JP6451634B2 - 吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット - Google Patents
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Description
〔1〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法:
(1)核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔2〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程(1)および(2)がそれぞれ(1’)および(2’)により行われる、〔1〕の方法:
(1’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること;ならびに
(2’)該ハイブリッドを含む溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔3〕標的核酸が、2以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的DNAを含有するサンプルである、〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕吸収剤ポリヌクレオチドがヌクレオチド残基を12個以上含む、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕吸収剤ポリヌクレオチドがホモポリヌクレオチドである、〔1〕〜〔6〕のいずれかの方法。
〔8〕吸収剤ポリヌクレオチドが、シトシンを含むヌクレオチド残基を含み、かつ修飾核酸塩基が修飾シトシンである、〔1〕〜〔7〕のいずれかの方法。
〔9〕修飾シトシンがメチルシトシンである、〔8〕の方法。
〔10〕ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、〔2〕〜〔9〕のいずれかの方法。
〔11〕ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、〔2〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕吸収剤ポリヌクレオチドおよび前記抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ELISAにより行われる、〔1〕〜〔11〕のいずれかの方法。
〔13〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット:
(I)捕捉プローブ;
(II)吸収剤ポリヌクレオチド;および
(III)修飾核酸塩基に対する抗体。
(1)核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートしても、ハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸(換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸)を含有する場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸および捕捉プローブが反応して、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に(標的核酸が存在するにもかかわらず)修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸および捕捉プローブが反応して、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程(2)において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば0.01nM以上、好ましくは0.1nM以上、より好ましくは1nM以上、さらにより好ましくは5nM以上、特に好ましくは10nM以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば1M以下、100mM以下、10mM以下、1mM以下、100μM以下、10μM以下または1μM以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント(例、完全または不完全フロイントアジュバント)とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し、最終免疫から約3〜約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞(例、NS−1)を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、PEG法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgA、IgE等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法(Ulmanら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90,1184−89(1993))、ADLibシステム(国際公開第2004/011644号)等のin vitro法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
(2−1)上記工程(1)で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること;および
(2−3)シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または2次抗体(2次抗体が用いられる場合)に結合した標識を利用して計測される値(例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性)である。
(2−1’)上記工程(1)で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること;
(2−3’)バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること;ならびに
(2−4’)補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
(2−1’’)上記工程(1)で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること;
(2−2’’)修飾核酸塩基を含む標的核酸(標品)、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること;ならびに
(2−3’’)シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
(i)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルおよび第1の親和性物質で標識された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること;
(ii)ハイブリッドを、第2の親和性物質で処理された固相に固定すること;
(iii)修飾核酸塩基に対する1次抗体を、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下において、固相に固定されたハイブリッドと反応させて、1次抗体とハイブリッドとの1次複合体を得ること;
(iv)標識物質で標識された2次抗体を1次複合体と反応させて、2次抗体と1次抗体との2次複合体を得ること;ならびに
(v)2次複合体中の2次抗体が有する標識物質を利用して、形成されたハイブリッド(換言すれば、修飾核酸塩基)の存在および/または量を測定すること
第1の親和性物質および第2の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ(例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ)で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程(i)および(ii)の代わりに、(i’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および固相に固定された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された捕捉プローブを得ること(例、第1の親和性物質で標識された捕捉プローブを、第2の親和性物質で処理された固相に加えること)をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程(iii)の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。2次抗体は、1次抗体のみを認識する抗体(例、1次抗体の定常領域に結合する抗体)であってもよいが、2次複合体中の1次抗体および1次複合体の双方を認識するものであってもよい。(i)〜(v)を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
(I)捕捉プローブ;
(II)吸収剤ポリヌクレオチド;および
(III)修飾核酸塩基に対する抗体。
捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチド、および修飾核酸塩基に対する抗体は、上述したとおりである。例えば、捕捉プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、2次抗体、2次抗体の検出試薬(例、2次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質)および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−TTGCGCGGCGTC[C]GTCCTGTTGACTTC−3’(配列番号1、[C]は5−メチルシトシン)、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は5’−GAAGTCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’(配列番号2)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、二本鎖構造部分中の核酸塩基[C]で不対部分が形成されるように設計した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド(DNA)のヌクレオチド配列は、5’−CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC−3’(配列番号3、吸収剤ポリヌクレオチド1)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、5−メチルシトシンを含む標的核酸(1pmol)と捕捉プローブ(5pmol)をハイブリダイゼーションBuffer(4×SSC、0.3%Tween20)100μL中に溶解させた後(核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度は10nMであり、捕捉プローブの濃度は50nMである)、60℃で2時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート(Thermo Scientific社製)に100μL加え、37℃で30分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上にハイブリッドを固定化した。300μLのPBS−Tで2回洗浄し、0.2、1、5、または25pmolの吸収剤ポリヌクレオチド1を含む75ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3。)溶液を100μLずつ加え、37℃で1時間反応させた(溶液中、吸収剤ポリヌクレオチド1の濃度はそれぞれ2、10、50または250nMである)。同時に吸収剤ポリヌクレオチド1を含まない75ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)溶液でも同様の操作を行った。300μLのPBS−Tで3回洗浄し、250ng/mLのペルオキシダーゼ標識抗IgG抗体(Thermo Scientific社製)を100μLずつ加え、37℃で30分反応させた。300μLのPBS−Tで3回洗浄した後、3,3’,5,5’−Tetramethylbenzidineを100μLずつ加え、遮光室温で15分反応させた。その後、2N塩酸溶液を100μLずつ加え、マイクロプレートリーダー(PerkinElmer社製Arvo)により450nmの吸光度を測定した。結果を表4、図2、3に示す。
