JP2017221172A - 修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】修飾核酸塩基を含む標的核酸、および無数の非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、捕捉プローブを用いて標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定する方法において、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を特異的に測定すること。
【解決手段】以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて標的核酸を固相に複数回固定すること；ならびに
（２）標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。
【選択図】なし

Description

本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法に関する。

標的核酸に含まれる修飾核酸塩基（例、メチルシトシン）の測定として、標的核酸の増幅を伴う方法（例、バイサルファイトパイロシーケンシング法）、および標的核酸の増幅を伴わない方法（例、修飾核酸塩基に対する抗体を用いるイムノアッセイ）が知られている。標的核酸の増幅を伴わない従来法では、標的核酸を固相に捕捉するために用いられる核酸プローブ（捕捉プローブ）を１つ用いて固相に標的核酸を捕捉した後に、修飾核酸塩基が測定されている（特許文献１、２、非特許文献１〜３）。

特開２０１２−２３００１９号公報 特開２０１４−１７６３３０号公報

ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．２０１２，８４，７５３３−７５３８ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１５，８７（２２），１１５８１−１１５８６

本発明者らは、修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、１つの捕捉プローブを用いて標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定する方法では、捕捉プローブの非標的核酸への結合によりバックグランドシグナルが高くなり、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を良好に測定し得ないという課題があることを見出した（参考例２）。具体的には、核酸サンプルに無数の非標的核酸が含まれる場合、無数の非標的核酸は多様なヌクレオチド配列を有するため、捕捉プローブのヌクレオチド配列と相補的な部分ヌクレオチド配列を有する非標的核酸も固相に捕捉され、この捕捉された非標的核酸に含まれる修飾核酸塩基も測定されてしまうことが高いバックグランドシグナルの一因と考えられた。
また、固相上に非特異的に吸着した非標的核酸の存在が高いバックグラウンドシグナルの一因であることも見出された（参考例３）。
したがって、このような核酸サンプルにおいて、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を良好に測定するためには、非標的核酸由来のバックグラウンドシグナルを抑制する必要があると考えられた。

本発明者らは、本発明者らにより見出された上記課題を解決するため鋭意検討した結果、複数の異なる捕捉プローブを用いることなどにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
（１）修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて標的核酸を固相に複数回固定すること；ならびに
（２）標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕前記核酸サンプルがゲノムＤＮＡサンプルである、〔１〕の方法。
〔３〕前記核酸サンプルが、非標的核酸１μｇ当たりの標的核酸モル数が２０ａｍｏｌ未満の量において標的核酸を含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記捕捉プローブとして、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブ、および標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブが併用される、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕以下を含む方法により（１）が行われる、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法：
（ｉ）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉；
（ｉｉ）固相から液相への標的核酸の放出；および
（ｉｉｉ）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉。
〔６〕以下を含む方法により（１）が行われる、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法：
（ｉ’）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた第１液相中の標的核酸の第１固相への捕捉；
（ｉｉ’）第１液相の第２液相への交換；
（ｉｉｉ’）第１固相から第２液相への標的核酸の放出；
（ｉｖ’）第１固相の第２固相への交換；
（ｖ’）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた第２液相中の標的核酸の第２固相への捕捉；および
（ｖｉ’）第２液相の第３液相への交換。
〔７〕以下を含む方法により（１）が行われる、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法：
（１−１）（ａ）核酸サンプルに含まれる標的核酸、（ｂ）第１親和性物質で標識された、標的核酸に対する第１捕捉プローブ、および（ｃ）第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第１固相を溶液中で反応させて、標的核酸および前記第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を含む第１溶液を得ること；
（１−２）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を、第１溶液から第２溶液に移すこと；
（１−３）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相から標的核酸を第２溶液中に放出させて、標的核酸および第１固相を含む第１放出溶液を得ること；
（１−４）第１固相を第１放出溶液から除去して、標的核酸を含み、かつ第１固相を含まない第２放出溶液を得ること；ならびに
（１−５）（ａ’）前記第２放出溶液に含まれる標的核酸、（ｂ’）第２親和性物質で標識された、標的核酸に対する第２捕捉プローブ、および（ｃ’）第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第２固相を反応させて、標的核酸および前記第２捕捉プローブを含む第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を含む第３溶液を得ること；
（１−６）前記第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を、前記第３溶液から第４溶液に移すこと。
〔８〕以下をさらに含む、〔７〕の方法：
（１ａ）（１−２）において、前記第１固相を前記第１溶液から第２溶液に移すときに、前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を洗浄すること；
（１ｂ）（１−６）において、前記第２固相を前記第３溶液から第４溶液に移すときに、前記第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を洗浄すること；
（１ｃ）（１ａ）および（１ｂ）の双方を行うこと。
〔９〕第１親和性物質が第２親和性物質と同じであり、かつ、第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第１固相が第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第２固相と同じである、〔７〕または〔８〕の方法。
〔１０〕固相が磁性粒子である、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕前記測定が標的核酸の非増幅的解析方法により行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕前記非増幅的解析方法が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、ナノポア分析またはマイクロポア分析である、〔１１〕の方法。

標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて標的核酸を固相に複数回固定することを含む本発明の方法は、１つの捕捉プローブを用いて標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定する従来法に比し、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基をより特異的に測定することができる。特に、本発明の方法は、核酸サンプルにおいて非標的核酸に対する標的核酸の相対量が少ない場合であっても、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を特異的に測定することができる点で優れる。
また、本発明の方法によれば、標的核酸の増幅を要することなく、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を特異的に測定することができる。したがって、本発明の方法は、標的核酸の増幅に必要な機器の使用を回避でき、また、標的核酸の増幅を要しない点で測定時間を短縮できるという利点も有する。

