin, biotin, digoxigenin, dinitrophenol, fluorescein, and fluorescein isothiocyanate. In this case, as the solid phase, one coated with another affinity substance having affinity with the affinity substance possessed by the solid phase probe can be used.
  • the solid phase probe can be composed of the same type or different type of nucleic acid with respect to the target nucleic acid.
  • the term “same species” means that the solid phase probe has the same main chain structure as the main chain structure of the target nucleic acid (a structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety).
  • the term “heterologous” means that the solid phase probe has a main chain structure different from the main chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety). Therefore, the type of solid phase probe is determined according to the type of target nucleic acid.
  • a DNA probe can be used as the solid phase probe of the same nucleic acid, and a nucleic acid probe other than the DNA probe can be used as the solid phase probe of the heterologous nucleic acid.
  • a normal RNA probe composed of the same type of RNA as the natural RNA can be used as a solid phase probe of the same type of nucleic acid, and a normal phase probe of heterogeneous nucleic acid can be used as a normal phase.
  • Nucleic acid probes other than RNA probes can be used.
  • the solid phase probe may be composed of a nucleic acid heterologous to the target nucleic acid.
  • Examples of the solid phase probe include a DNA probe, an RNA probe, a peptide nucleic acid (PNA) probe, a lock nucleic acid (also referred to as LNA, bridged nucleic acid (BNA)) probe, a phosphorothioate (S) nucleic acid probe, and the like.
  • Examples include chimeric nucleic acid probes in which two or more nucleic acid probes are linked and / or mixed.
  • Examples of RNA probes include those described above for capture probes.
  • the total number of nucleotide residues constituting the solid phase probe ensures the distance of the target nucleic acid from the solid phase that hybridizes with the capture probe and to which the solid phase probe is immobilized.
  • the length is not particularly limited as long as the length is sufficient, but may be, for example, 10 or more, preferably 15 or more, more preferably 20 or more.
  • the modified nucleobase can be detected with high sensitivity by securing the distance of the target nucleic acid from the solid phase (that is, the modified nucleobase detected in the present invention).
  • the total number of nucleotides constituting the solid phase probe may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 70 or less, or 60 or less.
  • Such a solid phase probe can be prepared, for example, by a nucleotide polymerization method known in the art.
  • the solid phase probe is a homopolynucleotide or a heteropolynucleotide.
  • a homopolynucleotide refers to a polynucleotide composed of only homologous nucleotide residues.
  • the homopolynucleotide is preferably a poly A, poly C or poly T composed only of nucleotide residues containing only one of adenine, cytosine or thymine as the nucleobase. More preferably, it is poly A or poly T composed of only nucleotide residues containing only one of adenine or thymine.
  • the homopolynucleotide is preferably a poly A, poly C or poly U composed only of nucleotide residues containing only one of adenine, cytosine or uracil as a nucleobase. More preferably, it is poly A or poly U composed only of nucleotide residues containing only one of adenine or uracil.
  • the homopolynucleotide is poly A or poly T.
  • a heteropolynucleotide refers to a polynucleotide composed of two or more heterologous nucleotide residues.
  • the heteropolynucleotide is preferably composed of nucleotide residues containing adenine, cytosine or thymine as a nucleobase, and more preferably composed of nucleotide residues containing adenine or thymine.
  • the heteropolynucleotide is an RNA probe, the heteropolynucleotide is preferably composed of nucleotide residues containing adenine, cytosine or uracil as a nucleobase, more preferably composed of nucleotide residues containing adenine or uracil.
  • the incubation is performed when the target nucleic acid is contained in the nucleic acid sample, and is hybridized with the capture probe (free), the solid phase probe (free or fixed on the solid phase described later) and the target nucleic acid in the nucleic acid sample. It is carried out in a suitable solution under conditions where the reaction is possible.
  • a suitable solution for example, a buffer solution containing a salt (eg, sodium citrate) and other components (eg, a surfactant) can be used.
  • the hybridization temperature is, for example, 15 to 95 ° C. (preferably 25 to 65 ° C.).
  • the expression “incubating nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe in solution” for step (1) means target nucleic acid (when nucleic acid sample contains target nucleic acid), capture probe and solid phase probe. It is contemplated that the nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe are incubated simultaneously or in a time lag manner so that a hybrid composed of Accordingly, the above expression specifically encompasses the following aspects: (1-1) Incubating nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe in solution simultaneously; (1-2) The nucleic acid sample and the capture probe are first incubated (if the nucleic acid sample contains the target nucleic acid, an intermediate hybrid composed of the target nucleic acid and the capture probe is formed), and then the solution obtained by the main incubation In combination with a solid phase probe (if the nucleic acid sample comprises a target nucleic acid, a hybrid composed of the target nucleic acid, the capture probe and the solid phase probe is formed); and (1-3) the capture probe and The solid phase probe is first incuba
  • the nucleic acid sample does not contain the target nucleic acid, incubation of the nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe in solution does not form the desired hybrid composed of the target nucleic acid, capture probe and solid phase probe.
  • the modified nucleobase cannot be detected, but it can be determined that the modified nucleobase is not present in the nucleic acid sample. If the nucleic acid sample contains a target nucleic acid that does not contain a modified nucleobase (in other words, a target nucleic acid that contains only an unmodified nucleobase), the nucleic acid sample, capture probe and solid phase probe can be modified by incubating in solution.
  • a target nucleic acid that does not contain a nucleobase, a capture probe, and a solid phase probe react to form a hybrid composed of the target nucleic acid, the capture probe, and the solid phase probe.
  • the modified nucleobase cannot be detected, but the modified nucleobase is not present in the nucleic acid sample (although the target nucleic acid is present), in other words, the target It can be determined that a given nucleobase in the nucleic acid is not modified.
  • the target nucleic acid containing the modified nucleobase, the capture probe and the solid phase probe react by incubating the nucleic acid sample, the capture probe and the solid phase probe in solution.
  • a hybrid composed of the target nucleic acid, the capture probe and the solid phase probe is formed.
  • the presence of the modified nucleobase can be determined, and the modified nucleobase can also be quantified.
  • the hybrid is formed by the double-stranded structure of the target nucleic acid and the capture probe formed by hybridization between the target nucleic acid and the capture probe, and the hybridization between the capture probe and the solid phase probe.
  • a hybridization complex composed of a target nucleic acid, a capture probe and a solid phase probe, having a double-stranded structure of the capture probe and the solid phase probe. Examples of hybrid structures are as described in Tables 1-1 to 1-5 below.
  • the double-stranded structure of the target nucleic acid and the capture probe may be formed in the entire region or a partial region of the target nucleic acid.
  • the hybrid may have a single-stranded structure of the target nucleic acid in either the 5 ′ terminal region or the 3 ′ terminal region [eg, (a-1) to (a-5), (b ⁇ 1) to (b-5)], or a double-stranded structure may be formed in the entire region of the target nucleic acid [eg, (c-1) to (c-5), (d-1) to ( d-5), (e-1) to (e-5), (f-1) to (f-5)].
  • a single-stranded structure of the target nucleic acid in either the 5 ′ terminal region or the 3 ′ terminal region [eg, (a-1) to (a-5), (b ⁇ 1) to (b-5)]
  • a double-stranded structure may be formed in the entire region of the target nucleic acid [eg, (c-1) to (c-5), (d-1) to ( d-5), (e-1) to (e-5), (f-1) to (f-5)].
  • the solid phase probe may hybridize with a capture probe at the 5 ′ end region to form a double-stranded structure [eg, (a-1) to (a-2), (c-1) to ( c-2), (e-1) to (e-2), (b-3) to (b-5), (d-3) to (d-5), (f-3) to (f- 5)], or may be hybridized with a capture probe at the 3 ′ end region to form a double-stranded structure [eg, (a-3) to (a-5), (c-3) to ( c-5), (e-3) to (e-5), (b-1) to (b-2), (d-1) to (d-2), (f-1) to (f- 2)].
  • a double-stranded structure eg, (a-1) to (a-2), (c-1) to ( c-2), (e-1) to (e-2), (b-3) to (b-5), (d-1) to (d-2), (f-1) to (f- 2)].
  • a single-stranded structure is a non-hybridized region of one or more nucleotide residues at the 5 ′ and / or 3 ′ end of a hybridized target nucleic acid, capture probe or solid phase probe, or non-terminal of a complementary probe It is a structure formed by having. In (a-1) to (f-5), the 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region of the target nucleic acid, the 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region of the capture probe, and the 5 ′ terminal region of the solid phase probe And a structure in which at least three of the 3 ′ terminal regions are hybridized.