50ng/mL抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)の代わりに、100ng/mL抗メチルシトシン抗体(Millipore社製、Clone33D3)、100ng/mL抗メチルシトシン抗体(Millipore社製、Clone162 33 D3)、10ng/mL抗メチルシトシン抗体(ZYMO RESEARCH社製、Clone10G4)を用いた以外は、実施例1と同様の方法で試験した。
その結果、異なる抗体クローンを用いた場合であっても、検出シグナルのバックグランド値の抑制効果があることが確認された(表7、図8)。
吸収剤ポリヌクレオチド1の代わりに、吸収剤ポリヌクレオチド2〜11を5pmol添加した以外は、実施例1と同様の方法で試験した。吸収剤ポリヌクレオチド2〜11の概要は、表8に示したとおりである。
吸収剤ポリヌクレオチド1の代わりに、吸収剤ポリヌクレオチド12〜23を5pmol添加した以外は、実施例1と同様の方法で試験した。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−AATCAG[C]GGGAGCTCTTTCTTTGCGCGGCGTCCGTCCTGTTGACTTC−3’(配列番号29、[C]は5−メチルシトシン)、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は5’−GAAGTCAACAGGACGACGCCGCGCAA−3’(配列番号2、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド(DNA)のヌクレオチド配列は5’−CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC−3’(配列番号3、吸収剤ポリヌクレオチド1)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量(1pmol、0.1pmol、または0.01pmol)で用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド1を5pmolで用いたこと、および50ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)を用いたこと以外は、実施例1と同様の方法で行った。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−G[C]GGAGCTCTCCCT[C]GGGA[C]GGTGGCAGCCTCGAGTGGTCCTGCA−3’(配列番号30、[C]は5−メチルシトシン)、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は5’−TGCAGGACCACTCGAGGCTGCCAC−3’(配列番号31、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド(DNA)のヌクレオチド配列は5’−CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC−3’(配列番号3、吸収剤ポリヌクレオチド1)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量(1pmol、0.1pmol、または0.01pmol)で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド1を25pmolで用いたこと、および50ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)を用いたこと以外は、実施例1と同様の方法で行った。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−G[C]GCAC[C]GTTTG[C]GACTTGGTGAGTGTCTGGGT[C]GCCT[C]GCTCC−3’(配列番号32、[C]は5−メチルシトシン)、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は5’−ACCCAGACACTCACCAAGTC−3’(配列番号33、5’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド(DNA)のヌクレオチド配列は5’−CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC−3’(配列番号3、吸収剤ポリヌクレオチド1)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量(1pmol、0.1pmol、または0.01pmol)で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド1を25pmolで用いたこと、および50ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)を用いたこと以外は、実施例1と同様の方法で行った。
標的核酸(DNA)のヌクレオチド配列は5’−GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT[C]GT−3’(配列番号34、[C]は5−メチルシトシン)、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は5’−CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAAAAAAAAAA−3’(配列番号35、3’末端はビオチン標識)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。またシトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド(DNA)のヌクレオチド配列は5’−CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC−3’(配列番号9、吸収剤ポリヌクレオチド4)であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基[C]が存在するように設計した。
吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量(1pmol、0.1pmol、または0.01pmol)で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド4を25pmolで用いたこと、および50ng/mLの抗メチルシトシン抗体(ニッポンジーン社製、Clone33D3)を用いたこと以外は、実施例1と同様の方法で行った。
Claims (12)
- 以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法:
(1)核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること;ならびに
(2)(1)で得られた溶液において、有効ヌクレオチド残基を60%以上の含有率で含む、12個以上のヌクレオチド配列領域を含む吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体を用いて標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。 - 核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程(1)および(2)がそれぞれ(1’)および(2’)により行われる、請求項1記載の方法:
(1’)修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること;ならびに
(2’)該ハイブリッドを含む溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。 - 標的核酸が、2以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項1または2記載の方法。
- 核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的DNAを含有するサンプルである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 吸収剤ポリヌクレオチドがホモポリヌクレオチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 吸収剤ポリヌクレオチドが、シトシンを含むヌクレオチド残基を含み、かつ修飾核酸塩基が修飾シトシンである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 修飾シトシンがメチルシトシンである、請求項7記載の方法。
- ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。
- ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、請求項2〜9のいずれか一項記載の方法。
- 吸収剤ポリヌクレオチドおよび前記抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ELISAにより行われる、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 以下を含む、標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基の測定用キット:
(I)捕捉プローブ;
(II)有効ヌクレオチド残基を60%以上の含有率で含む、12個以上のヌクレオチド配列領域を含む吸収剤ポリヌクレオチド;および
(III)標的核酸中に含まれる修飾核酸塩基に対する抗体。
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