図１は、捕捉プローブの有無における発光カウントの比較を示す図である。 図２は、非標的核酸由来シグナル（バックグラウンドシグナル）の低減に対する、１つの捕捉プローブを用いる従来法、および２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法の効果の比較を示す図である。 図３は、１回の捕捉により固相に吸着した核酸量（従来法）、および２回の捕捉により固相（粒子）に吸着した核酸量（本発明）の比較を示す図である。 図４は、２つの捕捉プローブの組み合わせにおける、標的核酸に対する各捕捉プローブのハイブリダイズ部位を示す図である。 図５は、１つの捕捉プローブを用いる従来法による、混合核酸サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の検出を示す図である。 図６は、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法による、混合核酸サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の検出を示す図である。 図７は、１つの捕捉プローブを用いる従来法による、抽出核酸サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の検出を示す図である。折れ線グラフ：バイサルファイトパイロシーケンシング法による測定結果（縦軸：メチル化率）；棒グラフ：従来法による測定結果（縦軸：発光カウント）。Ａ：培養細胞Ａ１７２；Ｕ：培養細胞Ｕ８７−ＭＧ；Ｔ：培養細胞Ｔ４７Ｄ；ＤＷ：蒸留水（ネガティブコントロール） 図８は、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法による、抽出核酸サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の検出を示す図である。詳細は、図７と同様である。

本発明は、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法を提供する。以下、修飾核酸塩基を含む標的核酸を、省略のため単に標的核酸と呼ぶことがある。

標的核酸は、ヌクレオチド単位が重合した天然または人工の核酸である。標的核酸としては、例えば、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、非コーディング領域（例、転写調節領域）、またはそれを含む領域であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、捕捉プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、または１００個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、または２００個または以下であってもよい。

本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４〜６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。

修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５−カルボキシルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。

本発明の方法は、以下を含む：
（１）修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて、標的核酸を固相に複数回固定すること；ならびに
（２）標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。

（１）では、核酸サンプルにおいて、標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて、標的核酸が固相に複数回固定される。これにより、非標的核酸、特に、標的核酸の測定の支障となる修飾核酸塩基を含む非標的核酸（例、複数の捕捉プローブのうちの一部の捕捉プローブのヌクレオチド配列と相補的な部分ヌクレオチド配列を有する、修飾核酸塩基を含む非標的核酸）を排除することができる。

核酸サンプルは、上述したような修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む任意の核酸サンプルである。非標的核酸は、ヌクレオチド単位が重合した天然または人工の核酸である。非標的核酸としては、例えば、修飾核酸塩基を含む非標的核酸、および修飾核酸塩基を含まない非標的核酸が挙げられる。非標的核酸としてはまた、例えば、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられるが、ＤＮＡが好ましい。

核酸サンプルに含まれる標的核酸および非標的核酸の量は特に限定されないが、本発明の方法は、核酸サンプルにおいて非標的核酸に対する標的核酸の相対量が少ない場合であっても、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を良好に測定できることが確認されている。したがって、本発明の方法は、非標的核酸に対する前記標的核酸の相対量が少ない場合に特に有効である。本発明の方法が特に有効である、非標的核酸に対する標的核酸の相対量は、非標的核酸１μｇ当たりの標的核酸モル数として、２０ａｍｏｌ（１０００ａｍｏｌ標的核酸／５０μｇ非標的核酸；実施例３および図５を参照）未満の量である。好ましくは、このような相対量は、非標的核酸１μｇ当たりの標的核酸モル数として、１０ａｍｏｌ以下、５ａｍｏｌ以下、２ａｍｏｌ以下、１ａｍｏｌ以下、または０．５ａｍｏｌ以下の量である。例えば、ヒトゲノムＤＮＡ中の１つの標的ＤＮＡのみを測定する場合、非標的核酸（ヒトゲノムＤＮＡ）１μｇ当たりの標的ＤＮＡモル数は、約０．５ａｍｏｌである。

核酸サンプルとしては、例えば、生物由来の生物学的サンプル、環境サンプル、および合成核酸の混合サンプルが挙げられる。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含む可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。合成核酸の混合サンプルとしては、例えば、人工的に合成された修飾核酸塩基を含む標的核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）であって、修飾核酸塩基の検量が所望されるものが挙げられる。

好ましくは、核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡサンプルである。

核酸サンプルは、上記（１）の工程の前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等の操作によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。

本発明で用いられる捕捉プローブとは、標的核酸とハイブリダイズして核酸ハイブリッドを形成する能力を有し、かつ、固相に固定可能であるか、または固相に固定されている核酸プローブをいう。

捕捉プローブは、標的核酸に対して同種および／または異種の核酸から構成され得る。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を、主鎖構造の全体として捕捉プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として捕捉プローブが有することを意味する。したがって、捕捉プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定されてもよい。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。好ましくは、捕捉プローブは、標的核酸に対して異種の核酸から構成されていてもよい。

捕捉プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ）プローブまたは架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。

一実施形態では、捕捉プローブは、ＲＮＡプローブである。ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。好ましくは、ＲＮＡプローブは、修飾ＲＮＡプローブである。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’−Ｏ−アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１〜Ｃ６アルキル化についてのＣ１〜Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１〜６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル）、ブチル基（例、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブである。

捕捉プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、捕捉プローブの長さ）は、標的核酸とハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１２個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは１８個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。捕捉プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下または５０個以下であってもよい。捕捉プローブは、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。

捕捉プローブは、工程（１）で用いられる場合、遊離の形態、または固相に固定された形態で用いることができる。したがって、捕捉プローブは、固相への特異的な結合を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば、捕捉プローブの５’末端または３’末端の一方にて行うことができる。固相への特異的な結合を可能にする物質または基としては、例えば、固相への特異的な共有結合を可能にする基または物質、および固相への特異的な親和性結合を可能にする親和性物質が挙げられる。固相への特異的な共有結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基、またはチオール基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基、またはアミノ基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。固相への特異的な親和性結合を可能にする親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子のうちの一方の鎖が挙げられる。この場合、固相としては、捕捉プローブが有する物質または基と特異的に結合する能力を有する物質または基でコーティングされたものを用いることができる。捕捉プローブは、工程（１）において遊離の形態で用いられる場合、ハイブリッド形成後に、固相に固定されてもよい。