  • these three terminal regions do not necessarily have to hybridize either, and single-stranded structural portions (ie, non-hybridized) in both the 3 ′ end region of the target nucleic acid and the 5 ′ end region of the capture probe.
  • Soybean region may have a single-stranded structure in both the 5 ′ end region of the target nucleic acid and the 3 ′ end region of the capture nucleic acid.
  • Both of the 5 ′ end regions of the phase probe may have a single-stranded structure portion, and both the 5 ′ end region of the capture probe and the 3 ′ end region of the solid phase probe have a single-stranded structure portion. It may be.
  • the number of nucleotide residues of the target nucleic acid and the capture probe corresponding to the double-stranded structure part of the target nucleic acid and the capture probe, and the capture probe and the solid phase corresponding to the double-stranded structure part of the capture probe and the solid phase probe The number of nucleotide residues of the probe (ie, the length of the double-stranded structure) is not particularly limited as long as it is long enough to allow hybridization with the target nucleic acid. The number may be 15 or more, more preferably 20 or more. The number of such nucleotide residues may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, or 30 or less.
  • the GC content in the double-stranded structure portion of the target nucleic acid and the capture probe is not particularly limited.
  • the GC content is 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 60% or more. There may be.
  • the GC content in the double-stranded structure part of the target nucleic acid and the capture probe may also be 90% or less, 80% or less, or 70% or less, for example.
  • the GC content in the double-stranded structure portion of the capture probe and the solid phase probe is preferably low.
  • the number of nucleotide residues of the target nucleic acid, the capture probe, and the solid phase probe corresponding to the single-stranded structure portion is not particularly limited as long as it is 1 or more. Is, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, or 50 It is more than one. Such a number is not particularly limited, and may be, for example, 10,000 or less, 5000 or less, 2000 or less, 1000 or less, 500 or less, 200 or less, or 100 or less. Capture probes and / or solid phase probes may be designed to form such single-stranded structural moieties in the hybrid at the 5 'end region or the 3' end region.
  • the capture probe may be designed such that an unpaired portion of the modified nucleobase is formed in a double stranded structure composed of the target nucleic acid and the capture probe in the hybrid.
  • the unpaired portion of the modified nucleobase can be introduced to facilitate detection of the modified nucleobase by the antibody.
  • a capture probe having a nucleotide sequence that is not completely complementary to the target nucleic acid in the double-stranded structure portion may be used.
  • An example of a capture probe in which an unpaired portion of a modified nucleobase is formed in a double-stranded structure composed of a target nucleic acid and a capture probe in a hybrid is complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid
  • Capture probe lacking a typical nucleotide residue [eg, (I) of Table 2].
  • Such a capture probe may lack only one nucleotide residue complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid (eg, (I-1) in Table 2), It may lack two or more (eg, 2-20, 2-10, or 2-5) contiguous nucleotide residues including nucleotide residues with modified nucleobases in nucleic acids [eg, (I-2) in Table 2].
  • the number in the unpaired portion of the nucleotide residue having the modified nucleobase is not particularly limited as long as it is 1 or more as described above.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 See, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 2. Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • Another example of a capture probe in which an unpaired portion of a modified nucleobase is formed in a double stranded structure composed of a target nucleic acid and a capture probe in a hybrid is for nucleotide residues having modified nucleobases in the target nucleic acid.
  • Capture probes having non-complementary nucleotide residues [eg, (I ′) in Table 2].
  • Such a capture probe may have only one nucleotide residue that is non-complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid [eg, (I′-1) in Table 2], Two or more (for example, 2 to 20, 2 to 10, or 2 to 5) adjacent nucleotide residues including a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid may be non-complementary. [Example, (I′-2) in Table 2].
  • Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the capture probe may be designed such that the modified nucleobase is present in the hybrid single stranded structure.
  • the modified nucleobase may be present at the non-terminal portion of the single-stranded structure portion on the 5 ′ end side (eg, (II) in Table 4), It may be present at the end of the single-stranded structure portion on the 5 ′ end side (eg, (III) in Table 4), and may be present at the non-terminal portion of the single-stranded structure portion on the 3 ′ end side.
  • the capture probe may be designed such that the hybrid single-stranded structural portion (target nucleic acid) contains the modified nucleobase in this manner.
  • the number in the single-stranded structure portion of the nucleotide residue having a modified nucleobase is not particularly limited as long as it is 1 or more as described above.
  • the capture probe is such that the modified nucleobase is present in the hybrid single-stranded structure and, as described above, an unpaired portion of the modified nucleobase is further formed in the hybrid double-stranded structure. May be designed. Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the method of the present invention further comprises preparing a solution containing the nucleic acid sample, the capture probe and the solid phase probe by adding a solution containing the nucleic acid sample and the capture probe to the solid phase to which the solid phase probe is immobilized. You may go out.
  • the method of the present invention may further include preparing a solution containing both the nucleic acid sample and the capture probe by adding the capture probe to the solution containing the nucleic acid sample.
  • the capture probe can be added to the nucleic acid sample in solid form or as a solution.
  • a nucleic acid sample and a capture probe are added simultaneously or separately to a solid phase probe in a solution fixed to a solid phase, and a solution containing the nucleic acid sample, the capture probe and the solid phase probe is added. It may further comprise preparing.
  • the concentration of the target nucleic acid in the solution is not particularly limited as long as it can be detected by the method of the present invention. It may be 0.01 nM or more, preferably 0.1 nM or more, more preferably 1 nM or more, 5 nM or more, or 10 nM or more.
  • the concentration of the target nucleic acid in the solution may also be, for example, 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less.
  • the target nucleic acid concentration in the nucleic acid sample is often unknown, so it may be difficult to set the exact target nucleic acid concentration.
  • concentration of the target nucleic acid may be known (eg, the presence and absence of modified nucleobases in the target nucleic acid, although the size and / or concentration of the target nucleic acid is separately measured) And the content of the modified nucleobase in the target nucleic acid is unknown). In such a case, the concentration of the target nucleic acid may be set as described above.
  • the concentration of the capture probe in the solution is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be detected by the method of the present invention. For example, 0.01 nM or more, preferably 0.1 nM or more, more preferably 1 nM or more, and even more preferably It may be 5 nM or more, particularly preferably 10 nM or more.
  • the concentration of the capture probe in the solution may also be, for example, 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less.
  • capture probes may be added to the solution so that such concentrations are achieved.
  • the concentration of the solid phase probe in the solution is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be detected by the method of the present invention. For example, 0.01 nM or more, preferably 0.1 nM or more, more preferably 1 nM or more, 5 nM or more, Alternatively, it may be 10 nM or more.
  • the concentration of the capture probe in the solution may also be, for example, 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less.
  • a solid phase probe may be added to the solution so that such a concentration is achieved.
  • the target nucleic acid may be a target nucleic acid that may contain two or more modified nucleobases.
  • the number of modified nucleobases that may be contained in the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is 2 or more. For example, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 10, or 2 to 5 (Eg, 2, 3, 4 or 5).
  • the methods of the invention can use heterologous nucleic acid probes designed to hybridize with target nucleic acids that may contain two or more modified nucleobases. Such a design is possible if the number of nucleobases that may be modified in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the modified nucleobase is measured using an antibody against the modified nucleobase in a solution containing the hybrid.
  • the solution obtained in the step (1) may be used as it is.
  • another solution is added and / or another solution is added.
  • Exchange to a solution may be performed. Such exchange can be performed, for example, by adding the solution obtained in step (1) to the solid phase, immobilizing the hybrid that may be contained in the solution to the solid phase, and then removing the solution from the solid phase. Accordingly, after washing with a washing solution, another solution (eg, a solution containing an antibody against a modified nucleobase) can be added.
  • the solution used for the measurement is not particularly limited as long as it is a solution suitable for the antigen / antibody reaction.
  • Measurement can be performed by immunological techniques.
  • immunological techniques include enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA, indirect competition ELISA, sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and latex agglutination.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and latex agglutination.
  • the antibody against the modified nucleobase may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody against the modified nucleobase may be any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY).
  • the antibody against the modified nucleobase may also be a full-length antibody.
  • a full-length antibody refers to an antibody comprising a heavy chain and a light chain comprising a variable region and a constant region, respectively (eg, an antibody comprising two Fab portions and an Fc portion).
  • the antibody against the modified nucleobase may also be an antibody fragment derived from such a full-length antibody.
  • the antibody fragment is a part of a full-length antibody, and examples thereof include F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, and Fv.
  • the antibody against the modified nucleobase may also be a modified antibody such as a single chain antibody.
  • the antibody against the modified nucleobase may be further used as a primary antibody in an immunoassay such as ELISA, and in this case, a secondary antibody is used in combination.
  • An antibody against a modified nucleobase is a modified nucleobase, a nucleoside having a modified nucleobase (a structural unit composed of a modified nucleobase and 2′-deoxyribose or ribose), or a nucleotide having a modified nucleobase (modified nucleobase, 2 '-Deoxyribose or structural unit composed of ribose and phosphate) or affinity to two or more nucleotides (eg, oligonucleotide composed of 2 to 5 nucleotides) including nucleotides with modified nucleobases If you do.
  • the antibody against the modified nucleobase is 1) from the group consisting of 2′-deoxy modified adenosine, 2′-deoxy modified guanosine, 2′-deoxy modified cytidine and 2′-deoxy modified thymidine Selected antibodies against deoxyribonucleosides with modified nucleobases 2) 2'-deoxy modified adenosine 5'-phosphate, 2'-deoxy modified guanosine 5'-phosphate, 2'-deoxy modified cytidine 5'-phosphate and 2 ' -An antibody against deoxyribonucleotides having a modified nucleobase selected from the group consisting of deoxy-modified thymidine 5'-phosphate, and 3) against two or more deoxyribonucleotides comprising the above deoxyribonucleotides having a modified nucleobase Body, and the like.
  • an antibody against a modified nucleobase when the target nucleic acid is RNA for example, 1 ′
  • an antibody against a nucleoside having a modified nucleobase selected from the group consisting of modified adenosine, modified guanosine, modified cytidine and modified uridine e.g., 1 ′
  • an antibody against a ribonucleotide having a modified nucleobase selected from the group consisting of modified adenosine 5'-phosphate, modified guanosine 5'-phosphate, modified cytidine 5'-phosphate and modified uridine 5'-phosphate e.g., 3'
  • An antibody against two or more ribonucleotides including the ribonucleotide having a modified nucleobase can be mentioned.
  • An antibody against a modified nucleobase includes, for example, a modified nucleobase, a nucleoside having a modified nucleobase, a nucleotide having a modified nucleobase, or two or more nucleotides including a nucleotide having a modified nucleobase, and a carrier protein (eg, BSA, KLH). ) And a complex prepared using an antigen as an antigen.
  • a complex prepared using an antigen as an antigen may be used in the method of the present invention.
  • an antibody against a modified nucleobase prepared as described below may be used.
  • a polyclonal antibody against a modified nucleobase is used about 2 to 4 times every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in an animal together with a commercially available adjuvant (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) using the above complex as an antigen. It is obtained by collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum.
  • adjuvant eg, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, cows, guinea pigs, and hamsters.
  • a monoclonal antibody against the modified nucleobase can be produced, for example, by a cell fusion method.
  • the above complex is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected about 3 days after the final administration, and white blood cells are collected.
  • the leukocytes and myeloma cells eg, NS-1) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor.
  • Examples of cell fusion include a PEG method and a voltage pulse method.
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
  • the monoclonal antibody may be any isotype such as IgG, IgM, IgA, and IgE.
  • monoclonal antibody production methods include phage display (Ulman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1184-89 (1993)), ADLib system (International Publication No. 2004 / Since in vitro methods such as No. 016444) are also known, such methods may be used for the production of antibodies against modified nucleobases.
  • the antibody against the modified nucleobase may be used by being immobilized on a solid phase.
  • the solid phase include particles (eg, magnetic particles), membranes (eg, nitrocellulose membrane), supports such as glass, plastic and metal, containers such as plates (eg, multiwell plates), and devices. It is done.
  • the antibody may also be provided in a form impregnated in a medium such as filter paper.
  • the antibody against the modified nucleobase may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance examples include enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin), fluorescent substances or proteins (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green) Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent substances (eg, luciferin, aequorin), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I).
  • enzymes eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase
  • affinity substances eg, streptavidin, biotin
  • fluorescent substances or proteins eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent substances (eg, luci
  • the measurement of the modified nucleobase by the antibody against the modified nucleobase is performed qualitatively or quantitatively, and the presence or amount of the modified nucleobase can be evaluated.
  • the measurement of the modified nucleobase is intended not only to measure the modified nucleobase itself but also to measure the target nucleic acid containing the modified nucleobase.
  • the determination of the presence or absence of a modified nucleobase may be performed as follows: (2-1) measuring the signal value by assaying with the antibody against the modified nucleobase in the solution obtained in the above step (1); (2-2) Measuring a background value by assaying with an antibody against the modified nucleobase in a solution that does not contain the target nucleic acid containing the modified nucleobase and contains the capture probe and the solid phase probe; And (2-3) comparing the signal value with the background value to evaluate the presence or absence of modified nucleobases.
  • the signal value and the background value are values measured using a label bound to an antibody against the modified nucleobase or a secondary antibody (when a secondary antibody is used) (eg, absorbance, Fluorescence, color development, and radioactivity).
  • the measurement of the amount of the modified nucleobase may be performed together with the measurement of the background value, for example. Specifically, it may be done by: (2-1 ′) measuring the signal value by assaying with an antibody against the modified nucleobase in the solution obtained in the above step (1); (2-2 ') Measuring a background value by assaying with an antibody against a modified nucleobase in a solution containing no target nucleic acid containing a modified nucleobase and containing a capture probe and a solid phase probe. ; (2-3 ′) correcting the signal value with the background value to obtain a corrected signal value; and (2-4 ′) evaluating the amount of modified nucleobase based on the corrected signal value.
  • the amount of modified nucleobase may be measured using a standard. Specifically, it may be done by: (2-1 ′′) measuring the signal value by assaying with an antibody against the modified nucleobase in the solution obtained in the above step (1); (2-2 ′′) A target nucleic acid containing a modified nucleobase (standard) and a solution containing a capture probe and a solid phase probe are assayed using an antibody against the modified nucleobase, and a calibration value is measured. And (2-3 ′′) assessing the amount of modified nucleobases by comparing signal values to calibration values. The measurement using the standard may be used in combination with the measurement of the background value.
  • the methods of the invention may be performed by ELISA.
  • the method of the invention by ELISA may be performed as follows: (I) A nucleic acid sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase, a capture probe and a solid phase probe labeled with a first affinity substance are incubated in a solution, and the target nucleic acid, the capture probe and the solid phase Forming a hybrid composed of probes; (Ii) immobilizing the hybrid to a solid phase treated with a second affinity substance; (Iii) reacting a primary antibody against the modified nucleobase with a hybrid immobilized on a solid phase to obtain a primary complex of the primary antibody and the hybrid; (Iv) reacting a secondary antibody labeled with a labeling substance with the primary complex to obtain a secondary complex of the secondary antibody and the primary antibody; and (v) 2 in the secondary
  • the first affinity substance and the second affinity substance are Used in combination with affinity (eg, combination of biotin and streptavidin).
  • affinity eg, combination of biotin and streptavidin.
  • obtaining a solid phase probe immobilized on a solid phase eg, adding a solid phase probe labeled with a first affinity substance to a solid phase treated with a second affinity substance
  • the method of the present invention may comprise washing the solid phase prior to step (iii).
  • the secondary antibody may be an antibody that recognizes only the primary antibody (eg, an antibody that binds to the constant region of the primary antibody), but both the primary antibody and the primary complex in the secondary complex. May be recognized.
  • the methods of the invention involving (i)-(v) can also be performed according to the methodology described in detail herein.
  • the present invention also provides a kit for measuring a modified nucleobase.
  • the kit of the present invention includes, for example: (I) a capture probe; (II) a solid phase probe; and (III) an antibody against the modified nucleobase.
  • the antibodies for the capture probe, solid phase probe and modified nucleobase are as described above.
  • the solid phase probe may be labeled with an affinity substance
  • the antibody against the modified nucleobase may be labeled with a labeling substance.
  • the kit of the present invention comprises an affinity substance, a labeling substance, a secondary antibody, a detection reagent for the secondary antibody (eg, a substrate for the enzyme when the secondary antibody is labeled with an enzyme), a solid phase, etc. It may further contain the components as described above.
  • the solid phase may be treated with an affinity substance.
  • the kit of the present invention may also contain a modified nucleobase preparation or a target nucleic acid preparation containing the modified nucleobase as a solution or as a
  • the kit of the present invention includes each component in an isolated form or a mixed form.
  • each component may be provided in a form accommodated in a different container (eg, tube, plate).
  • the capture probe and the solid phase probe are mixed.