固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に分散可能な固相（例、粒子）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、カーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料または磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは液相中に分散可能な固相であり、より好ましくは粒子であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。捕捉プローブが固定される固相として、液相中に分散可能な固相が用いられる場合、当然のことながら、液相を収容または搭載可能な固相を併用することができる。

本発明の方法で用いられる捕捉プローブの数は、２個以上である限り特に限定されないが、好ましくは、２個、３個、４個、または５個であり、より好ましくは、２個または３個であり、特に好ましくは２個である。

好ましい実施形態では、複数の捕捉プローブとして、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブ、および標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブを併用することができる。このような併用により、標的核酸をより特異的に測定することができる。

標的核酸の５’末端領域とは、標的核酸の全長がｎ個のヌクレオチド残基からなる場合、標的核酸における５’末端ヌクレオチド残基（１番目）から５’→３’方向に起算してｎ／３番目のヌクレオチド残基までの領域をいう。好ましくは、標的核酸の５’末端領域は、標的核酸における５’末端ヌクレオチド残基（１番目）から５’→３’方向に起算してｎ／４番目、ｎ／５番目、ｎ／６番目、ｎ／７番目、ｎ／８番目、ｎ／９番目、またはｎ／１０番目のヌクレオチド残基までの領域である。ｎ／３、ｎ／４、ｎ／５、ｎ／６、ｎ／７、ｎ／８、ｎ／９、またはｎ／１０の値が小数点以下の値を有する場合、小数点以下の値は考慮されない。例えば、標的核酸の全長が１００個のヌクレオチド残基からなる場合、標的核酸の５’末端領域は、標的核酸における５’末端ヌクレオチド残基（１番目）から５’→３’方向に起算して３３番目のヌクレオチド残基までの領域であり、好ましくは、２５番目、２０番目、１６番目、１４番目、１２番目、１１番目、または１０番目のヌクレオチド残基までの領域である。

標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブは、上記のような５’末端領域の全体または一部にハイブリダイズして核酸ハイブリッドを形成できる限り、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有するものと解される。したがって、捕捉プローブは、上記のような５’末端領域の全体または一部にハイブリダイズするものであれば、さらに５’末端領域の３’隣接領域にハイブリダイズするものであってもよい。好ましくは、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブは、５’末端領域の全体または一部のみにハイブリダイズし、５’末端領域の３’隣接領域にはハイブリダイズしない捕捉プローブであってもよい。

標的核酸の３’末端領域とは、標的核酸の全長がｎ個のヌクレオチド残基からなる場合、標的核酸におけるｎ番目のヌクレオチド残基から３’→５’方向に起算してｎ／３番目のヌクレオチド残基までの領域をいう。好ましくは、標的核酸の３’末端領域は、標的核酸における３’末端ヌクレオチド残基（ｎ番目）から３’→５’方向に起算してｎ／４番目、ｎ／５番目、ｎ／６番目、ｎ／７番目、ｎ／８番目、ｎ／９番目、またはｎ／１０番目のヌクレオチド残基までの領域である。ｎ／３、ｎ／４、ｎ／５、ｎ／６、ｎ／７、ｎ／８、ｎ／９、またはｎ／１０の値が小数点以下の値を有する場合、小数点以下の値は考慮されない。例えば、標的核酸の全長が１００個のヌクレオチド残基からなる場合、標的核酸の３’末端領域は、標的核酸における３’末端ヌクレオチド残基（１００番目）から３’→５’方向に起算して３３番目のヌクレオチド残基までの領域（換言すれば、標的核酸における５’末端ヌクレオチド残基（１番目）から５’→３’方向に起算すると、６８番目〜１００番目のヌクレオチド残基からなる領域）であり、好ましくは、２５番目、２０番目、１６番目、１４番目、１２番目、１１番目、または１０番目のヌクレオチド残基までの領域（換言すれば、標的核酸における５’末端ヌクレオチド残基（１番目）から５’→３’方向に起算すると、７６番目、８１番目、８５番目、８７番目、８９番目、９０番目、または９１番目から１００番目までのヌクレオチド残基からなる領域）である。

標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブは、上記のような３’末端領域の全体または一部にハイブリダイズして核酸ハイブリッドを形成できる限り、標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有するものと解される。したがって、捕捉プローブは、上記のような３’末端領域の全体または一部にハイブリダイズするものであれば、さらに３’末端領域の５’隣接領域にハイブリダイズするものであってもよい。好ましくは、標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブは、３’末端領域の全体または一部のみにハイブリダイズし、３’末端領域の５’隣接領域にはハイブリダイズしない捕捉プローブであってもよい。

本発明の方法では、用いられる異なる捕捉プローブの数に応じて、標的核酸の固相への捕捉を２回以上繰り返し行うことができる。例えば、用いられる異なる捕捉プローブの数がＸである場合、（標的核酸の固相への捕捉）をＸ回、および（固相から液相への標的核酸の放出）をＸ−１回（またはＸ回。Ｘ回目は任意）行うことができる。具体的には、２つの異なる捕捉プローブが用いられる場合、本発明の方法は、以下を含む方法により行うことができる：
（ｉ）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉；
（ｉｉ）固相から液相への標的核酸の放出；および
（ｉｉｉ）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉。

（ｉ）〜（ｉｉｉ）において、液相としては、水、または緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液）等の水溶系溶媒を用いることができる。また、（ｉ）における液相としては、修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルを利用することができる。

標的核酸に対する捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉は、標的核酸および捕捉プローブのハイブリッドを形成し得る任意の条件下で、標的核酸、および捕捉プローブ（固相に固定されていてもよい）、ならびに必要に応じて固相（捕捉プローブが固相に固定されていない遊離の形態で用いられる場合）を溶液中でインキュベートすることにより行うことができる。このような条件（例、溶液の塩濃度、インキュベーション温度、インキュベーション時間）は周知である（例、国際公開第２０１０／０９１８７０号、国際公開第２００６／１２１８８８号、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号を参照）。