  • the kit of the present invention may be provided in the form of a device. Specifically, all of the components may be provided in a form housed in the device. Alternatively, some of the components may be provided in a form housed in the device, and the rest may be provided in a form that is not housed in the device (eg, a form housed in a different container). In this case, components that are not contained in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • Example 1 Examination of solid phase probe The influence of the solid phase probe on the background value of the detection signal was examined.
  • the nucleotide sequence of the solid phase probe (DNA) is as shown in Table 5, and those artificially synthesized by Hokkaido System Saens were used.
  • a solid phase probe was dissolved in 100 ⁇ L of hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.1% SDS), and then added to a streptavidin-coated plate (manufactured by Thermo Scientific) at 37 ° C. By reacting for 30 minutes, the solid phase probe was immobilized on the streptavidin plate. Washed twice with 300 ⁇ L of PBS-T, and 500 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Millipore, Clone33D3.
  • This antibody is not limited to 5-methylcytosine but also the main chain structure of DNA (eg, deoxyribose moiety and 50 ⁇ L of an antibody that recognizes at least a part of a structure composed of repeating units of a phosphate moiety) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 3 times with 300 ⁇ L PBS-T, 50 ⁇ L of 500 ng / mL peroxidase-labeled anti-IgG antibody (Thermo Scientific) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • DNA eg, deoxyribose moiety and 50 ⁇ L of an antibody that recognizes at least a part of a structure composed of repeating units of a phosphate moiety
  • Example 2 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (1)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-TTGCCGCGCGTC [C] GTCCTGTTGAACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) for capturing the target nucleic acid Is 5'-GAAGTCCAACAGGACGACGCCCGCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • nucleotide sequence of solid phase probe (DNA) is 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • the capture probe When the capture probe is hybridized with the target nucleic acid and the solid phase probe, an unpaired portion is formed at the modified nucleobase [C] in the double-stranded structure portion composed of the target nucleic acid and the capture probe. Designed.
  • the measurement of the modified nucleobase using the solid phase probe and the capture probe was performed as follows. First, 5 pmol of a solid phase probe was dissolved in 100 ⁇ L of PBS buffer, and then added to a streptavidin-coated plate (Thermo Scientific), and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. A solid phase probe was immobilized on the surface.
  • the immobilized solid phase probe nucleic acid was washed twice with 300 ⁇ L of PBS-T, and a target nucleic acid (1-pmol, 0.1-pmol) containing 5-methylcytosine in hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.1% SDS) was obtained.
  • the concentration of the target nucleic acid is 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, or 0.01 nM, respectively
  • the concentration of the solid phase probe is theoretically 50 nM or less (50 nM assuming that the total amount of the solid phase probe used is immobilized on the solid phase), and the reaction is performed at 60 ° C. for 2 hours. Subsequently, the reaction is carried out at 37 ° C. for 30 minutes to hybridize the target nucleic acid, the capture probe, and the solid phase probe. It was allowed to form.
  • Example 3 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (2)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) is 5'-GAAGTCAACAGGACGACGCCCGCGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • Example 4 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (3) 5'-GAAGTCAACAGGACGACGCCCGCCGCAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 '(SEQ ID NO: 16) as the nucleotide sequence of the capture probe (DNA), and 5'-GGGGGGGGGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 17, 5 'end is biotin-labeled as the nucleotide sequence of the solid phase probe (DNA) ) was used in the same manner as in Example 2, except that As a result, it was confirmed that the combined use of the solid phase probe and the capture probe suppressed the background value and improved the S / N value as compared with the single use of the capture probe (Reference Example 1) (Table 7). 3-5). In addition, the solid-phase probe and the capture probe used in this example had lower background value suppression efficiency than those in Examples 2 and 3. This indicates that a solid phase probe with a low content of guanine residues is more appropriate.
  • Reference Example 1 Use of capture probe in measurement of modified nucleobases (1)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-TTGCCGCGCGTC [C] GTCCTGTTGAACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11, [C] is 5-methylcytosine), and the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) is 5′-GAAGTCACAGAGCGACGCCGCGCAA-3 '(SEQ ID NO: 18, 5' ends are labeled with biotin), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • the measurement of the modified nucleobase using the capture probe was performed as follows. First, a hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.
  • Example 5 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (4)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-AATCAG [C] GGGAGCTCTTTCTTTGCGCGGGCGTCCGTCCTGTTGACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 19, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) for capturing the target nucleic acid Is 5'-GAAGTCAACAGGACGGACGCCGCGCAAAAAAAAAAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • the nucleotide sequence of the solid phase probe (DNA) is 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
  • the artificially synthesized products were used.
  • the capture probe was designed such that the modified nucleobase [C] is present in the single-stranded structure portion of the hybrid when a hybrid with the target nucleic acid and the solid phase probe is formed.
  • Measurement of modified nucleobases using capture probes and solid phase probes uses different target nucleic acids in different amounts (10 pmol, 1 pmol, 0.1 pmol or 0.01 pmol) and uses different capture probes and different solid phase probes.
  • Reference Example 2 Use of capture probe in measurement of modified nucleobases
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-AATCAG [C] GGGAGCTCTTTCTTTGCGCGGGCGTCCGTCCTGTTGACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 19, [C] is 5-methylcytosine), the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) for capturing the target nucleic acid Is 5′-GAAGTCAACAGGACGGACGCCGCCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 18, 5 ′ end is biotin-labeled), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • the measurement of the modified nucleobase using the capture probe was performed as follows.
  • a target nucleic acid (10 pmol, 1 pmol, 0.1 pmol or 0.01 pmol) containing 5-methylcytosine and a capture probe (5 pmol) were dissolved in 100 ⁇ L of hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.1% SDS). Thereafter, the reaction was performed at 60 ° C. for 2 hours to form a hybrid of the target nucleic acid and the capture probe. A solution not containing the target nucleic acid was also prepared and the same operation was performed. 100 ⁇ L of the solution after the hybridization reaction was added to a streptavidin-coated plate (Thermo Scientific) and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to immobilize the nucleic acid hybrid on the streptavidin plate.
  • streptavidin-coated plate Thermo Scientific
  • Example 6 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (5)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GGAGCTCTCCCT [C] GGGA [C] GGTGGCAGCCCTGAGGTGTCCTGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 20, [C] is 5-methylcytosine), for capturing the target nucleic acid
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) is 5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAGGACCACTCGGAGCTGCCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
  • the nucleotide sequence of the solid phase probe (DNA) is 5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • the capture probe was designed such that the modified nucleobase [C] is present in the single-stranded structure portion of the hybrid when a hybrid with the target nucleic acid and the solid phase probe is formed.
  • the measurement of the modified nucleobase using the capture probe and the solid phase probe was performed as follows. First, 5 pmol of a solid phase probe was dissolved in 100 ⁇ L of PBS buffer, and then added to a streptavidin-coated plate (Thermo Scientific), and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. A solid phase probe was immobilized on the surface.
  • the detection sensitivity is amplified by the combined use of a capture probe and a solid phase probe in a low concentration range (eg, 0 to 0.01 pmol) of a target nucleic acid containing a plurality of modified nucleobases.
  • Reference Example 3 Use of capture probe in measurement of modified nucleobases (3)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GGAGCTCTCCCT [C] GGGA [C] GGTGGCAGCCCTGAGGTGTCCTGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 20, [C] is 5-methylcytosine), for capturing the target nucleic acid
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) was 5′-TGCAGGACCACTCGAGGCTGCCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 22, 5 ′ end was labeled with biotin), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • target nucleic acid (1 pmol, 0.1 pmol, 0.01 pmol or 0.001 pmol) containing 5-methylcytosine and a capture probe (5 pmol) are dissolved in 100 ⁇ L of hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.3% Tween 20). Then, the reaction was carried out at 60 ° C. for 2 hours to form a hybrid of the target nucleic acid and the capture probe. A solution not containing the target nucleic acid was also prepared and the same operation was performed. 100 ⁇ L of the solution after the hybridization reaction was added to a streptavidin-coated plate (Thermo Scientific) and reacted at 37 ° C.
  • streptavidin-coated plate Thermo Scientific
  • Example 7 Use of solid phase and capture probes in the measurement of modified nucleobases (6)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GCAC [C] GTTTG [C] GACTTGGTGAGTGTCTGGGT [C] GCCT [C] GCCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 23, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) for capturing the target nucleic acid is 5′-AAAAAAAAAAAAAAAAACCCACAACTCACCCAAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
  • the nucleotide sequence of the solid phase probe (DNA) is 5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  • the capture probe was designed such that the modified nucleobase [C] is present in the single-stranded structure portion of the hybrid when a hybrid with the target nucleic acid and the solid phase probe is formed.
  • the measurement of the modified nucleobase using the capture probe and the solid phase probe was performed in the same manner as in Example 6 except that a different target nucleic acid and a different capture probe were used.
  • a target nucleic acid different from Example 2 Example 5 and Example 6 and a different capture probe were used, a decrease in the background value, And the improvement of S / N value was recognized (Table 10, FIG. 10, 11).
  • the combined use of a capture probe and a solid phase probe is between the target nucleic acid concentration range (0.001 to 1 pmol) and the detection signal value.
  • the use of only the capture probe showed almost no change in the detection signal value in the low concentration range (0 to 0.01 pmol) of the target nucleic acid ( FIG. 11).
  • the detection sensitivity is amplified by the combined use of a capture probe and a solid phase probe in a low concentration range (eg, 0 to 0.01 pmol) of a target nucleic acid containing a plurality of modified nucleobases.
  • Reference Example 4 Use of capture probe in measurement of modified nucleobases (4)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GCAC [C] GTTTG [C] GACTTGGTGAGTGTCTGGGT [C] GCCT [C] GCCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 23, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (DNA) for capturing the target nucleic acid is 5′-ACCCAGACACTCACCCAAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 25, 5 ′ end is biotin-labeled), and is artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. Each was used.
  • the measurement of the modified nucleobase using the capture probe was performed in the same manner as in Reference Example 3 except that a different target nucleic acid and a different capture probe were used. The results were as shown in Table 10 and FIGS.
  • Example 8 Use of heterologous nucleic acid probe in the measurement system of the present invention
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5'-TTGCCGGGCGTC [C] GTCCTGTTGAACTTC-3 '(SEQ ID NO: 11, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe (heterologous nucleic acid probe: 2′-O-methylated RNA + DNA) for capturing the target nucleic acid is 5′-GAAGUCAACAGGACGGAGCCCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 26, 1st to 26th on the 5 ′ end side)
  • the main chain of nucleotide residues is 2′-O-methylated RNA, and the main chain of nucleotide residues 27 to 48 is DNA).
  • the nucleotide sequence of the solid phase probe is 5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT- '(SEQ ID NO: 1, 5' end biotin-labeled), and artificially synthesized ones were used respectively by Hokkaido System Science Co..
  • an unpaired portion is formed at the modified nucleobase [C] in the double-stranded structure portion composed of the target nucleic acid and the capture probe.
  • Measurement of the modified nucleobase using a heterologous nucleic acid probe (Experiment 1) was performed in the same manner as in Example 6 except that a different target nucleic acid and a different capture probe were used.
  • Experiment 2 uses a homologous nucleic acid probe (5′-GAAGTCAACAGAGCGACGCCGCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA) whose main chain is DNA (in contrast to the target nucleic acid) instead of the capture probe whose main chain is 2′-O-methylated RNA used in Experiment 1. -3 ′ (SEQ ID NO: 12)) was used in the same manner as in Experiment 1.
  • Experiment 2 is similar to Example 2 from the viewpoint of the types of target nucleic acid (DNA), capture probe (DNA) and solid phase probe (DNA) used.
  • the absorbance measured in Experiment 1 was divided by the absorbance measured in Experiment 2 (same species) to obtain an OD450 ratio (different species / same species).
  • the ratio of background values was determined by measuring the absorbance (background value (heterogeneous)) measured in the absence of a target nucleic acid containing a modified nucleobase (ie, 0 pmol) in Experiment 1.
  • 2 corresponds to the value obtained by dividing by the absorbance (background value (same type)) measured in the absence of the target nucleic acid containing the modified nucleobase (ie, 0 pmol).
  • S / N (heterogeneous) and S / N (homogeneous) were calculated from the absorbance measured in Experiment 1 and Experiment 2, respectively, and then S / N (heterogeneous) was divided by S / N (similar). , S / N (different / same species) was determined.
  • S represents the absorbance measured in the presence of a target nucleic acid (1 ppmol, 1 pmol, 0.1 pmol or 0.01 pmol) containing a modified nucleobase.
  • N represents the absorbance (background value) measured in the absence of the target nucleic acid containing the modified nucleobase (ie, 0 pmol).
  • the results are shown in Table 11.
  • the heterologous nucleic acid probe suppressed the background value compared to the homologous nucleic acid probe (Table 11).
  • the amount of the target nucleic acid is smaller (for example, 0.1 pmol or less, particularly 0.01 pmol or less), in other words, when the concentration of the target nucleic acid in the solution is lower (for example, 1 nM or less, particularly 0.1 nM or less).
  • the heterologous nucleic acid probe suppressed the detection signal value more than the homologous nucleic acid probe.
  • the heterologous nucleic acid probe In the range of the amount of the target nucleic acid used, the heterologous nucleic acid probe always showed an excellent effect on the suppression of the detection signal value as compared with the same type nucleic acid probe.
  • the S / N value measured using the heterologous nucleic acid probe was equivalent to the S / N value measured using the same kind of nucleic acid probe.
  • the heterologous nucleic acid probe improved the S / N value more than the homologous nucleic acid probe. That is, with respect to the S / N value, the heterologous nucleic acid probe always showed the same or better effect than the homologous nucleic acid probe. From the above, it was shown that the use of a heterologous nucleic acid probe in the method of the present invention is beneficial.
  • the method and kit of the present invention are useful for measuring modified nucleobases.

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Abstract

　本発明は、修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系の構築のために、検出シグナルのバックグラウンド値を抑制する技術を提供する。具体的には、本発明は、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること、ならびに得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定することを含む、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明はまた、捕捉プローブ、固相プローブおよび修飾核酸塩基に対する抗体を含む、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。

Description

固相プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット
　本発明は、修飾核酸塩基の測定方法およびキットに関する。
　核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出において、ビオチン等の物質が人工的に導入された核酸塩基を、抗体を利用したイムノアッセイで検出する技術が、これまでに多数報告されている。また、天然に存在する修飾核酸塩基（例、メチルシトシン、ヒドロキシルメチルシトシン）をイムノアッセイで検出する技術も報告されている（特許文献１、及び非特許文献１、２）。
特開２０１２－２３００１９号公報
Ｐｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６） Ｋｕｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２０１２，８４，７５３３－７５３８
　本発明者らは、上記のような修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系を構築するにあたり、修飾核酸塩基に対する抗体の核酸プローブに対する非特異的な結合により、検出シグナルのバックグラウンド値が高くなるという課題が存在することを見出した。したがって、高感度のイムノアッセイ系の構築のためには、バックグラウンド値を抑制する技術の開発が必要であった。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定において、２種のプローブ（捕捉プローブおよび固相プローブ）を併用することによりバックグランド値を抑制することなどに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）当該ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび該固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕捕捉プローブまたは固相プローブの一方または双方が、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕捕捉プローブが、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、〔６〕の方法。
〔８〕固相プローブがポリＡまたはポリＴである、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、〔２〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、〔２〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
　本発明の方法およびキットによれば、検出シグナルのバックグランド値の低減により、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できる。
図１は、本発明の方法による標的核酸中の修飾核酸塩基の測定概要の一例を示す図である。Ｒ－Ｎ：修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｎ：核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｒ：核酸塩基が有する置換基。 図２は、固相プローブ１～１０および修飾核酸塩基に対する抗体の存在下で計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図３は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ、０．００１ｐｍｏｌ、０．００１ｐｍｏｌ、０．１ｍｏｌまたは１ｐｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例２～４；－：参考例１）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示す図である（実施例２～４および参考例１）。 図４は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例２～４；－：参考例１）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図５は、修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である（実施例２～４および参考例１）。Ｓ／Ｎにおいて、Ｓは、修飾核酸塩基を含む標的核酸（１ｐｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示し、Ｎは、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す。 図６は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例５；－：参考例２）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図７は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、１ｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例５；－：参考例２）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示す図である。 図８は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例６；－：参考例３）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図９は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、１ｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例６；－：参考例３）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示す図である。 図１０は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例７；－：参考例４）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図１１は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（０ｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、１ｍｏｌまたは１０ｐｍｏｌ）、捕捉プローブ（＋）、固相プローブ（＋：実施例７；－：参考例４）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示す図である。