固相から液相への標的核酸の放出は、標的核酸を固相から液相中に移行させ得る任意の条件下で処理することにより行うことができる。このような処理としては、例えば、ｐＨ調節剤（例、酸性物質、アルカリ性物質、またはこれらの物質を含む溶液）、加熱、競合剤（例、固相への特異的な親和性結合を可能にする親和性物質、標的核酸の相補核酸）、光による処理が挙げられる。標的核酸は、固相への捕捉プローブの固定手段の種類および放出処理の種類等の因子に応じて、捕捉プローブとのハイブリッドの形態、または標的核酸単独の形態で放出される。

第１捕捉プローブを用いた１回目の捕捉では、標的核酸のみならず、第１捕捉プローブのヌクレオチド配列と相補的な部分ヌクレオチド配列を有する非標的核酸も固相に捕捉され得る。しかし、第１捕捉プローブとは異なる第２捕捉プローブを用いた２回目の捕捉により、標的核酸のみ捕捉し、このような非標的核酸の捕捉を回避することで、非標的核酸を排除することができる。２回目に捕捉された標的核酸は、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の測定前に、固相から放出されてもよい。

より具体的には、２つの異なる捕捉プローブが用いられる場合、本発明の方法は、以下を含む方法により行うことができる：
（ｉ’）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた第１液相中の標的核酸の第１固相への捕捉；
（ｉｉ’）第１液相の第２液相への交換；
（ｉｉｉ’）第１固相から第２液相への標的核酸の放出；
（ｉｖ’）第１固相の第２固相への交換；
（ｖ’）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた第２液相中の標的核酸の第２固相への捕捉；および
（ｖｉ’）第２液相の第３液相への交換。

（ｉ’）、（ｉｉｉ’）および（ｖ’）はそれぞれ、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と同様にして行うことができる。

（ｉｉ’）では、第１液相が第２液相に交換される。換言すれば、標的核酸が捕捉された第１固相が、第１液相から第２液相に移される。これにより、第１固相に捕捉されなかった、第１液相中に含まれる非標的核酸を系から除去することができる。

（ｉｖ’）では、第１固相が第２固相に交換される。換言すれば、第１固相が系から除去され、第２固相が系に投入される。これにより、第１固相に非特異的に吸着した非標的核酸を系から除去することができる。

（ｖｉ’）では、第２液相が第３液相に交換される。換言すれば、標的核酸が捕捉された第２固相が、第２液相から第３液相に移される。これにより、第２固相に捕捉されなかった、第２液相中に含まれる非標的核酸（例、第１捕捉プローブのヌクレオチド配列と相補的な部分ヌクレオチド配列を有し得る、第１固相に捕捉されていた非標的核酸）を系から除去することができる。

（ｉ’）〜（ｖｉ’）において、液相としては、水、または緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液）等の水溶系溶媒を用いることができる。また、（ｉ’）における液相としては、修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルを利用することができる。

（ｖｉ’）の結果、標的核酸を捕捉した第２固相、および第３液相を含む系が得られる。この系を、後述する工程（２）に付すことにより、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定することができる。第２固相に捕捉された標的核酸は、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の測定前に、固相から放出されてもよい。第２固相に捕捉された状態、または第２固相から放出された状態（例、捕捉プローブとのハイブリッドの形態、または標的核酸単独の形態）にある標的核酸において、修飾核酸塩基を測定することができる。

好ましい実施形態では、（１）は、以下を含む方法により行うことができる：
（１−１）（ａ）核酸サンプルに含まれる標的核酸、（ｂ）第１親和性物質で標識された、標的核酸に対する第１捕捉プローブ、および（ｃ）第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第１固相を溶液中で反応させて、標的核酸および前記第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を含む第１溶液を得ること；
（１−２）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を、第１溶液から第２溶液に移すこと；
（１−３）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相から標的核酸を第２溶液中に放出させて、標的核酸および第１固相を含む第１放出溶液を得ること；
（１−４）第１固相を第１放出溶液から除去して、標的核酸を含み、かつ第１固相を含まない第２放出溶液を得ること；ならびに
（１−５）（ａ’）前記第２放出溶液に含まれる標的核酸、（ｂ’）第２親和性物質で標識された、標的核酸に対する第２捕捉プローブ、および（ｃ’）第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第２固相を反応させて、標的核酸および前記第２捕捉プローブを含む第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を含む第３溶液を得ること；
（１−６）前記第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を、前記第３溶液から第４溶液に移すこと。

（１−１）において、反応は、（ａ）〜（ｃ）を同時または別々にインキュベーションすることにより行うことができる。インキュベーションは、上述したとおりである。このような反応により、標的核酸および第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を含む第１溶液が得られる。第１親和性物質、および第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質としては、上述したような親和性物質を用いることができる。

反応が同時に行われる場合、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む溶液を調製し、次いでインキュベートすることにより、反応を行うことができる。一方、反応が別々に行われる場合、先ず、（ａ）および（ｂ）を反応させて第１核酸ハイブリッドを形成し、次いで、形成された第１核酸ハイブリッドを（ｃ）と反応させて、標的核酸および第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を調製することができる。あるいは、先ず、（ｂ）および（ｃ）を反応させて、捕捉プローブが固定された第１固相を形成し、次いで、この第１固相を（ａ）と反応させて、標的核酸および第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を調製してもよい。

（１−２）において、標的核酸および第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相が、第１溶液から第２溶液に移される。これにより、第１溶液中に含まれていた、第１固相に捕捉されなかった非標的核酸（第１溶液中に含まれていた非標的核酸）を除去することができる。第１溶液から第１固相を取り出した後、第２溶液に移す前に、このような第１固相を洗浄してもよい。これにより、第１固相に付着している第１溶液中に含まれる非標的核酸をさらに除去することができる。洗浄は、適切な界面活性剤を含む緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液）で１回以上（例、１〜３回）行うことができる。