　本発明は、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
　核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有するサンプル、または当該標的核酸を含有すると疑われるサンプルである。核酸サンプルはまた、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含有する可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。このようなサンプルは、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。
　標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、ＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域（例、転写調節領域）である。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、捕捉プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸が含む修飾核酸塩基の数は、１個以上（例、１～１００個、１～２０個、１～１０個または１～５個）であれば特に限定されない。
　本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４～６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
　修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５－メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５－ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５－カルボキシルシトシン）である。より好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５－メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５－ヒドロキシメチルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
　本発明で用いられる捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとハイブリダイズし得る核酸分子である。捕捉プローブは、例えば、第１の領域で標的核酸とハイブリダイズし得、かつ第２の領域で固相プローブとハイブリダイズし得る。捕捉プローブは、標的核酸に対して同種および／または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を、主鎖構造の全体として捕捉プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として捕捉プローブが有することを意味する。したがって、捕捉プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、捕捉プローブは、標的核酸に対して異種の核酸を含んでいてもよい。
　捕捉プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’－Ｏ－アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’－Ｏ－アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１～Ｃ６アルキル化のＣ１～Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１～６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル）、ブチル基（例、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡプローブである。
　捕捉プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、捕捉プローブの長さ）は、標的核酸および固相プローブとハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば２０個以上、好ましくは２５個以上、より好ましくは３０個以上であってもよい。捕捉プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下または５０個以下であってもよい。例えば、捕捉プローブにおいて標的核酸とハイブリダイズし得る第１の領域中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。第１の領域中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。捕捉プローブにおいて固相プローブとハイブリダイズし得る第２の領域は、同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成されていてもよく、異なる種類の２以上のヌクレオチド残基から構成されていてもよい。第２の領域が同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成され、かつ、捕捉プローブがＤＮＡプローブである場合、第２の領域は、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、グアニンまたはチミンのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＧまたはポリＴ領域であり、より好ましくは、アデニンまたはチミンの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＴ領域である。第２の領域が同じ種類のヌクレオチド残基のみから構成され、かつ、捕捉プローブがＲＮＡプローブである場合、第２の領域は、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、グアニンまたはウラシルのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＧまたはポリＵ領域であり、より好ましくは、アデニンまたはウラシルの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＵ領域である。好ましくは、第２の領域は、ポリＡまたはポリＴ領域である。このような捕捉プローブは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。捕捉プローブは、遊離の形態で用いられる。
　本発明において、固相プローブとは、捕捉プローブとハイブリダイズし得、かつ固相に固定可能なプローブをいう。固相プローブは、工程（１）において、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、固相プローブは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（固相プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（固相プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、固相プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。
　固相プローブは、標的核酸に対して同種または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を固相プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を固相プローブが有することを意味する。したがって、固相プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の固相プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の固相プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の固相プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の固相プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、固相プローブは、標的核酸に対して異種の核酸から構成されてもよい。
　固相プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブが挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、捕捉プローブに関して上述したものが挙げられる。
　固相プローブを構成するヌクレオチド残基の総数（即ち、固相プローブの長さ）は、例えば、捕捉プローブとハイブリダイズし、かつ固相プローブが固定される固相からの標的核酸の距離を確保するのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。本発明では、固相からの標的核酸（即ち、本発明で検出される修飾核酸塩基）の距離を確保することで、修飾核酸塩基を高感度に検出することができる。固相プローブを構成するヌクレオチドの総数はまた、例えば１００個以下、８０個以下、７０個以下または６０個以下であってもよい。このような固相プローブは、例えば、当該分野で公知のヌクレオチド重合法により調製できる。
　固相プローブは、ホモポリヌクレオチドまたはヘテロポリヌクレオチドである。
　ホモポリヌクレオチドとは、同種のヌクレオチド残基のみから構成されるポリヌクレオチドをいう。ホモポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＴであり、より好ましくは、アデニンまたはチミンの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＴである。ホモポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ホモポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルのいずれか一つのみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡ、ポリＣまたはポリＵであり、より好ましくは、アデニンまたはウラシルの一方のみを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリＡまたはポリＵである。好ましくは、ホモポリヌクレオチドは、ポリＡまたはポリＴである。
　ヘテロポリヌクレオチドとは、２以上の異種のヌクレオチド残基から構成されるポリヌクレオチドをいう。ヘテロポリヌクレオチドがＤＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはチミンを含むヌクレオチド残基から構成される。ヘテロポリヌクレオチドがＲＮＡプローブである場合、ヘテロポリヌクレオチドは、好ましくは、核酸塩基としてアデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成され、より好ましくは、アデニンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基から構成される。
　工程（１）において、インキュベートは、核酸サンプル中に標的核酸が含まれる場合に捕捉プローブ（遊離）、固相プローブ（遊離または後述する固相に固定）および核酸サンプル中の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応が可能である条件下で適切な溶液中で行われる。このような溶液としては、例えば、塩（例、クエン酸ナトリウム）およびその他の成分（例、界面活性剤）を含む緩衝液を用いることができる。ハイブリダイゼーション温度は、例えば１５～９５℃（好ましくは２５～６５℃）である。
　ここで、工程（１）についての表現「核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートする」とは、標的核酸（核酸サンプルが標的核酸を含有する場合）、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが最終的に形成されるように、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブが同時または時間差の様式においてインキュベートされることが意図される。
　したがって、上記表現は、具体的には、以下の態様を包含するものである：
（１－１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中で同時にインキュベートすること；
（１－２）核酸サンプルおよび捕捉プローブを先ずインキュベートし（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸および捕捉プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を固相プローブと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）；ならびに
（１－３）捕捉プローブおよび固相プローブを先ずインキュベートし（捕捉プローブおよび固相プローブから構成される中間ハイブリッドが形成される）、次いで、本インキュベーションにより得られた溶液を核酸サンプルと組み合わせてさらにインキュベートすること（核酸サンプルが標的核酸を含む場合、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される）。
　核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートしても、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成される目的のハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
　核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
　核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブが反応して、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
　本発明において、ハイブリッドは、標的核酸と捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造、ならびに捕捉プローブと固相プローブとの間のハイブリダイゼーションにより形成される捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造を有する、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体である。ハイブリッドの構造の例は、以下の表１－１～１－５に記載されるとおりである。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造は、標的核酸の全体領域または一部領域で形成されていてもよい。例えば、ハイブリッドは、標的核酸の一本鎖構造を５’末端領域または３’末端領域のいずれかに有していてもよく〔例、（ａ－１）～（ａ－５）、（ｂ－１）～（ｂ－５）〕、または標的核酸の全体領域において二本鎖構造を形成していてもよい〔例、（ｃ－１）～（ｃ－５）、（ｄ－１）～（ｄ－５）、（ｅ－１）～（ｅ－５）、（ｆ－１）～（ｆ－５）〕。固相プローブは、５’末端領域で捕捉プローブとハイブリダイズして二本鎖構造を形成していてもよく〔例、（ａ－１）～（ａ－２）、（ｃ－１）～（ｃ－２）、（ｅ－１）～（ｅ－２）、（ｂ－３）～（ｂ－５）、（ｄ－３）～（ｄ－５）、（ｆ－３）～（ｆ－５）〕、または３’末端領域で捕捉プローブとハイブリダイズして二本鎖構造を形成していてもよい〔例、（ａ－３）～（ａ－５）、（ｃ－３）～（ｃ－５）、（ｅ－３）～（ｅ－５）、（ｂ－１）～（ｂ－２）、（ｄ－１）～（ｄ－２）、（ｆ－１）～（ｆ－２）〕。一本鎖構造は、ハイブリッドを形成した標的核酸、捕捉プローブまたは固相プローブの５’末端および／または３’末端、または補足プローブの非末端において、１個以上のヌクレオチド残基の非ハイブリダイズ領域を有することにより形成される構造である。なお、（ａ－１）～（ｆ－５）では、標的核酸の５’末端領域および３’末端領域、捕捉プローブの５’末端領域および３’末端領域、ならびに固相プローブの５’末端領域および３’末端領域のうちの少なくとも三つの末端領域がハイブリダイズしている構造を提示した。しかし、ハイブリッドでは、このような三つの末端領域もまた必ずしもハイブリダイズする必要はなく、標的核酸の３’末端領域および捕捉プローブの５’末端領域の双方で一本鎖構造部分（即ち、非ハイブリダイズ領域）を有していてもよく、標的核酸の５’末端領域および捕捉の３’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよく、捕捉プローブの３’末端領域および固相プローブの５’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよく、捕捉プローブの５’末端領域および固相プローブの３’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ハイブリッドにおいて、標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数、ならびに捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造部分に対応する捕捉プローブおよび固相プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、二本鎖構造部分の長さ）は、それぞれ、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。このようなヌクレオチド残基の個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。捕捉プローブおよび固相プローブの二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は低いことが好ましい。
　ハイブリッドにおいて、一本鎖構造部分に対応する標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、各一本鎖構造部分の長さ）は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または５０個以上である。このような個数はまた、特に限定されないが、例えば、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下または１００個以下であってもよい。捕捉プローブおよび／または固相プローブは、このような一本鎖構造部分をハイブリッドにおいて５’末端領域または３’末端領域に形成するように設計されてもよい。