（１−３）において、標的核酸の第２溶液中への放出は、上述したような処理により行うことができる。標的核酸は、捕捉プローブとのハイブリッドの形態、または単独の形態で第２溶液中に放出される。これにより、標的核酸および第１固相を含む第１放出溶液が得られる。

（１−４）において、第１固相が第１放出溶液から除去される。これにより、標的核酸を含み、かつ第１固相を含まない第２放出溶液が得られる。これにより、第１固相に吸着した非標的核酸を除去することができる。第１放出溶液からの第１固相の除去は、第１放出溶液と第１固相との分離を可能にする任意の様式において行うことができる。

（１−５）において、反応は、（ａ’）〜（ｃ’）を同時または別々にインキュベーションすることにより行うことができる。反応を同時または別々に行う場合の詳細は、（１−１）と同様である。インキュベーションは、上述したとおりである。このような反応により、標的核酸および前記第２捕捉プローブを含む第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を含む第３溶液が得られる。第２親和性物質、および第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質としては、上述したような親和性物質を用いることができる。

（１−５）において、第２捕捉プローブとして、第１捕捉プローブと異なる捕捉プローブを用いることで、標的核酸を特異的に固相に捕捉することができる。特に、第１捕捉プローブおよび第２捕捉プローブの組み合わせとして、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブ、および標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブを併用することにより、標的核酸を特異的に捕捉することができる。

（１−６）において、第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相が、第３溶液から第４溶液に移される。これにより、第３溶液中に含まれていた、第２固相に捕捉されなかった非標的核酸（例、第１捕捉プローブのヌクレオチド配列と相補的な部分ヌクレオチド配列を有し得る、第１固相に捕捉されていた非標的核酸）を除去することができる。第３溶液から第２固相を取り出した後、第４溶液に移す前に、このような第２固相を洗浄してもよい。これにより、第２固相に付着している第３溶液中に含まれる非標的核酸をさらに除去することができる。洗浄は、適切な界面活性剤を含む緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液）で１回以上（例、１〜３回）行うことができる。

（１−１）〜（１−６）において、溶液としては、水、または緩衝液（例、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液）等の水溶系溶媒を用いることができる。また、（１−１）における溶液としては、修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルを利用することができる。

（１−６）の結果、第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を含む第４溶液が得られる。この第４溶液を、後述する工程（２）に付すことにより、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定することができる。第２固相に捕捉された標的核酸は、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の測定前に、固相から放出されてもよい。第２固相に捕捉された状態、または第２固相から放出された状態（例、捕捉プローブとのハイブリッドの形態、または標的核酸単独の形態）にある標的核酸において、修飾核酸塩基を測定することができる。

（２）では、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の測定は、当該分野で公知である任意の方法により行うことができる。例えば、測定は、核酸の非増幅的解析方法、または核酸の増幅的解析方法により行うことができる。

核酸の非増幅的解析方法は、標的核酸の増幅工程を伴わない、標的核酸の絶対量を増加させない任意の解析方法である。核酸の非増幅的解析方法としては、例えば、イムノアッセイ（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６））、質量分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７（２），５０４−５１０（２００５））、電気化学分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８３，７５９５−７５９９（２０１１））、高速液体クロマトグラフィー分析（例、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（８），ｅ６１（２００６））、ナノポア分析またはマイクロポア分析（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））が挙げられる。

イムノアッセイにより修飾核酸塩基が測定される場合、抗修飾核酸塩基抗体を用いて標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定できる。イムノアッセイは、当該分野において公知である任意の免疫学的方法により行うことができる。具体的には、このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、化学発光ＥＩＡ（ＣＬＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、凝集法、免疫染色、フローメトリー法、バイオレイヤー干渉法、Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ法、化学増幅型ルミネッセンス・プロキシミティ・ホモジニアス・アッセイ、ラインブロット法、ウエスタンブロット法が挙げられる。

質量分析、電気化学分析、または高速液体クロマトグラフィー分析により修飾核酸塩基が測定される場合、標的核酸をヌクレアーゼ（例、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ）により分解して、標的核酸の分解産物であるモノマー単位（ヌクレオチド）を含む溶液を回収した後、この溶液をこのような技術に付すことで、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定できる。

ナノポア分析またはマイクロポア分析により修飾核酸塩基が解析される場合、標的核酸を固相から放出させて標的核酸を含む溶液を得た後、この溶液をナノポア分析またはマイクロポア分析に付すことで、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定できる。

核酸の増幅的解析方法は、標的核酸の増幅工程により標的核酸の絶対量を増加することができる任意の解析方法であり、例えば、１以上のプライマーを用いることにより標的核酸の絶対量を指数関数的または非指数関数的に増幅する方法である。核酸の増幅的解析方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンシング法、バイサルファイトパイロシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、単一ヌクレオチド・プライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）法、メチライト法、ＣＯＢＲＡ法、メチル化特異的ＭＬＰＡ法が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知である（例、特開２０１２−０９０５５５号公報、特開２０１４−０３６６７２号公報、国際公開第２００９／０３７６３５号）。

好ましくは、測定は、標的核酸の非増幅的解析方法により行うことができる。本発明の方法によれば、（１）により、修飾核酸塩基を含む非標的核酸が特異的に除去されていることから、標的核酸の増幅を要することなく、修飾核酸塩基を含む標的核酸を正確に測定できるためである。この場合、本発明の方法は、標的核酸の増幅工程を一切要せずに行うことができる。

本発明では、核酸サンプル中の所望の核酸の量及び割合（例、核酸サンプル中の標的核酸量、または核酸サンプル中の核酸量および核酸量に対して予測される標的核酸の割合）を考慮して、修飾核酸塩基による標的核酸の修飾頻度を評価してもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

参考例１：メチルシトシンを含む標的核酸の調製
標的核酸は下記に示す手順で調製した。標的核酸の調製には、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法を使用した。ＰＣＲ用の酵素としては東洋紡績社製ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（商品番号：ＫＯＤ−２０１）、核酸増幅用の２種類のプライマーとしては北海道システムサイエンス社により人工合成された、フォワードプライマー：５’−ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＡＣ−３’（配列番号１）、リバースプライマー：５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号２）を使用した。ＰＣＲ増幅のプロトコールは、９４℃で２分間加熱した後、９４℃を１５秒、５５℃を３０秒、６８℃を１分、を１セットとして３０サイクルとした。

北海道システムサイエンス社により人工合成された核酸（ヌクレオチド配列：５’−ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＣＧ ＣＧＧ ＴＧＣ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＣＧ ＡＣＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＣＧ ＣＣＴ ＣＧＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＧ ＡＧＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＧＣＡ−３’（配列番号３））を鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製することで、１３８塩基対の核酸を調製した。

上記で調製した核酸中のＣｐＧのシトシンをメチル化するため、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＣｐＧ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＳｓｓＩ）（商品番号：ＥＭ０８２１）で処理を行った。反応溶液は添付文書に従って調製した。３７℃で２０分間反応させた後、６５℃でさらに２０分間反応させた後、キアゲン社ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔを使用して精製することで、５−メチルシトシンを含む標的核酸を得た。

参考例２：捕捉プローブによる非標的核酸の非特異的な捕捉
標的核酸を捕捉するための核酸プローブである捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。非標的核酸として、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（インビトロジェン社製）を使用した。

まず、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）と捕捉プローブ（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。また、捕捉プローブを含まない溶液も同様に調製した。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

その結果、捕捉プローブが存在する場合、捕捉プローブが存在しない場合と比較して発光カウントが高かった（表１、図１）。

以上より、捕捉プローブが非標的核酸を非特異的に捕捉することにより、非標的核酸由来のバックグラウンドシグナルが上昇すると考えられた。

実施例１：標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の特異的な検出による非標的核酸由来シグナルの低減
本実施例では、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法、ならびに１つの捕捉プローブを用いる従来法について、非標的核酸由来シグナル（バックグラウンドシグナル）の低減に対する効果を評価した。

（１−１）２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法による、標的核酸に含まれるメチルシトシンの特異的な検出
捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、捕捉プローブ２は５’−ＧＵＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＵＵ ＣＵＡ−３’（配列番号５）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸は参考例１で調製したものを使用した。非標的核酸として、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（インビトロジェン社製）を使用した。

まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１００ａｍｏｌ）またはサケ精液由来ゲノムＤＮＡ（２００μｇ）と、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ２（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、５−メチルシトシンを含む標的核酸およびサケ精液由来ゲノムＤＮＡを共に含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ２を固定化した。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、捕捉プローブとハイブリッドを形成していた核酸を反応溶液中に放出させた。磁性粒子を集磁して除いた後、全量の反応上清を、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）８５μＬに加えた。この反応液を９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

（１−２）１つの捕捉プローブを用いる従来法による、標的核酸に含まれるメチルシトシンの検出
捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸は参考例１で調製したものを使用した。非標的核酸として、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（インビトロジェン社製）を使用した。

まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１００ａｍｏｌ）またはサケ精液由来ゲノムＤＮＡ（２００μｇ）と、捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、５−メチルシトシンを含む標的核酸およびサケ精液由来ゲノムＤＮＡを共に含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

（１−３）結果
従来法では、標的核酸と非標的核酸で発光カウントに差はなかった（表２、図２）。一方、本発明の方法では、非標的核酸は緩衝液のみのサンプルと同等の低い発光カウントしか示さず、標的核酸のみ高い発光カウントを示した（表２、図２）。

以上より、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法は、１つの捕捉プローブを用いる従来法に比し、非標的核酸由来のバックグラウンドシグナルを特異的に低減できることが示された。

参考例３：固相への核酸の吸着の評価
本参考例では、標的核酸を固相に２回捕捉する本発明の方法論（２つの異なる捕捉プローブの使用に起因）、ならびに標的核酸を固相に１回捕捉する従来の方法論（１つの捕捉プローブの使用に起因）について、固相への核酸吸着量を評価した。本発明の方法論による固相への核酸吸着量の評価は、２回目の捕捉後に固相から放出された核酸の量を測定することにより行った。従来の方法論による固相へのＤＮＡ吸着量の評価は、１回目の捕捉後に固相から放出された核酸の量を測定することにより行った。

検討用核酸は参考例１で調製したものを使用した。

まず、検討用核酸（１００ａｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。この溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、磁性粒子上に非特異的に吸着した検討用核酸を反応溶液中に放出させた。

磁性粒子を集磁して除いた後、反応上清に等量の５０ｍＭ ＨＣｌ水溶液を加えて中和した後、検討用核酸を増幅可能な位置に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅することにより、磁性粒子上に非特異的に吸着したＤＮＡ量を測定した（標的核酸を固相に１回捕捉する従来の方法論による固相へのＤＮＡ吸着量の評価）。

また、磁性粒子を集磁して除いた後、１５μＬの反応上清を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）８５μＬに加えた。この溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、磁性粒子上に非特異的に吸着した検討用核酸を反応溶液中に放出させた。磁性粒子を集磁して除いた後、反応上清に等量の５０ｍＭ ＨＣｌ水溶液を加えて中和した後、検討用核酸を増幅可能な位置に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅することにより、磁性粒子上に非特異的に吸着したＤＮＡ量を測定した（標的核酸を固相に２回捕捉する本発明の方法論による固相への核酸吸着量の評価）。

リアルタイムＰＣＲ増幅の詳細を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ：０．０５μＬ
磁性粒子に吸着したＤＮＡサンプル：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ

検討用核酸を増幅可能な位置に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒのヌクレオチド配列は５’−ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＡＣ−３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒのヌクレオチド配列は５’−ＧＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ Ｃ−３’（配列番号６）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。

上記組成の反応溶液を以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分

反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）〜（３）を５０サイクル繰り返した。

その結果、２回捕捉した場合に固相に吸着した核酸量は、１回捕捉した場合のものに比し、非常に少なかった（表３、図３）。

以上より、標的核酸を固相に２回捕捉する本発明の方法論は、標的核酸を固相に１回しか捕捉しない本発明の方法論に比し、固相に非特異的に吸着する核酸量を大幅に低減できることが示された。

実施例２：標的核酸に対する２つの捕捉プローブのハイブリダイズ部位による標的核酸の特異的な検出の評価
捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、捕捉プローブ２は５’−ＧＵＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＵＵ ＣＵＡ−３’（配列番号５）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、３’末端はビオチン標識）、捕捉プローブ３は５’−ＡＣＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＵＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＵＣ−３’（配列番号７）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸は参考例１で調製したものを使用した。非標的核酸として、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（インビトロジェン社製）を使用した。

まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１００ａｍｏｌまたは１ｆｍｏｌ）またはサケ精液由来ゲノムＤＮＡ（２００μｇ）と、捕捉プローブ（１ｐｍｏｌ；捕捉プローブ２または捕捉プローブ３）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、５−メチルシトシンを含む標的核酸およびサケ精液由来ゲノムＤＮＡを共に含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブを固定化した。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、捕捉プローブとハイブリッドを形成していた核酸を反応溶液中に放出させた。磁性粒子を集磁して除いた後、全量の反応上清を捕捉プローブ（１ｐｍｏｌ；捕捉プローブ１または捕捉プローブ３）を含む緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）８５μＬに加えた。この反応液を９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブを固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

その結果、異なる２つの捕捉プローブの組み合わせにより発光カウントが異なり、２つの捕捉プローブを標的核酸の両末端領域にハイブリダイズできるように設計した場合、発光カウントが最も高かった（表４、図４）。

以上より、標的核酸に対する２つの捕捉プローブを標的核酸の両末端領域にハイブリダイズできるように設計した場合、標的核酸の特異的な検出に優れることが示された。

実施例３：標的核酸および非標的核酸の混合核酸サンプルにおける、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の特異的な検出
標的核酸および非標的核酸を混合することにより得られた核酸サンプルにおいて、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法が標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を特異的に検出できるか検討した。

捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、捕捉プローブ２は５’−ＧＵＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＵＵ ＣＵＡ−３’（配列番号５）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。５−メチルシトシンを含む標的核酸は参考例１で調製したものを使用した。非標的核酸として、サケ精液由来ゲノムＤＮＡ（インビトロジェン社製）を使用した。

まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ａｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）および／またはサケ精液由来ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）と、捕捉プローブ２（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、５−メチルシトシンを含む標的核酸およびサケ精液由来ゲノムＤＮＡを共に含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ２を固定化した。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、捕捉プローブとハイブリッドを形成していた核酸を反応溶液中に放出させた。磁性粒子を集磁して除いた後、全量の反応上清を捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）８５μＬに加えた。この反応液を９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

比較のため、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を、１つの捕捉プローブを用いる従来法によっても測定した。従来法による測定は、まず、５−メチルシトシンを含む標的核酸（１０ａｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、または１ｆｍｏｌ）および／またはサケ精液由来ゲノムＤＮＡ（５０μｇ）と、捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１００μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、５−メチルシトシンを含む標的核酸およびサケ精液由来ゲノムＤＮＡを共に含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

その結果、従来法では、標的核酸および非標的核酸の混合核酸サンプルにおいて測定された発光カウントは、非標的核酸を含まない標的核酸の核酸サンプルにおいて測定されたものよりも高く、非標的核酸に対する標的核酸の相対量が低い場合に発光カウントが顕著に高くなる傾向が認められた（表５、図５）。一方、本発明の方法では、標的核酸および非標的核酸の混合核酸サンプルにおいて測定された発光カウントは、非標的核酸に対する標的核酸の相対量にかかわらず、非標的核酸を含まない標的核酸の核酸サンプルにおいて測定されたものと同等であった（表５、図６）。

以上より、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法は、標的核酸および非標的核酸の混合核酸サンプル（ゲノムＤＮＡ含有サンプル）において、非標的核酸のバックグランドシグナルを大幅に低減しつつ、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を検出できることが示された。また、標的核酸および非標的核酸の混合核酸サンプルにおいて非標的核酸に対する標的核酸の相対量が低い場合（例、非標的核酸１μｇ当たりの標的核酸モル数が２０ａｍｏｌ未満の量において標的核酸を含む核酸サンプルを用いる場合）、本発明の方法が特に優れることが示された。

実施例４：天然の生物学的サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の特異的な検出
天然の生物学的サンプルである細胞から抽出された、標的核酸および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法が標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を特異的に検出できるか検討した。本検討では、本発明の方法、および１つの捕捉プローブを用いる従来法を、既知手法であるバイサルファイトパイロシーケンシング法（標的核酸の増幅を伴う解析方法）と比較することにより行った。

培養細胞Ａ１７２、Ｕ８７−ＭＧ、Ｔ４７Ｄは、ＤＳファーマバイオメディカル社より購入したものを培養後、Ｂｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ＰＮ１３３６２）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。

捕捉プローブ１は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号４）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）、捕捉プローブ２は５’−ＧＵＣ ＧＧＧ ＡＣＧ ＣＡＡ ＡＧＣ ＧＵＵ ＣＵＡ−３’（配列番号５）（核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。

まず、３Ｅ＋７コピー相当の培養細胞由来ゲノムＤＮＡと１２ｕｎｉｔｓの制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）、４８ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭＫＣｌ）８０μＬ中に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、８０℃で１０分間反応させることで、制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡを得た。