　一実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように設計されてもよい。修飾核酸塩基の不対部分は、抗体による修飾核酸塩基の検出を容易にするために導入され得る。このような不対部分の形成のためには、例えば、二本鎖構造部分において、標的核酸に対して完全には相補的ではないヌクレオチド配列を有する捕捉プローブを使用すればよい。
　ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの一例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して相補的なヌクレオチド残基を欠落する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に相補的な１個のヌクレオチド残基のみを欠落するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ－１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２～２０個、２～１０個または２～５個）の隣接ヌクレオチド残基を欠落するものであってもよい〔例、表２の（Ｉ－２）〕。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の不対部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。なお、このような核酸プローブについては、例えば、特許文献１および非特許文献２を参照のこと。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの別の例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して非相補的なヌクレオチド残基を有する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ’）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に非相補的な１個のヌクレオチド残基のみを有するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ’－１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２～２０個、２～１０個または２～５個）の隣接ヌクレオチド残基が非相補的なものであってもよい〔例、表２の（Ｉ’－２）〕。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　別の実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように設計されてもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）において、修飾核酸塩基は、５’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩ）〕、５’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩＩ）〕、３’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＶ）〕、または３’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（Ｖ）〕、あるいはこれらの２つ、３つまたは４つの組合せであってもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）が修飾核酸塩基をこのような様式で含むように、捕捉プローブが設計されてもよい。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の一本鎖構造部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。あるいは、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在し、かつ、上述したように、ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分がさらに形成されるように設計されてもよい。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明の方法は、核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。この場合、本発明の方法は、核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。捕捉プローブは、固体の形態、または溶液として、核酸サンプルに添加することができる。あるいは、本発明の方法は、固相に固定された溶液中の固相プローブに、核酸サンプルおよび捕捉プローブを同時または別々に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。
　修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルから上述したインキュベーション用溶液が調製される場合、溶液中の標的核酸の濃度は、本発明の方法により検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の標的核酸の濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。核酸サンプル中の標的核酸の濃度は不明であることも多いので標的核酸の厳密な濃度の設定は難しい場合もあるが、核酸サンプルの種類によっては、核酸サンプルに含有され得る標的核酸の濃度を経験的にある程度予測できることがあり、また、標的核酸の濃度が判明していることもある（例えば、標的核酸のサイズおよび／または濃度が別途測定されているものの、標的核酸中の修飾核酸塩基の有無および標的核酸中の修飾核酸塩基の含有率が不明な場合）ので、そのような場合には、上記のとおり標的核酸の濃度設定を試みてもよい。
　溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
　溶液中の固相プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、５ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、固相プローブを溶液に添加してもよい。
　好ましい実施形態では、標的核酸は、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸であってもよい。ここで、標的核酸に含まれる可能性がある修飾核酸塩基の個数は、２以上である限り特に限定されないが、例えば、２～３０個、２～２０個、２～１０個または２～５個（例、２、３、４もしくは５個）である。標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の個数が複数である場合、標的核酸と異種核酸プローブとのハイブリダイゼーションに用いられる溶液中の標的核酸が極めて低い濃度（例、０．０１ｎＭ以上）であっても、修飾核酸を高感度に測定できることが確認されている（実施例６、７）。したがって、本発明の方法では、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸とハイブリダイズするように設計された異種核酸プローブを用いることができる。測定すべき標的核酸中の修飾される可能性がある核酸塩基の個数が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
　修飾核酸塩基は、ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて測定される。測定に際しては、工程（１）で得られた溶液をそのまま用いてもよいが、抗体による修飾核酸塩基の測定により適した溶液において測定を行うため、別の溶液の添加および／または溶液の別の溶液への交換を行ってもよい。このような交換は、例えば、工程（１）で得られた溶液を固相に添加して、溶液中に含有され得るハイブリッドを固相に固定化し、次いで固相から溶液を除去し、必要に応じて洗浄液で洗浄した後、別の溶液（例、修飾核酸塩基に対する抗体を含有する溶液）を添加することにより行うことができる。測定に用いられる溶液は、抗原・抗体反応に適切な溶液である限り特に限定されない。
　測定は、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はさらに、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイにおいて１次抗体として用いられるものであってもよく、この場合、２次抗体が併用される。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド（修飾核酸塩基および２’－デオキシリボースもしくはリボースから構成される構造単位）、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチド（修飾核酸塩基、２’－デオキシリボースもしくはリボースおよびホスフェートから構成される構造単位）、あるいは修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチド（例、２～５個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド）に対する親和性を有していればよい。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、１）２’－デオキシ修飾アデノシン、２’－デオキシ修飾グアノシン、２’－デオキシ修飾シチジンおよび２’－デオキシ修飾チミジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオシドに対する抗体、２）２’－デオキシ修飾アデノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシ修飾グアノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシ修飾シチジン　５’－ホスフェートおよび２’－デオキシ修飾チミジン　５’－ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３）修飾核酸塩基を有する上記デオキシリボヌクレオチドを含む２以上のデオキシリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、例えば、１’）修飾アデノシン、修飾グアノシン、修飾シチジンおよび修飾ウリジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドに対する抗体、２’）修飾アデノシン　５’－ホスフェート、修飾グアノシン　５’－ホスフェート、修飾シチジン　５’－ホスフェートおよび修飾ウリジン　５’－ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３’）修飾核酸塩基を有する上記リボヌクレオチドを含む２以上のリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、例えば、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド、修飾核酸塩基を有するヌクレオチド、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチドと、キャリアタンパク質（例、ＢＳＡ、ＫＬＨ）との複合体を、抗原として用いて調製されたものを用いることができる。例えば、このような複合体を用いて調製された修飾核酸塩基に対する種々の抗体が市販されているので、本発明の方法では、市販抗体を用いてもよい。本発明の方法では、修飾核酸塩基に対する抗体はまた、例えば、下記のとおり調製されたものを用いてもよい。
　例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２～３週間おきに２～４回程度投与し、最終免疫から約３～約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
　修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに２～４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ－１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４－８９（１９９３））、ＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ　ｖｉｔｒｏ法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、固相に固定化されて用いられてもよい。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチックおよび金属等の支持体、プレート（例、マルチウェルプレート）等の容器、ならびにデバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法で２次抗体が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識されていてもよい。
　修飾核酸塩基に対する抗体による修飾核酸塩基の測定は、定性的または定量的に行われ、修飾核酸塩基の有無または量を評価することができる。なお、本発明において、修飾核酸塩基の測定とは、修飾核酸塩基自体の測定のみならず、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定もまた意図される。
　例えば、修飾核酸塩基の有無の測定は、以下により行われてもよい：
（２－１）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２－３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
　修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
　また、修飾核酸塩基の量の測定は、例えば、バックグランド値の測定とともに行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２－１’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２－３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２－４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
　あるいは、修飾核酸塩基の量の測定は、標品を用いて行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２－１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつ捕捉プローブおよび固相プローブを含有する溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２－３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
　標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
　特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡにより行われてもよい。例えば、核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、ＥＬＩＳＡによる本発明の方法は、以下により行われてもよい：
（ｉ）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび第１の親和性物質で標識された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ）ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、固相に固定されたハイブリッドと反応させて、１次抗体とハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成されたハイブリッド（換言すれば、修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること
　第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の代わりに、（ｉ’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相に固定された固相プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸、捕捉プローブおよび当該固相プローブから構成されるハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された固相プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された固相プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ）～（ｖ）を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
　本発明はまた、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下を含む：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）固相プローブ；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
　捕捉プローブ、固相プローブおよび修飾核酸塩基に対する抗体は、上述したとおりである。例えば、固相プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
　本発明のキットは、互いに隔離された形態または混合された形態にて各構成成分を含む。例えば、本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、例えば、捕捉プローブおよび固相プローブは、混合された形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：固相プローブの検討
　固相プローブが検出シグナルのバックグランド値に与える影響を検討した。
　固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は表５に示したとおりであり、北海道システムサエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３。本抗体は、５－メチルシトシンのみならず、ＤＮＡの主鎖構造（例、デオキシリボース部分およびリン酸部分の繰り返し単位から構成される構造）の少なくとも一部を認識する抗体である）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、固相プローブ配列により検出シグナルのバックグラウンド値が大きく変化することが確認された（表６、図２）。表６の結果より、固相プローブとしては、Ａおよび／またはＴ（もしくはＵ）を含むもの（換言すれば、ＣおよびＧを含まないもの）が好ましいと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例２：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（１）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１１、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１３、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
　固相プローブおよび捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。固定化された固相プローブ核酸を３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中に５－メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え（核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０．０１ｎＭであり、捕捉プローブの濃度は５０ｎＭであり、固相プローブの濃度は理論上５０ｎＭ以下（用いた全量の固相プローブが固相に固定されたと仮定した場合、５０ｎＭ）である）、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３～５）。
実施例３：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（２）
　捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１５、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
　その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３～５）。
実施例４：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（３）
　捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号１６）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列として５’－ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ－３’（配列番号１７、５’末端はビオチン標識）を使用した以外は、実施例２と同様の方法で試験した。
　その結果、固相プローブおよび捕捉プローブの併用は、捕捉プローブの単独使用（参考例１）に比し、バックグラント値を抑制し、かつＳ／Ｎ値を向上させることが確認された（表７、図３～５）。また、本実施例で用いた固相プローブおよび捕捉プローブは、実施例２及び３のものに比し、バックグランド値の抑制効率が低かった。このことは、グアニン残基の含量が少ない固相プローブがより適切であることを示す。
参考例１：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（１）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１１、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ－３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
　捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５－メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌ、または０．００１ｐｍｏｌ）と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と標的核酸を捕捉するためのプローブ核酸のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　結果は、表７、図３～５に示すとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例５：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（４）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１９、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１２）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、ならびに異なる捕捉プローブおよび異なる固相プローブを用いたこと以外は、実施例２と同様の方法で行った。
　その結果、標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように、捕捉プローブを設計した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表８、図６、７）。
参考例２：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（２）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１９、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ－３’（配列番号１８、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
　捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５－メチルシトシンを含む標的核酸（１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５０μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で７分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　結果は、表８、図６、７に示すとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例６：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（５）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号２０、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ－３’（配列番号２１）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５ｐｍｏｌの固相プローブをＰＢＳ緩衝液１００μＬ中に溶解させた後、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に全量加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に固相プローブを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、ハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）中に５－メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）を含む溶液を１００μＬ加え、６０℃で２時間反応させ、続いて３７℃で３０分反応させることで、標的核酸、捕捉プローブ、および固相プローブ３者のハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２および実施例５と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表９、図８、９）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１～１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０～０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図９）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０～０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
参考例３：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（３）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号２０、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ－３’（配列番号２２、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
　捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５－メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、０．０１ｐｍｏｌまたは０．００１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた後、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上に核酸のハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　結果は、表９、図８、９に示すとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例７：修飾核酸塩基の測定における固相プローブおよび捕捉プローブの使用（６）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ－３’（配列番号２３、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ－３’（配列番号２４）、固相プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
　その結果、捕捉プローブおよび固相プローブを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例２、実施例５および実施例６と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１０、図１０、１１）。興味深いことに、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸を用いた本試験では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用は、標的核酸の濃度範囲（０．００１～１ｐｍｏｌ）と検出シグナル値との間でより直線的な関係（傾きがほぼ一定）を示したが、捕捉プローブのみの使用は、標的核酸の低い濃度範囲（０～０．０１ｐｍｏｌ）において、検出シグナル値に殆ど変化は認められなかった（図１１）。このことは、複数の修飾核酸塩基を含む標的核酸の低い濃度範囲（例、０～０．０１ｐｍｏｌ）では、捕捉プローブおよび固相プローブの併用により、検出感度が増幅されることを示唆する。
参考例４：修飾核酸塩基の測定における捕捉プローブの使用（４）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ－３’（配列番号２３、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ－３’（配列番号２５、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。
　捕捉プローブを用いた修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、参考例３と同様の方法で行った。
　結果は、表１０、図１０、１１に示すとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例８：本発明の測定系における異種核酸プローブの使用
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１１、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ（異種核酸プローブ：２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ＋ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＵＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号２６、５’末端側の１番目から２６番目までのヌクレオチド残基の主鎖は２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡであり、２７番目から４８番目までのヌクレオチド残基の主鎖はＤＮＡである）、固相プローブのヌクレオチド配列は５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸および固相プローブとのハイブリッドが形成されたとき、標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。
　異種核酸プローブを用いる修飾核酸塩基の測定（実験１）は、異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で行った。
　次いで、同種核酸プローブを用いて修飾核酸塩基の測定（実験２）を同様に行った。実験２は、実験１で使用した一部の主鎖が２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡである捕捉プローブの代わりに、主鎖がＤＮＡである（標的核酸に対する）同種核酸プローブ（５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１２））を用いた以外は、実験１と同様の方法で試験した。なお、実験２は、用いた標的核酸（ＤＮＡ）、捕捉プローブ（ＤＮＡ）および固相プローブ（ＤＮＡ）の種類の観点から、実施例２に類する。
　実験１で測定された吸光度（異種）を、実験２で測定された吸光度（同種）で除算して、ＯＤ４５０比（異種／同種）を求めた。ここで、バックグランド値の比（異種／同種）は、実験１において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（異種））を、実験２において、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値（同種））で除算して求めた値に対応する。
　また、実験１および実験２で測定された吸光度からＳ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）をそれぞれ算出し、次いで、Ｓ／Ｎ（異種）をＳ／Ｎ（同種）で除算して、Ｓ／Ｎ（異種／同種）を求めた。なお、Ｓ／Ｎ（異種）およびＳ／Ｎ（同種）について、Ｓは、修飾核酸塩基を含む標的核酸（１ｐｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌまたは０．０１ｐｍｏｌ）の存在下で測定された吸光度を表し、Ｎは、修飾核酸塩基を含む標的核酸の不在下（即ち、０ｐｍｏｌ）で測定された吸光度（バックグランド値）を表す。結果を表１１に示す。
　その結果、バックグランド値の比（異種／同種）より明らかであるように、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、バックグランド値を抑制した（表１１）。また、標的核酸の量がより少ないとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以下、特に０．０１ｐｍｏｌ以下）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度がより低いとき（例えば１ｎＭ以下、特に０．１ｎＭ以下）、ＯＤ４５０比（異種／同種）の低下が認められた（表１１）。さらに、標的核酸の量がより多いとき（例えば０．１ｐｍｏｌ以上、特に１ｐｍｏｌ以上）、換言すれば、溶液中の標的核酸の濃度が高いとき（例えば１ｎＭ以上、特に１０ｎＭ以上）、Ｓ／Ｎ比（異種／同種）の向上が認められた（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　上記結果を説明すると以下のとおりである。
１）標的核酸が存在しないか、または標的核酸の濃度が少ない場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、検出シグナルの値をより抑制した。使用した標的核酸の量の範囲では、検出シグナル値の抑制に関し、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に優れた効果を奏した。
２）使用した標的核酸の量が少ない場合、異種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値は、同種核酸プローブを用いて計測されたＳ／Ｎ値と同等であった。一方、使用した標的核酸の量が多い場合、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、Ｓ／Ｎ値をより向上させた。つまり、Ｓ／Ｎ値に関して、異種核酸プローブは、同種核酸プローブに比し、常に同等以上の効果を奏した。
　以上より、本発明の方法における異種核酸プローブの使用は有益であることが示された。
　本発明の方法およびキットは、修飾核酸塩基の測定に有用である。

Claims (14)

  1. 　以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
    （１）核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
    （２）（１）で得られた溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
  2. 　核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、請求項１記載の方法：
    （１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、捕捉プローブおよび固相プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸、捕捉プローブおよび固相プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
    （２’）当該ハイブリッドを含む溶液において、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
  3. 　標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　核酸サンプルおよび捕捉プローブを含有する溶液を固相プローブが固定された固相に添加して、核酸サンプル、捕捉プローブおよび該固相プローブを含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　前記核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　捕捉プローブまたは固相プローブの一方または双方が、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　捕捉プローブが、標的核酸に対して異種の核酸を含むプローブである、請求項６記載の方法。
  8. 　固相プローブがポリＡまたはポリＴである、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　修飾核酸塩基を構成する核酸塩基がシトシンである、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　ハイブリッド中の標的核酸および捕捉プローブから構成される二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、請求項２～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、請求項２～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 　修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
  14. 　以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
    （Ｉ）捕捉プローブ；
    （ＩＩ）固相プローブ；および
    （ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
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