次に、制限酵素切断済みのゲノムＤＮＡと、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ２（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１６０μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、ゲノムＤＮＡを含まない反応溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ２を固定化した。２００μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液を２０μＬ加え、室温で５分間インキュベートすることで、捕捉プローブとハイブリッドを形成していた核酸を反応溶液中に放出させた。磁性粒子を集磁して除いた後、全量の反応上清を捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）８５μＬに加えた。この反応液を９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

次に、標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を、１つの捕捉プローブを用いる従来法によっても測定した。従来法による測定は、まず、３Ｅ＋７コピー相当の培養細胞由来ゲノムＤＮＡと１２ｕｎｉｔｓの制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）、４８ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭＫＣｌ）８０μＬ中に溶解させ、３７℃で２４時間反応させた後、８０℃で１０分間反応させることで、制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡを得た。
次に、制限酵素切断済みのゲノムＤＮＡと、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブ１（１ｐｍｏｌ）を緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）１６０μＬ中に溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で３０分間反応させた。また、ゲノムＤＮＡを含まない反応溶液も調製し、同様の操作を行った。反応後の溶液に、２５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（自社調製品）を５０μＬ加え、３７℃で１０分反応させることで、磁性粒子上に捕捉プローブ１を固定化した。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製抗メチルシトシン抗体Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３を同仁化学社製Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（商品番号：ＬＫ１３）を用いてアルカリフォスファターゼ標識）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、化学発光基質ＡＭＰＰＤ溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で５分反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ベルトールド社製Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）により発光カウントを測定した。

バイサルファイトパイロシーケンシング法は、既報の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２８１，３６３−３６５、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００２，２３，２４，４０７２−４０７９）にしたがい行った。

その結果、従来法で測定された発光カウントは、バイサルファイトパイロシーケンシング法の測定結果と必ずしも相関しなかった（表６、図７）。一方、本発明の方法は、バイサルファイトパイロシーケンシング法の測定結果と相関した（表６、図８）。

以上より、２つの異なる捕捉プローブを用いる本発明の方法は、標的核酸の増幅を伴うことなく、標的核酸の増幅を伴う方法と少なくとも同等の解析精度で、天然の生物学的サンプル中の標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定できることが示された。

本発明の方法は、診断、研究等の分野で利用することができる。

Claims (13)

1. 以下を含む、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定方法：
   （１）修飾核酸塩基を含む標的核酸、および非標的核酸を含む核酸サンプルにおいて、標的核酸に対する複数の異なる捕捉プローブを用いて標的核酸を固相に複数回固定すること；ならびに
   （２）標的核酸に含まれる修飾核酸塩基を測定すること。
2. 前記核酸サンプルがゲノムＤＮＡサンプルである、請求項１記載の方法。
3. 前記核酸サンプルが、非標的核酸１μｇ当たりの標的核酸モル数が２０ａｍｏｌ未満の量において標的核酸を含む、請求項１または２記載の方法。
4. 前記捕捉プローブとして、標的核酸の５’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブ、および標的核酸の３’末端領域にハイブリダイズする能力を有する捕捉プローブが併用される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 以下を含む方法により（１）が行われる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法：
   （ｉ）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉；
   （ｉｉ）固相から液相への標的核酸の放出；および
   （ｉｉｉ）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた液相中の標的核酸の固相への捕捉。
6. 以下を含む方法により（１）が行われる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法：
   （ｉ’）標的核酸に対する第１捕捉プローブを用いた第１液相中の標的核酸の第１固相への捕捉；
   （ｉｉ’）第１液相の第２液相への交換；
   （ｉｉｉ’）第１固相から第２液相への標的核酸の放出；
   （ｉｖ’）第１固相の第２固相への交換；
   （ｖ’）標的核酸に対する第２捕捉プローブを用いた第２液相中の標的核酸の第２固相への捕捉；および
   （ｖｉ’）第２液相の第３液相への交換。
7. 以下を含む方法により（１）が行われる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法：
   （１−１）（ａ）核酸サンプルに含まれる標的核酸、（ｂ）第１親和性物質で標識された、標的核酸に対する第１捕捉プローブ、および（ｃ）第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第１固相を溶液中で反応させて、標的核酸および前記第１捕捉プローブを含む第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を含む第１溶液を得ること；
   （１−２）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を、第１溶液から第２溶液に移すこと；
   （１−３）前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相から標的核酸を第２溶液中に放出させて、標的核酸および第１固相を含む第１放出溶液を得ること；
   （１−４）第１固相を第１放出溶液から除去して、標的核酸を含み、かつ第１固相を含まない第２放出溶液を得ること；ならびに
   （１−５）（ａ’）前記第２放出溶液に含まれる標的核酸、（ｂ’）第２親和性物質で標識された、標的核酸に対する第２捕捉プローブ、および（ｃ’）第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第２固相を反応させて、標的核酸および前記第２捕捉プローブを含む第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を含む第３溶液を得ること；
   （１−６）前記第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を、前記第３溶液から第４溶液に移すこと。
8. 以下をさらに含む、請求項７記載の方法：
   （１ａ）（１−２）において、前記第１固相を前記第１溶液から第２溶液に移すときに、前記第１核酸ハイブリッドが固定された第１固相を洗浄すること；
   （１ｂ）（１−６）において、前記第２固相を前記第３溶液から第４溶液に移すときに、前記第２核酸ハイブリッドが固定された第２固相を洗浄すること；
   （１ｃ）（１ａ）および（１ｂ）の双方を行うこと。
9. 第１親和性物質が第２親和性物質と同じであり、かつ、第１親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第１固相が第２親和性物質と特異的に結合する能力を有する物質で標識された第２固相と同じである、請求項７または８記載の方法。
10. 固相が磁性粒子である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
11. 修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
12. 前記測定が標的核酸の非増幅的解析方法により行われる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
13. 前記非増幅的解析方法が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、ナノポア分析またはマイクロポア分析である、請求項１１記載の方法。